Nghiên cứu công nghệ sinh tổng hợp Enzym glucose oxidaza (god) và ứng dụng trong công nghiệp chế biến một số sản phẩm từ quả nhằm đảm bảo ổn định chất lượng chống biến màu, hạn chế mất mùi sản phẩm

Nghiên cứu công nghệ sinh tổng hợp Enzym glucose oxidaza (god) và ứng dụng trong công nghiệp chế biến một số sản phẩm từ quả nhằm đảm bảo ổn định chất lượng chống biến màu, hạn chế mất mùi sản phẩm

BỘ CÔNG THƯƠNG

VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI CẤP BỘ

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH TỔNG HỢP ENZYM GLUCOSE OXIDAZA (GOD) VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP CHẾ BIẾN MỘT SỐ SẢN PHẨM TỪ QUẢ NHẰM ĐẢM BẢO ỔN ĐỊNH CHẤT LƯỢNG CHỐNG BIẾN MÀU,

MỞ ĐẦU

Glucooxydaza (GOD) – một trong những enzym oxy hóa khử, được sử dụng khá rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm và chuẩn đoán trong y học Chúng xúc tác một cách đặc hiệu cho phản ứng giữa glucoza với oxy Glucoza bị oxi hóa thành axit gluconic và oxy được tiêu thụ Vì thế, GOD có thể được ứng dụng để lọai bỏ oxy và để định tính và định lượng glucoza

Enzym GOD còn được gọi là β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase hay EC 1.1.3.4 Trong tự nhiên enzym GOD được tìm thấy trong các mô động vật, thận, gan

trong canh trường của nấm mốc, nhất là các loài A niger, P amagasakiense, P

chrysogenum, P vitale, P notatum và một số loài Penicillium khác [1]; [12]; [30]

Enzym GOD được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: Công nghiệp thực phẩm, trong y học và trong phân tích Trong công nghiệp thực phẩm GOD được sử dụng như một chất bảo quản không độc, có nguồn gốc tự nhiên và an toàn (để loại bỏ glucoza và oxy khỏi thực phẩm và đồ uống) như: Bảo quản dịch ép các loại quả nhiệt đới, bảo quản rượu vang Đồng thời, enzym GOD còn được dùng để loại bỏ glucoza khỏi lòng trắng trứng trước khi sấy khô làm nguyên liệu để sản xuất bánh ngọt [64]; [65];[66];[70] Trong y học GOD được sử dụng để xác định hàm lượng glucoza trong dịch của cơ thể (xác định hàm lượng glucoza trong máu hoặc nước tiểu của các bệnh nhân tiểu đường) Ngoài ra enzym GOD còn được dùng để đánh dấu các kháng thể và

để phát hiện các kháng thể đánh dấu của khối u và các kháng thể của virut Trong phân tích, enzym GOD được sử dụng rộng rãi để sản xuất các KIT thử sinh học nhằm xác định hàm lượng glucoza có trong mẫu [9]; [88];[90]

GOD có thể được tổng hợp bằng phương pháp lên men chìm từ nguồn cacbon

là glucoza, saccaroza, tinh bột và một số chất dinh dưỡng với sự có mặt của oxy bởi các chủng nấm mốc hoặc nấm men [1]; [11];[13]

Ở Việt nam, cho đến nay chưa có công trình nghiên cứu về GOD nào được công bố Do vậy, việc nghiên cứu sinh tổng hợp enzym GOD ứng dụng trong bảo quản các sản phẩm thực phẩm sẽ rất có ý nghĩa, nó mở ra một triển vọng mới trong việc thay thế các chất bảo quản có nguồn gốc hóa học, góp phần nâng cao chất lượng thực phẩm, đảm bảo vệ sinh an toàn cho người tiêu dùng

Mục đích của nghiên cứu

Quá trình sinh tổng hợp GOD bằng chủng A niger sẽ được nghiên cứu ở ba mức độ

khác nhau: Nuôi lắc trong bình tam giác, trong bình lên men 5 lít và qui mô pilot

1 Lựa chọn chủng giống

- Lựa chọn chủng giống A niger

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái

- Kiểm tra độ an toàn của chủng giống (dựa trên kết quả kiểm tra độc tố aflatoxin B1,B2,G1,G2)

- Định tên chủng giống chọn lựa

2 Nghiên cứu điều kiện sinh tổng hợp enzym GOD

- Xác định ảnh hưởng của các ion kim loại đến quá trình sinh tổng hợp enzym (Sắt, đồng, kẽm, mangan, coban v.v)

- Xác định thành phần môi trường sinh tổng hợp enzym (các bon, nitơ, khoáng, chất có hoạt tính bề mặt tween 80, EDTA v.v.)

- Xác định điều kiện nuôi cấy để sinh tổng hợp enzym GOD (pH, nhiệt độ, tốc độ đảo trộn môi trường v.v)

- Nghiên cứu động học của quá trình sinh tổng hợp GOD

- Sản xuất thử nghiệm enzim GOD quy mô xưởng thực nghiệm

3 Thu nhận, tinh sạch enzym và xác định đặc tính của chế phẩm

- Lựa chọn phương pháp phá vỡ tế bào

- Thu nhận và tinh sạch enzym

- Nghiên cứu đặc tính của enzym GOD sinh tổng hợp được

4 Nghiên cứu đặc tính sinh hóa và độ an toàn của chế phẩm enzym

5 Nghiên cứu xác định các điều kiện thích hợp trong quá trình sử dụng enzym GOD trong chế biến quả quy mô phòng thí nghiệm và xưởng thực nghiệm (nước quả và rượu vang)

6 Nghiên cứu áp dụng thử nghiệm GOD trong công nghiệp chế biến nước quả và rượu vang

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

I.1 Lịch sử phát hiện enzym GOD

Enzym GOD (GOD) là một enzym chống oxi hóa được sinh tổng hợp từ những năm 1950 Năm 1904, Maximow đã phát hiện ra một hệ thống enzym tiêu thụ oxy trong dịch chiết nấm mốc Năm 1926, D.Mueller đã xác định lại hệ thống này và ông

ta đặt tên cho enzym này là glonga oxidaza GOD được chiết tách lần đầu tiên từ hệ

sợi nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium glaucum do nhà khoa học Muller (năm

1928) Kể từ sau lần đầu được phát hiện và tách chiết nhiều nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu enzym GOD Năm 1946, Keilin và Haitree chứng minh rằng GOD là một flavinprotein với một nhóm ngoại (prosthetic) FAD và có đặc tính kháng khuẩn

“antibiotic" (do tạo thành hydro peroxit H2O2) [9]

Tiếp theo là báo cáo của Keston năm 1956 về cặp phản ứng giữa GOD, peroxidaza và một chất tạo mầu Trên nguyên tắc này “que nhúng” định lượng glucoza

đã xuất hiện để xác định hàm lượng glucoza trong nước tiểu Cũng trong năm 1956, dựa trên bài báo của Teller, Worthington lần đầu tiên đã đưa ra hệ thống enzym định lượng để xác định hàm lượng glucoza bằng phương pháp so mầu

Các chủng nấm mốc Aspergillus niger, Penicillium glaucum và nấm men

Saccharomyces cerevisiae là nguồn vi sinh vật có khả năng sản xuất ra GOD tốt nhất

Enzym GOD thu được dưới dạng enzym nội bào (Aspergillus niger, Saccharomyces

cerevisiae) hay ngoại bào (Penicillium glaucum) được làm sạch với các mức độ khác

nhau, tùy theo mục đích sử dụng Enzym GOD tinh sạch đã loại bỏ các polysaccharit tạp này đã được giới thiệu cho mục đích bảo quản thực phẩm, y học chuẩn đoán và phân tích

I 2 Cấu tạo của enzym GOD

Cũng giống như mọi enzym khác GOD có bản chất là protein GOD là một protein có cấu trúc đối xứng, gồm hai monomer giống nhau có trọng lượng phân tử vào khoảng 80,000 daltons, liên kết đồng hóa trị với nhau nhờ các cầu nối disulfit

Trọng lượng phân tử của enzym GOD khoảng 160.000 dalton Kích thước phân tử của GOD thu nhận từ các nguồn khác nhau là khác nhau (khối lượng phân tử GOD thu

được từ Aspergillus niger là 186.000 Da từ Penicillium notatum là 152.000 Da) [39]

Để có thể làm việc như một chất xúc tác, mỗi một monomer của GOD cần một nhân tố phụ trợ là FAD (flavin adenine dinucleotide) Trong phản ứng oxy hóa khử do enzym GOD xúc tác, FAD đóng vai trò như chất nhận điện tử ban đầu và khử thành FADH2 sau đó FADH2 được oxy hóa bởi chất nhận điện tử cuối cùng là một phân tử oxy (O2) vì oxy có thế oxy hóa khử cao hơn Sau đó oxy được khử thành hydro peroxit (H2O2) FAD được gắn với protein bởi liên kết không đồng hóa trị và có thể bị giải phóng khỏi cấu trúc protein khi bị biến tính

Enzym GOD được gắn với 16% (w/w) hydratcacbon 80% (w/w) hydratcacbon

là mannoza Đường mannoza có thành phần nitơ và oxy liên kết với các axit amin: Arginin, threonin và serin Mạch hydratcacbon trong phân tử GOD không tham gia vai trò xúc tác của phản ứng enzym và cấu tạo của nó cho tới nay vẫn chưa được xác định

rõ ràng [23]

Enzym GOD được sinh tổng hợp từ A niger có cấu tạo bởi 583 axit amin

Enzym GOD có tính đặc hiệu rất cao Một thay đổi nhỏ trong cấu trúc đã có tác động lớn tới hoạt lực oxy hoá của enzym Gốc glucoza trong phân tử của enzym ở dạng β- D- glucoza có hoạt tính oxy hoá mạnh hơn α- D- glucoza 157 lần [39]

Hình 1.1 Cấu trúc không gian ba chiều của GOD

Hình 1.2 Cấu trúc tiểu đơn

vị của GOD (mầu đỏ là

FAD)

I.3 Tính chất của enzym GOD [8];[39];[92]

¾ Tính chất vật lý

- Phân tử protein tan dễ dàng trong dung dịch potassium phosphate 0.1M, pH 7.0 cho dung dịch mầu vàng, trong suốt Hệ số phân li của dung dịch GOD 1% (w/v) ở bước sóng 280 nm là 13.8

- Enzym thể hiện mức độ chuyên hóa rất cao đối với β-D glucoza mặc dầu deoxy-D-glucoza, D-mannoza và D-fructoza cũng bị oxy hóa

