nghiên cứu công nghệ sản xuất vắcxin chống dị ứng từ mạt bụi nhà acarien d pteronyssinus (DP) và ứng dụng trong chẩn đoán, điều trị một số bệnh dị ứng hen phế quản, viêm mũi dị ứng, viêm kết mạc nghiên cứu quy trình tác

Các tác giả đã đi sâu nghiên cứu các đặc tính sinh học, hóa sinh, miễn dịch của các dị nguyên nói trên, sử dụng các dị nguyên này trong chẩn đoán và điều trị các bệnh dị ứng đã mang lại

Bộ khoa học và công nghệ Công ty Vaccin pasteur Đà lạt

Báo cáo kết quả đề tài nhánh

KC 10-10/ 06-10/04

“Nghiên cứu quy trình tách chiết và điều chế dị nguyên

mạt bụi nhà Acarien D.pteronyssinus Tại Việt NAm ”

Chủ nhiệm đề tài nhánh: PGS.TS.Nguyễn Hoài An

TS Nguyễn Thị Ngọc Dung

Thời gian thực hiện: 01/07/2007 - 30/03/2009

7598-4 20/01/2010

Hà nội, 05 – 2009

Bộ khoa học và công nghệ Công ty Vaccin pasteur Đà lạt

Báo cáo kết quả đề tài nhánh

KC 10-10/ 06-10/04

“Nghiên cứu quy trình tách chiết và điều chế dị nguyên

mạt bụi nhà Acarien D.pteronyssinus Tại Việt NAm ”

Chủ nhiệm đề tài nhánh: PGS.TS.Nguyễn Hoài An

Ks.Đinh Văn Minh

Hà nội, 05 - 2009

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong mấy chục năm qua, số người mắc bệnh dị ứng có xu hướng tăng nhanh, ở nhiều nước tỷ lệ mắc bệnh dị ứng ở vị trí thứ ba, sau các bệnh tim mạch và ung thư, ở một vài nước nó còn chiếm vị trí hàng đầu, phổ biến nhất

là dị ứng do phấn hoa, bụi nhà, bụi bông và lông vũ Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) tại các nước công nghiệp phát triển, chỉ riêng các thể hen phế quản dị ứng có tới 4-5% viêm mũi dị ứng 15-20% và tổng tần số các trường hợp dị ứng đạt tới 10-15% dân số thế giới

Ngày nay không còn ai nghi ngờ rằng nhiều bệnh dị ứng ( như Hen phế quản atopy, Viêm mũi dị ứng, mày đay, eczema atopy, và nhiều bệnh khác) do tác động của bụi nhà là một trong những nguyên nhân thông thường nhất (Helk et al, 1986; Berardino et al,1987; Plátt-Mills et al, 1987; Bousquet et al, 1988; Saint-Remy et al, 1988)

Để chẩn đoán một bệnh dị ứng, trước hết cần phải xác định nguyên nhân gây dị ứng (một hoặc nhiều DN đặc hiệu) Vì vậy tiến hành test mẫn cảm (sensitivity testing) với các DN điều chế được vẫn là phương pháp chủ yếu để tìm nguyên nhân của bệnh Mặt khác, phương pháp điều trị bằng DN còn gọi

là phương pháp “giảm mẫn cảm đặc hiệu” hoặc “liệu pháp miễn dịch” là phương pháp điều trị hiệu quả, nhất là khi người bệnh phải thường xuyên tiếp xúc với DN Phương pháp này chính là đưa DN vào cơ thể đã mẫn cảm với nó nhằm làm cho cơ thể thay đổi cách đáp ứng miễn dịch : thay đổi cân bằng giữa các quần thể lympho bào T : Th1/Th2 nghiêng về Th1, làm giảm dòng

Th2/Tho đặc hiệu dị nguyên, dẫn tới sự giảm mẫn cảm các tế bào đích (tế bào

dị ứng) mastocyte, basophille làm giảm sự giải phóng các chất trung gian và

do đó hạn chế được các triệu chứng dị ứng Đó cũng là cơ sở của biện pháp tiêm chủng vaccin chống dị ứng

2

Hiện nay, việc điều chế cũng như ứng dụng DN nói chung và DN D.pteronyssinus nói riêng đã được tiến hành ở nhiều trung tâm dị ứng của nhiều nước trên thế giới với nhiều loại DN sản xuất ra mỗi năm, cung cấp cho nhiều nước như allergam, allergen, allerglobulin ở Việt Nam, trong nhiều năm gần đây việc điều chế và đưa vào ứng dụng các dị nguyên bụi nhà, bụi

bông, lông vũ đã được các tác giả Nguyễn Năng An, Nguyễn Văn Hướng, Nguyễn Văn Sửu, Vũ Minh Thục, Phan Quang Đoàn, v.v thực hiện thành

công Các tác giả đã đi sâu nghiên cứu các đặc tính sinh học, hóa sinh, miễn dịch của các dị nguyên nói trên, sử dụng các dị nguyên này trong chẩn đoán

và điều trị các bệnh dị ứng đã mang lại hiệu quả tích cực Song các tác giả chưa đi sâu nghiên cứu thành phần chính có khả năng tạo nên hoạt tính của dị nguyên bụi nhà, đó là các loài mạt có trong bụi nhà và các sản phẩm thải của chúng Bụi nhà chỉ là môi trường sống của mạt Mặt khác, một số kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy sử dụng dị nguyên bụi nhà để điều trị cho bệnh nhân hen phế quản và viêm mũi dị ứng cho kết quả thấp hơn so với dùng dị

nguyên mạt bụi nhà để điều trị

Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nắng, nóng, có độ ẩm cao

Đây là điều kiện thuận lợi cho mạt bụi nhà phát triển, đặc biệt đối với loài phổ

biến như D pteronyssinus

Do đó việc nghiên cứu tách chiết dị nguyên mạt bụi nhà D

pteronyssinus để có thể ứng dụng vào thực tế y học nước ta là một yêu cầu cấp

thiết và có ý nghĩa khoa học

Chúng tôi tiến hành đề tài :

“Nghiờn cứu quy trỡnh tỏch chiết và điều chế Dị nguyờn mạt bụi nhà Acarien D.pteronyssinus tại Việt nam”

Với mục tiêu:

- So sánh các phương pháp điều chế dị nguyên tại Việt nam

- Xây dựng một quy trình điều chế dị nguyên có hiệu quả cao

3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TÌNH HÌNH CÁC BỆNH DỊ ỨNG VÀ VAI TRÒ CỦA CÁC DỊ NGUYÊN

Ngày nay, dị ứng học đã trở thành một lĩnh vực quan trọng của y học không chỉ bởi người ta ngày càng tìm ra nhiều bệnh có cơ chế dị ứng: hen phế quản, viêm mũi dị ứng, mày đay, phù Quinke, dị ứng thuốc, xơ cứng bì mà còn do tỷ lệ người mắc bệnh dị ứng ngày càng gia tăng [1], [8]

Các thống kê dịch tễ học gần đây ở trong và ngoài nước cho thấy, các bệnh dị ứng đường hô hấp trên - chủ yếu là VMDƯ và hen phế quản (HPQ) chiếm tỷ lệ từ 10-15% dân số, tương ứng với 2,5% - 3,5% tổng số người bệnh đến khám bệnh ở mọi chuyên khoa và chiếm một phần đáng kể trong kinh phí dành cho y tế

