2.2. Phương phỏp điều chế
2.2.1. Vật liệu thụ
Vật liệu chớnh của chế phẩm vắc xin là dị nguyờn mạt, sinh ra từ quỏ trỡnh nuụi mạt.
Mạt sử dụng trong sản xuất là Dermatophagoides pteronyssinus (D.pt)
2.2.2. Mụi trường nuụi
Dermatophagoidespteronyssinus được làm mụi trường : nấm men
saccharonyces cereivisiae, thức ăn tổng hợp (chế biến từ bột ngụ, gạo, đậu tương, bột cỏ, cỏm gạo, khụ dầu lạc, polyvitamin, trứng gà) tỷ lệ 1:1
2.2.3. Nuụi cấy mạt
Dermatophagoides pteronyssinus đựơc nuụi trong điều kiện: nhiệt độ 25 , độ ẩm 70-80% ở trong búng tối. Đảo trộn mụi trường nuụi theo chu kỡ và tớnh toỏn số lượng mạt và quan sỏt tỡnh trạng sinh trưởng của nú.
2.2.4.. Thu dị nguyờn mạt
Chu kỡ nuụi khụng nhỏ hơn 4 thỏng. Khi số lượng mạt ớt nhất đạt 5000/gam mụi trường, độ thuần khiết là ≥ 90%, tiến hành thu cỏc dị nguyờn mạt.
26
2.2.5. Thu bỏn thành phẩm
Ngõm cỏc dị nguyờn mạt trong ether để tẩy nhờn, làm khụ chất rắn đó tẩy nhờn cho đến khi hết mựi và cõn nú. Trộn chất rắn trờn với dung dịch đệm muối nước Photphat theo Coca hoặc amonisulphat theo A.D.Ado trong 72 giờ, khuấy ở nhiệt độ 4OC. Sau đú lọc bằng giấy lọc, ly tõm 3.500 vũng/phỳt, lọc thanh trựng ta thu được dịch chiết chuẩn của dị nguyờn mạt.
Để chọn lọc phương phỏp nào cú hiệu xuất điều chế cao, chỳng tụi tiến hành tỏch chiết dị nguyờn theo phương phỏp Ad Ado (là phương phỏp đó ỏp dụng để tỏch chiết dị nguyờn bụi nhà ở Việt nam trước đõy) và ỏp dụng phương phỏp tỏch chiết dị nguyờn của Coca kết hợp với phương phỏp Sutherland, cú cải tiến của Khoa Miễn dịch – Dị nguyờn, Bệnh viện Tai Mũi Họng Trung ương .
27
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát và xây dựng quy trình tách chiết dị
nguyên MBN theo Ad Ado
Nguyên liệu
Chiết xuất
Nộn
Loại bỏ axit benzoic
Lọc Ly tâm để 72 giờ, ở 24OC. 0,01 NH4OH, pH = 8 - 9; Phenol 0,5% Bỏcặn Natribenzoat 2%, pH = 2 - 4.
Axeton lạnh 1 - 10OC. Giữ ở 40 C trong 12 giờ. Ly tâm 3.000 v/p ì 30 phút. Bỏ cặn. Kết tủa dị nguyờn 0,01 NH4OH, Lắc 30 phút Ly tâm 3.000 v/p , trong 30 phút Dị nguyên Ly tâm Chiết xuất Thẩm tớch Tiệt trùng
28
Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát và xây dựng quy trình tách chiết dị
nguyên MBN theo Coca kết hợp Sutherland, có cải tiến
Bỏn thành phẩm được đụng khụ, giữở - 20oC để sử dụng.
2.2.6. Chế phẩm văc xin D.pt
Sau khi đó thu được tủa DN thụ, để thu được DN tinh khiết hơn, chỳng tụi tiến hành tinh chế theo sơ đồ hỡnh 2.4 bằng cỏch hũa tan lại tủa DN bằng dung dịch đệm Coca, đểở 40 C trong 24 giờ, trong thời gian đú khuấy liờn tục bằng mỏy khuấy từ. Ly tõm với tốc độ 3000 v/p ì 30 phỳt, 40 C. Lấy phần Nguyên liệu Nguyên liệu đã khử chất béo Sản phẩm nghiền Cặn dị nguyên N−ớc nổi Hỗn dịch Khử chất béo bằng ete, tỷ lệ 1:5
Nghiền bằng cối nghiền tế bào
Chiết xuất bằng đệm Coca, pH 7,0 (1g sản phẩm nghiền : 10 ml Coca) trong 24 giờ, 40 C.
Tạo tủa bằng benzoat natri (40g benzoat natri : 1 lít n−ớc nổi). Dùng HCl 2N dẫn pH đến
Hòa tan cặn bằng axeton lạnh (tỷ lệ 1:5), lắc đều. Tạo tủa DN. Giữ ở 40 C trong 24 giờ. Ly tâm 3.000 v/p ì 30 phút, ở 40