2 Protein của bản thân enzym là có tính axit và có điểm đẳng điện (pI) là 4.2

¾ pH tối ưu

- pH của môi trường ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzym vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, enzym và độ bền của protein enzym Đa số các enzym đều bền trong giới hạn pH từ 5- 9 Độ bền của enzym đối với môi trường cũng có thể tăng lên khi có cơ chất coenzym và ion Ca++

- pH tối thích (pHopt) cho hoạt động của GOD thu được từ các nguồn khác nhau là khác nhau Giá trị pH không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố như cơ chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ v.v pH thích hợp cho hoạt động của GOD vi sinh vật trong khoảng 4 –7, tối ưu nhất là 5.6

¾ Tính đặc hiệu

Enzym có đặc tính chuyên hóa cao đối với βglucoza Với đồng phân α glucoza enzym không có tác dụng Với các cơ chất như 2-deoxy-D-glucoza, D-mannoza và D-galactoza enzym GOD thể hiện hoạt tính rất thấp

-D-¾ Các chất ức chế

- Ức chế bởi: D- arabinoza và 2- deoxy-D-glucoza

- Ức chế hoàn toàn bởi: ρ- cloromercuribenzoat

- Ức chế một phần bởi: 8- hydroxycholin, semicarbazit

¾ Điều kiện bảo quản

Enzym GOD dạng khô là ổn định trong nhiều năm khi bảo quản ở chỗ mát Các dạng dung dịch tính ổn định phụ thuộc nhiều vào các điều kiện bảo quản

I.4 Cơ chế hoạt động cña enzym GOD [77]

Enzym GOD (còn gọi là β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase, EC 1.1.3.4) là một enzym oxi hóa khử β-D glucoza bị oxi hóa thành axit gluconic và oxi bị tiêu thụ

GOD

Phản ứng tổng quát: C6H12O6 + ½ O2 C6H12O7

Trước tiên, β-D-glucoza bị loại nước thành D-glucono-1,5-lacton và FAD bị khử thành dạng FAD khử Sau đó D-glucono-1,5-lacton bị kết hợp với nước tạo thành axit gluconic và FAD khử phản ứng với oxy tạo thành hydro peroxit (H2O2) Nếu có mặt enzym catalaza hydro peroxit (H2O2) sẽ bị phân hủy thành nước và oxy

Phương trình phản ứng như sau:

C6H12O6 + FAD C6H10O6 + FAD~H2

gluconolacton +O2 +H2O

C6H12O7 H2O2 H2O + ½ O2

+ FAD

Sự tạo thành axit gluconic làm giảm pH môi trường nên trong quá trình phản ứng đồng thời phải bổ sung kiềm để điều chỉnh pH

Theo cơ chế hoạt động xúc tác của của enzym GOD, quá trình oxy hoá glucoza luôn

có sự hình thành H2O2 chính sản phẩm phụ này lại ức chế ngược hoạt động của enzym GOD Hoạt lực của enzym GOD luôn biểu hiện giảm mạnh sau 5 giờ phản ứng Các kết quả đều cho thấy hoạt lực của GOD giảm tỷ lệ nghịch với sự tăng của nồng độ

H2O2 [45]

I 5 Chỉ tiêu chất lượng của một số chế phẩm GOD [8]

¾ Hoạt tính riêng

Dựa vào hoạt tính riêng của GOD mà chia enzym này thành 4 loại:

- Loại I khoảng 210 U/mg

- Loại II khoảng 70 U/mg

- Loại III khoảng 20 U/mg

- Loại IV khoảng 1.5 U/mg

¾ Mức độ tinh sạch

- Loại I: amylaza, sacaroza – mỗi loại < 0.01%, catalaza <10U/mg

- Loại II: amylaza, sacaroza – mỗi loại < 0.1%, catalaza < 250 U/mg

- Loại III: amylaza, sacaroza – mỗi loại < 0.1%, catalaza < 260 U/mg

¾ Dạng chế phẩm GOD có sẵn

- Loại I và II dạng dung dịch

- Loại III và IV dạng bột khô

¾ Độ bền

GOD được bảo quản ở 40C, không bị giảm hoạt tính trong vòng 12 tháng

II TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT GOD TRONG NƯỚC VÀ

GOD được tìm thấy trong các mô động vật, thận, gan trong canh trường nuôi

cấy nấm mốc, nhất là các loài Aspergillus niger, P amagasakiens, P chrysogenum, P

vitale P notatum, P glaucum, P purpurogennum và P variabile [1]; [12]; [30]

GOD sinh tổng hợp từ các vi sinh vật nói trên đã được nghiên cứu kỹ ở các nước như: Liên Xô, Tiệp Khắc, Mỹ và Nhật Trên thị trường đã có một số chế phẩm enzym GOD được lưu hành với những tên thương phẩm như Oxidoredutaza 1.1.3.4 (Liên Xô) GluzymeTM BG của hãng Ecozym (Hungary), Glucose oxidase của hãng Calzyme (Mỹ) hay Novarom của hãng Novozyme (Đan Mạch) [9]; [70]

Kreston (1956) đã sản xuất que thử glucoza để xác định glucoza niệu Worthington (1956) lần đầu tiên đã đưa ra phương pháp định lượng glucoza dựa trên phản ứng màu của enzym Ông đã sử dụng enzym GOD dạng thô tách chiết từ

các enzym khác như amylaza, maltaza, saccharaza Williams và cộng sự (1976), Auses

và cộng sự (1975) đã tiến hành xác định hàm lượng glucoza bằng enzym GOD đã được tinh sạch với sự có mặt H2O2 và chất chỉ thị màu luminol Greenfeld và cộng sự (1975), Lahoda và cộng sự (1975) đã sử dụng enzym GOD cố định trong chuẩn đoán bệnh tiểu đường Năm 1997, enzym GOD đã được Janser sử dụng để bảo quản dịch ép các loại quả nhiệt đới Pickering (2000) đã sử dụng GOD trong bảo quản rượu vang [64]; [65];[66];[70]

Chính vì tính chất ưu việt của GOD mà các công trình nghiên cứu về enzym này vẫn được tiếp tục công bố Akulova và cộng sự (1978) đã nghiên cứu động học

của quá trình sinh tổng hợp và tính ổn định của enzym GOD từ chủng Penicillium

vitale Li (1996) đã nghiên cứu nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp GOD từ chủng Streptomyces sp Năm 2001, các tác giả Kapat, A., Jung, J.K., Park, Y.H đã nghiên

cứu nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp GOD từ chủng Saccharomyces cerevisiae tái tổ hợp Cùng thời gian này Rinas và cộng sự đã sản xuất GOD từ chủng Aspergillus niger

tái tổ hợp và sử dụng các nguồn cacbon không phải glucoza Gần đây có nhiều công trình công bố điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sinh tổng hợp GOD, sinh tổng hợp catalaza (CAT) và kích thích sinh tổng hợp cả hai enzym.[34], [39], [69];[71] Năm 2003, Hafiz và cộng sự đã tiến hành tối ưu hoá các thông số khác nhau của quá trình sản xuất

GOD trên môi trường tinh bột sử dụng chủng Aspergillus niger [36] Rhinas và cộng

sự (2001) đã nghiên cứu ảnh hưởng của sự thông khí đến hình thái sợi nấm, sự tạo

thành viên và sự sản xuất enzym GOD của chủng tái tổ hợp Aspergillus niger Theo

tác giả này, trong nuôi cấy chìm khi tốc độ thông khí tăng từ 200 – 800 v/p, hình thái

sinh trưởng của A niger thay đổi từ hạt kích thước lớn (đường kính trung bình 1500

µm) đến hạt kích thước nhỏ Có một sự tương quan giữa cường độ thông khí với hình thái sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym GOD Khả năng tổng hợp enzym tăng lên khi thay đổi hình thái sinh trưởng từ dạng viên đến dạng sợi mảnh Tuy nhiên, dạng sợi mảnh có sức căng bề mặt lớn hơn, cần thông khí mạnh hơn và lượng sinh khối thu được ít hơn [63];[69]

Cho đến nay, ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào về GOD được

công bố

II.1 Chủng vi sinh vật trong sản xuất enzym GOD

Chủng giống là điều kiện tiên quyết quan trọng nhất trong sản xuất enzym công nghiệp bằng kỹ thuật lên men Việc lựa chọn chủng giống đang ngày càng đóng vai trò quan trọng trong sản xuất enzym Một chủng giống tốt không chỉ giúp tăng sản lượng của sản xuất enzym, tăng tốc độ sử dụng nguyên liệu thô mà còn liên quan đến tính đa dạng của các enzym, rút ngắn quá trình sản xuất, cải thiện quá trình lên men và tách chiết

Nấm sợi là vi sinh vật hoại sinh điển hình, chúng tiết ra một loạt các enzym tham gia vào việc phân hủy các polyme sinh học của các mô động vật và thực vật Đại bộ phận các enzym này là enzym thủy phân và đóng vai trò quan trọng trong dinh dưỡng của nấm mốc, giải phóng cacbon và nitơ liên kết trong các đại phân tử để cung cấp dinh dưỡng cho nấm mốc Điều này làm cho nấm sợi như là vật chủ để sản xuất các enzym [12]

Khả năng của nấm sợi trong việc bài tiết protein ở mức cao là một trong những đặc điểm then chốt trong việc xem xét chúng như là vật chủ giàu tiềm năng để sản xuất các protein tái tổ hợp có giá trị cao dùng trong y học [23]

Khả năng sinh tổng hợp GOD được phát hiện ở nhiều chủng nấm mốc như

Penicilium (P notatum, P chrysogenum, P .vitale), Aspergillus (A niger), nấm men

(Saccharomyces sp) và vi khuẩn (Streptomyces sp) [71] Tuy nhiên, enzym GOD được sản xuất chủ yếu từ các chủng A niger, P notatum, P glaucum, P amagasakiense, P

purpurogenum, P variablile và Alternaria alternate [30]

Trong một vài năm gần đây, nhiều công trình nghiên cứu về khả năng sinh hợp

GOD của chủng nấm mốc A.niger đã được công bố Trong số các chủng nấm mốc được sử dụng để sản xuất enzym qui mô công nghiệp thì chủng Aspergillus niger là

được sử dụng nhiều hơn cả nhờ sự đa dạng về trao đổi chất của chủng này Việc sử

dụng chủng A niger để sinh tổng hợp enzym GOD có những ưu điểm sau [30]:

• A niger có thể tạo ra các enzym nhất định với với số lượng vài kg/1 m3 ở điều kiện thích hợp

• A niger có lịch sử lâu đời về ứng dụng trong công nghiệp lên men và nhìn

chung chúng được coi là an toàn

• Các ngành công nghiệp lên men là tương tự nhau về các điều kiện cần thiết để

cực đại hóa việc sản xuất các protein đồng hình của Aspergillus Vì vậy, nó cung cấp

