Nghiên cứu công nghệ sản xuất vắcxin chống dị ứng từ mạt bụi nhà acarien d pteronyssinus (DP) và ứng dụng trong chẩn đoán, điều trị một số bệnh dị ứng hen phế quản, viêm mũi dị ứng, viêm kết mạc nghiên cứu giám định phân

Việc sử dụng đơn phương mỗi loại hoặc kết hợp các chỉ thị hệ gen ty thể với nhau hoặc/và với chỉ thị hệ gen nhân tế bào để tăng thêm mức độ chính xác trong việc giám định đã được ứng dụn

Viện Công nghệ sinh học

BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NHÁNH

KC10-10/06-10/02

NGHIÊN CỨU GIÁM ĐỊNH PHÂN TỬ VÀ CHẨN ĐOÁN

LOÀI MẠT D PTERONYSSINUS TẠI VIỆT NAM

VÀ ĐỊNH KỲ KIỂM NGHIỆM GIỐNG ĐỂ NUÔI CẤY

TẠO NGUỒN DỊ NGUYÊN THUẦN KHIẾT

Chủ nhiệm đề tài nhánh: PGS.TS Lê Thanh Hòa Thời gian thực hiện: 01/01/2007 - 28/02/2009

7598-2

20/01/2010

HÀ NỘI-2009

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, vấn đề dị ứng (hen phế quản, viêm mũi dị ứng…) là bệnh có tính chất phổ biến trong xã hội, gây ra bởi môi trường bị ô nhiễm và/hoặc do vi sinh vật

Đặc biệt, dị ứng do các loài mạt Dermatophagoides pteronyssinus (D pteronyssinus)

và Dermatophagoides farinae (D farinae) là vấn đề bệnh mang tính chất toàn cầu

Dị nguyên (kháng nguyên gây dị ứng) của D pteronyssinus và D farinae thường có mặt trong bụi nhà, do hai loài mạt này sống và sản sinh ra trong đó, gây

nên các triệu chứng bệnh lý dị ứng: hen phế quản, viêm mũi dị ứng, viêm kết mạc và nhiều biểu hiện bệnh lý khác Việc sử dụng miễn dịch học liệu pháp đặc hiệu

(immunotherapy) bằng dị nguyên D pteronyssinus và D farinae trong điều trị, nhằm

mục đích làm giảm thiểu số lượng bệnh nhân mắc các bệnh dị ứng, ngăn ngừa sự gây mẫn cảm ở những bệnh nhân mới, tiến tới ngăn ngừa sự tiến triển xấu đi của các bệnh

dị ứng đang được ứng dụng rộng rãi Điều kiện mang tính quyết định trong miễn dịch học liệu pháp đặc hiệu bằng dị nguyên là dị nguyên phải được chiết xuất từ chính các loài mạt gây dị ứng cho bệnh nhân đã được giám định loài Vấn đề này hiện nay chưa được nghiên cứu giám định một cách chính xác giữa các loài mạt có trong bụi nhà ở các vùng địa lý khác nhau, trong đó có Việt Nam

Cho đến nay, việc phân biệt và giám định các loài mạt có trong bụi nhà và giống nuôi cấy sản xuất dị nguyên, chủ yếu dựa trên phương pháp hình thái học Tuy nhiên, phương pháp này không cho phép xác định chính xác sự đa dạng tiến hoá của các loài mạt và loài chủ yếu gây dị ứng có trong quần thể Mặt khác, giám định phân loại các loài mạt bằng kĩ thuật sinh học phân tử vẫn còn rất hạn chế, mặc dù đã được ứng dụng chẩn đoán, giám định đối với nhiều loài sinh vật như: ký sinh trùng gây

bệnh, vi khuẩn, virus với độ chính xác cao Việc giám định loài D pteronyssinus và

D farinae bằng phương pháp giám định gen (hay còn gọi là giám định phân tử) là

những nội dung mới, quan trọng trong nghiên cứu tạo ra sản phẩm đơn loài hay đa loài, giúp cho việc điều trị các bệnh di ứng bằng miễn dịch học liệu pháp nhằm hạn chế các bệnh này một cách có hiệu quả

Trong hơn một thập kỷ qua, phương pháp giám định loài sinh vật dựa trên đặc điểm phân tử ADN đã phát triển và đang được sử dụng rộng rãi Thực chất của phương pháp phân loại này là dựa vào các đặc điểm kiểu gen (genotype) thay vì sử dụng kiểu hình (phenotype) trong phương pháp phân loại hình thái học, với ưu điểm

là cần ít mẫu vật, không phụ thuộc vào các giai đoạn phát triển cá thể của sinh vật, có

độ chính xác cao rất phù hợp cho việc phát hiện và định loại các loài sinh vật Hiện

nay, có nhiều chỉ thị phân tử (của các gen hay tổ hợp gen) đang được sử dụng trong việc giám định loài, đây là các gen hay tổ hợp gen có tính bảo tồn cao và chỉ thị được chọn là đặc trưng cho loài sinh vật Đối với hệ gen ty thể (mitochondrial genome),

các chỉ thị chọn lọc là các gen: cox1 (cytochrome oxidase c subunit 1), gen ARN

ribosome 12S (12S rARN), gen ARN ribosome 16S (16S rARN); đối với hệ gen nhân (nuclear genome), các chỉ thị chọn lọc là các tổ hợp vùng giao gen là ITS-1 và ITS-2 (internal transcribed spacer 1 and 2) Việc sử dụng đơn phương mỗi loại hoặc kết hợp các chỉ thị hệ gen ty thể với nhau hoặc/và với chỉ thị hệ gen nhân tế bào để tăng thêm mức độ chính xác trong việc giám định đã được ứng dụng trong chẩn đoán, giám định

và phân tích phả hệ các loài sinh vật

Trong giai đoạn 2007-2009, để góp phần cung cấp cơ sở dữ liệu di truyền học

và xây dựng mô hình phân loại chính xác các loài mạt gây dị ứng, chúng tôi đã thực hiện các nội dung nghiên cứu và sử dụng các chỉ thị di truyền ADN hệ gen ty thể

(12S, cox1) và ITS-2 để giám định loài mạt sản xuất dị nguyên tại Việt Nam và xây

dựng qui trình giám định và qui trình chẩn đoán

Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài nhánh cấp Nhà nước

KC10-10/06-10/02: “Nghiên cứu giám định phân tử và chẩn đoán loài mạt D pteronyssinus tại

Việt Nam và định kỳ kiểm nghiệm giống để nuôi cấy tạo nguồn dị nguyên thuần khiết” do PGS.TS Lê Thanh Hoà chủ nhiệm (2007-2009) (Phòng Miễn dịch học,

Viện Công nghệ sinh học), thuộc khuôn khổ đề tài Nhà nước KC10-10/06-10:

“Nghiên cứu công nghệ sản xuất vacxin chống dị ứng từ mạt bụi nhà acarien

Dematophagoides pteronyssinus để ứng dụng trong chẩn đoán, điều trị một số bệnh dị ứng: Hen phế quản, Viêm mũi dị ứng, Viêm kết mạc” do GS.TSKH Vũ Thị

Minh Thục chủ nhiệm (Viện Tai-Mũi-Họng) và Viện Vacxin cơ sở II Đà Lạt chủ trì

Chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài với mục tiêu: Giải mã và so sánh biến đổi

thành phần gen 12S và cox1 của mạt gây dị ứng thuộc giống Dermatophagoides (Dermatophagoides pteronyssinus và Dermatophagoides farinae, mẫu của Mỹ) và

chẩn đoán giám định loài mạt gây dị ứng tại Việt Nam, từ đó xây dựng qui trình giám

