C. Bỏn −ớc nổi.
h. Đặc tớnh của thành phẩm (Dermatophagoides pteronyssinus)
3.3.2. Những chi tiết d−ợc lý:
*) Danh sỏch thành phần tỏ dược:
Natri chloride, Glycerin, Phenol, nước cất
*) Những trường hợp khụng tương hợp: Khụng cú *) Hạn sử dụng: 3 năm kể từ ngày sản xuất. Khụng sử dụng sau thời hạn sử dụng ghi rừ ràng trờn lọ *) Những điều thận trọng đặc biệt khi bảo quản:
Dung dịch dị nguyờn D. pteronyssinus cần được bảo quản ở nhiệt độ từ +2- +8°C. Trong trường hợp vận chuyển, những lọ thuốc này cần được giữ ở vị trớ thẳng đứng. Trong trường hợp vận chuyển bằng mỏy bay, khụng để thuốc trong khoang hành lý. Những lọ dung dịch dị nguyờn D. pteronyssinus cần được đặt lại vào trong tủ lạnh càng sớm càng tốt sau khi di chuyển.
*) Bản chất và thành phần của lọ chứa thuốc
Dung dịch thuốc được đúng trong lọ thủy tinh loại 1 cú thể tớch 5 ml. Mỗi lọ như vậy chứa 5 ml dung dịch vắc xin dị nguyờn D. pteronyssinus với nhón ghi rừ nồng độ pha chế : 1/500; 1/5.000 ; 1/50.000; 1/500.000; ngày sản xuất, hạn sử dụng.
43
Ch−ơng 4 Bàn luận
Tổ chức Y tế thế giới (WHO) khuyến cỏo rằng thuật ngữ “chiết xuất dị ứng” (allergy extract) nờn được thay thế bằng “ vaccine dị nguyờn” (allergen vaccine). Với sự thừa nhận khuyến cỏo này, chỳng tụi sử dụng thuật ngữ vaccine dị nguyờn cho những dung dịch dị nguyờn dựng trong điều trị miễn dịch đặc hiệu cỏc bệnh dị ứng hen phế quản, viờm mũi dị ứng, viờm kết mạc dị ứng do mạt bụi nhà D. pteronyssinus. Vaccine dị nguyờn được sử dụng trong điều trị để điều hoà giảm cơ chế được trung gian bởi IgE gõy ra cỏc bệnh dị ứng. Để thực hiện điều này, vaccine dị nguyờn thay đổi tớnh miễn dịch của phản ứng dị ứng được tăng cường với cỏc dị nguyờn gõy ra những bệnh này. Dị nguyờn chẩn đoỏn là những chiết xuất dị nguyờn được sử dụng cho mục đớch chẩn đoỏn và được sử dụng để khẳng định tớnh dị ứng lõm sàng nghi ngờở cỏc bệnh nhõn dị ứng. Điều này được thực hiện bằng cỏch thực hiện test da trực tiếp phự hợp. [3, 8, 12, 13, 19, 28, 37, 44].
Quá trình sản xuất chiết xuất dị nguyên đặt ra một số bắt buộc trong việc lựa chọn nguyên liệu nguồn và các điều kiện lý hóa sử dụng trong thao tác chiết. Quá trình cần không làm phân hủy protein/dị nguyên cũng nh− không làm thay đổi đáng kể thành phần, kể cả tỷ lệ định l−ợng giữa các thành phần tan. Chiết xuất cần thực hiện trong các điều kiện giống với các điều kiện sinh lý trong đ−ờng hô hấp ng−ời, nh− pH và c−ờng độ ion, đồng thời ngăn chặn sự phân hủy protein có thể cũng nh− sự phát triển vi sinh vật. Thời gian chiết tối −u luôn luôn là sự thỏa hiệp giữa hiệu suất và sự phân hủy/ biến chất các dị nguyên riêng.[ 2, 5, 15, 46, 53] .
Cuối cùng chiết xuất cần đ−ợc bảo quản trong các điều kiện để ngăn chặn sự suy giảm hoạt tính dị nguyên hoặc bằng cách làm khô lạnh hoặc bằng
44
cách bảo quản ở nhiệt độ thấp (-200C đến - 800C), có thể với sự hiện diện của các chất làm ổn định nh− 50% glycerol hoặc một protein không dị nguyên nh− albumin huyết thanh ng−ời.[15, 46, 53].