điểm khởi đầu tốt nhất để nhận biết các ảnh hưởng hóa lý đối với việc sản xuất và bài tiết các protein dị hình khi dùng một chủng tương tự

• Các loài Aspergillus là các nhà máy bài tiết protein hiệu quả, với số lượng cao

gấp nhiều lần so với trong tự nhiên Chúng không có khuynh hướng tích lũy một số lượng lớn protein nội bào dưới dạng cấu trúc cơ thể như vi khuẩn và nấm men

• Aspergillus là một hệ thống sản xuất hữu ích các protein dị hình nhận được từ

các nấm sợi khác

• Tính ổn định của các biến đổi di truyền là khá cao vì vậy, mối đe dọa của sự lại giống hầu như không được nhắc tới

II 2 Định tên chủng nấm mốc

Aspergillus niger là một trong những loài nấm mốc được nghiên cứu nhiều nhất

Tuy nhiên, các cơ sở để phân loại chúng là chưa thật chắc chắn Thông thường tên A

niger có thể được sử dụng cho bất kỳ thành viên nào thuộc nhóm này bởi vì chúng rất

khó phân biệt Các đặc điểm về hình thái của chúng là rất giống nhau và rất khó phân

biệt các loài trong cùng một nhóm A niger [16] Theo Al-Musallam (1981) và Samson (2004) thuộc nhóm A niger gồm có 8 loài: A niger, A tubingensis, A foedidus, A

piperis, A brasiliensis, A vadensis, A costaricensis và A lacticoffeatus

Cho đến năm 1991 bằng kỹ thuật gen dựa trên kết quả đọc trình tự các đoạn gen ITS, β-tubilin, calmodulin, IGS và cox1 đã cho phép phân biệt chính xác hơn các loài trong

là có sinh độc tố ochratoxin A (OA) trên hạt cafe, trong khi A tubingensis là loài

không sinh độc tố vi nấm này [16]

II.3 Độc tố nấm mốc [3];[4]; [7]; [14];[17]

Một số chủng nấm mốc thuộc nhóm Aspergillus trong quá trình sinh trưởng ở

điều kiện nuôi cấy nhất định có sinh ra độc tố vi nấm Trong số các độc tố do nấm mốc sinh ra thì aflatoxin là độc tố gây nguy hiểm nhất, nó ảnh hưởng xấu tới gan và là nguyên nhân gây xơ gan và ung thư gan Chỉ với một hàm lượng rất nhỏ (10 mg) mà con người ăn phải cũng có thể gây tử vong

Bảng 1 1 Các loài thuộc chi nấm cúc Aspergillus và các độc tố nấm

7 A flavus aflatoxin (k), axit koji, axit nitro-propionic,

tremorgen, aspertoxin, metylstergmatocystin, axit aspergillic

8 A fumigatus aflatoxin (k), fumigacillin, gliotoxin

9 A flacipes aflatoxin (k)

16 A ochraceus ochratoxin A, B, C, aflatoxxin (k)

19 A parasitieus aflatoxin (k)

22 A terreus patulin (k), citrin, axit terreic

24 A varsicolor sterogmatocystin (k), aversin, versicolorin A, B, C

Chú thích: x: độc tố nấm mốc chưa biết; k: độc tố nấm mốc gây ung thư gan;

Cho đến nay, người ta đã phát hiện được tất cả 16 aflatoxin Trong 16 aflatoxin

đã được phát hiện, cần đặc biệt chú ý đến các aflatoxin B1, G1, B2, G2 vì các aflatoxin này có độc tính cao nhất, đồng thời cũng là các aflatoxin được tạo thành với số lượng nhiều nhất, cả trong các cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm cũng như trong môi trường lên men

II 4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym

II 4 1 Ảnh hưởng của các ion kim loại và khoáng chất

Các ion kim loại và khoáng chất trong môi trường có ảnh hưởng đáng kể đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp các chất chuyển hóa của tế bào Tùy theo nhu cầu của vi sinh vật đối với các ion kim loại và khoáng chất mà chúng được chia thành các nguyên

tố đại lượng (như P, K, S, Ca, Mg, Fe.v.v) hay nguyên tố vi lượng (như Mn, Mo, Zn,

Cu, Co, Ni.v.v)

Nhu cầu về các nguyên tố đại lượng hay vi lượng thay đổi tuỳ thuộc vào từng loại nấm và vào điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường và thời gian nuôi cấy [2] Nồng độ cần thiết của các muối khoáng đối với vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn thường thay đổi theo các phạm vi sau đây:

Bảng 1 2 Nhu cầu của vi sinh vật về các loại muối khoáng [2]

Nồng độ cần thiết (g/l) Muối khoáng

Vi khuẩn Nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn

sinh học trong tế bào nấm Một số nguyên tố tham gia vào cấu trúc của các enzym kim loại Một số nguyên tố kim loại khác tuy không tham gia vào cấu trúc của enzym nhưng cũng có ảnh hưởng rất quan trọng đối với hoạt động của nhiều enzym [2]

Lưu huỳnh cũng là một nguyên tố khoáng quan trọng trong tế bào vi sinh vật Lưu huỳnh có mặt trong thành phần một số axit amin (systin, systein và một tripeptide

là glutathion) Ngoài ra, lưu huỳnh còn có vai trò quan trọng trong các quá trình oxi hóa khử Việc chuyển nhóm sulphidrin thành nhóm disulphit có vai trò rất lớn trong quá trình chuyển điện tử từ nguyên liệu hô hấp đến oxi phân tử Các hợp chất hữu cơ

có chứa lưu huỳnh ở dạng oxy hóa thường có tác dụng độc đối với tế bào vi sinh vật, trong khi các muối sulphat vô cơ lại được vi sinh vật đồng hóa rất tốt [2]

Sắt là nguyên tố rất cần thiết để giúp vi sinh vật có thể tổng hợp một số enzym chứa sắt như: xitocrom, xitocrommoxidaza, peroxidaza, catalaza v.v Trong sinh tổng

hợp enzym GOD và peroxidaza từ A niger nguồn Fe thích hợp nhất là FeSO4.7H2O [2],[35],[48]

Magiê là nguyên tố được vi sinh vật đòi hỏi với hàm lượng khá cao (10-3 – 10

-4M) Magiê đóng vai trò một cofacto, chúng tham gia vào nhiều phản ứng enzym có liên quan đến các quá trình photphoril hóa (chuyển H3PO4 từ một hợp chất hữu cơ này sang một hợp chất hữu cơ khác) Mg2+ có thể làm hoạt hóa các enzym hexokinaza, ATP-aza, pirophotphataza, phophopheraza, transaxetilaza, photphoglucomutaza, cacboxylaza, enolaza, các enzym trao đổi protein, các enzym oxi hóa khử của chu trình Crep Mg2+ còn có vai trò quan trọng trong việc làm iên kết các tiểu phần riboxom với nhau Nguồn Mg, S được dùng phổ biến là MgSO4 [2], [36]

Canxi có vai trò trong việc xây dựng các cấu trúc tinh vi của tế bào Canxi đóng vai trò cầu nối trung gian giữa nhiều thành phần quan trọng của tế bào sống (như giữa ADN và protein trong nhân, giữa các nucleotit với nhau, giữa ARN và protein trong ribôxom) Canxi rất cần thiết đối với việc hình thành các cấu trúc không gian ổn định của nhiều bào quan như riboxom, ti thể, nhân v.v Trong quá trình tổng hợp GOD từ

nấm mốc A niger, muối canxi cacbonat có tác dụng kích thích quá trình sinh tổng hợp

cả enzym GOD và catalaza trong khi canxiclorua lại có tác dụng kìm hãm chúng [36], [54]

Kẽm cũng là một cofacto tham gia vào nhiều hoạt động của enzym Zn có vai trò đáng kể trong việc hoạt hóa các enzym như cacboanhydraza, enolaza, photphataza kiềm, pirophotphataza, lơxitinaza v.v [2]

Mangan tham gia vào cấu trúc của một số enzym hô hấp Mangan có vai trò quan trọng trong việc làm hoạt hóa một số enzym như phophomonoesteraza, cacboxylaza, ATP-aza, hydroxylamin reductaza, acginaza, aminopeptidaza, enolaza, photphoglucomutaza v.v [54]

Kali là nguyên tố chiếm tỷ lệ khá cao trong thành phần khoáng của tế bào vi sinh vật Kali thường tồn tại dưới dạng ion K+ ở mặt ngoài của màng tế bào Một lượng đáng kể ion K+ tồn tại ở trạng thái liên kết hóa lý không bền với protein và các thành phần khác của nguyên sinh chất Kali làm tăng độ ngậm nước của các hệ thống keo do

đó ảnh hưởng đến các quá trình trao đổi chất, nhất là các quá trình tổng hợp Nguồn kali thường dùng dưới dạng muối KH2PO4, K2HPO4 hoặc K2SO4 [36]

Trong tế bào vi sinh vật, các ion kim loại có sự tương tác với nhau, một enzym

có thể bị hoạt hóa bởi nhiều ion kim loại khác nhau, cũng có trường hợp một ion kim loại này lại có tác dụng đối kháng đối với một ion kim loại khác [2] Bình thường trong nuôi cấy vi sinh vật, người ta không cần bổ sung các nguyên tố vi lượng, các nguyên tố này thường có sẵn trong nước máy hoặc trong các hóa chất dùng làm môi trường Tuy nhiên, trong một số trường hợp cụ thể phải bổ sung một số nguyên tó vi lượng vào môi trường nuôi cấy như bổ sung Zn vào môi trường nuôi cấy nấm mốc, bổ sung Co vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn sinh tổng hợp B12, bổ sung B và Mo vào môi trường nuôi cấy các vi sinh vật cố định đạm v.v [2] Sự tồn tại dư thừa các ion kim loại và các nguyên tố khoáng là không cần thiết và có thể dẫn đến những ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym

II.4.2 Ảnh hưởng của dinh dưỡng cacbon, nitơ, photpho và các chất có hoạt tính bề mặt

Sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của nấm mốc không chỉ bị ảnh hưởng bởi các ion kim loại và muối khoáng mà còn bị ảnh hưởng rất lớn bới thành phần dinh dưỡng cacbon và nitơ