- Thụy Điển: 25,87% VMDƯ; 8,1% HPQ

- Na Uy: 24,95% VMDƯ; 8,51% HPQ

- Việt nam : 15 - 20% VMDƯ; 5 - 7 % HPQ

- Một số nước Đông Nam Á: VMDƯ ở Thái Lan: 38,63%; Singapore: 39,58%; Indonexia: 41,45% [9], [11], [14], [28], [32], [41], [44]

Giống như phần lớn các môn hóa sinh, lịch sử thuật ngữ dị nguyên quay trở về thời gian khi các dị nguyên phân lập được bằng cách sử dụng một số kỹ thuật tách sinh hóa "kinh điển", và phần hoạt tính (phần lớn có tính dị nguyên) thường được đặt tên theo ý nghĩ chợt nảy ra của nhà nghiên cứu Đã có những

cố gắng sớm để tinh lọc dị nguyên phấn hoa và dị nguyên mạt bụi nhà, sử dụng chiết phenol, kết tủa muối và các kỹ thuật điện di trong những năm 1940-1950 Trong những năm 1960, sự trao đổi ion và môi trường lọc trong gel đã được đưa vào sử dụng, và dị nguyên đầu tiên được tinh lọc là "kháng

4

nguyên E" của cỏ phấn hương Dị nguyên này được King và Norman đặt tên

vì nó ở một trong năm phân đoạn kết tủa (đánh dấu từ A đến E)

Đỉnh cao phát triển đầu những năm 1970 là những nghiên cứu về các kháng nguyên của Marsh, mô tả các tính chất phân tử của các dị nguyên, các yếu tố ảnh hưởng đến tính dị nguyên, đáp ứng miễn dịch với dị nguyên, và các nghiên cứu miễn dịch di truyền của đáp ứng IgE với các dị nguyên phấn hoa tinh lọc Những nghiên cứu đầu tiên của Marsh định nghĩa rõ ràng về một dị nguyên "chính" là một dị nguyên tinh khiết cao gây đáp ứng test da tức thì ở

> 90% bệnh nhân có đáp ứng test da Hiện nay, nói chung một dị nguyên

chính là dị nguyên mà hơn 50% bệnh nhân dị ứng phản ứng với nó

Một dị nguyên chính thường có các tiêu chuẩn sau:

1 Tỷ lệ mẫn cảm > 80% (>2 ng IgE đặc hiệu dị nguyên/mL) ở một quần thể lớn bệnh nhân dị ứng

2 Một tỷ lệ đáng kể IgE toàn phần (>10%) có thể là đặc hiệu dị nguyên

3 Sự hấp thu dị nguyên từ nguyên liệu nguồn làm giảm đáng kể hiệu năng chiết xuất

4 Sự hấp thu huyết thanh bằng dị nguyên tinh khiết làm giảm đáng kể IgE đặc hiệu với chiết xuất dị nguyên

5 Dị nguyên chiếm một tỷ lệ đáng kể protein có thể chiết xuất được trong chất liệu nguồn

6 Có thể sử dụng dị nguyên làm một dấu hiệu đánh giá tiếp xúc môi trường

7 Có thể đo được cả đáp ứng kháng thể và đáp ứng tế bào với dị nguyên trong một tỷ lệ cao bệnh nhân dị ứng

8 Dị nguyên đã chứng tỏ hiệu quả như một phần của một vacxin dị ứng Tài liệu trên thế giới thường xuyên được bổ sung bởi các sách hướng dẫn xem xét toàn diện các vấn đề về dị ứng học Người ta đang thảo luận các điều kiện hình thành các loại tăng độ mẫn cảm khác nhau, các cách chẩn đoán,

5

điều trị và phòng các trạng thái dị ứng Việc giải quyết những nhiệm vụ này phụ thuộc đáng kể vào danh mục và chất lượng của các DN Số lượng các tập chuyên khảo nói về DN như một loại sinh phẩm không nhiều Tuy nhiên, những tiến bộ của dị ứng học ứng dụng, hóa miễn dịch và công nghệ sinh học thường xuyên mở ra những triển vọng mới đối với việc tạo nên các chế phẩm

DN Việc nghiên cứu sâu các thành phần DN phối hợp với những kết quả nghiên cứu lâm sàng cho phép tách các thành phần ít hoạt tính và để lại các phân đoạn chính của DN [23], [25], [32], [41]

Thực tiễn y học đã sử dụng rộng rãi các chế phẩm DN được chiết xuất bởi nước - muối để chẩn đoán xác định tác nhân gây bệnh dị ứng và đặc trị bằng MDĐH Việc mở rộng danh mục các DN đã dẫn tới sự cần thiết phải tiến hành một số lượng lớn các mẫu thử nghiệm chẩn đoán trên da, kết hợp với việc tăng số lượng bệnh nhân đã làm phức tạp công việc của ngành dị ứng học Ngoài ra đi đôi với việc dùng các chiết xuất nước - muối để chữa bệnh đôi khi gây nên các phản ứng quá mẫn tại chỗ, từng vùng và từng hệ thống ở những người mẫn cảm cao, đặc biệt là khi sử dụng các mũi tiêm DN có nồng

độ lớn Thời gian của đợt điều trị cũng là một vấn đề rất quan trọng đối với bệnh nhân, đòi hỏi các bác sĩ lâm sàng phải mất nhiều thời gian chăm sóc Chính vì vậy mà trong thời gian vừa qua đã có nhiều đề xuất về cấu trúc các dạng DN mới Ví dụ, với mục đích chẩn đoán, người ta đã áp dụng các hệ thống hấp thu DN bằng phóng xạ RAST (Radio Allergosorbent Test) và ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) Trong nghiên cứu các thể

DN điều trị, một trong những xu hướng được chú ý là biến đổi những KN làm mất đi khả năng phản ứng với những kháng thể đặc hiệu loại IgE mà vẫn duy trì hoạt tính miễn dịch (hình thành trong cơ thể các kháng thể bao vây loại IgG) Đã có dự tính sử dụng các kháng nguyên với nồng độ nhỏ nhất để chữa bệnh bằng cách nối chúng với các chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu [48], [53], [54], [55], [63], [64], [65]

6

Việc sử dụng an toàn và có hiệu quả các seri DN khác nhau ở một mức

độ đáng kể tùy thuộc vào việc tiêu chuẩn hóa chúng và phương pháp kiểm tra chất lượng Trong các công trình điều chế và tiêu chuẩn hóa DN của Việt Nam, chúng tôi sử dụng phương pháp điều chế DN theo dạng nước - muối Chúng tôi cố gắng phản ánh đầy đủ tình hình hiện nay trong lĩnh vực nghiên

cứu và điều chế DN nói chung, đặc biệt là DN D.pteronyssinus, phát hiện các

đặc điểm lý-hóa, miễn dịch và ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị GMCĐH [9], [11], [15], [39], [40], [63], [83], [93]

1.2 MẠT BỤI NHÀ DERMATOPHAGOIDES PTERONYSSINUS

1.2.1 DỊ NGUYÊN MẠT BỤI NHÀ D.PTERONYSSINUS

Mạt bụi nhà (tiếng Anh - house dust mites, tiếng Pháp - les acariens) được nhà da liễu Scheremetevsky (Nga) phát hiện năm 1876, Bogdanov (Nga

1894) mô tả dưới tên Dermatophagoides scheremetewskji Sau đó, các nhà nghiên cứu ở châu Âu thấy Dermatophagoides pteronyssinus mà đôi khi gọi

chúng là những con mạt nhỏ (Microacariens) ở trên giường, mặc dù chúng sống cả ở trong vải bọc gỗ mềm, tấm thảm và các đồ đạc có vải bọc khác [9], [22], [25], [43], [47], [68]