Các môi tr−ờng chiết sử dụng rộng rãi nhất là các hệ đệm n−ớc có pH từ 6 đến 9 và c−ờng độ ion từ 0,05 đến 0,2. Nói chung, cần tránh các chất pha loãng không phải là n−ớc do nguy cơ biến chất protein.
ủy ban đặc biệt của Hiệp hội Quốc tế các Hội Miễn dịch học (I.U.I.S) có nhiệm vụ nghiên cứu phác thảo các chỉ dẫn cho chiết xuất tiêu chuẩn quốc tế đầu tiên của mạt D. pteronyssinus đã cho rằng chiết xuất này cần đ−ợc điều chế từ nguyên liệu ban đầu đại diện cho chất liệu mà con ng−ời tiếp xúc trong môi tr−ờng xung quanh tự nhiên của mình; do vậy đã quyết định lựa chọn các môi tr−ờng nuôi mạt, nuôi trên chất liệu tự nhiên với con ng−ời, nh−ng đã đ−ợc mạt tiêu hóa gần nh− hoàn toàn tại thời điểm lấy, môi tr−ờng này chứa không chỉ các kháng nguyên cơ thể mà còn chứa các kháng nguyên chuyển hóa, trong đó thành phần cơ bản là các hạt phân cho Der p I (Lind và cộng sự, 1984).[5, 7, 17, 18, 22, 25].
Mạt bụi nhà là kháng nguyên chủ yếu của DNBN - một trong những nguyên nhân chính gây ra các bệnh dị ứng đ−ờng hô hấp nh− HPQ, VMDƯ... ở n−ớc ta, số ng−ời HPQ chiếm 4-5% dân số, ở các thành phố lớn nh− Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh, Hải Phòng tỉ lệ này còn cao hơn. Để chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân, các cơ sở y tế th−ờng dùng dị nguyên nhập ngoại của Pháp và CHLB Đức. Trong những năm qua, chúng ta đã nghiên cứu tách chiết và đ−a vào ứng dụng một số dị nguyên nh− DNBN toàn phần của Nguyễn Văn H−ớng và cộng sự (1993), DNBN và DNBB của Nguyễn Năng An và cộng sự (1996), DNBN của Vũ Minh Thục (1987), DNBB của Vũ Minh Thục và cộng sự (2003), Dị nguyên lông vũ (2008 – Vũ Minh Thục và cộng sự), dị nguyên nấm Candida albicans (2004 – Vũ Minh Thục và cộng sự). Hiện nay, số bệnh nhân đến khám và điều trị về dị ứng đ−ờng hô hấp ngày
45
một tăng nên việc tách chiết dị nguyên MBN D. pteronyssinus là cần thiết để tiến tới sản xuất thuốc dùng, đồng thời góp phần làm phong phú bộ dị nguyên, nâng cao hiệu quả chẩn đoán và điều trị các bệnh dị ứng, góp phần tiết kiệm ngoại tệ nhập thuốc của n−ớc ngoài.
Dựa vào các tài liệu, kết quả nghiên cứu và căn cứ vào điều kiện của Việt Nam, sau khi phân lập đ−ợc loài MBN D. pteronyssinus từ các mẫu bụi nhà ở Hà Nội, chúng tôi tiến hành nuôi mạt bằng môi tr−ờng: nấm men
saccharonyces cereivisiae, thức ăn tổng hợp (chế biến từ bột ngụ, gạo, đậu tương, bột cỏ, cỏm gạo, khụ dầu lạc, polyvitamine, trứng gà), tỷ lệ 1:1; ở điều kiện nhiệt độ 25 – 270 C và độ ẩm t−ơng đối của môi tr−ờng 75% - 80%.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, chất liệu nguồn để chiết là toàn bộ môi tr−ờng nuôi. Chiết xuất dị nguyên mạt bụi nhà D.pt đ−ợc thu nhận từ môi tr−ờng nuôi cấy sau 10 - 12 tuần, là thời điểm mà mạt bụi nhà đã ăn hầu hết các thức ăn trong môi tr−ờng, chỉ còn lại mạt bụi nhà, các chất chuyển hoá, phân mạt. Nh− vậy, chế phẩm sẽ đảm bảo hoạt tính kháng nguyên của mạt bụi nhà D.pt.