9 Nguồn dinh dưỡng cacbon [10];[36],[68]; [69]

Để sản xuất enzym GOD qui mô thương mại bằng chủng A niger và phương

pháp lên men chìm, có thể sử dụng những nguồn thức ăn cacbon rất khác nhau Các

nguồn hydratcacbon được A niger sử dụng làm nguồn năng lượng để sinh tổng hợp

GOD có thể kể đến: Glucoza, sacaroza, maltoza, fructoza, rỉ đường, dịch chiết khoai tâyvà một vài loại tinh bột Khi phát triển trên môi trường có nguồn cacbon là glucoza, thời kỳ tiền phát thường rút lại rất ngắn và hệ sợi nấm rất nhanh chóng được tích lũy trong môi trường nuôi cấy

Đối với các nguồn cacbon cao năng khó phân huỷ như tinh bột, thì trước hết nấm mốc phải sinh ra các enzym để phân huỷ các hợp chất này thành các chất đơn phân tử sau đó mới đồng hoá được chúng [2] Theo Fiedurek J (1997) trên môi trường có 6%

bột mì được sử dụng như nguồn cacbon duy nhất, chủng A niger GIV 10 có thể sinh

tổng hợp enzym GOD nội bào và ngoại bào với hoạt tính enzym đạt cao nhất [29] Theo J Mirón và cộng sự (2002), khi nghiên cứu sản xuất GOD từ chủng A niger, họ

đã phát hiện ra rằng axit gluconic được sinh ra từ glucoza nhờ hoạt động của enzym cũng có thể được coi như nguồn cacbon dùng cho sinh trưởng, mà không hề cản trở quá trình sinh tổng hợp GOD mặc dầu axit gluconic được sinh ra do hoạt động của enzym GOD [51],[59],[66] Ngoài ra, enzym GOD cũng có thể được tổng hợp từ

chủng A niger trên môi trường có nguồn cacbon là glycerol, đường riboza, arabinoza,

xyloza, rhamnoza, mannoza, galactoza và hỗn hợp của xyloza/xilan [69]

9 Nguồn dinh dưỡng nitơ

Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên quá trình sinh tổng hợp GOD từ A niger bằng

phương pháp lên men chìm đã được nghiên cứu sâu Nguồn nitơ dùng cho sinh tổng

hợp GOD từ chủng A niger bao gồm các nguồn nitơ vô cơ khác nhau như muối nitrat

của canxi, natri, amoni, kali và nguồn nitơ hữu cơ như dịch chiết nấm men, nước chiết malt, peptone, dịch chiết ngô, nước chiết đậu tương [47].Natri nitrat và cao nấm men

là nguồn nitơ phổ biến nhất được dùng để sinh tổng hợp GOD Tuy nhiên, theo Kona

R.P và cộng sự (2000) để sản xuất GOD từ A niger, trong số các nguồn nitơ như canxi

nitrat, natri nitrat, amoni nitrat, kali nitrat, dịch chiết nấm men và pepton thì natri nitrat cho hoạt lực enzym GOD cao nhất (đạt 595 ± 30 Unit/ml) trong khi sử dụng dịch chiết

ngô như nguồn nitơ duy nhất với hàm lượng 20ml/l hoạt lực enzym cao hơn hẳn (đạt

640 ± 36 Unit/ml) [47]

9 Nguồn dinh dưỡng photpho

Photpho luôn luôn chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các nguyên tố khoáng của tế bào

vi sinh vật Photpho có mặt trong cấu tạo của nhiều thành phần quan trọng của tế bào (như axit nucleic, photphoprotein, photpholipit, trong nhiều coenzym quan trọng như ATP, ADP, UDP, UTP, XDP, XTP, NAD, NADP, flavin v.v.), trong một số vi tamin như thiamin, biotin v.v Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng photpho người ta thường sử dụng các loại photphat vô cơ Việc bổ sung photphat vào môi trường dinh dưỡng ngoài việc cung cấp photpho còn có tác dụng tạo ra tính đệm của môi trường Với các tỷ lệ thích hợp, hỗn hợp muối KH2PO4 và K2HPO4 có thể tạo ra những mức pH ổn định trong khoảng pH 4.5 – 8.0 Trong môi trường axit K2HPO4tạo ra ion OH- còn trong môi trường kiềm KH2PO4 sẽ tạo ra ion H+ Trong quá trình sinh tổng hợp GOD từ A

niger, nguồn photpho có thể dùng dưới dạng muối KH2PO4, K2HPO4 hoặc (NH4)2HPO4, NH4H2PO4, trong đó KH2PO4 và K2HPO4 là thích hợp hơn cả [36]; [40], [41]

9 Ảnh hưởng của các chất có hoạt tính bề mặt [2]; [37]; [40]

Khi sinh trưởng trong môi trường dịch thể vi sinh vật chịu ảnh hưởng của sức căng bề mặt của môi trường Đa số các môi trường dịch thể dùng trong phòng thí nghiệm có sức căng bề mặt khoảng 0,57 – 0,63mN/cm Những thay đổi mạnh mẽ sức căng bề mặt có thể làm ngừng sinh trưởng và làm tế bào chết Khi sức căng bề mặt thấp, các thành phần của tế bào chất bị tách khỏi tế bào Điều này chứng tỏ màng tế bào chất bị tổn thương Các chất làm tăng sức căng bề mặt đa số là các muối vô cơ

Các chất làm giảm sức căng bề mặt chủ yếu là các axit béo, alcohol, saponat và các chất có chuỗi cacbon dài, thẳng và thơm Các chất nói trên được gọi là các chất có hoạt tính bề mặt Tác dụng của chúng thể hiện trong việc làm thay đổi các đặc tính bề mặt của vi sinh vật, trước hết là nâng cao tính thấm của tế bào Trong thực tế người ta

sử dụng hiện tượng này trong việc nuôi cấy các vi khuẩn kháng axit Khác với các vi khuẩn khác, vi khuẩn kháng axit có bề mặt kỵ nước và việc giảm sức căng bề mặt của môi trường sẽ kích thích sự sinh trưởng của chúng Sức căng bề mặt thấp còn ngăn cản

vi khuẩn gắn vào bề mặt cứng, tránh cho chúng khổi cạnh tranh sinh trưởng Việc

thêm một lượng nhỏ chất có hoạt tính bề mặt như Tween 80 vào môi trường nuôi cấy giúp cho vi khuẩn sinh trưởng khuyếch tán đồng đều trong dung dịch [2] Các chất có hoạt tính bề mặt cũng được dùng để sát trùng, tẩy uế R.P Kona (2001), khi nghiên

cứu sinh tổng hợp enzym GOD từ chủng nấm mốc Aspergillus niger đã sử dụng dung

dịch 0,5g/l tween 80 để thu bào tử [47] Hao Peng (2004), khi nghiên cứu ảnh hưởng

của EDTA đến quá trình tổng hợp enzym GOD của chủng Penicillium sp JW 8312

cho thấy, nồng độ EDTA bổ sung thích hợp nhất là 290ppm, trong khi nồng độ

580ppm kìm hãm sinh trưởng và làm giảm hoạt tính enzym [40]

II 4.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

Việc sản xuất enzym GOD từ chủng A niger chịu ảnh hưởng của một số yếu tố

môi trường như nhiệt độ, pH, thời gian, chế độ thông khí v.v Để đạt được sản lượng GOD cao người ta cần phải nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy, chế

độ thông khí thích hợp cho sinh trưởng của chủng vi sinh vật sử dụng Tuy nhiên, điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng, phát triển từng loài có thể không trùng với điều kiện tối

ưu cho quá trình sinh tổng hợp enzym

enzym GOD từ A niger khoảng pH ban đầu của môi trường trong khoảng từ 5-7

[ 42];[47];[73]

9 Nhiệt độ [42]

Nhiệt độ lên men thích hợp cần phải được duy trì mặc dầu vi sinh vật trong quá trình hoạt động trao đổi chất cũng sinh nhiệt Nhiệt độ có vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng của sợi nấm, việc sản sinh bào tử và sự nảy mầm của chúng Khi nuôi cấy

chậm lại Khi nuôi cấy nấm mốc ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối thích, kết quả là làm

ức chế và biến tính enzym và sự sinh trưởng bị dừng lại Mặc dầu hầu hết nấm sợi là

có nhiệt độ tối thích giữa 250C và 350C, một số loài có thể phát triển mạnh ở 500C Ở nhiệt độ 400C được coi là nhiệt độ tối thích cho việc sản xuất các chất trao đổi và tiêu

thụ đường của chủng A niger ACTT 10577

9 Chế độ thông khí

Trong quá trình sinh tổng hợp GOD từ A niger nấm mốc đều cần oxy để sinh

trưởng và tổng hợp enzym Nhu cầu oxy sẽ khác nhau tuỳ theo giai đoạn Nồng độ oxy hòa tan tới hạn (DO) xác định khả năng thích hợp nhất của vi sinh vật tùy thuộc vào sản phẩm mong muốn cuối cùng Việc sinh tổng hợp enzym GOD bị ảnh hưởng đáng

kể bởi hàm lượng oxy hòa tan Nồng độ DO 100% thể hiện là nồng độ ngưỡng để tăng sản lượng enzym lên vài lần [61] Sự giao động của DO trong quá trình lên men theo chu kỳ hình sin cho thấy đường DO thổi vào bình lên men qui mô công nghiệp qua ống dẫn khí là rất thuận lợi cho việc sản xuất GOD Ngoài ra, Michael Trager đã

chứng minh rằng, ở nồng độ DO kém tối ưu và ở giai đoạn nhất định A niger đã tiết

enzym vào môi trường [61];[63] Tốc độ sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym GOD

của chủng A niger ở tốc độ khuấy 700v/p là cao hơn ở tốc độ khuấy 460v/p [55] Hơn nữa, việc tăng tốc độ khuấy không chỉ làm tăng tốc độ sinh trưởng của A niger mà còn

nâng cao hoạt tính GOD Hoạt tính enzym GOD đạt cao nhất ở nồng độ đường của môi trường là 5% (tốc độ khuấy 700v/p) và hoạt tính enzym không cao hơn khi nồng

độ đường trong môi trường tăng lên 7% Khi cung cấp oxy tinh khiết vào bình lên men,

tốc độ sinh trưởng của A niger (ở pha ổn định) là 95mg sợi nấm khô/100ml/giờ và

sinh khối chỉ đạt 61 mg khi oxy tinh khiết được thay bằng không khí [63] Hoạt tính glucooxidaza trong nuôi cấy cấp oxy cao gấp đôi trong nuôi cấy thông khí Độ nhớt của dịch nuôi cấy sẽ cao hơn khi nồng độ sợi nấm tăng lên Độ nhớt của dịch nuôi cấy cung cấp oxy là thấp hơn độ nhớt của dịch nuôi cấy thổi không khí