định và qui trình chẩn đoán mạt bụi nhà D pteronyssinus tại Việt Nam

Các nội dung đặt ra để thực hiện, như sau:

1 – Giải trình trình tự một đoạn gen 12S, cox1 của mẫu chuẩn D

pteronyssinus và D farinae có nguồn gốc từ Mỹ

2 – Giải trình tự một đoạn gen 12S, cox1 của các mẫu mạt thu tại Việt Nam để

định loại và xây dựng phương pháp chẩn đoán giám định phân tử

3 - Phân tích trình tự nucleotide của các gen thu nhận từ các mẫu mạt

Dermatophagoides spp nghiên cứu, so sánh với trình tự tương ứng của các loài mạt

khác nhau trên thế giới

4 – Khảo sát giá trị ứng dụng chỉ thị phân tử của gen 12S và cox1 trong phân

tích và giám định các loài mạt

5- Xây dựng qui trình giám định gen mạt bụi nhà D pteronyssinus của Việt

Nam có được qui trình và kit xét nghiệm phân tử D pteronyssinus và D farinae

6- Xây dựng qui trình chẩn đoán phân tử mạt bụi nhà D pteronyssinus của

Việt Nam, có được qui trình chi tiết các bước tiến hành thực hiện chẩn đoán phân tử

D pteronyssinus và D farinae thực hiện được tại Việt Nam

7- Trên cơ sở qui trình chẩn đoán, giám định, định kỳ thực hiện kiểm nghiệm

giống mạt theo lô để nuôi cấy tạo nguồn dị nguyên thuần khiết

8- Góp phần đào tạo nghiên cứu viên và sau đại học

Sau khi hoàn thành nghiên cứu, sản phẩm đề tài nhánh được đặt ra là xây dựng qui trình giám định và chẩn đoán phân tử loài mạt bụi nhà nuôi cấy của Việt Nam, như sau:

1 QUI TRÌNH GIÁM ĐỊNH GEN MẠT BỤI NHÀ

quan trong trong đề tài Trách nhiệm Nhiệm vụ chính

Lê Thanh Hòa PGS, TS, NCVC

Phòng Miễn dịch học

Chủ nhiệm

đề tài nhánh

Chỉ đạo công việc, thiết

kế mồi, phân tích chuỗi gen, xây dựng qui trình Nguyễn Thị Bích Nga ThS, NCV

Phòng Miễn dịch học Tham gia Thực hiện PCR, giải trình tự, định kỳ kiểm

tra giống Nguyễn Thị Tuyết

Nhung ThS, NCV Phòng Miễn dịch học Tham gia Tách ADN tổng số; thực hiện PCR, giải

trình tự Hoàng Thị Minh Châu ThS, NCV

Phòng Miễn dịch học Tham gia Thực hiện một số công đoạn đề tài, quản lý

kinh phí, viết báo cáo

Tham gia Các công đoạn của đề

tài và viết luận văn Hoàng Văn Mạnh* CN (Trường ĐH KH

Tự nhiên Thái Nguyên, cao học năm 2008-2009)

Tham gia Các công đoạn của đề

tài và viết luận văn

*Hợp đồng tạm thời

Phần I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về bệnh dị ứng

Dị ứng (hay còn gọi là quá mẫn) là những tổn thương hoặc những hiện tượng

bệnh lý xảy ra trong quá trình tương tác giữa các thành phần của đáp ứng miễn dịch

và các kháng nguyên đặc hiệu Dựa vào đặc điểm biểu hiện của hiện tượng quá mẫn

và bản chất của các thành phần đáp ứng miễn dịch, người ta chia quá mẫn thành 4 týp chính: i) Týp 1: Quá mẫn tức thì; ii) Týp 2: Quá mẫn làm tan tế bào bởi kháng thể và

bổ thể; iii) Týp 3: Quá mẫn do phức hợp miễn dịch hay bệnh phức hợp miễn dịch; iv) Týp 4: Quá mẫn muộn

Một trong những nguyên nhân phổ biến gây ra bệnh dị ứng được xác định là dị

nguyên của sinh vật có trong bụi nhà (kháng nguyên gây dị ứng có mặt trong bụi nhà), trong đó dị nguyên của mạt có trong thành phần bụi nhà, đặc biệt là loài D pteronyssinus và D farinae đã và đang được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu

(Tilak và Jogdand, 1989; Fleming, 1999; Teplitsky và cs, 2008) Hàng loạt công trình

nghiên cứu đã chứng minh rằng sự có mặt của các loài mạt đặc biệt là D pteronyssinus và D farinae trong thành phần của bụi nhà có tính chất quyết định hoạt

tính kháng nguyên gây ra dị ứng (Chew và cs, 1995; Malainual và cs, 1995; Martinez và cs, 2005; Cevit và cs, 2007; Teplitsky và cs, 2008)

Suarez-Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nắng, nóng và có độ ẩm cao

Đây là điều kiện thuận lợi cho mạt phát triển, đặc biệt đối với loài D pteronyssinus

và D farinae, nguyên nhân chủ yếu gây ra bệnh lý miễn dịch dị ứng trên thế giới và

có thể chúng cũng là (các) loài gây bệnh dị ứng ở nước ta (Đoàn Thị Thanh Hà, 2002; Phạm Quang Chinh, 2004) Do đó, việc nghiên cứu xác định chỉ thị phân tử để ứng

dụng cho giám định chính xác loài mạt D pteronyssinus, D farinae, nuôi cấy, tách chiết và nghiên cứu các đặc tính sinh học của dị nguyên mạt D pteronyssinus và D farinae, giúp cho việc chẩn đoán và điều trị hiệu quả các bệnh dị ứng là một yêu cầu

cấp thiết và có ý nghĩa khoa học (Vũ Thị Minh Thục, 1995; Phạm Quang Chinh và

cs, 2003)

1.2 Đặc điểm sinh học các loài mạt Dermatophagoides spp

1.2.1 Đặc điểm hình thái học

Mạt D pteronyssinus và D farinae có dạng hình oval Mạt D pteronyssinus

không phân chia thành các phần đầu, ngực, bụng rõ ràng như các côn trùng khác mà đầu - ngực và bụng hợp thành một khối duy nhất gồm: thể hàm, phần thân và các cấu tạo khác (vỏ, chân, hậu môn và cơ quan sinh sản) (Lyon, 1991) (Hình 1.1) Mạt gây

dị ứng (hen phế quản, viêm mũi dị ứng) có trong bụi nhà và đồ dùng gia đình là một loại động vật vi chân đốt (microathropods), có kích thước khoảng 250-300 µm, hiện

nay được phân loại thuộc ngành Chân khớp (Arthropoda), bộ Acariformes, lớp Nhện (Arachnida) (Suarez-Martinez và cs, 2005) Mạt thuộc bốn họ (Pyroglyphidae, Glycyphagoidea, Acaridae, và Echimyopodidae) là thành phần thường xuyên trong bụi nhà, chăn chiếu, dụng cụ gia đình, có sản phẩm trao đổi chất là dị nguyên gây dị

ứng phổ biến trong xã hội Mạt nhà, trong đó đặc biệt là hai loài Dermatophagoides pteronyssinus Trouessart 1897 (Dp) và Dermatophagoides farinae Hughes (Df), thuộc họ Pyroglyphidae, có vai trò chính gây dị ứng đối với cộng đồng trên toàn thế

giới (Fleming, 1999; Suarez-Martinez và cs, 2005)