Tình hình nghiên cứu nước ngoài

Kern (1921), Cooke, Storm van Leeuven (1922) phát hiện phản ứng da dương tính với dịch chiết bụi nhà có mạt trong đó ở các bệnh nhân dị ứng Năm 1925, Varekamp đã thu nhận được chế phẩm từ dịch chiết mạt và thử nghiệm trong lâm sàng dị ứng Tác giả đã chỉ ra vai trò của MBN trong việc gây bệnh dị ứng nhưng chưa khẳng định được tính KN chủ yếu của chúng trong thành phần của bụi nhà Tuy nhiên, mối quan tâm rộng rãi tới nguồn DN gây cảm ứng bệnh chỉ được thể hiện trong nửa sau của thế kỷ XX

Năm 1964, Voorhorst và cộng sự nhận thấy rằng mạt Dermatophagoides

(Bogdanov, 1894) có mặt trong bụi nhà là nguyên nhân gây HPQ; Voorhorst

và cộng sự (1969) kết luận rằng Dermatophagoides pteronyssinus

7

(Trouessart, 1897) là nguồn DN chủ yếu gây bệnh cơ địa dị ứng do bụi nhà

Các tác giả đã chứng minh sự phụ thuộc trực tiếp của tần số phản ứng với chế

phẩm bụi nhà ở các bệnh nhân vào độ bão hòa mạt trong bụi nhà Trong

nghiên cứu này, người ta đã xử lý đặc biệt một trong các phần bụi được thu

thập ở vùng núi cao Thụy Sĩ với số lượng mạt không đáng kể, sau đó làm cho

tất cả mạt đều chết Tiếp theo chia nguyên liệu làm 2 phần, rồi đưa một lượng

nhỏ mạt sống vào 1 trong 2 phần đó Cả 2 phần nguyên liệu giữ trong điều

kiện tối ưu cho mạt sinh sản trong 3 tháng Sau đó tách chiết DN theo cùng

một kỹ thuật Kết quả cho thấy chế phẩm tách chiết từ phần có mạt bụi nhà

sống có hoạt tính KN mạnh gấp 100 lần Nghiên cứu này đã khẳng định cơ sở

tác dụng gây dị ứng của bụi nhà là D pteronyssinus Từ đó các nhà nghiên

cứu hướng vấn đề dị ứng vào MBN [9], [10], [11], [16], [18], [25], [47]

Hàng loạt các công trình nghiên cứu của các tác giả khác trên thế giới đã

chứng minh chính MBN, đặc biệt là loài D pteronyssinus - thành phần quan

trọng nhất của bụi nhà quyết định hoạt tính KN của nó và cho rằng DNBN chỉ

mang tính KN khi có mạt trong bụi [9], [11], [25], [43], [79]

Hình 1.1 Mạt D pteronyssinus

Tình hình nghiên cứu trong nước

NhËn thøc ®−îc vai trß quan träng cña dÞ nguyªn trong chÈn ®o¸n vµ ®iÒu

trÞ, ë ViÖt nam ngay tõ nh÷ng n¨m 1982 c¸c nghiªn cøu cña NguyÔn N¨ng

An, NguyÔn V¨n H−íng vµ Vò Minh Thôc vÒ viÖc ®iÒu chÕ dÞ nguyªn lµ môc

8

tiêu quan trọng hàng đầu giúp cho việc chẩn đoán và điều trị miễn dịch đặc hiệu bằng dị nguyên nhằm giảm thiểu sự gia tăng các bệnh dị ứng: HPQ, VMDƯ, Viêm kết mạc Trong nước, các nghiên cứu từ năm 1980 đến năm

2003 của nhiều nhóm tác giả [2, 6, 8] mới chỉ dừng lại ở dị nguyên bụi nhà toàn phần, dị nguyên lông vũ, dị nguyên bụi bông Sự khẳng định của các công trình khoa học trên thế giới: thủ phạm chính gây nên HPQ, VMDƯ,

Viêm kết mạc do bụi nhà chính là Acarien D pteronyssinus, hoạt tính kháng nguyên của dị nguyên bụi nhà phụ thuộc chặt chẽ vào số lượng Acarien D pteronyssinus có trong bụi nhà Bởi vậy, ngay từ những năm 90 các nhóm nghiên cứu trong nước đã hướng tới việc phân lập, nuôi cấy mạt bụi nhà D pteronyssinus nhưng chưa thành công do chưa nghiên cứu được các môi trường nghiên cứu cho mạt bụi nhà D pteronyssinus tồn tại và phát triển Đến

năm 2003, nhóm nghiên cứu của Labo Miễn dịch dị nguyên thuộc Bệnh viện Tai Mũi Họng TW bước đầu đã nghiên cứu thành công một số môi trường

nuôi cấy đã điều chế dị nguyên D pteronyssinus từ các môi trường này và

bước đầu thử nghiệm trong chẩn đoán và điều trị miễn dịch đặc hiệu trong VMDƯ đã cho kết quả hết sức khả quan từ 75-85% Trên cơ sở những kết quả nghiên cứu ban đầu rất đáng khích lệ này, nhóm nghiên cứu chúng tôi hy vọng rằng được thực hiện đề tài này nhằm xây dựng và hoàn thiện quy trình công

nghệ sản xuất vắc xin dị nguyên D pteronyssinus để phục vụ công tác dự

phòng chẩn đoán và điều trị bệnh dị ứng: HPQ,VMDƯ, Viêm kết mạc do dị

nguyên D pteronyssinus tại Việt Nam

1982 : Nguyễn Năng An, Nguyễn Văn Hướng, Vũ Minh Thục v.v… nghiên cứu về bụi nhà toàn phần

1987 : Vũ Minh Thục, Nguyễn Năng An, Nguyễn Chí Phi : “Nghiên cứu

về thành phần hóa sinh miễn dịch của dị nguyên bụi nhà”

1990 : Vũ Minh Thục : Nghiên cứu về vai trò của mạt bụi nhà trong bệnh dị ứng (Luận văn PTS)

1993 : Nguyễn Văn Hướng và CS nghiên cứu về : “Điều chế, tiêu chuẩn hóa và ứng dụng trong lâm sàng của dị nguyên bụi nhà toàn phần”

1996 : Nguyễn Năng An, Vũ Minh Thục, Phan Quang Đoàn, Lê Văn Khang, nghiên cứu độ mẫn cảm của dị nguyên bụi nhà và hiệu quả điều trị của chúng

9

2001 : Vũ Minh Thục, Phạm Quang Chinh, Lưu Tham Mưu nghiên cứu

điều tra 2 loài mạt bụi nhà gây bệnh dị ứng: D.pteronyssinus và G domesticus

ở Hà Nội và các vùng phụ cận

2002 : Vũ Minh Thục, Phạm Quang Chinh, Đái Duy Ban : “Nuôi cấy mạt

bụi nhà D.pteronyssinus tạo nguồn dị nguyên góp phần chẩn đoán và điều trị

bệnh dị ứng do mạt bụi nhà”

ở nước ta, theo công trình nghiên cứu của Vũ Minh Thục (1990) thấy rằng

Glycyphacus domesticus và Dermatophagoides pteronyssinus là 2 loài D pteronyssinus phổ biến nhất ở Hà Nội Tần số phát hiện chúng trong các mẫu bụi tương ứng là 89,09% và 43,64%, tỷ lệ trên tổng số D.pteronyssinus tương