II.5 Thu hồi và tinh sạch enzym

Sản xuất enzym GOD (GOD) bằng chủng A niger được biết đến từ lâu Tuy

nhiên, các nghiên cứu sự phân bố enzym trong các chủng nấm mốc còn ít được quan tâm Clarke và cộng sự đã nghiên cứu định lượng enzym GOD ngoại bào, trong màng

tế bào, tế bào chất và trong các thành phần khác của nấm mốc A niger NRRL-3 nuôi

cấy trên môi trường thạch nước chiết malt (MEA) Các tác giả đã tách được các thành phần riêng rẽ và xác định được hoạt tính enzym GOD, trong đó GOD ngoại bào chiếm 38% hoạt động tổng thể, 60% còn lại ở trạng thái liên kết trong sợi khuẩn ty bao gồm: màng tế bào, tế bào chất và chất dịch khác chiếm tỷ lệ tương ứng 34, 12 và 16% [59]

Witteveen và cộng sự đã nghiên cứu định vị hoạt động của GOD và catalaza

của A niger N 400 (CBS 120.49) theo phương pháp hoá học miễn dịch và cũng xác

định GOD tập trung ở màng tế bào [59] Đối với trường hợp enzym tiết ra môi trường,

để thu dịch enzym người ta thường tách sinh khối và các chất cặn bã ra khỏi canh trường bằng ly tâm hoặc lọc ép với việc sử dụng thêm các chất trợ lọc hoặc các chất tạo kết tủa

Đối với enzym còn nằm trong tế bào thì việc phá vỡ tế bào là rất cần thiết

II.5.1 Cơ chế của việc giải phóng enzym nội bào [27]; [52]

Việc giải phóng các enzym nội bào ra khỏi tế bào thực chất là quá trình làm tổn thương tế bào Có hai cách để có thể làm thay đổi màng tế bào dẫn đến việc giải phóng enzym là làm cạn kiệt năng lượng hoặc làm tổn thương màng tế bào

II 5.1.1 Cơ chế làm cạn kiệt năng lượng

Sự ức chế quá trình chuyển hóa năng lượng là làm cạn kiệt năng lượng ATP dẫn đến sự giải phóng liên tục các các ion Na+, K+ và Cl- trên màng và dẫn đến làm phồng màng tế bào Hậu quả của sự thâm nhập các ion Ca2+ vào bên trong tế bào là kích hoạt các enzym phospholipaza, kết quả của những phản ứng do enzym phospholipaza xúc tác đã gây ra những tổn thương cho màng tế bào Khi các lỗ thủng nhỏ trên màng được khắc phục nhờ sự hàn gắn lại trong pha thuận nghịch thì chỉ một phần rất nhỏ enzym được giải phóng ra, nhưng khi năng lượng ATP đã giảm đến mức thấp, tính toàn vẹn của màng bị phá vỡ nghiêm trọng, sự tổn thương của tế bào là không thể khắc phục thì một lượng lớn enzym được giải phóng

II.5.1.2 Cơ chế tổn thương màng tế bào bằng cơ học và phi cơ học

Có rất nhiều cách để phá vỡ các tế bào vi sinh vật Việc lựa chọn phương pháp phá vỡ tế bào tùy thuộc vào chủng vi sinh vật và sản phẩm cần thu nhận Các phương pháp phá vỡ tế bào dựa trên hai nguyên lý là phá vỡ bằng tác nhân cơ học và phá vỡ bằng tác nhân phi cơ học Hiệu quả của từng phương pháp được đánh giá dựa trên mức

độ tế bào bị phá vỡ và mức độ hoạt động của enzym được giải phóng ra

a) Các phương pháp phá vỡ tế bào bằng tác nhân cơ học [93]

™ Phương pháp đồng hóa (Homogenizers)

Máy đồng hóa bơm sinh khối qua một van có lỗ đã được giới hạn liều lượng Máy sử dụng áp suất cao (trên 1500 bar) tiếp sau là sự giãn nở ngay lập tức thông qua một vòi đặc biệt Sự phá vỡ tế bào được gắn với ba cơ chế: Sự đẩy lên van, sự xé chất lỏng rất mạnh ở trong van và sự giảm áp suất đột ngột ở đầu ra, cuối cùng gây ra sự nổ

vỡ tế bào Phương pháp này được ứng dụng chủ yếu để giải phóng các phần tử bên trong tế bào Theo Hetherington và cộng sự, đây là phương pháp phá vỡ tế bào (hay tỷ

lệ protein được giải phóng) tốt nhất

™ Phương pháp nghiền bi (Ball Mills)

Sử dụng các bi gốm hoặc bi thủy tinh và được khuấy ở tốc độ cao Các tế bào trong dịch huyền phù bị vỡ do các lực cắt, nghiền, va đập và cọ sát giữa các hạt và giải phóng các phân tử sinh học Ở mức công nghệ đơn giản nhất, các bi thủy tinh được bổ sung vào dịch huyền phù và mẫu được trộn bằng máy trộn vortex của phòng thí nghiệm Bằng cách này, các tế bào được phá vỡ dễ dàng, không đắt và có thể thực hiện với nhiều mẫu khác nhau Khi phá vỡ một lượng mẫu lớn bằng phương pháp này, cần trang bị bộ phận làm mát (thường dùng CO2 lỏng) bởi vì khi khuấy mạnh, một lượng lớn nhiệt được tỏa ra

™ Phá vỡ bằng siêu âm (Ultrasonic disruption)

Một phương pháp được ứng dụng khá rộng rãi là phá vỡ tế bằng sóng siêu âm

tần số cao (thường là 20-50 kHz) Về nguyên tắc, tần số cao do dòng điện sinh ra và năng lượng cơ học được chuyển đến mẫu qua một đầu kim loại giao động với tần số rất cao Đầu kim loại được đặt trong ống đựng tế bào (mẫu) và sự rung tần số cao gây

ra áp suất cao ở tại vùng đó và kết quả là tác động mạnh và tạo ra lỗ hổng và kết cục là phá vỡ hoàn toàn tế bào

Nhược điểm của phương pháp phá vỡ tễ bào bằng tác nhân cơ học

- Phương pháp phá vỡ tế bào bằng cơ học có một số nhược điểm sau:

- Các tế bào bị phá vỡ hoàn toàn, tất cả các vật chất bên trong tế bào được giải phóng Vì vậy, sản phẩm cần phải được tách khỏi hỗn hợp các protein, các axit nucleic và các mảnh vỡ của thành tế bào

- Các mảnh vụn của tế bào sinh ra thường là những mảnh nhỏ vì thế làm cho dung dịch khó lọc trong

- Hầu hết các phương pháp phá vỡ tế bào bằng cơ học đều sinh nhiệt, vì vậy các protein dễ bị biến tính trừ khi các thiết bị được làm mát một cách đầy

đủ

b) Các phương pháp phá vỡ tế bào bằng tác nhân phi cơ học [83]

™ Cải thiện tính thấm nhờ hóa chất (Chemical Permeabilization)

Nhiều phương pháp hóa học đã được sử dụng để cải thiện tính thấm của thành

tế bào nhằm chiết rút các thành phần bên trong các tế bào vi sinh vật Các dung môi hữu cơ như toluen, ete, phenylethyl alcohol DMSO, benzen, methanol, chloroform có thể dễ dàng tạo ra các kênh dẫn qua màng tế bào

Việc cải thiện tính thấm bằng hóa chất cũng có thể đạt được kết quả khi sử dụng các chất kháng sinh, các thionin, các chất hoạt động bề mặt, các tác nhân làm nứt

nẻ và làm đứt gẫy Một chất rất quan trọng đó là EDTA (tác nhân bẻ gẫy) được sử dụng rộng rãi để cải thiện tính thấm của các vi sinh vật Gram âm Hiệu lực của nó thể hiện ở kết quả của việc gắn các cation hóa trị hai Ca2+, Mg2+ Cuối cùng là ổn định cấu trúc của các màng bên ngoài bằng cách gắn các lipopolysaccharit với nhau Ngay khi các cation này bị EDTA tách ra các lipopolysaccharit cũng bị tách ra, kết quả là các vùng có khả năng thấm của lớp thành bên ngoài tế bào tăng lên

™ Cải thiện tính thấm bằng gây sốc thẩm thấu

Trong khi các tế bào chịu được sự thay đổi từ từ của áp suất thẩm thấu bên ngoài môi trường do có sự thích ứng với những thay đổi, thì những tế bào chịu sự thay đổi áp suất thẩm thấu nhanh đột ngột, có thể bị tổn thương về mặt cơ học Quá trình này diễn ra đặc trưng khi môi trường có nồng độ đường sacaroza cao Người ta cho rằng, các enzym được giải phóng bằng phương pháp này là các enzym định vị ở gần bề

mặt tế bào [30] Theo Fiedurek, J (1992)để giải phóng enzym GOD khỏi chất bao, sợi

nấm A niger 72 giờ tuổi được hòa vào dung dịch NaCl có nồng độ từ 0,4- 2.8 M/l [31]

™ Thủy phân (Lysis)

Phương pháp phá vỡ tế bào bằng thủy phân thường được sử dụng cho những tế bào dễ bị phá vỡ Thông thường, nồng độ các chất ion hóa trong môi trường bị giảm xuống làm cho các tế bào bị phồng lên và vỡ ra Trong một số trường hợp, một số chất hoạt động bề mặt có thể được bổ sung vào và kết hợp với khuấy nhẹ hoặc siêu âm để tách rời hoàn toàn các thành phần của tế bào

Sự phá vỡ tế bào bằng phương pháp thủy phân có nhược điểm là không kiểm soát được mức độ phá vỡ tế bào, kết quả là giải phóng tất cả các sản phẩm nội bào (các protein, các axit nucleic, các mảnh vỡ của tế bào) cũng như làm biến tính các sản phẩm

™ Cải thiện tính thấm bằng enzym (Enzymatic Permeabiization)

Các enzym cũng có thể được dùng để cải thiện tính thấm của tế bào, nhưng phương pháp này thường bị giới hạn trong việc dùng để giải phóng các chất bao hoặc các enzym bề mặt Các enzym dùng trong cải thiện tính thấm là những enzym thương phẩm có sẵn trên thị trường: β (1-6) và β (1-3) glycanaza, proteaza và mannaza