Hình 1.1 Mạt D pteronyssinus (A) và D farinae (B)

(Nguồn: http://www.slate.com/id/2189856/ ; http://2.bp.blogspot.com/)

Về hình thái học, mạt có cấu tạo bao gồm: i) Thể hàm: Gồm có miệng và bộ

phận phụ, đó là các chân xúc giác phát triển nhiều hoặc ít tuỳ theo từng loài, mà các kìm (đầu chân) có chức năng cầm, nắm hoặc gộp lại với miệng thành vòi hút hay vòi

trích (châm đốt); ii) Phần thân: Có hình oval, lông ở phần hông nhiều hơn phân lưng

và bụng, độ dài và hình dạng lông thay đổi tuỳ theo loài; phần ngực mang hai cặp chân trước; phần thân giữa mang hai cặp chân sau; phần thân sau: không chân có hậu

môn (Hình 1.1); iii) Các cấu tạo khác: gồm Vỏ (hay còn gọi là da): có nhiều kiểu

khác nhau trơn hoặc có nếp nhăn; mềm, mịn hoặc cứng, da có chức năng trao đổi nước và hô hấp; Chân: Con trưởng thành có 8 chân, gồm nhiều đốt, các lông ở chân đóng vai trò cơ quan xúc giác và được dùng để xác định loài theo phương pháp phân loại hình thái học; Hậu môn và cơ quan sinh sản: Phần dưới cùng của thân phía mặt bụng là hậu môn, cơ quan sinh sản nằm giữa các chân sau, phân biệt giữa con đực và cái ở hình dạng ngoài của cơ quan này, con cái đẻ trứng, trứng phát triển thành ấu trùng, sau đó thành mạt trưởng thành gây bệnh (Lyon, 1991)

1.2.2 Tên gọi, phân loại và phân bố

Dermatophagoides pteronyssinus và Dermatophagoides farinae thuộc Ngành

Chân Khớp (Arthropoda), Lớp Nhện (Arachnida), Bộ Acarina, Họ Pryoglyphidae, Giống Dermatophagoides (Hình 1.2) Nghiên cứu về sự phân bố của các loài mạt có

trong bụi nhà đã phát hiện trên 130 loài mạt thuộc 27 họ, trong đó D pteronyssinus là

loài mạt phổ biến nhất, chiếm từ 70%- 98% tổng số mạt phát hiện được, phần lớn số còn lại đều ít gặp (Suarez-Martinez và cs, 2005) Sự phân bố của các loài mạt phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau: mùa, vị trí địa lí, đặc điểm khí hậu, điều kiện xã hội và sinh hoạt (Fleming và cs, 1999) Nhiều công trình nghiên cứu đã công bố cho thấy, ở các nước châu Âu chủ yếu gặp các loài mạt thuộc họ Pyroglyphidae Đặc biệt, mạt thuộc họ này được phát hiện trong 100% các mẫu bụi nghiên cứu ở Hà Lan và ở Italia là 73% Cho đến nay, ở Việt Nam vẫn chưa có nhiều công trình nghiên cứu được công bố về sự phân loại chính xác của các loài mạt này trong bụi nhà, tuy đã có một số nghiên cứu nuôi cấy, tách chiết dị nguyên và khảo sát đặc tính sinh hoá học miễn dịch dị nguyên của loài mạt phân lập tại Việt Nam (Đoàn Thị Thanh Hà, 2002; Phạm Quang Chinh và cs, 2003; Phạm Quang Chinh, 2004)

ARTHROPODA

PROARTHROPODA EUARTHROPODA

TRILOBITIFORMA CHELICERATA MANDIBULATA

Crustaceans Myriapoda Insects

ARACHNIDA

ARANEAE SCORPIONES

ACARINA

GAMASOIDAE IXOIDAE ACAROIDAE ORIBATEI TARSONEMOIDAE TROMBIDIOIDAE DEMODICOIDAE

Psoroptidae Pyroglyphidae Acaridae (Tyroglyphidae) Glycyphagidae Sarcoptidae

Lepidoglyphus destructor (Glycyphagus destructor) Glycyphagus domesticus

Sarcoptess cabier

Hình 1.2 Sơ đồ vị trí phân loại của D pteronyssinus và D farinae

1.3 Hệ gen ty thể động vật và chỉ thị phân tử gen ty thể

1.3.1 Giới thiệu về ty thể

Ty thể (mitochondria) là bào quan (organelle) phổ biến của tế bào nhân chuẩn (Eucaryota) Ty thể có các đặc điểm cấu tạo đặc trưng, không giống với các bào quan khác trong tế bào Bao ngoài ty thể là hai lớp màng, màng ngoài nhẵn, màng trong gấp nếp Chúng có ADN hệ gen riêng cấu tạo dạng vòng cùng với đó là bộ máy phiên

mã và dịch mã riêng Bào quan này nhân lên độc lập không phụ thuộc vào quá trình phân chia của tế bào Các đặc điểm này của ty thể rất giống với đặc điểm cấu tạo của

vi khuẩn và do đó các nhà khoa học cho rằng ty thể là bào quan bắt nguồn từ vi khuẩn sống cộng sinh nội bào (endosymbiosis) với các tế bào nhân thật xuất hiện sớm nhất (Saccone và cs, 1999; Kuroiwa và cs, 2006) Ty thể có hình hạt đậu hoặc ovan, kích thước từ 0,5-1 µm, được bao bọc bởi hai lớp màng: màng ngoài nhẵn, trên đó có các protein có chức năng vận chuyển các chất vào và ra khỏi ty thể; màng trong cuộn lại thành các nếp gấp, là nơi diễn ra quá trình tổng hợp ATP của ty thể Hai màng ty thể chia ty thể thành hai khoang khác biệt Khoang chứa chất đệm cơ bản (matrix) nằm bên trong ty thể và khoang gian màng nằm giữa màng trong và màng ngoài, trong đó

có hệ gen ty thể (Kuroiwa và cs, 2006)

Ở hầu hết các động vật, hệ gen ty thể là các phân tử ADN dạng vòng, kích thước 13-20 kb, chứa 36 hoặc 37 gen, cùng với một số vùng cần thiết cho quá trình tái bản và phiên mã (Boore, 1999) Trong số đó, có 12 hoặc 13 gen mã hoá cho các protein tham gia vào chuỗi vận chuyển điện tử; 2 gen ARN ribosome, 22 gen ARN vận chuyển acid amin cần thiết cho quá trình tổng hợp protein và một vùng không mã hóa có kích thước thay đổi tuỳ theo loài động vật (Zhang và Hewitt, 1997; Boore, 1999) (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Các gen trong hệ gen ty thể động vật

động vật Tên chuẩn hóa dùng hiện nay Cytochrome oxidase subunits I, II, III COI, COII, COIII cox1, cox2, cox3