ứng là 42,3% và 49,0% Số lượng của chúng trong 1g bụi trung bình là 332,76±163,1 và 385,24±220,38 con [4]

Tầm quan trọng của việc nuôi cấy D pteronyssinus là để chủ động tạo

nguồn dị nguyên phục vụ cho việc điều chế, tạo các chế phẩm thương mại - chế phẩm vacxin chống dị ứng (sản phẩm công nghệ sinh học) để ứng dụng trong

chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân dị ứng do mạt bụi nhà D.pteronyssinusở

Việt nam

Việc sử dụng an toàn và có hiệu quả các seri dị nguyên khác nhau ở một mức độ đáng kể tùy thuộc vào việc tiêu chuẩn hóa chúng và phương pháp kiểm tra chất lượng Trong các công trình điều chế và tiêu chuẩn hóa dị nguyên của Việt Nam, chúng tôi sử dụng phương pháp điều chế dị nguyên theo dạng muối – nước Chúng tôi cố gắng phản ánh đầy đủ tình hình hiện nay trong lĩnh vực nghiên cứu và điều chế các dị nguyên nói chung, đặc biệt là dị

nguyên D pteronyssinus phát hiện các đặc điểm lý-hóa, miễn dịch của chúng

để ứng dụng chúng trong chẩn đoán và điều trị miễn dịch đặc hiệu bằng dị nguyên

1.2.2 VAI TRề CỦA MẠT BỤI NHÀ TRONG BỆNH DỊ ỨNG

Khi bạn hỳt bụi, quột, làm sạch bụi nhà vệ sinh nhà cửa (hoặc cú mặt trong lỳc đú) mà bạn bị chảy nước mũi, ngứa mũi và hắt hơi từng hồi, thỡ cú thể là bạn đó dị ứng với một chất nào đú trong bụi nhà Thành phần chớnh

10

xác nào gây ra dị ứng cho bạn có thể được khẳng định bằng phản ứng thử dị ứng tiến hành trên da, hoặc bằng phản ứng huyết thanh của bạn [9], [10], [25] Nếu bạn bị dị ứng với bụi nhà thì những triệu chứng của bạn thường xuất hiện cả trong hoặc ngoài nhà, ở trong nhà thường tệ hơn ngoài trời, và càng ở lâu trong nhà thì lại càng bị nặng hơn Thường thì các triệu chứng dị ứng với bụi thể hiện một cách xấu nhất vào lúc sáng, khi ngủ dậy Ngủ trên một cái giường bẩn hoặc một cái đệm bẩn thì có thể góp phần làm xuất hiện các triệu chứng, cũng như nằm ngủ dưới quạt trần hay quạt quay đi quay lại một cách giao động khiến cho bụi trong nha bay quanh quẩn trong không khí khi bạn đi ngủ Những triệu chứng do một chất nào đó trong bụi nhà gây ra sẽ giảm đi hoặc sẽ mất đi khi bạn đi nghỉ, và sẽ trở nên tồi tệ khi bạn hết kỳ nghỉ trở về nhà [1, 4, 5, 15]

1.2.2.1 Mạt bụi nhà với bệnh dị ứng đường hô hấp

MBN là nguồn DN quan trọng và rất phổ biến trên thế giới Mẫn cảm dị ứng với MBN chiếm 10 – 20% dân số, nhưng biên độ dao động rất lớn, từ 8 – 40% Theo Dutau, MBN chiếm 60 – 70% nguyên nhân gây dị ứng đường hô hấp và tỉ lệ mẫn cảm tăng lên theo tuổi: 11,4% dưới 2 tuổi; 25% từ 2 đến 6 tuổi; 59,1% trên 6 tuổi; 70% trên 16 tuổi Loại mạt thường gặp trong các mẫu

bụi là D pteronyssinus và D farinae, bản chất dị nguyên của chúng là enzym

proteaza [1], [8], [9], [10], [20], [25], [28]

Mức độ mẫn cảm với MBN thường cao, do đó các dịch chiết mạt thậm chí ở nồng độ thăm dò 10-7 có thể gây phản ứng tại chỗ lẫn các phản ứng toàn thân và phản ứng ổ có biểu hiện Tuy nhiên, cần phải nhận thấy rằng bụi nhà khác nhau có thể khác nhau về độ bão hòa mạt Khi phân tích gần 300 mẫu bụi từ các căn hộ bệnh nhân HPQ, mạt được phát hiện ở 30,6% số mẫu bụi Mạt xâm nhập cơ thể bằng con đường hít Người ta phát hiện chúng ở da, đôi khi ở trong nước tiểu và chỗ ẩm ướt [41], [43], [44], [52], [54]

11

Đối với bụi nhà, MBN chiếm hơn 70% tính dị ứng nguyên Vì vậy người

ta đặt vấn đề xem xét lại thuật ngữ “dị ứng với bụi nhà”

Theo Pepys và cộng sự, tần số phát hiện D pteronyssinus trong các mẫu

bụi nhà là hơn 80%

Nhiều nhà nghiên cứu đã phát hiện thành phần khu hệ mạt nhà ở và tỉ lệ

dị ứng do MBN ở các khu vực khác nhau và nhận thấy rằng D pteronyssinus

là loài mạt có hoạt tính gây dị ứng cao phổ biến nhất, chiếm từ 70 – 98% tổng

số mạt phát hiện được Thành phần hệ MBN phụ thuộc nhiều yếu tố khác nhau, chẳng hạn như mùa, vị trí địa lý, đặc điểm khí hậu, điều kiện xã hội và sinh hoạt [1, 19, 56, 57, 59, 73, 74]

Một số nghiên cứu nhận thấy rằng, phụ thuộc vào điều kiện sống của bệnh nhân hoặc các đặc điểm nghề nghiệp của họ mà có những phản ứng dị ứng khác nhau với các loài mạt khác nhau

MBN là nguyên nhân gây các bệnh HPQ, viêm mũi, viêm kết mạc dị ứng Ngoài ra, chúng còn là căn nguyên của bệnh mày đay mạn tính, viêm da

dị ứng Nhiều nhà nghiên cứu đã xác nhận mối liên hệ của các bệnh dị ứng kể

trên với mạt D pteronyssinus

Tỉ lệ mạt trong bụi nhà là yếu tố bệnh căn của HPQ và các bệnh khác, dao động lớn và phụ thuộc vào điều kiện địa lý-khí hậu Ở nước có khí hậu

duyên hải ẩm, sự mẫn cảm với DN D pteronyssinus chiếm 70 – 100% số

trường hợp bệnh nhân HPQ dị ứng Ở nước có khí hậu lục địa khô, tỉ lệ này thấp hơn và dao động từ 14,1 đến 43,2% [1], [9], [10], [11], [20], [22], [25] Tovey và cộng sự đã chứng minh các mẫu phân mạt cũng là một nguồn DNBN quan trọng Kanchurin và cộng sự nhận thấy về hoạt tính, phân mạt không khác so với các chế phẩm từ cơ thể mạt Việc sử dụng ức chế RAST của Stewart và cộng sự đã cho thấy hoạt tính tiềm tàng của dịch chiết mạt nguyên vẹn cao hơn 3 lần so với dịch chiết từ vỏ cuticul của chúng hoặc từ môi trường nuôi cấy chúng [1], [32], [43], [46], [65]