Trở ngại chính của việc ứng dụng phương pháp enzym là tính ổn định hoạt lực của enzym, tính nhậy cảm của tế bào đối với các enzym còn tùy thuộc vào trạng thái của tế bào Ngoài ra, phương pháp thủy phân enzym qui mô lớn thường đắt và sau thủy phân cần loại bỏ hoặc làm bất hoạt enzym để cho tế bào sinh trưởng hoặc để tách các sản phẩm mong muốn

có thể là dịch lỏng, nhớt hoặc đặc,dễ sử dụng và

dễ vệ sinh, được bảo hành, dễ nâng công suất,

có chọn lọc, và có thể sử dụng lại

Khó có thiết bị như vậy, Cần có các thuyết trình

để nkhách hàng quan tâm

trình hoạt động, có thể lập lại với một số lượng lớn

Chậm bởi vì cần phải đi qua nhiều lần, không có biện pháp giữ lại các sản phẩm phụ, không có bộ phận làm mát,không có

hệ thống CIP & SIP, chỉ dùng cho các chất lỏng, không dễ sử dụng và vệ sinh nnhư nhiều thiết bị khác

Các loại enzym / các loại

hóa chất

suất

II.5.2 Tinh sạch enzym [8], [27], [39],[52],[68]

Tùy theo yêu cầu sử dụng enzym mà ta cần enzym tinh sạch hay không tinh sạch Rất ít khi enzym thu được sau khi phá vỡ tế bào được sử dụng ngay, trong hầu hết các trường hợp đòi hỏi phải qua bước tinh sạch enzym Để tách và tinh chế enzym người ta thường dựa vào tính chất cơ bản của enzym để đưa ra các phương pháp thích hợp

- Các phương pháp dựa vào sự thay đổi tính hoà tan bao gồm: thay đổi pH (kết tủa ở điểm đẳng điện), thay đổi lực ion (kết tủa enzym bằng muối trung tính), làm giảm hằng số điện môi (kết tủa enzym bằng dung môi hữu cơ) v.v

- Các phương pháp phụ thuộc vào điện tích như: điện di, điểm đẳng điện, sắc ký trao đổi ion

- Các phương pháp phụ thuộc vào khối lượng phân tử: Ly tâm, lọc gel, thẩm tích, siêu lọc v.v

Khi tế bào bị phá vỡ, điều quan trọng là phải xác định những thành phần nào có mặt trong dịch phá vỡ tế bào để quá trình tinh sạch có hiệu quả và không bị cản trở

Các phương pháp tinh sạch enzym bao gồm: Tủa muối và các phương pháp sắc

ký

Trước khi tinh sạch enzym GOD được tách từ A niger ở nhiệt độ từ 0-50C 50 g

dịch chiết của A niger được hòa vào 300ml dung dịch đệm natri axetat 0.1M (pH 4,5)

và được thẩm tách ngược trong 5 lít dung dịch đệm nói trên Bước ban đầu này là để loại bỏ số lượng lớn các chất điện phân có thể phân tách có mặt trong dịch chiết của

Asp niger Tủa protein mầu nâu tạo thành trong khi thẩm tách được loại bỏ bằng ly

tâm Dịch phái trên có chứa toàn bộ hoạt tính enzym GOD được sử dụng để đưa vào cột Amberlite CG-50 (kích thước cột 50 x 6cm), sử dụng dung dịch đệm natri axetat 0.1M (pH 4,5) Cột được rửa với 4 lít dung dịch đệm natri axetat 0.1M (pH 4,5) để loại bỏ với số lượng đáng kể các chất bẩn Tiếp theo enzym được tách rửa tới một dung dịch mầu vàng bằng dung dịch đệm natri axetat 0.1M (pH 5.0) Protein được kết tủa từ dung dịch mầu vàng bằng việc thêm amon sulphat bão hòa 90% Tủa được tách bằng ly tâm và được hòa tan trở lại trong 50ml đệm natri photphat 0.1M (pH 6.0) Dung dịch này được thẩm tích ngược bằng cùng dung dịch đệm

Dung dịch đã thẩm tích được dùng để chạy qua cột DEAE-cellulose (kích thước

50 x 4 cm) với dung dịch đệm là natri photphat 0.1M (pH 6.0) Cột trao đổi ion được rửa bằng 5 lít dung dịch đệm là natri photphat 0.1M (pH 6.0) Protein mầu nâu với hoạt tính catalaza cao được tách rửa Cuối cùng, DEAE-cellulose được rửa với đệm photphat 0.2M (pH 6.0), theo cách tách rửa này, thu được protein mầu vàng với hoạt tính GOD Dịch mầu vàng được thêm vào một lượng amon sulphat đến độ bão hòa 90% Tủa tạo thành được ly tâm và hòa tan trở lại trong nước, cuối cùng thẩm tách ngược bằng nước

II 6 Ứng dụng của enzym GOD

Dựa trên khả năng sử dụng nguyên tử ôxi để ôxi hoá β-glucoza thành axít gluconic và giải phóng hydro peroxít của GOD, enzym này đã được nghiên cứu sử dụng làm phụ gia hỗ trợ chống ôxi hóa trong bảo quản thực phẩm và đồ uống từ những năm 1950

Hiện nay, enzym GOD thương phẩm đã có mặt trên thị trường phụ gia thực phẩm thế giới Trong danh mục phụ gia thực phẩm được phép sử dụng của FAO, GOD

có số hiệu INS: 1102 mục 14.2.3 với hướng dẫn là chất chống ôxi hóa, bảo quản, hỗ trợ và ổn định cho quá trình chế biến thực phẩm nhờ các đặc tính chủ yếu sau[43]:

- Tạo thành hydro peroxit

- Tạo thành gluconic axit

- Loại bỏ glucoza

- Loại bỏ oxy

II.6 1 Ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm

II 6 1 1 Loại bỏ oxy trong chế biến thực phẩm

Đối với các loại đồ hộp, sau khi ghép nắp bên trong vẫn còn một lượng oxy nhất định Oxy còn sót lại trong thực phẩm đóng hộp có thể gây ra oxi hóa của dầu hoặc sự ăn mòn thành hộp dẫn đến làm hỏng hương và vị của sản phẩm Quá trình này

có thể được hạn chế bằng việc xử lý với GOD và SOD [46]

Ứng dụng chính của GOD là ngăn ngừa phản ứng nâu hóa (Maillard reaction)

Sự có mặt của glucoza trong khoai tây làm cho khoai tây chiên dễ chuyển sang màu nâu, màu nâu có thể được giảm bớt nếu khoai tây được ngâm trong dung dịch GOD trước khi chiên [53]

Việc bổ sung thêm GOD và xylanaza trong suốt quá trình làm bánh mì có thể thay đổi cấu trúc của gluten trong bột mỳ và làm tăng chất lượng, hình thức bên ngoài của bánh mì lên rất nhiều [46] Các loại thực phẩm sấy khô như: sữa bột, cafe rang, nấm men khô còn sống, v.v khi đóng gói và bảo quản đông lạnh rất dễ bị oxy hóa bởi lượng không khí còn lại trong bao bì Bổ sung GOD vào các loại thực phẩm đóng gói trên, phần oxy còn lại có thể được giảm xuống tối đa, hỗ trợ kéo dài chất lượng sản phẩm và thời hạn bảo quản

II.6 1 2 Loại bỏ glucoza khỏi lòng trắng trứng

Glucoza trong lòng trắng trứng là nguyên nhân làm cho sản phẩm bột trứng bị thay đổi mầu sắc và hương vị trong quá trình bảo quản và lưu thông Nếu trong quá trình sản xuất bột trứng, trước khi sấy tạo bột, bổ sung enzym GOD (165 U kg-1) cùng với lượng hydro peroxit (khoảng 0.1 % w/w) thì lượng glucoza có trong trứng tươi sẽ được loại bỏ, chất lượng bột trứng sẽ được nâng cao và ổn định trong quá trình bảo quản [75]

II 6 1 3 Cải thiện chất lượng nước quả

GOD là chất bảo quản có nhiều triển vọng trong công nghiệp sản xuất đồ uống không cồn và nước quả Năm 1997, E.Janser đã ứng dụng GOD để bảo quản dịch ép các loại quả nhiệt đới Đặc biệt là với nước quả đục, chế phẩm enzym sử dụng có thể

ổn định hương cho nước quả

Theo báo cáo trong một sang chế của Châu Âu cho thấy rằng GOD, catalaza và SOD có thể được sử dụng để loại bỏ oxy còn sót lại trong các loại đồ uống Tuy nhiên,

để GOD không bị ức chế thì không được rót nước quả vào chai hay hộp ở nhiệt độ cao [80]

II.6.1.4 Cải thiện chất lượng rượu vang:

Sự nâu hóa của rượu vang do rất nhiều nhân tố gây ra Trong sản xuất rượu vang, rượu bị nâu hóa mạnh do thành phần hợp chất polyphenol bị ôxi hóa dưới xúc tác của hệ enzym oxy hóa trong vỏ nho và các thành phần quả Thông thường, các chất chống ôxi hóa như SO2 được bổ sung vào rượu vang, để ngăn ngừa sự nâu hóa và để bảo vệ hợp chất phenol

Nếu GOD-catalaza được đưa vào rượu vang, với lượng glucoza phù hợp có thể hạn chế được quá trình nâu hóa rượu Để có thể đảm bảo hiệu quả của enzym, nồng độ GOD nên sử dụng từ 20-40 U/l và glucoza 0.1g/100ml [64]; [66]

II.6.1 5 Loại bỏ oxy ra khỏi bia

Trong sản xuất bia, người ta thường dùng GOD để ổn định chất lượng cho bia thành phẩm Một hàm lượng nhỏ chế phẩm này khi đưa vào trong bia sẽ tách hết oxy

có trong chất lỏng và trong khoảng không làm tăng tính chất cảm quan của sản phẩm

từ 50 – 100 ngày [77]

Hệ enzym GOD-catalaza được đưa vào để loại bỏ oxy còn sót lại trong chai bia rất hiệu quả Hệ enzym GOD-catalaza được bổ sung vào trong bia sau khi nấm men đã được tách khỏi bia và hệ enzym này đóng vai trò bảo vệ bia trong quá trình lọc, đóng chai và sau khi đóng chai

II.6.1 6 Bảo quản đồ hải sản tươi sống

Mầu hồng của một số loại hải sản sau tiền xử lý và đông lạnh là rất hấp dẫn, nhưng mầu của tôm rất dễ bị chuyển từ đỏ sang vàng do sự oxy hóa Nếu tôm được ngâm trong dung dịch enzyme GOD và catalaza hoặc bổ sung enzyme vào trong nước muối đóng túi mầu hồng có thể được bảo vệ Việc sử dụng GOD và catalaza tạo ra hydro peoxyt có tác dụng làm chậm sự sinh trưởng của các vi sinh vật trong vòng 5 ngày, giảm sự nâu hóa đến 80% và ức chế sự phát sinh NH3 và nitơ bay hơi tổng số [43] Việc xử lý cá hồi với lượng dung dịch GOD thích hợp, có thể làm chậm quá trình oxi hóa giữ cho cá tươi lâu hơn GOD còn được dùng để ngăn ngừa chất béo của cá khỏi sự oxi hóa, với 0.5U/mL enzym GOD cộng với 1-4mg/mL đường glucoza, tác dụng kháng khuẩn có thể được duy trì mà không gây ra sự giảm pH và kết tủa protein của cá [33]