NADH dehydrogenase subunits 1-6, 4L ND1-6, 4L nad1-6, nad4L

ATP synthase subnits 6,8 A6, A8 hoặc ATP6, ATP8 atp6, atp8

ARN ribosome tiểu phần lớn LrARN rnl, rrnL

ARN ribosome tiểu phần nhỏ SrARN rns, rrnS

18 ARN vận chuyển chuyên biệt cho mỗi

acid amin

Mỗi acid amin tương ứng với

một ký tự

trnV, trnH

2 ARN vận chuyển đặc hiệu cho leucine Được phân biệt bởi codon nhận

biết L(CUN) và L(UUR) trnL1, trnL2

2 ARN vận chuyển đặc hiệu cho serine Được phân biệt bởi codon nhận

biết S(AGN) và S(UCN)

mang tính đặc trưng cho các loài trong một ngành động vật Trật tự gen ở các loài có

xương sống (vertebrate) được chuẩn hoá cao Cụm gen mã hoá cho ARN vận chuyển

các acid amin N-W-A-C-Y ở động vật có xương sống là vị trí có sự thay đổi không đáng kể Trật tự này được xem là trạng thái nguyên thủy của sự sắp xếp gen ty thể ở động vật có xương sống Sự chuyển vị làm cho trình tự N-W-A-C-Y thành W-A-N-C-Y là đặc trưng cho sự sắp xếp phổ biến ở động vật có xương sống Bên cạnh đó, các nhà khoa học cũng đã quan sát thấy có sự sắp xếp trật tự này thành A-C-W-N-Y ở một số loài thú có túi (Boore, 1999) Hệ gen ty thể của động vật có vú có cấu trúc và

tổ chức hết sức chặt chẽ, các gen không chứa intron, một số trường hợp có hiện tượng các gen gối lên nhau, giữa các gen không có sự tách biệt rõ ràng, nucleotide cuối cùng của một gen nằm gần nucleotide đầu tiên của gen tiếp theo và gần như là chỉ cần một cặp base sau mỗi gen đã có thể xác định ranh giới cho một gen Ngoại trừ vùng không mã hoá (non-coding region), vùng này ở hệ gen ty thể của người và động vật

bậc cao còn có tên gọi là ‘D loop’, bắt đầu cho việc sao chép ADN (Lewine, 2008)

Sau động vật có xương sống, động vật chân khớp (Arthropoda) là nhóm có hệ

gen ty thể được nghiên cứu nhiều hơn cả Các trình tự ADN toàn bộ hệ gen ty thể của

Drosophila melanogaster và D yakuba được xác định có lẽ sớm nhất, không lâu sau

đó hệ gen ty thể ở người cũng đã được xác định Nói chung, có rất ít sự sắp xếp lại trật tự ADN ty thể giữa các loài trong cùng giống (genus), thuộc động vật chân khớp Nếu có, thì sự sắp xếp lại trong hệ gen ty thể chỉ xảy ra đối với các gen ARN vận chuyển Sự thay đổi phổ biến nhất ở chân khớp thường xảy ra ở các gen nằm gần vùng không mã hoá (long non-coding region) Sự sắp xếp lại dường như cũng xảy ra

ở các gen mã hóa cho ARN vận chuyển của vùng tương ứng với các acid amin N-S1 (AGN)-E-F ở Drosophila (Zhang và Hewitt, 1997; Boore, 1999)

A-R-1.3.2 Các gen ty thể làm chỉ thị phân tử

Các gen mã hóa cho các protein ở hệ gen ty thể động vật bao gồm: 7 gen mã

hoá cho phức hợp nicotinamide dehydrogenase (nad) đó là nad1-6 và nad4L; 3 gen

mã hóa cho phức hợp cytochrome oxidase (cox) là cox1-3; 1 gen mã hoá cho cytochrome b (cob) và 2 gen mã hoá cho adenosine triphosphatase (atp) là atp6 và atp8 Hệ gen ty thể của tất cả sinh vật đa bào đều chứa 13 gen mã hoá protein, trong

đó có gen atp8 (Boore, 1999), kể cả ở loài mạt Dermatophagoides pteronyssinus

(Dermauw và cs, 2009), nhưng cho đến nay, các nghiên cứu ở giun tròn (Nematoda)

và tất cả các sán dẹt (Platyhelminthes) cho thấy vẫn không có sự hiện diện của gen này trong hệ gen ty thể (Le và cs, 2002; Hu và Gasser, 2006)

Tính bảo tồn cao về độ dài của các gen mã hoá protein trong các loài thuộc các ngành khác nhau, ở cả hai mức nucleotide và amino acid, làm cho việc xác định các gen này phục vụ nhiều mục đích khác nhau đều thực hiện tương đối dễ dàng Đặc biệt

các gen cox (ví dụ, cox1) và phần lớn các gen nad (ví dụ, nad1, nad3) được ứng dụng

nhiều trong việc giám định các loài theo dòng mẹ (chị em, siblings), cũng như các

loài có quan hệ gần gũi phả hệ (Le và cs, 2002; Lee và cs, 2004; Hu và Gasser, 2006;

Dermauw và cs, 2009) Tuy nhiên, sự tương đồng về các gen atpase (apt6, atp8) và một số gen nad (nad4L, nad3 và nad6) thì ít hơn, thậm chí ngay ở cả các loài có quan

hệ gần gũi Để xác định chính xác các gen này, ngoài việc so sánh sự tương đồng với các trình tự đã biết trong cơ sở dữ liệu thuộc Ngân hàng gen, còn phải xét đến đặc tính sinh hoá của chúng (ví dụ, như tính chất ưa nước, kỵ nước và một số đặc tính

khác) (Le, 2001; Hu và Gasser, 2006) ARN ribosome ty thể gồm 2 tiểu phần (rrnL 16S rARN cấu tạo nên tiểu phần lớn của ribosome; và rrnS - 12S rARN cấu tạo nên

-tiểu phần nhỏ), cuộn lại thành cấu trúc bậc hai, tồn tại ở ty thể tất cả động vật đa bào

Ở hầu hết các loài, các gen mã hóa cho ARN ribosome nằm trên cùng một chuỗi và được tách biệt bằng một hoặc vài ARN vận chuyển hoặc một số gen mã hoá protein khác nhau ARN ribosome ty thể là chỉ thị phân tử có giá trị trong chẩn đoán, giám định, phân loại và nghiên cứu di truyền quần thể (Boore, 1999; Le, 2001; Le và cs, 2002; Hu và Gasser, 2006; Suarez-Martinez và cs, 2005; Dermauw và cs, 2009)

1.4 Đặc điểm hệ gen ty thể của Arthropoda

1.4.1 Xác định chỉ thị hệ gen ty thể trong nghiên cứu giám định loài mạt

Cho đến đầu năm 2009, chưa có các công trình nghiên cứu cơ bản nào về đặc tính phân tử hệ gen ty thể của các loài mạt gây bệnh dị ứng ở Việt Nam cũng như trên thế giới được công bố Tuy nhiên, trình tự hệ gen ty thể hoàn chỉnh của 28 loài thuộc ngành Chân khớp Arthropoda đã được xác định Gần đây, đầu năm 2009, công trình

giải mã toàn bộ hệ ge ty thể của loài mạt D pteronyssinus đã được hoàn thành

(Dermauw và cs, 2009), hệ gen gồm 14.203 bp (đăng ký Ngân hàng gen số: EU884425) (Hình 1.4)

Trong hơn một thập kỷ qua, phương pháp giám định loài sinh vật dựa trên đặc điểm phân tử ADN đã phát triển và đang được sử dụng rộng rãi Thực chất của phương pháp phân loại này là dựa vào các đặc điểm kiểu gen (genotype) thay vì sử dụng kiểu hình (phenotype) trong phương pháp phân loại hình thái học, ưu điểm là cần ít mẫu vật, không phụ thuộc vào các giai đoạn phát triển cá thể của sinh vật, có

độ chính xác cao rất phù hợp cho việc phát hiện và định loại các loài sinh vật Hiện

nay, nhiều chỉ thị phân tử (các gen hay tổ hợp gen) đang được sử dụng trong việc giám định loài, đây là các gen hay tổ hợp gen có tính bảo tồn cao, và đặc trưng cho loài sinh vật