12

Ở các nước khác nhau, có 14 - 100% số bệnh nhân dị ứng cho thử

nghiệm da dương tính với DN mạt Dermatophagoides sp do đó ở các nước

trên thế giới, đang tiến hành nghiên cứu vấn đề dị ứng với MBN

Sự mẫn cảm với DN mạt xảy ra chủ yếu bằng đường mũi Khi giũ đồ trải giường, quét dọn phòng, các DN mạt lọt vào đường hô hấp Lúc này những thành phần mạt khô và bị hủy hoại bay lên và được hít vào cùng với không khí Hoạt tính của DN mạt tỉ lệ thuận với thành phần mạt trong nó Khi giảm hoặc loại trừ được MBN khỏi môi trường chung quanh bệnh nhân, tính phản ứng của phế quản giảm, mức KT đặc hiệu IgE giảm, IgG tăng, tình trạng của bệnh nhân được cải thiện [1], [80], [82]

Tính đặc hiệu DN của các loại bụi khác nhau là một vấn đề rất quan trọng Ado cho rằng bụi nhà có tính chất DN đặc hiệu

Có tác giả cho rằng có thể sử dụng các DNBN nguồn gốc khác nhau để chẩn đoán dị ứng với bụi nhà Tác giả đã dùng DN từ bụi phân lập ở nước họ (Mỹ) để nghiên cứu dị ứng đối với bụi ở bệnh nhân của nước khác (Đức) Kết quả cho thấy 69,1% số trường hợp có kết quả thử nghiệm da dương tính với các DN này Tuy nhiên, cho đến nay chưa có ý kiến thống nhất về khả năng

sử dụng DNBN chuẩn để phát hiện bệnh dị ứng ở các nước Vấn đề này rất quan trọng đối với dị ứng học thực hành, đặc biệt, nếu chú ý đến ý kiến của Ado cho rằng bụi có tính đặc hiệu đối với từng bệnh nhân Khi nghiên cứu tính chất DN của bụi có nguồn gốc khác nhau, Ado và cộng sự nhận thấy ý nghĩa của “bụi cá nhân” trong bệnh sinh HPQ

Nhiều tác giả cho rằng ngoài con đường hít còn có thể có con đường tổn

thương do tiếp xúc với mạt D pteronyssinus Chẳng hạn, các nhà nghiên cứu Nhật Bản chỉ ra rằng giống mạt Dermatophagoides có thể đóng vai trò bệnh sinh của mày đay Các tác giả đã tiến hành thử nghiệm dưới da với DN D pteronyssinus và D farinae ở 138 bệnh nhân mày đay mạn tính Đã phát hiện phản ứng dương tính với D pteronyssinus ở 37 bệnh nhân (26,8%), còn với

13

D farinae – ở 68 bệnh nhân (40,3%) Titova và cộng sự, Kanchurin,

Vaitsekauskaite đã chỉ ra vai trò của mạt trong bệnh căn mày đay, chứng

minh sự mẫn cảm với D pteronyssinus ở những bệnh nhân mày đay bằng các

thử nghiệm da và phản ứng phân hủy tế bào mast gián tiếp

Đã có những tài liệu nói về vai trò bệnh căn của MBN trong các bệnh da

dị ứng của người như viêm da dị ứng và viêm da thần kinh

Kể từ khi Voorhorst R (1964) chỉ ra vai trò của MBN trong việc phát sinh HPQ dị ứng, đến nay nhờ tạo ra được các KT đơn dòng người ta đã đo được số lượng DN trong môi trường sống, mức độ DN có thể gây mẫn cảm cũng như mức độ DN dẫn đến xuất hiện triệu chứng bệnh lý

Các hạt phân của mạt chứa phần lớn DN Der p I, có kích thước trung

bình 20 µm, trong đó 4% Der p I có kích thước dưới 5 µm có thể được hít thẳng vào phổi DN MBN có hoạt tính enzym, do đó làm tăng tính thấm của hàng rào biểu mô đường hô hấp Các phần tử DN này có nhiều trong bụi của vải bọc nệm giường, chăn, gối, thảm Khi quét dọn hoặc giũ các đồ đạc trên, chúng lơ lửng trong không khí khoảng 20 – 30 phút Đối với DN có kích cỡ lớn sẽ bị giữ lại ở niêm mạc mũi, còn DN có kích cỡ nhỏ đi thẳng vào phổi Tại các nơi đó, DN sẽ gây nên bệnh cảnh lâm sàng

Phần lớn các báo cáo đều cho thấy mức độ DNBN gây mẫn cảm là 2 µg/g bụi mịn (tương đương số mạt hơn 100 con/g) và mức độ gây xuất hiện triệu chứng bệnh lý là 10 µg/g bụi mịn (tương đương hơn 500 con/g)

Theo Platts-Mills và cộng sự, liều 2 µg/g bụi mịn của Der p I gây mẫn cảm, còn Dreborg chỉ ra liều 10 µg/g bụi mịn gây cơn hen cấp ở người mẫn cảm Nghiên cứu của Sporile và cộng sự ở Anh cho thấy nồng độ DN mạt trong bụi nhà của những đứa trẻ bị hen cao hơn nồng độ DN ở nhà những đứa trẻ khỏe mạnh Trẻ sơ sinh nếu sớm tiếp xúc với môi trường có nồng độ hơn

10 µg Der p I /g bụi sẽ xuất hiện bệnh hen trong 10 năm đầu

14

Mức độ biểu hiện bệnh cảnh lâm sàng của cá nhân có cơ địa mẫn cảm (atopy) tiếp xúc với môi trường có DN phụ thuộc vào các yếu tố:

+ Độ mẫn cảm của từng cá nhân Liều lượng chung gây mẫn cảm và

biểu hiện dị ứng là 2 - 10 µg/g, một vài nghiên cứu cho thấy với liều DN mạt

từ 1 – 2 µg/g đã gây mẫn cảm ở một số trẻ nhỏ Ở môi trường có nồng độ DN thấp chỉ có cơ địa rất mẫn cảm mới thể hiện, môi trường có mức độ DN cao thì ngay cả người có cơ địa mẫn cảm yếu có thể bộc lộ triệu chứng của bệnh

+ Thời gian tiếp xúc Với liều DN thấp nhưng nếu tiếp xúc hàng ngày,

thường xuyên cũng làm xuất hiện triệu chứng ở người mẫn cảm Nghiên cứu của Ihre và cộng sự cho thấy nếu hít hàng ngày trong 1 tuần với liều DN rất thấp (dưới 1 mg/ngày hoặc dưới 1 pg/phút) sẽ tăng phản ứng phế quản

Mức độ DN mạt trong không khí thay đổi theo mùa và ảnh hưởng bởi sự thông khí, nhiệt độ, độ ẩm nên mức độ mẫn cảm và triệu chứng của bệnh cũng thay đổi theo

Ở nước ta, theo Nguyễn Năng An , Nguyễn Văn Hướng, Vũ Minh Thục,

dị nguyên mạt bụi nhà chiếm vị trí lớn trong bệnh căn HPQ, Viêm mũi dị ứng

và nhiều bệnh dị ứng khác Các nghiên cứu trong nước đã chú ý tới vai trò

mạt thuộc họ Pyroglyphidae, trong đó D pteronyssinus – một loài MBN

thường gặp ở nước ta có ý nghĩa to lớn Có thể là do độ ẩm không khí cao gần như quanh năm, số ngày sương mù nhiều, nhiệt độ trung bình hàng năm tương đối cao đã tạo điều kiện thuận lợi cho mạt phát triển ở nước ta và làm cho vấn đề dị ứng với MBN ngày càng trở nên quan trọng Tuy nhiên, các công trình nói trên mới chỉ đánh dấu bước khởi đầu trên con đường nhận thức vai trò của MBN trong bệnh căn và bệnh sinh của các bệnh dị ứng ở nước ta