II.6.1.7 Ổn định chất lượng của mayonnaise

Trong mayonaise ngoài dầu thực vật và nước, các thành phần chính là lòng đỏ trứng sống, muối, nước ép chanh và giấm Trong quá trình đồng hóa, 10-12% không khí (so với tổng thể tích) được đưa vào sản phẩm Thời hạn sử dụng của mayonnaise bị rút ngắn rất nhiều do sự có mặt của oxy Việc bổ sung hệ enzym GOD-catalaza vào mayonnaise thành phẩm, sau 6 tháng chất lượng của mayonnaise xử lý với enzym tốt hơn hẳn mẫu đối chứng không xử lý cả về chỉ số oxi hóa và cảm quan (Xem bảng 4) [43] Axit gluconic tạo thành từ phản ứng xúc tác enzym không ảnh hưởng xấu đến

Bảng 1.4 Ảnh hưởng của việc sủ dụng enzym GOD-catalaza đến sự ổn định chất lượng của mayonnaise [43]

GOD được sử dụng trong y học từ những năm 1950 Do trong quá trình khử

glucoza và giải phóng hydroperoxit có tính kháng khuẩn mạnh nên GOD được sử dụng trong y học [9] Enzym này không những tác dụng lên vi khuẩn Gram dương mà cả

những vi khuẩn Gram âm, thậm chí cả những loài vi khuẩn đã quen với Penecillin

hoặc các chất kháng sinh khác Nhiều nghiên cứu cho thấy GOD có thể làm ức chế

hoặc đình chỉ sự hoạt động của các loài vi khuẩn thuộc giống Staphylococcus,

Streptococcus vi khuẩn lỵ, thương hàn, trực khuẩn đường ruột, những vi khuẩn có giáp

mạc và một số vi khuẩn chịu axit khác [94]

Một thể keo có chứa GOD, LPO và NaSCN được phát hiện là có tác dụng lên virus HSV-1, HIV, lên bạch cầu của tế bào T của người và virus-IIIB GOD có khả năng thu gom ngay lập tức vào trong tế bào lympho, bên cạnh đó GOD còn làm tăng tính thấm của hệ bạch huyết [43] Thậm chí, GOD còn được sử dụng như tác nhân điều trị bệnh ung thư hệ bạch huyết nhờ sự nhậy cảm của nó với H2O2 Ngoài ra, enzym GOD còn được dùng để đánh dấu các kháng thể và để phát hiện các kháng thể đánh dấu của khối u [8] và các kháng thể của virut[9]

Một ứng dụng quan trọng của GOD là chúng được sử dụng trong sản xuất các KIT thử sinh học để định lượng glucoza trong y học và phân tích Thành phần chính của bộ KIT xác định glucoza là GOD và enzym peroxidaza [56]

Hợp chất GOD, lactoperoxidaza (LPO) và iốt có thể được dùng để khử mùi hôi của miệng GOD, lactoperoxidaza (LPO) và potassium thiocynate có thể được dùng để

sản xuất kem đánh răng, nước súc miệng, và kẹo cao su [43]

Mới đây, GOD còn được sử dụng để bảo quản các vật liệu dễ bị oxy hoá ở trạng thái khô bằng “túi khử oxy” Đó là túi chứa glucoza, chế phẩm GOD – catalaza và dung dịch đệm cần thiết Túi được đặt vào thùng (hoặc hộp) chứa sản phẩm, oxy trong thùng (hoặc hộp) sẽ được “túi” này hấp thụ hoàn toàn [15]

CHƯƠNG II NGUYEN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I.1 Vi sinh vật

™ 22 chủng nấm mốc Aspergillus niger trong bộ sưu tập giống vi sinh vật của

Viện Công nghiệp Thực phẩm được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu

• Môi trường giữ giống và thu bào tử (Môi trường PDA) [5]

Dịch chiết khoai tây (*): 1000 ml

Glucoza: 20 g Thạch: 20 g Cách làm (*): Cân 300 g khoai tây, gọt vỏ, thái lạt lựu Cho 1 lít nước ninh trong 1 giờ Lọc bã khoai tây, phần nước thu được là dịch chiết khoai tây

Môi trường được hấp thanh trùng ở 121oC/30 phút

• Môi trường sơ tuyển (Môi trường John Marwell) [44]

NaNO3: 3 g Glucoza: 18 g

K2HPO4: 1g Glycerol: 20 g MgSO4.7H2O: 0,5 g Thạch: 20 g KCl: 0,5 g Methyl Red: 0,01 g FeSO4.7H2O: 0,01 g Nước cất: 1000 ml

pH = 5,6; môi trường được hấp thanh trùng ở 1210C/30 phút (glucoza được thanh trùng riêng ở 1050C/20 phút sau đó được bổ sung vào môi trường trước khi đổ hộp lồng)

• Môi trường xác định hình thái (Môi trường Czapek Dox) [5],[25]

NaNO3: 2 g FeSO4: 0,01 g

KH2PO4: 1 g Sacaroza: 30 g KCl: 0,5 g Thạch: 20 g (có hoặc không) MgSO4: 0,01 g Nước cất: 1000 ml

pH = 5,6; môi trường được hấp thanh trùng ở 1210C/30 phút

• Môi trường nhân giống

• Môi trường sinh tổng hợp GOD (Môi trường cơ bản theo Liu J Z Kí hiệu MT1) [51]

Môi trường được hấp thanh trùng ở 1210C/30 phút

™ Chủng giống nấm men Saccharomyces cerevisiae trong sưu tập giống Viện

Công nghiệp thực phẩm

Môi trường:

- Môi trường phân lập và môi trường bảo quản nấm men malt agar

- Môi trường nhân giống nấm men, môi trường hoạt hoá là nước chiết malt 120Bx

- Môi trường lên men là dịch sirô pha loãng của từng loại quả dâu, nho, dứa, mận

và táo mèo có độ đường từ 18 – 200Bx

- Môi trường giữ giống và bảo quản: sử dụng môi trường phân lập, giống sau khi được phân lập đem bảo quản trong tủ lạnh 40C thời gian 1 tháng

I.2 Nguyên liệu quả:

Nho: Nho sử dụng để lên men các mẫu rượu vang dùng trong thí nghiệm là giống nho

nguyên liệu của công ty THHH Trà Cầu Đất Nho tươi được tách cuống, rửa sạch, tách hạt rồi ép thu dịch

Dâu: Dâu tằm có nguồn gốc Sơn Tây Dâu được làm sạch, xay nhỏ, ép thu dịch

Lạc tiên, dứa: Lạc tiên sử dụng trong nghiên cứu là loại lạc tiên vỏ tím Loại dứa

được sử dụng nghiên cứu trong đề tài này là Cayene

I.3 Chế phẩm enzim GOD

Chế phẩm enzim GOD sử dụng trong nghiên cứu là enzim chế phẩm của đề tài có bổ sung peroxydaza

Chế phẩm enzim GOD của Công ty SHIFA – Trung Quốc

Chế phẩm Maxazyme GOD 4000L của Mỹ

I.4 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

1.4.1 Thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm:

- Tủ cấy vô trùng Esco (Nhật Bản)

- Tủ ấm Sanyo (Nhật Bản)

- Máy lắc Shel Lab (Nhật Bản)

- Máy ly tâm Rotanta 460 (Nhật Bản)

- Máy siêu âm Bandelin (Nhật Bản)

- Máy lắc ổn nhiệt Thermocomfort (Eppendorf, Đức)

- Nồi hấp Tomy SS-325 (Nhật Bản)

- Tủ sấy Sanyo (Nhật Bản)

- Thiết bị khuyếch đại gen GeneAmp® PCRSystem 9700 (Mỹ)

- Cân phân tích Shimadzu BW320D (Nhật Bản)

- Kính hiển vi Nikon (Nhật Bản)

- Thiết bị đo pH (Nhật Bản)

- Thiết bị đo mật độ quang Shimadzu (Nhật Bản)

- Thiết bị cô quay chân không

- Thiết bị li tâm ống

- Chiết quang kế

1.4.2 Dụng cụ

Ống nghiệm, đĩa petri, đũa thủy tinh, bình tam giác (150 ml, 500 ml), pipet

(1ml, 5 ml, 10 ml), pipepman (1000 µl, 200 µl), que cấy, ống falcon, Eppendorf, bình

định mức, ống đong, cuvét, giấy parafin, đồng hồ bấm giây

1.4.3 Hóa chất

Hoá chất Nước/ Hãng SX Hoá chất Nước/ Hãng SX

EDTA (Etilendiamin Tetracetic acid) Nhật FeSO 4 7H 2 O Anh

Kali tartrate Nhật ZnSO 4 7H 2 O Anh

Bộ KIT xác định hoạt lực GOD Ailen Natri axetate Anh

Ciocalteur

Ấn Độ

II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

II.1 Phương pháp hóa sinh, hóa lý:

II.1.1 Xác định hàm lượng chất khô tổng số bằng chiết quang kế

Lọc trong dịch quả và tiến hành đo bằng chiết quang kế, giá trị đọc được là tỷ lệ %

chất khô hòa tan có trong dịch quả (tính theo 0Bx) Đo nhiệt độ của dịch quả để hiệu

chỉnh kết quả về 200C

II.1.2 Xác định pH của dịch quả bằng máy đo pH

Lọc trong dịch quả và tiến hành đo pH của dịch quả bằng máy đo pH để bàn

II.1.3 Xác định hàm lượng axit chuẩn độ được bằng phương pháp chuẩn độ với

NaOH 0,1N

Các mẫu dịch quả hoặc rượu vang trước khi chuẩn độ cần lọc trong và đuổi

CO2 hòa tan bằng cách lắc đều trong 5 phút Sau đó các mẫu được chuẩn độ với NaOH

0,1N tới khi xuất hiện màu hồng nhạt, chất chỉ thị là polyphenolphthalein Trường hợp

màu của mẫu sẫm khó quan sát, cần pha loãng trước khi chuẩn Khi đó kết quả cần

nhân với hệ số pha loãng

Ax - Lượng axit có trong 1 lít sản phẩm, g/l

n - Số ml NaOH 0,1N tiêu hao, ml

1000 - Hệ số chuyển từ ml sang lít

V - Số ml mẫu đem phân tích

II.1.4 Xác định hàm lượng đường tổng số theo phương pháp Nelson-Somogyi II.1.5 Xác định hàm lượng polyphenol tổng số bằng phương pháp Folin-Ciolcateau (Singleton et al., 1999)

a Nguyên tắc

Oxy hóa toàn bộ lượng polyphenol trong rượu vang bàng dung dịch Ciolcateau (hỗn hợp axit phosphotungstic và axit phosphomolybdic) Các axit này sẽ