Thông thường, gen cox1, nad1, cob của hệ gen ty thể là những gen có giá trị

được chọn làm chỉ thị trong giám định và định loại các loài có họ hàng gần gũi; các

gen nad3, 16S (rrnL), 12S (rrnS), vùng không mã hoá (NR, non-coding region) được

chọn trong phân loại và so sánh biến đổi gen của các loài họ hàng xa (hình 1.9) Các gen ty thể là các cấu trúc di truyền đại diện dòng mẹ, do vậy, khi giám định các loài

có khả năng giao phối hay trong vùng tạp lai ngoại loài (inter-specific hybridization), nhất thiết cần xem xét thêm chỉ thị hệ gen nhân (ví dụ ITS-2) Từ đó, việc phân tích

dòng lai sẽ xác định được di truyền theo bố hay theo mẹ (Lê Thanh Hòa và cs, 2007;

Le và cs, 2007)

1.4.2 Hệ gen ty thể của Varroa destructor và D pteronyssinus

Tại thời điểm bắt đầu của đề tài (2007), toàn bộ hệ gen ty thể của loài mạt

Varroa destructor kí sinh ở ong mật (honey bee) (Navajas và cs, 2002); và khi đề tài chuẩn bị kết thúc (2009), toàn bộ hệ gen ty thể của loài mạt D pteronyssinus

(Dermauw và cs, 2009)đã được giải mã và phân tích đầy đủ tạo điều kiện thuận lợi

để thực hiện đề tài thành công

Hệ gen ty thể của Varroa destructor: đây là một loại mạt kí sinh ở ong mật

(honey bee) là một loại ectoparasite, có mối quan hệ gần gũi với D pteronyssinus và

D farinae, và hệ gen ty thể của chúng được giải trình tự hoàn toàn có kích thước

16.476 bp Thành phần nucleotide của vùng mã hoá chủ yếu của các gen trong

mtADN của V destructor có 39% A, 41%T, 8%C và 12%G, tạo nên tỷ lệ A + T

chiếm 80% trong đó tỷ lệ A + T của các gen mã hóa protein, tính toán cho mỗi gen là 80,9% Bên cạnh đó, tỉ lệ A + T của vùng không mã hóa đạt 79,9% (Navajas và cs, 2002), đây là điều kiện thuận lợi cho việc tách hai mạch đơn ADN, cần thiết cho mở đầu sao mã cũng như phiên mã của mtADN Các gen mã hóa cho protein nằm xen kẽ

với các gen tARN, vùng điều khiển được định vị giữa hai gen rrnL và rrnS Vị trí của hai nhóm tARN (trnA, trnR, trnN, trnS(agn), trnE và trnF nằm giữa hai gen nad3 và nad5) và trnK và trnD nằm hai giữa gen cox2 và atp8, thứ tự sắp xếp này được cho

là ổn định (Hình 1.3) (Navajas và cs, 2002) Hai gen rARN có mặt trong hệ gen ty thể

V destructor cũng như hai gen tương ứng trong tất cả các hệ gen ty thể khác, một mã hóa rARN cấu tạo nên tiểu phần nhỏ (rrnS) và một mã hóa cho rARN cấu tạo nên tiểu phân lớn (rrnL) Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, tín hiệu mở đầu và kết thúc phiên

mã cũng như sử dụng mã di truyền của hệ gen ty thể V destructor cũng tương tự như

các loài Metazoan khác (Navajas và cs, 2002)

Hình 1.3 Vị trí các gen của hệ gen ty thể của ngoại ký sinh trùng ong mật Varroa

destructor và vùng gen cox1, 12S (vòng tròn) sử dụng trong giám định chẩn đoán loài mạt Dermatophagoides spp

Hệ gen ty thể của D pteronyssinus: Toàn bộ hệ gen có độ dài 14.203 bp, bao

gồm 13 gen mã hoá cho protein, 2 gen ARN ribosome (rARN) và 22 gen ARN vận chuyển (tARN) Trật tự sắp xếp của các gen đã có những thay đổi cơ bản so với một

số hệ gen ty thể của các loài mạt tổ tiên như Limulus polyphemus, chỉ có 11/38 gen có

độ bảo tồn trật tự sắp xếp (Dermauw và cs, 2009) Định vị trên sợi dương của hệ gen

ty thể có 8 gen, trên sợi âm (sợi bổ sung, comlementary strand) có 5 gen mã hoá cho protein (Hình 1.4) Tổng toàn bộ thành phần A+T sử dụng kiến tạo hệ gen là 72,6%, một vùng không mã hoá có độ dài 286 bp, có nhiều cấu trúc lặp, có lẽ đây là phần của

hệ gen chứa vùng điều khiển sự nhân lên của hệ gen ty thể Phân tích phả hệ sử dụng

nucleotide và amino acid đều cho thấy, D pteronyssinus tập hợp cùng một nhóm gần gũi với Steganacarus magnus (Dermauw và cs, 2009) Với hiểu biết chi tiết hệ gen ty thể của D pteronyssinus việc nghiên cứu giám định và phân tích gen của (các) loài

mạt gây dị ứng tại Việt Nam càn có cơ sở tiến hành chính xác hơn

Hình 1.4 Trật tự sắp xếp gen trong hệ gen ty thể của loài mạt D pteronyssinus

Cũng như các loài trong giới Metazoan khác, cấu trúc hệ gen ty thể của

Arthropoda nói chung và D pteronyssinus nói riêng, có dạng vòng tròn, kích thước

khoảng 15-17 kb (tùy theo loài) chứa 37 gen, bao gồm 22 gen ARN vận chuyển (tARN), 2 gen ARN ribosome (rARN) đó là rrnL và rrnS, 13 gen mã hoá cho protein

và một vùng không mã hoá Vùng không mã hóa này đóng vai trò khởi đầu sao mã hay phiên mã, hoặc cả hai của phân tử ADN ty thể (Navajas và cs, 2002; Dermauw và

cs, 2009)

1.5 Hệ gen nhân và các chỉ thị phân tử được sử dụng

Trong tế bào của cơ thể, song song tồn tại 2 hệ gen bao gồm hệ gen nhân tế bào (nuclear genome) và hệ gen ty thể (mitochondrial genome, đối với động vật) hoặc lạp thể (chloroplast, đối với thực vật) Hai hệ gen này đều có sản phẩm riêng, hoạt động có tính chất vừa độc lập, vừa tương tác, và dĩ nhiên hệ gen ty thể chịu ảnh hưởng điều hòa của hệ gen nhân tế bào

Hệ gen nhân tế bào có hệ số đột biến thấp hơn hệ gen ty thể Tuy nhiên, bất kỳ

sự thay đổi nào của các gen quan trọng cũng dẫn đến sự biến đổi hệ gen có tính chất đặc trưng của loài Xét về phương diện phân loại học, nếu chỉ chọn một hay vài gen

để phân tích, sẽ không cho kết quả của tiến trình tiến hoá, vì trong một loài các gen

cơ bản có chiều hướng bảo tồn rất cao Do vậy phân tích gen bảo tồn trong hệ gen của nhân chỉ có giá trị trong giám định, mà ít có giá trị trong phân loại (Lê Thanh Hòa, 2007) Mặt khác, các vùng có cấu trúc lặp, hay những vùng có hệ số biến thái cao trong hệ gen nhân là đối tượng phân tích để phân loại (Blair, 2005)

Hình 1.5 Chỉ thị phân tử ADN hệ gen nhân tế bào (Ghi chú: A Minh hoạ các chỉ thị phân tử hệ

gen ty thể thường sử dụng (vạch bên dưới các gen) đại diện là sán lá gan Fasciola hepatica; B sơ đồ

cấu trúc tổ hợp ADN ribosome của hệ gen nhân cung cấp chỉ thị 18S và ITS-2 với các mồi thực hiện