1.2.2.2.Vai trò của dị nguyên mạt trong cơ chế bệnh lý (quá mẫn typI)

a Cái gì trong bụi nhà đã gây ra dị ứng:

Một cuộc tranh cãi đã nổ ra trong nhiều năm tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới là chỉ một chất kháng nguyên đặc biệt duy nhất có trong bụi nhà

15

gây ra dị ứng, hoặc triệu chứng do dị ứng gây ra có thể quy cho một trong những chất đã được thừa nhận là có trong bụi đáng nghi ngờ nhất, đó là những con mạt trong bụi nhà Tuy nhiên, mọi thành phần trong bụi nhà đều có thể là nguyên nhân của những triệu chứng, các loại côn trùng khác và phân của chúng, nhất là con gián, cũng như những mảnh vụn ở lông, da của các con vật nuôi trong nhà (chó và mèo) Thật là không may vì nhiều người có cơ địa

dị ứng lại thường dễ bị cảm ứng với nhiều thành phần trong bụi nhà của họ

Họ có thể phản ứng với mạt bụi nhà, bào tử nấm, phấn hoa và nước tiểu của mèo [9], [11], [77], [78], [79], [80]

b Thành phần nào của mạt bụi nhà gây ra dị ứng:

Người bị dị ứng với hạt tròn phân mạt Một con mạt sản ra một lượng khoảng 200 lần trọng lượng cơ thể nó, hạt tròn phân mạt chứa tiềm năng gây

dị ứng cao chỉ có trong thời gian ngắn ngủi của cuộc đời nó Khi thải ra ngoài, được không khí mang đi khi các vật dùng như thảm đệm, các đồ đạc.v.v bị xáo lộn Với kích thước siêu nhỏ (phải nhìn qua kính hiển vi mới thấy) những tiểu thể trên rất dễ hít vào mũi và phổi, ở đó nó làm khởi phát triệu chứng dị ứng, mật độ quần thể bọ sống trong nhà quyết định mức độ vấn đề mà bạn phải đương đầu với những tiểu thể phân chúng Mặc dù xác những con bọ chết có thể được khống khí mang đi, nhưng chúng không góp gì đáng kể cho việc bị dị ứng với MBN [77], [78], [79], [80], [82]

c Cơ chế bệnh lý

+ Giai đoạn mẫn cảm: DN lần đầu tiên xâm nhập vào cơ thể mẫn cảm

tạo ra các kháng thể IgE đặc hiệu với DN (chưa có biểu hiện lâm sàng)

+ Giai đoạn tức thì: xảy ra trong 10 – 15 phút khi cơ thể tiếp xúc lại với

DN đã gây mẫn cảm Các triệu chứng như hen, ngạt mũi là do kết quả gắn kết giữa IgE và DN làm hoạt hóa tế bào mast ở niêm mạc mũi Các chất trung gian hóa học giải phóng ra từ các hạt trong tế bào như histamin, tryptaza Các chất trung gian mới hình thành có nguồn gốc từ màng tế bào như leucotrien,

16

prostaglandin Các chất trung gian có nguồn gốc lipit như yếu tố hoạt hóa tiểu cầu cũng xuất hiện Các chất này gây giãn mạch, tăng tính thấm thành mạch dẫn đến phù nề, ngạt mũi Các tuyến nhầy mũi tăng tiết Các dây thần kinh hướng tâm bị kích thích làm ngứa mũi, hắt hơi Các chất trung gian, đặc biệt

là histamin, kích thích sợi thần kinh hướng tâm và sợi trục giải phóng các nơropeptit tại chỗ (chất P và tachykinin) Những chất này lại kích thích tế bào mast thoát hạt Ngoài ra, DN làm lympho bào T (CD4+Th0) hoạt hóa thành lympho T (CD4+Th2)

+ Giai đoạn muộn: xảy ra từ 2 – 48 giờ Đáp ứng tế bào chiếm ưu thế do

sự tương tác giữa các tế bào dưới ảnh hưởng của các cytokin Tính chất đặc trưng của HPQ, VMDƯ là sự tích tụ tại chỗ các tế bào viêm như lympho TCD4, eosinophil, basophil, nơrophil Trong đó, eosinophil giải phóng ra một lượng rất lớn các protein cơ bản gây độc tế bào biểu mô đường hô hấp và sự

có mặt của các ion kích thích tế bào mast thoát hạt

Các biểu hiện trên đều do các cytokin điều biến Ngoài các tế bào lympho T, cytokin còn tiết ra từ các tế bào mast, basophil, đại thực bào và tế bào biểu mô IL-4 kích thích lympho B tăng sản xuất IgE, tăng bộc lộ các phân tử kết dính (ICAM) ở thành mạch để thu hút eosinophil đến mô tổ chức, chuyển lympho Th0 thành lympho Th2, bộc lộ các thụ thể IgE có ái lực thấp (CD23), ức chế tạo thành IFNγ, kích thích tế bào mono biệt hóa thành tế bào trình diện kháng nguyên IL-13 kích thích lympho B sản xuất IgE, bộc lộ thụ thể IgE có ái lực thấp (CD23), hoạt hóa tế bào nội mô bộc lộ phân tử kết dính

để thu hút các tế bào viêm tới tổ chức IL-5 có đặc tính chọn lọc đối với eosinophil, gồm kích thích biệt hóa và trưởng thành của các eosinophil từ tủy xương, hoạt hóa các eosinophil và làm tăng thời gian sống của nó ở tổ chức

17

Hỡnh 1.2 Vai trũ của dị nguyờn MBN trong cơ chế bệnh lý

1.3 QUY TRèNH ĐIỀU CHẾ DỊ NGUYấN

Nhận thức được vai trò quan trọng của các loại dị nguyên đối với bệnh dị ứng, nhiều tác giả đã tiến hành nghiên cứu và công bố các kết quả trong việc điều chế dị nguyên

1.3.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu cho chiết xuất DN mạt có thể là cơ thể mạt thuần khiết hoặc

hỗn hợp nuôi cấy Lần đầu tiên, Chapman đã tinh chế dị nguyên từ mạt D pteronyssinus nuôi cấy Lind đã tinh chế và mô tả đặc điểm của hai dị nguyên chính từ phân mạt D pteronyssinus và từ hỗn hợp nuôi cấy chúng Các tác giả

khác cũng tách chiết dị nguyên từ hỗn hợp mạt nuôi cấy [29] Theo Ipsen và cộng sự, lợi thế của dịch chiết hỗn hợp nuôi cấy là chứa tất cả những nguyên liệu mà bệnh nhân dị ứng với mạt gặp phải trong môi trường tự nhiên, trong khi lợi thế của dịch chiết mạt thuần khiết (mạt được tách riêng) là tránh được nhiễm các thành phần của môi trường nuôi cấy Dịch chiết hỗn hợp nuôi cấy bao gồm các chất từ cơ thể mạt, trứng, ấu trùng, các hạt phân, các chất phân hủy của mạt và cả các chất ô nhiễm của môi trường nuôi cấy Dịch chiết mạt thuần khiết chỉ chứa các chất chiết xuất từ cơ thể mạt Nồng độ tương đối của