Folin-bị khử thành các oxit vonfram (W8O23) và oxit molipden (M8O23) có màu xanh

Màu xanh này bị hấp thụ nhiều nhất ở bước sóng 765 nm và cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng polyphenol có trong mẫu

b Tiến hành

Lọc qua màng lọc 0,45µ rồi pha loãng mẫu với tỷ lệ 1 : 10 Sau đó lấy 1 ml mẫu

đã pha loãng cho vào bình định mức 100 ml Cho thêm 60 ml nước cất Cho thêm tiếp

5 ml dung dịch Folin- Ciolcateau và lắc đều trong 30 giây, cho 20 ml Na2CO3 và lắc đều Dùng nước cất định mức tới 100 ml Lắc đều và để yên 2h ở 20ºC để phản ứng đạt trạng thái ổn định

Dùng cuvet 10 mm để đo độ hấp thụ ở bước sóng 765 nm và lấy nước cất để hiệu chỉnh về 0

Để có thể xác định được hàm lượng polyphenol tổng số, cần xác định đường chuẩn polyphenol (quy về axit gallic) Tiến hành như sau: pha các dung dịch axit gallic

có nồng độ từ 0 đến 500mg/l, ví dụ 0, 50, 100, 150, 250, 500mg/l Với mỗi dung dịch này, lấy 1ml cho vào bình định mức 100ml rồi tiến hành như trên

c Kết quả

Từ các giá trị độ hấp thụ của các mẫu chuẩn bị từ các dung dịch axit gallic có nồng độ khác nhau ta vẽ được đường chuẩn sự phụ thuộc của độ hấp thụ với hàm lượng axit gallic Từ đường chuẩn ta suy ra lượng polyphenol tổng số (quy về axit gallic) của mẫu cần phân tích

II.1.6 Xác định màu rượu vang (color density)

Xác định màu theo phương pháp của Mazza et al., (1999)

a Nguyên tắc

Độ hấp thụ của rượu vang đỏ được đo ở hai bước sóng là 520 nm (màu đỏ) và

420 nm (màu nâu hoặc vàng)

b Tiến hành

Lọc mẫu bằng màng lọc 0,45µm rồi đem đo đô hấp thụ ở 2 bước sóng 420nm

và 520nm Nếu màu đậm có thể pha loãng trước khi so màu, khi tính toán cần nhân với

hệ số pha loãng Nếu là nước quả thì dùng mẫu trắng là dung dịch 20% glucoza + 1g

axit tartaric, nếu là rượu vang thì mẫu trắng là dung dịch etanol 10% + 1g axit tartaric

c Kết quả

Cường độ màu = (A420 + A520) x hệ số pha loãng

Cường độ màu thể hiện màu sắc tổng thể của dung dịch khi ta quan sát Cường

độ màu càng lớn thì màu của dung dịch càng sẫm

Sắc thái màu =

520

420

A A

Sắc thái màu càng nhỏ thì màu của dung dịch càng trong và sáng (sắc thái thiên

về màu đỏ) Sắc thái màu càng lớn thì màu của dung dịch càng tối

Trong đó, A420 và A520 lần lượt là độ hấp thụ của mẫu ở 420 và 520nm

II.1.7 Xác định hàm lượng anthocyanin tổng số

Anthocyan tổng số được xác định theo phương pháp chênh lệch pH (Metivier et al.,

1980)

a Nguyên tắc

Dựa trên sự phụ thuộc của màu sắc của anthocyanin vào pH Khi pH ≤ 1 toàn

bộ lượng anthocyanin ở dạng màu đỏ, khi pH ≥ 4,5 toàn bộ anthocyanin ở dạng không màu

b Tiến hành

Lọc mẫu qua màng lọc 0,45µm rồi tiến hành pha loãng 10 lần với cả 2 dung dịch đệm ở trên, trường hợp màu đậm quá có thể pha loãng trước bằng nước cất hoặc pha loãng nhiều lần hơn bằng dung dịch đệm Sau đó đặt ở chỗ tối trong vòng 1 giờ cho màu sắc ổn định Sau đó đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 520nm với mẫu trắng là các dung dịch đệm tương ứng

c Kết quả

Hàm lượng anthocyanin tổng số được tính theo malvidinclorua-3,5-glucozit theo công thức:

TA (Total anthocyanins) = (A520pH 1,0 – A520pH 4,5) x 25,575 x f (mg/l) Trong đó

TA - Hàm lượng anthocyanin tổng số

A520pH 1,0 - Độ hấp thụ ở 520 của mẫu pha loãng 10 lần bằng đệm pH 1,0

A520pH 4,5 - Độ hấp thụ ở 520 của mẫu pha loãng 10 lần bằng đệm pH 4,5

255,75 - Hệ số quy đổi từ giá trị độ hấp thụ thành hàm lượng mg/l

f - Hệ số pha loãng

II.1.8 Xác định hương băng phương pháp sắc kí khí

Điều kiện chạy :

Chiết mẫu bằng kỹ thuật vi chiết pha rắn

- Cân 0,3 mg mẫu vào bình thủy tinh 15 ml có nắp silicon

- Thêm vào 20 l chất nội chuẩn (4-methyl-pentanol) và 0,5 g NaCl

- Cho bay hơi cân bằng ở 10 phút ở 580C

- Chiết bằng sợi vi chiết 10 phút ở 550C

- Bơm vào GC

II.1.9 Xác định độc tố Aflatoxin bằng sắc ký bản mỏng (TLC)

vòng/phút trên môi trường MT1 Sau 3 ngày nuôi ở 300C, độc tố aflatoxin B1, B2, G1,

G2 được kiểm tra bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) dưới ánh sáng huỳnh

quang với marker là aflatoxin B1, B2, G1, G2 chuẩn

II.1.10 Phương pháp xác định lượng protein theo Lowry

Thuốc thử

Thuốc thử A: 20g Na2CO3 được hoà tan trong 1 lit 0,1M NaOH

Thuốc thử B: 0,5g CuSO4 và 1g Potassium tartrate (2C4H4K2O6.H2O) được hoà tan

trong 100 ml nước cất

Thuốc thử C: 50 ml thuốc thử A và 1ml thuốc thử B được trộn đều (thuốc thử này

phải được dùng ngay)

Thuốc thử D: 1 thể tích thuốc thử phenol gốc và 1 thể tích nước cất hai lần được hoà

đều (thuốc thử này phải được dùng ngay)

Tiến hành phân tích

Trong ống phân tích có chứa 0,5 ml dung dịch protein (0,005- 0,1%) và 5 ml thuốc thử

C được trộn đều và giữ yên ở 300C trong 10 phút

Sau đó 0,5 ml thuốc thử D được thêm vào hỗn hợp trên, trộn đều và giữ yên ở 300C trong 20 phút Sau đó OD của mẫu kiểm tra được đo ở 750 nm Nước cất được sử

dụng như mẫu trắng

Xây dựng đường cong protein chuẩn

Thuốc thử Albumin chuẩn được sử dụng như dung dịch protein

Ống albumin chuẩn 1g/l, ống albumin chuẩn ở trên được hoà vào 180 ml nước cất hai lần Nồng độ pha loãng như bảng sau:

A: Nồng độ Protein (mg/ml); C: Nồng độ protein cuối cùng (mg/ml)

Mẫu trắng: Mẫu không có protein

OD của dung dịch albumin với các nồng độ khác nhau ở 750 nm

II.1.11 Phương pháp xác định hoạt lực enzym GOD

Hoạt lực GOD được xác định theo phương pháp của hãng Megazyme [56]

Cách tiến hành:

¾ Chuẩn bị dịch chiết enzym:

- Cân 1g mẫu phân tích hòa với 5ml dung dịch đệm kali dihydro phosphat 1M, pH 7,0

- Tiến hành nghiền bằng phương pháp siêu âm với tần số 80 kHz trong 2 phút

- Ly tâm ở 40C/10000 v/p/10 phút để thu dịch chiết enzym

¾ Dung dịch hóa chất dùng để phân tích:

- Dung dịch đệm kali dihydro phosphat 0,1M, pH 7,0: Hòa tan 13,6 g

KH2PO4 bằng 800 ml nước cất trong bình định mức 1 lít rồi điều chỉnh tới pH 7,0 bằng dung dịch NaOH 2M và thêm nước cất đến thể tích 1 lít

- Dung dịch hỗn hợp peroxidaza và 4-aminoantipyrin (POD): Hòa tan hỗn hợp peroxidaza (128U) và 4-aminoantipyrin (16mg) trong dung dịch đệm kali phosphat (12ml, 1M, pH 7,0) đã được pha loãng trong 150 ml nước cất rồi thêm nước cất tới thể tích 200 ml

- Dung dịch D-glucoza: Hòa tan 4,5 g D-glucoza trong 40 ml nước cất trong bình định mức 50 ml rồi thêm nước cất tới thể tích 50 ml

- Dung dịch mẫu thí nghiệm: GOD đã được pha loãng

- Đọc với đối chứng nước cất

Trình tự cho vào cuvét Mẫu trắng

(Blank)

Mẫu thí nghiệm (Sample)

Trộn đều, đọc sự thay đổi mật độ quang của dung dịch (A 1 ) sau 5 phút

D: hệ số pha loãng (nếu có)

Đường cong chuẩn xác định hoạt lực GOD [2’]

Phương trình đường cong chuẩn xác định hoạt lực GOD đã được xây dựng

chính xác bởi công ty Megazyme có dạng:

mU/0,5ml = (15,4 x ∆A 2 ) + ( 44,7 x ∆A) + 0,03

II.2 Phương pháp vi sinh:

II.2.1 Phương pháp sơ tuyển các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp

GOD [44]

Từ 22 chủng nấm mốc có trong bộ sưu tập giống của Viện CNTP được tiến

hành sơ tuyển: Phân phối môi trường ra các đĩa petri đã vô trùng Khi môi trường đã

đông nguội, cấy chấm mỗi chủng nấm mốc vào chính giữa bề mặt thạch, gói kín đưa

vào tủ ấm 300C cho nấm phát triển Sau 48 giờ lấy ra quan sát vòng phản ứng màu

hồng với chỉ thị methyl đỏ để chọn ra 6 chủng có vòng mầu hồng lớn nhất