Chúng tôi lựa chọn 2 ph−ơng pháp chiết xuất dị nguyên mạt bụi nhà D.pt bằng hệ đệm muối n−ớc: Ph−ơng pháp dùng muối NH4OH 0,01M và ph−ơng pháp Coca có cải tiến. Hai ph−ơng pháp này có −u điểm là đơn giản, dễ áp dụng, kinh phí đỡ tốn kém, phù hợp với điều kiện của Việt nam. Nh−ng hiệu suất của ph−ơng pháp Coca có cải tiến cao hơn so với ph−ơng pháp của Ađo (Hiệu suất của ph−ơng pháp Ađo chỉ bằng 0,75% ph−ơng pháp của Coca cải tiến). Cải tiến ở đây là chúng tôi đã rút ngắn thời gian chiết xuất dị nguyên để tránh hiện t−ợng bị phân huỷ quá nhiều do dung dịch cho vào. Bởi vậy, trong các nghiên cứu sau chúng tôi dùng ph−ơng pháp Coca có cải tiến để thu nhận mạt bụi nhà D.pt. [1, 5, 11, 15, 65]
So với l−ợng DNBN toàn phần do Nguyễn Văn H−ớng và cộng sự (1993) thu đ−ợc trung bình 2,4 g/kg bụi nhà, l−ợng dị nguyên MBN của chúng tôi thu đ−ợc cao gấp 5 lần. Ngoài l−ợng dị nguyên thu đ−ợc lớn hơn, tách chiết dị
46
nguyên từ mạt chủ động hơn về nguyên liệu (thu gom bụi nhà tốn công sức hơn, phải thu trên vùng rộng lớn, phụ thuộc mùa phát triển của mạt). Điều đó cho thấy rằng dị nguyên mạt bụi nhà nuôi cấy, cho chúng ta một l−ợng kháng nguyên mạt bụi nhà D.pt tinh khiết hơn so với bụi nhà toàn phần.
Dị nguyờn đụng khụ sau điều chế được pha chế thành cỏc dạng thành phẩm bằng cỏc dung dịch hũa tan và dung mụi pha loóng, đúng lọ 5ml, nhón ghi rừ thời gian sản xuất, nồng độ, hạn sử dụng. Cỏc lọ thành phẩm được gửi đi kiểm định, đỏnh giỏ cỏc tiờu chớ và tiến tới sử dụng trong lõm sàng.
47
KếT LUậN
1. Đã tạo đ−ợc chế phẩm văc xin dị nguyên mạt bụi nhà D. pteronyssinus.
2. Có thể điều chế đ−ợc một l−ợng lớn dị nguyên mạt bụi nhà D. pteronyssinus.
3.Đã xây dựng đ−ợc quy trình điều chế văcxin dị nguyên mạt bụi nhà D. pteronyssinus đạt tiêu chuẩn ở mức cơ sở.
48
QUY TRèNH CễNG NGHỆ SẢN XUẤT VẮCXIN CHỐNG DỊỨNG TỪ MẠT BỤI NHÀ ACARIEN D. PTERONYSSINUS
Nuụi cấy mạt,thu dịnguyờn
Kiểm định dị nguyờn Tiệt trựng Rút lọ Dỏn nhón, đúng lọ Thành phẩm Bảo quản Tẩy nhờn bằng ete Chiết xuất dị nguyờn Lọc sơ bộ Lọc thanh trựng Bỏn thành phẩm Pha chế thành phẩm (Cỏc loại nồng độ khỏc nhau) Tiền xử lý (Rửa, xắp xếp) Khử trựng Thu thập Bụi nhà Phõn loại và giỏm định hỡnh thỏi học Giỏm định phõn tử Cỏc lọ chứa dị nguyờn Kiểm định dị nguyờn
49