1.3.2 Tách chiết dị nguyên

Khi tách chiết dịch chiết DN phải chú ý dịch chiết không phải là một dung dịch, trong đó có một lượng chất hoạt động nhất định hòa tan mới đánh giá

được những khó khăn về sau của chuẩn hóa Quá trình này không được làm

biến tính protein DN, cũng không được làm thay đổi tỉ lệ giữa các thành phần riêng Sự chiết xuất cần phải thực hiện trong điều kiện (pH, lực ion) tương tự với trạng thái sinh lý và ngăn chặn sự thủy phân, sự phát triển của vi sinh vật

Do đó, chiết xuất phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp (cản trở sự thủy phân) và

có thể có các chất diệt khuẩn và diệt nấm [38, 40]

Khái niệm dịch chiết dị nguyên

Hơn 90 năm làm chúng ta xa dần các công trình cổ điển của Noon L (1911)

và Freeman I (1911) về thu nhận các dị nguyên từ phấn hoa thực vật để chẩn

đoán và điều trị bệnh nhân bị sốt cỏ khô Đây là thời kỳ khi mà chưa một nhà lý thuyết và lâm sàng nào biết bản chất cơ sở hoạt tính của những chế phẩm họ sử dụng Các nghiên cứu của Coca A (1925) đã góp phần vào việc vạch ra phương pháp thu nhận dị nguyên Trong những thông báo của ông có những dữ liệu còn giữ nguyên giá trị cho đến ngày nay Chẳng hạn, ông chỉ ra rằng nếu bản chất của cơ chất gây dị ứng chưa biết mà sử dụng phương pháp xử lý thô nguyên liệu

là không hợp lý, nên hạn chế bởi chiết xuất đơn giản bằng dung dịch đệm hoặc nước Để làm giàu các hợp phần có hoạt tính của dịch chiết, ông đưa ra giai

đoạn cô đặc nguyên liệu trong thiết bị chân không ở nhiệt độ thấp Coca A nhận thấy dịch chiết bình thường chứa cả các sản phẩm không cần thiết để chẩn

đoán, do đó đề nghị tiến hành thẩm tách, bởi vì các hợp phần có hoạt tính gây

Nước cất (đun sôi trước khi dùng để loại bỏ CO2) đến 1 lít

Thứ hai: dung dịch nước phenol 4% Trong nghiên cứu của Coca, chúng

ta thấy cả phương án bổ sung glycerol vào dịch chiết chính để ổn định hoạt tính của chế phẩm Theo các tài liệu, các dị nguyên trong hỗn hợp với glycerin

đựng trong lọ thủy tinh tối màu giữ được hoạt tính đến 7 năm Ngày nay người

ta ít dùng dạng hỗn hợp với glycerin

Công nghệ hiện đại thu nhận dị nguyên theo phương pháp Coca gồm

7 giai đoạn chính:

1 Thu nhận nguyên liệu và chuẩn bị tách chiết Đối với các dị nguyên

khác nhau giai đoạn chuẩn bị không giống nhau Trong trường hợp này, nguyên liệu (bụi nhà) thu gom những thành phần có hoạt tính (mạt), trường hợp khác loại bỏ dầu mỡ

2 Chiết xuất và lọc Tiến hành chiết xuất trong điều kiện lắc Đối với

phấn hoa thực vật hoàn thành quá trình này trong thời hạn ngắn hơn (2 ngày

đêm) Chiết xuất bụi nhà và biểu bì động vật có thể kéo dài đến 3 - 4 ngày

đêm Tiến hành chiết ở nhiệt độ < nhiệt độ phòng để ngăn ngừa vi khuẩn phát triển Khử dầu mỡ nguyên liệu cũng làm giảm mức độ nhiễm khuẩn Nếu kỹ thuật dự tính khử dầu mỡ dịch chiết thì cho vào đệm chiết ete dietylic 1%, nó

sẽ bị loại bỏ trong quá trình làm đông khô Khoảng thời gian giữa chiết xuất

và lọc cần phải tối thiểu Dịch chiết được lọc hoặc quay ly tâm, phải có giá trị

pH 6,9 ± 0,3

Trên cơ sở thực tế phổ biến, các kết quả nghiên cứu của Kauffman H và CS (1985) thật thú vị Sau khi đánh giá điều kiện chiết xuất mạt bụi nhà trong dung dịch đệm nhẹ, các tác giả đi đến kết luận liệu pháp chiết phải nhanh chóng, không quá 1 giờ, bởi vì trong thời gian tiếp theo, mặc dù lượng sản phẩm phong bế IgE tăng nhưng hoạt tính của chúng giảm và lúc đó các chất vô ích sẽ tích lũy

3 Thẩm tách dịch chiết Giai đoạn này loại bỏ các thành phần phân tử

20

lượng thấp, các sắc tố, sự có mặt của chúng là không mong muốn (có thể là những phản ứng da không đặc hiệu và làm chậm sự hình thành phản ứng đặc hiệu) Khi cần thiết nhờ thẩm tách mà làm tăng nồng độ protein trong dịch chiết DN

4 Khử trùng dịch lọc Dùng bộ lọc Zeits, nến gốm hoặc màng lọc Lựa

chọn đúng điều kiện tiệt trùng có ý nghĩa lớn để đảm bảo protein toàn phần mất mát ít nhất và giữ được tính đặc hiệu cơ chất

5 ổn định dịch lọc ở 4±20C có thể bảo quản dịch lọc lâu dài (3-6 tháng) với mục đích ổn định hoàn toàn tính chất vật lý của chúng

6 Thu nhận chế phẩm Hòa tan dịch lọc đến nồng độ yêu cầu và rót vào

DN bằng axeton [8, 59]

Trong kết quả nghiên cứu của mình được công bố vào năm 1957, Scoville

đã đưa ra một quy trình chung để tách chiết các loại DN Theo tác giả, nguyên liệu để tách chiết DN được làm nhỏ và loại chất béo trước giai đoạn chiết để nâng cao hiệu quả chiết xuất Để loại chất béo tác giả đã sử dụng một số dung môi hữu cơ như: ete, toluen, xylen Tác giả đã sử dụng các dung dịch đệm có

pH 8 để làm dung môi chiết Sau khi được tinh chế, điều chỉnh tới nồng độ thích hợp, dịch chiết được diệt khuẩn

Richard Shough cũng đưa ra một quy trình chiết xuất DN tương tự Scoville nhưng có cải tiến đôi chút Trong giai đoạn loại chất béo, tác giả đã sử dụng hai loại đệm: đệm salin và đệm Coca mà thành phần chính là hệ đệm photphat

21

Như vậy, các tác giả tuy đưa ra phương pháp khác nhau để tách chiết DN nhưng tất cả các phương pháp này đều trải qua các giai đoạn chính, đó là: loại chất béo, chiết xuất và tinh chế

Thời gian cần thiết để thu nhận dịch chiết thường khoảng giữa biến tính của chế phẩm và sản lượng mong muốn Khi nghiên cứu ảnh hưởng của thời

gian chiết xuất đến việc tách các DN, Geissler và cộng sự nhận thấy các

protein, gluxit và các chất DN tách ra ngay nhưng có động học không giống nhau Trong thời gian 48 giờ, các DN chính được tách ra không ngừng Hoạt tính gây dị ứng chung của dịch chiết đạt điểm cao sau 4 – 5 giờ chiết rút [57, 58]

Theo Ipsen và cộng sự, điều quan trọng là giảm thiểu các chất phi KN có

KLPT thấp ≤ 3000 đến 5000 Da khỏi dịch chiết cuối cùng Có thể thực hiện

nhiệm vụ này bằng thẩm tách, siêu lọc hoặc sắc ký loại bỏ theo kích thước Dịch chiết cuối cùng cần được bảo quản ở nhiệt độ duy trì hoặc giảm thiểu hư hỏng hoạt tính DN bằng cách làm đông khô dịch chiết hoặc cất giữ ở nhiệt độ thấp (- 200 C đến – 800 C), có thể có các chất làm ổn định (glyxerin, albumin huyết thanh người) Môi trường chiết xuất được sử dụng rộng rãi là hệ đệm (pH 6 đến 9, lực ion 0,05 đến 0,2) Nói chung, dung môi khô nên hạn chế dùng vì nguy cơ làm biến tính protein

Mặc dù có nhiều phương pháp thu nhận DN được đề xuất, nhưng nhiều chi tiết về tách chiết DN từ mạt không được mô tả, chẳng hạn, vấn đề tách KN chủ yếu khỏi hỗn hợp môi trường dinh dưỡng, nhất là khi người ta dùng những chất có hoạt tính KN (ví dụ móng ngựa) để nuôi mạt

Từ những nguyên liệu dị nguyên gốc dịch chiết dị nguyên được điều chế dưới dạng dung dịch mẹ, từ đó chế ra dung dịch nước để phục vụ cho chẩn

đoán và điều trị thể hiện bằng sơ đồ sau:

22

+ Có 2 “sơ đồ” sản xuất dù sử dụng một hoặc vài nguyên liệu DN:

- Hoặc sản xuất các dung dịch mẹ đông khô → từ đó chế ra dung dịch nước và dung dịch tác dụng chậm được hấp phụ trên photphat canxi

- Hoặc sản xuất các dung dịch mẹ tác dụng chậm được hấp phụ trên hydroxit nhôm

Phần lớn các dịch chiết DN thu được bằng chiết xuất nguyên liệu sinh học với dung dịch Ví dụ NH4HCO3, NH4OH, các dung dịch muối photphat

23

1.3.3 SƠ ĐỒ SẢN XUẤT (SƠ ĐỒ TỔNG QUÁT)

Sơ đồ 1.1: Sơ đồ sản xuất

Cân nguyên liệuChiết xuất Lọc trong

Lọc tiệt trùng

Kết tủa trên gel Al(OH)3

Rửa gel

Ổn định gel Phân chia

Đóng lọ, bọc nútDán nhãn

Dự trữ

Dung dịch mẹ đông khô Dung dịch mẹ (10.000 PNU/ml)

Đông khô Đông khô

24

1.3.4 ĐIỀU CHẾ DỊCH CHIẾT CHUẨN

Các giai đoạn điều chế dịch chiết chuẩn được trình bày chi tiết ở sơ đồ 2

SƠ ĐỒ ĐIỀU CHẾ KIỂM TRA

- Thao tác (bằng tay) dịch chiết DN, kiểm tra nguyên liệu

- Độ trong của dung dịch, kiểm tra các sản phẩm trung gian

- Kiểm tra thời gian, t0 chiết xuất

- Kiểm tra độ trong của dịch chiết thu được

- Kiểm tra thể tích

- Kiểm tra manitol

- Kiểm tra thể tích

- Độ trong của dung dịch

- Kiểm tra độ nguyên vẹn của màng tiệt trùng

- Kiểm tra t0 của phòng lạnh

- Kiểm tra t0, thời gian của khâu tiệt trùng

- Làm khớp sau khi kiểm tra ức chế RAST

- Đăng ký đông khô

- Kiểm tra t0, thời gian tiệt trùng

- Trong ni tơ

- Sự tương hợp (phích đóng gói)

- Kiểm tra t0 phòng lạnh

- Sự tương hợp (phích đóng gói)

Sơ đồ 1.2: Sơ đồ điều chế dịch chiết chuẩn

Cân nguyên liệu

Chiết xuấtLọc trongSiêu lọc

Làm ổn định thể tích theo RAST

Bổ sung manitolChiết xuất tiệt trùng

Dự trữ

Phân chiaĐông khô

Đóng nútDán nhãn

Dự trữĐóng gói

Điều chế dịch để chiết

Rửa và tiệt trùng lọ

Rửa và tiệt trùng nút

25

Ch−¬ng 2 §èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Vắc xin dị nguyên mạt bụi nhà D pteronyssinus (là chất chiết chuẩn của mạt bụi nhà D.pt đó được nuôi cấy trong phũng thí nghiệm )

- Xây dựng quy trình điều chế văc xin dị nguyên D pteronyssinus

2.2 Phương pháp điều chế

2.2.1 Vật liệu thô

Vật liệu chính của chế phẩm vắc xin là dị nguyên mạt, sinh ra từ quá trình nuôi mạt

Mạt sử dụng trong sản xuất là Dermatophagoides pteronyssinus (D.pt)

2.2.2 Môi trường nuôi

Dermatophagoidespteronyssinus được làm môi trường : nấm men saccharonyces cereivisiae, thức ăn tổng hợp (chế biến từ bột ngô, gạo, đậu

tương, bột cá, cám gạo, khô dầu lạc, polyvitamin, trứng gà) tỷ lệ 1:1

2.2.3 Nuôi cấy mạt

Dermatophagoides pteronyssinus đựơc nuôi trong điều kiện: nhiệt độ

25 , độ ẩm 70-80% ở trong bóng tối Đảo trộn môi trường nuôi theo chu kì

và tính toán số lượng mạt và quan sát tình trạng sinh trưởng của nó

2.2.4 Thu dị nguyên mạt

Chu kì nuôi không nhỏ hơn 4 tháng Khi số lượng mạt ít nhất đạt 5000/gam môi trường, độ thuần khiết là ≥ 90%, tiến hành thu các dị nguyên mạt

26

2.2.5 Thu bán thành phẩm

Ngâm các dị nguyên mạt trong ether để tẩy nhờn, làm khô chất rắn đã tẩy nhờn cho đến khi hết mùi và cân nó Trộn chất rắn trên với dung dịch đệm muối nước Photphat theo Coca hoặc amonisulphat theo A.D.Ado trong 72 giờ, khuấy ở nhiệt độ 4OC Sau đó lọc bằng giấy lọc, ly tâm 3.500 vòng/phút, lọc thanh trùng ta thu được dịch chiết chuẩn của dị nguyên mạt

Để chọn lọc phương pháp nào có hiệu xuất điều chế cao, chúng tôi tiến

hành tách chiết dị nguyên theo phương pháp Ad Ado (là phương pháp đã áp dụng để tách chiết dị nguyên bụi nhà ở Việt nam trước đây) và áp dụng

phương pháp tách chiết dị nguyên của Coca kết hợp với phương pháp Sutherland, có cải tiến của Khoa Miễn dịch – Dị nguyên, Bệnh viện Tai Mũi Họng Trung ương

nguyªn MBN theo Ad Ado

Khử chất béo bằng ete, tỷ lệ 1:5

Nghiền bằng cối nghiền tế bào

Chiết xuất bằng đệm Coca, pH 7,0 (1g sản phẩm nghiền : 10 ml Coca) trong 24 giờ, 40 C

Tạo tủa bằng benzoat natri (40g benzoat natri : 1 lít nước nổi) Dùng HCl 2N dẫn pH đến

Hòa tan cặn bằng axeton lạnh (tỷ lệ 1:5), lắc đều Tạo tủa