PCR (Lê Thanh Hòa và cs, 2007)

Chỉ thị phân tử ở hệ gen nhân tế bào thường được sử dụng là ADN ribosome (nuclear ribosomal operon) và vùng giao gen ITS (Internal Transcribed Spacer) tiểu phần 1 (ITS-1) và 2 (ITS-2) (Blair, 2005) Trong hệ gen nhân tế bào, một tổ hợp gen

quan trọng gọi là tổ hợp ADN ribosome (ADNr), bao gồm các cụm gen là

18S-ITS1-5,8S-ITS2-28S hợp thành Mỗi một hệ gen có nhiều cụm gen nối tiếp nhau Bất kỳ gen ribosome nào (18S, 5,8S, 28S) hay vùng giao gen (ITS-1, ITS-2) đều được sử dụng trong phân tích phân loại (Hình 1.5)

Hình 1.5 mô tả toàn bộ cấu trúc tổ hợp ADN ribosome (nuclear ribosomal operon) Các cụm gen ADN ribosome (rADN) sắp xếp nối tiếp nhau và cách nhau

bằng một vùng giao tổ hợp IGS (inter-genic spacer) Có khoảng 100 cụm rADN ở loài sán máng (S mansoni) và sán phổi (P ohirai) Trong hệ gen nhân của sán lá gan nhỏ (Opisthorchis viverrini), rADN chiếm đến 6,1% thành phần ADN của hệ gen

Vùng đầu 5’ của gen 18S có định vị một chuỗi ADN ngoại tổ hợp gọi là vùng ngoại

28S 18S 1 5.8S 2 28S 18S

Intergenic spacer (IGS)

Internal transcribed spacer

(ITS) External transcribed spacer (ETS)

Intergenic spacer (IGS)

Internal transcribed spacer

(ITS) External transcribed spacer (ETS)

Intergenic spacer (IGS)

Internal transcribed spacer

(ITS) External transcribed spacer (ETS)

ITS-2

ITS-1

gen ETS (External Transcribed Spacer) (Blair, 2005) Giữa gen 18S và 5,8S là vùng giao gen ITS-1 (Internal Transcribed Spacer 1) có độ dài khoảng 300-600 bp; và giữa gen 5,8S và 28S là vùng giao gen ITS-2 (internal transcribed spacer 2) có độ dài

tương đương khoảng 300-500 bp

ITS-1 và ITS-2 có mức độ biến đổi ngoại loài rất cao, khó có thể sử dụng để so sánh phân tích các loài khác giống, nhưng chúng lại là đối tượng lý tưởng trong nghiên cứu phả hệ nguồn gốc các chủng trong cùng loài hoặc cùng giống, đặc biệt về hiện tượng lai nội và ngoại loài ITS-2 đại diện phả hệ dòng bố (paternality), nếu được phân tích cùng với một số chỉ thị hệ gen ty thể đại diện dòng mẹ (maternality) thì việc giám định gen, chẩn đoán loài và phân tích hiện tượng lai ngoại loài có điều kiện xác định chính xác nguồn gốc dòng lai (Blair, 2005; Lê Thanh Hoà, 2007)

Các gen 18S và 28S cũng là đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất trong cấu trúc của tổ hợp ARN ribosome nhân Gen 18S (nSSU) có kích thước khoảng 2000 bp

là một trong số những trình tự được dùng nhiều trong các nghiên cứu phân tích phả

hệ ở động vật đa bào (Telford và cs, 2003)

Phần 2

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu chúng tôi sử dụng trong đề tài gồm;

1 Mẫu mạt chuẩn thuộc hai loài D pteronyssinus và D farinae (do GS.TS

Slater JA, Center for Biologics Evaluation and Research, US Food and Drug Administration, Bethesda; USA) cung cấp nhằm xác định chính xác chỉ thị phân tử làm tiêu chuẩn cho giám định và chẩn đoán hai loài mạt này và phân biệt với các loài mạt khác (Bảng 2.1)

2 Các đợt mẫu mạt thu tại Viện Tai-Mũi-Họng của Việt Nam do GS.TSKH

Vũ Thị Minh Thục cung cấp (bảng 2.1), trong đó có nhiều mẫu của một cá thể nhằm xác định độ sạch loài hiện có (mỗi mẫu một con); cũng như nhiều lô mẫu nuôi thuần khiết (mỗi lô khoảng 10-20 con) (Bảng 2.1)

3 Tất cả mạt do Viên TMH cung cấp đều đã được chuyên gia xác định hình thái học Các mẫu mạt hoặc lô mạt sau khi tiếp nhận bắt buộc phải thẩm định bằng phương pháp sinh học phân tử bằng cách so sánh đối chiếu chuỗi gen với mẫu mạt

chuẩn thuộc hai loài D pteronyssinus và D farinae của Mỹ

Bảng 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu

1 D pteronyssinus Mỹ DpA-US Mẫu chuẩn được cung cấp dưới dạng ADN tổng số

2 D farinae Mỹ DfA-US Mẫu chuẩn được cung cấp dưới dạng ADN tổng số

3 Các lô mẫu mạt nuôi tại Viện Tai-Mũi-Họng Việt Nam DpT(1-2-3-4)-VN

Mẫu nghiên cứu được cung cấp dưới dạng mạt đông lạnh (từng cá thể hoặc từng nhóm) theo các lô khác nhau để giám định và kiểm tra giống

2.2 Dụng cụ, trang thiết bị và hoá chất nghiên cứu

Bộ pipetman (10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl), đầu côn các loại, đĩa Petri,

lọ đựng môi trường, và ống nuôi vi khuẩn

2.2.2 Hoá chất

- Hoá chất: Yeast Extract và trypton (DIFCO-Mỹ), EDTA, SDS, Tris-HCl

(Sigma-Mỹ), Acid acetic (Merk-Đức), X-gal (Sigma-Mỹ), Kanamycin, Ampicilin (Merk-Đức), Agar (Sigma, Mỹ); Agarose (Sigma, Mỹ), cồn tuyệt đối

- Bộ kit tách chiết ADN tổng số “QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN Inc, USA)”, bộ kit dùng cho phản ứng PCR do hãng Promega cung cấp, kit tách dòng

“TA cloning Kit” (Invitrogen), bộ kit Plasmid Extraction Kit (BIONEER) sử dụng

tách chiết ADN plasmid tái tổ hợp

- BigDyeTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Mỹ), QIAquick PCR Purification Kit, kit Dye-Ex 2.0 Spin Kit (QIAGEN Inc.) tinh sạch

sản phẩm PCR để giải trình trình tự, đều do hãng QIAGEN cung cấp Tế bào E coli

thuần chủng DH5α-T1(Invitrogen)

- Các mồi cho phản ứng PCR đặt của hãng Bioneer (Hàn Quốc), các loại

enzym giới hạn: EcoRI, BamHI, NotI (New England BioLabs - Mỹ)

2.3 Phương pháp

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu phân tích gen 12S và cox1 từ hai mẫu mạt chuẩn D pteronyssinus và D farinae của Mỹ và mẫu nghiên cứu nguồn gốc Việt

Nam, trên hai lĩnh vực kĩ thuật chính:

- Kĩ thuật sinh học phân tử (molecular cloning): phân lập gen 12S và cox1 từ

hai mẫu mạt chuẩn

- Các chương trình tin-sinh học (bioinformatics): thu nhận và phân tích các đặc tính sinh học (thành phần nucleotide, acid amine, các khác biệt về thành phần nucleotide cũng như acid amin) Xác định mối quan hệ phả hệ của các loài mạt dựa

trên trình tự gen 12S Sơ đồ quy trình nghiên cứu gen 12S và cox1 hệ gen ty thể mạt

bụi nhà được trình bày trên Hình 2.1

2.3.1 Tách chiết ADN tổng số

- Mục đích: i) Mẫu mạt chuẩn D pteronyssinus và D farinae của Mỹ được

cung cấp dưới dạng ADN tổng số có lý lịch kèm theo (Dr Slater JE, Biopol, USA); ii) Thu nhận ADN tổng số của các cá thể hoặc các lô mạt Việt Nam với hàm lượng cao,

và đảm bảo độ tinh khiết làm khuôn cho PCR

- Tiến hành: i) Các mẫu mạt chuẩn (USA) sử dụng trong nghiên cứu của chúng

tôi được cung cấp dưới dạng ADN tổng số; ii) Các cá thể hoặc từng lô mạt được tách chiết ADN tổng số sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN) Do đó, sau khi thu nhận ADN mẫu chuẩn hay tách chiết ADN từ mẫu nghiên cứu, chúng tôi tiến hành điện di trên thạch agarose 1% để kiểm tra ADN tổng số trước khi sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR

- Các chương trình tin-sinh học (bioinformatics): thu nhận và phân tích các đặc tính sinh học (thành phần nucleotide, acid amin, các khác biệt về thành phần nucleotide cũng như acid amin) Xác định mối quan hệ phả hệ của các loài mạt dựa

trên trình tự gen 12S Sơ đồ quy trình nghiên cứu gen 12S và cox1 hệ gen ty thể mạt

bụi nhà được trình bày trên Hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát và xây dựng qui trình giám định và chẩn đoán

2.3.2 Thực hiện phản ứng PCR

- Mục đích: Thu nhận một lượng lớn các phân tử ADN của gen 12S và cox1,

sản phẩm được nhân lên nhờ chuỗi phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu, làm nguyên liệu cho quá trình tách dòng

MẪU MẠT THEO LÔ (1 HOẶC 10 CON)

(thành phần nucleotide và amino acid)

NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ PHÂN TỬ/SO SÁNH

(phân tích nucleotide, amino acid, xác định phả hệ)

XÂY DỰNG QUI TRÌNH GIÁM ĐỊNH

XÂY DỰNG QUI TRÌNH CHẨN ĐOÁN

ĐỊNH KỲ KIỂM NGHIỆM GIỐNG

MẪU MẠT THEO LÔ (1 HOẶC 10 CON)

(thành phần nucleotide và amino acid)

NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ PHÂN TỬ/SO SÁNH

(phân tích nucleotide, amino acid, xác định phả hệ)

XÂY DỰNG QUI TRÌNH GIÁM ĐỊNH

XÂY DỰNG QUI TRÌNH CHẨN ĐOÁN ĐỊNH KỲ

KIỂM NGHIỆM GIỐNG

- Thiết kế mồi: i) Cặp mồi đặc hiệu giống Dermatophagoides là DpF-DpR

thiết kế để nhân đoạn gen cox1 (378 bp) của nhiều loài mạt với mục đích giám định

(identification), từ đó sau khi có sản phẩm cần giải trình trình tự và so sánh đối chiếu

để giám định loài cần tìm; ii) Căp mồi đặc hiệu loài chỉ riêng cho D pteronyssinus là

Dp12F-Dp12R được thiết kế rất đặc hiệu dùng để thực hiện việc nhân đoạn gen 12S

(395 bp) của riêng loài mạt D pteronyssinus với mục đích vừa chẩn đoán vừa giám

định, không cần thiết phải giải trình trình tự vì sản phẩm PCR chỉ thu được từ loài D

pteronyssinus mà không từ bất kỳ loài mạt nào khác (Bảng 2.2)

Bảng 2.2 Trình tự thiết kế của hai cặp mồi Dp12F-Dp12R và DpF-DpR

Tên

Độ dài (mer)

Độ dài của sản phẩm thu được

Dp12F 5’ AAACTAGGATTAGATACCCTAG 3’ 22

Dp12R 5’ TACTATGTTACGACTTATCTATC 3’ 23

395 bp (toàn bộ gen 12S)*

DpF 5’ GTTTTGGGATTATCTCTCATA 3’ 21

DpR 5’ GAGCAACAACATAATAAGTATC 3’ 22

378 bp (toàn bộ

gen cox1)

*Đặc hiệu chỉ riêng cho D pteronyssinus để chẩn đoán

- Tiến hành: i) Chúng tôi thực hiện phản ứng PCR sử dụng ADN tổng số thu

nhận làm khuôn, cặp mồi Dp12F-Dp12R để nhân đoạn gen 12S, cặp mồi DpF-DpR

để nhân đoạn gen cox1, trên khuôn ADN của hai mẫu chuẩn; sử dụng bộ kit PCR

(Promega), thực hiện trên máy PCR (PTC-100)

Các thành phần cho một phản ứng như sau:

Tên hóa chất Thể tích (µl)

Mồi ngược 3 ADN tổng số 2

72oC – 10 phút Sản phẩm được bảo quản ở 4oC

ii) Sau khi giải trình trình tự xác định loài và độ đặc hiệu của các cặp mồi,

chúng tôi tiến hành sử dụng cặp mồi DpF-DpR nhân gen cox1 và Dp12S và Dp12R

nhân gen 12S trên khuôn ADN của các mẫu mạt Việt Nam (lô DpT4-VN); sử dụng

bộ kit PCR (Promega), thực hiện trên máy PCR (PTC-100)

iii) ADN sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên thạch agarose 1%,

nếu có kích thước đúng như tính toán của cặp mồi thiết kế, sẽ tiến hành tinh sạch sản

phẩm bằng bộ hóa chất QIAquick PCR Purification Kit

2.3.3 Điện di

- Mục đích: Kiểm tra sự có mặt của ADN tổng số cũng như ADN sản phẩm

PCR

- Tiến hành: Chúng tôi thực hiện điện di kiểm tra ADN tổng số, ADN sản

phẩm PCR và ADN plasmid tái tổ hợp trên thạch agarose 1%, bằng bộ điện di ADN

(Bio-Rad), đọc kết quả trên máy soi gen chụp hình Dolphin-DOC với phần mềm

Wealtec Dolphin 1.1

2.3.4 Dòng hóa ADN sản phẩm PCR

- Mục đích: Thu nhận một số lượng lớn bản sao ADN sản phẩm PCR một cách

chính xác, làm nguyên liệu cho giải trình trình tự

- Tiến hành: Chúng tôi sử dụng plasmid mang (còn gọi là vector dẫn truyền)

pCR®2.1-TOPO® với bộ Kit TOPO-TA cloning (Invitrogen) (hình 2.2)

Đây là loại vector được thiết kế có đầu lồi T (Thymine) phù hợp gắn với các

ADN có đầu lồi A (Adenin) sản phẩm của PCR sử dụng enzym Taq-polymerase, theo

nguyên tắc bổ xung tạo nên plasmid tái tổ hợp mang đoạn ADN ngoại lai Sản phẩm

sau phản ứng được chuyển nạp vào các tế bào khả biến E coli DH5α-T1 (Invitrogen),

và được nuôi cấy để chọn lọc các dòng tế bào tái tổ hợp nhằm thu nhận mốt số lượng

lớn plasmid tái tổ hợp chính xác Các bước như sau:

* Thực hiện phản ứng nối ADN ngoại lai - sản phẩm của PCR

Trải đều mẫu tế bào sau lắc ở trên vào các đĩa thạch LB-agar 1,5% đã chuẩn bị

sẵn (bổ sung Kanamycin 50 µl (40mg/ml) và 100µl X-gal (40mg/ml), ghi nhãn)) Mỗi

đĩa thạch khoảng 2-3 µl tế bào sau chuyển nạp Ủ đĩa trong tủ ấm 370C, ít nhất 18-20

giờ

* Chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp

Sau ủ 18-20 giờ, các đĩa thạch được lấy ra để chọn lọc các dòng vi khuẩn tái tổ

hợp (các khuẩn lạc màu trắng là các khuẩn lạc của vi khuẩn có khả năng mang

ống môi trường LB lỏng có bổ sung Kanamycin, sau đó được lắc trong máy lắc điều

nhiệt (200 vòng/phút, 370C) trong 10-20 giờ để các tế bào sinh trưởng và nhân lên với

số lượng lớn

* Tách chiết ADN plasmid tái tổ hợp

Chúng tôi sử dụng bộ hoá chất Plasmid Extraction Kit (BIONEER) để tách

chiết ADN plasmid tái tổ hợp (Phụ lục 2)

* Cắt kiểm tra: ADN plasmid tái tổ hợp bằng enzym giới hạn EcoRI

Do vector pCR®2.1TOPO® được thiết kế có điểm cắt của enzym giới hạn

EcoRI tại hai đầu của vùng tiếp nhận ADN ngoại lai, nên khi được cắt bằng EcoRI,

ADN plasmid tái tổ hợp được cắt thành hai đoạn hoặc nhiều đoạn (nếu trong ADN

ngoại lai có chứa điểm cắt của EcoRI) Một đoạn có kích thước 3,9 kb của vector

pCR®2.1TOPO®, và 1 (hoặc 2) đoạn có kích thước tương đương với đoạn ADN sản

phẩm của PCR được gài vào vùng nhân dòng của vector

Thành phần phản ứng cắt ADN plasmid tái tổ hợp bằng enzym giới hạn

Sản phẩm sau cắt được điện di kiểm tra trên thạch agarose 1%, nếu sản phẩm

cắt cho kết quả tương ứng với kích thước ADN sản phẩm PCR, thì ADN plasmid tái

tổ hợp được thu nhận và được giải trình trình tự Soi gen và chụp hình kết quả điện di

trên máy Dolphin-DOC, phần mềm Wealtec Dolphin 1.1

2.3.5 Giải trình trình tự, thu nhận, xử lí và phân tích chuỗi gen 12S và cox1

Quá trình giải trình trình tự đoạn ADN sản phẩm thu nhận sau tách dòng được

tiến hành hoặc với mồi xuôi (hoặc với mồi ngược) là các chuỗi oligonucleotide được

thiết kế bám vào các trình tự vector ở hai đầu đoạn ADN ngoại lai được gài vào Mồi

dùng để giải trình trình tự ADN plasmid tái tổ hợp gồm:

- Mồi xuôi (M13F): 5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’

- Mồi ngược (M13R): 5’-CAGGAAACAGCATTGAC-3’

Chu trình nhiệt giải trình tự:

* Tinh sạch sản phẩm của phản ứng giải trình trình tự: được tinh sạch bằng bộ

hoá chất Dye-Ex 2.0 Spin Kit (QIAGEN)

Sản phẩm sau khi tinh sạch, được đông khô và đọc trình tự trên máy tự động ABI-3100 Avant Genetic Analyzer (Mỹ) tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Trình tự chuỗi nucleotide thu nhận được xử lí, phân tích và so sánh với các

chuỗi gen 12S và cox1 thu nhận được so sánh với các chuỗi gen tương ứng của cùng loài mạt D pteronyssinus, D farinae và các loài mạt khác đăng kí trong Ngân hàng

gen (Bảng 2.3)

Bảng 2.3 Danh sách các mẫu mạt sử dụng để so sánh, phân tích gen 12S và cox1

hàng gen

Gen 12S (rrnS)

1 DpA-US(60-1)12S(395bp) Dermatophagoides pteronyssinus USA Đang đăng kí

2 DpA-US(61-3)12S(395bp) Dermatophagoides pteronyssinus USA Đang đăng kí

3 Dp(strA)-12S(395bp) Dermatophagoides pteronyssinus Không biết AF529911

4 Dp(strB)-12S(395bp) Dermatophagoides pteronyssinus Không biết AF529912

5 Dp(strC)-12S(395bp) Dermatophagoides pteronyssinus Không biết AF529913

6 Dp(strD)-12S(395bp) Dermatophagoides pteronyssinus Không biết AF529914

7 Dp(strE)-12S(395bp) Dermatophagoides pteronyssinus Không biết AF529915

8 Dp(cl2)-12S(395bp) Dermatophagoides pteronyssinus Không biết DQ402424

11 B tropicalis-12S(391bp) Blomia tropicalis Không biết AF529916

12 B tropicalis-12S(391bp) Blomia tropicalis Không biết AF529917

13 B tropicalis-12S(391bp) Blomia tropicalis Không biết AF529918

14 B tropicalis-12S(391bp) Blomia tropicalis Không biết AF529919

15 B tropicalis-12S(391bp) Blomia tropicalis Không biết AF529920

16 B tropicalis-12S(391bp) Blomia tropicalis Không biết AF529921

17 G privatus-12S(391bp) Glycyphagus privatus Không biết AF529908

Gen cox1

18 DpA-US(58-3)CO1(378bp) Dermatophagoides pteronyssinus USA Đang đăng kí

19 DpA-US(59-2)CO1(378bp) Dermatophagoides pteronyssinus USA Đang đăng kí

20 DfA-US(76-2)CO1(378bp) Dermatophagoides farinea USA Đang đăng kí

21 DpCO1(378bp) Dermatophagoides pteronyssinus Không biết AY525570

Các chuỗi gen 12S và cox1 thu nhận được so sánh với các chuỗi gen tương ứng của cùng loài mạt D pteronyssinus, D farinae và các loài mạt khác đăng kí trong

Ngân hàng gen (Bảng 2.3)

Phần 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

Chúng tôi xin trình bày tất cả kết quả nghiên cứu chia làm 5 nhóm kết quả, theo yêu cầu của đề tài:

Nhóm kết quả I: Giải trình tự gen 12S và cox1 của mẫu chuẩn D pteronyssinus và

D farinae có nguồn gốc từ Mỹ làm chỉ thị phân tử chuẩn để so sánh

Nhóm kết quả II: Giám định gen mạt của Việt Nam (lô DpT4) ứng dụng chỉ thị

phân tử 12S trong phân tích và so sánh với các chủng của Mỹ và thế giới

Nhóm kết quả III: Kết quả định kỳ thực hiện kiểm nghiệm giống mạt theo lô (lô

DpT1, DpT2, DpT3) để nuôi cấy tạo nguồn dị nguyên thuần khiết

Nhóm kết quả IV: Xây dựng qui trình giám định phân tử và qui trình chẩn đoán phân tử mạt bụi nhà D pteronyssinus của Việt Nam để thực hiện tại Việt Nam Nhóm kết quả V: Công bố bài báo khoa học và đào tạo

Hà, 2002; Fleming, 1999; Vũ Thị Minh Thục, 1995) Điều kiện mang tính quyết định

là dị nguyên phải được chiết xuất từ chính các loài mạt gây bệnh cho bệnh nhân, mà giám định chủ yếu hiện nay là hình thái học, nhiều khi nhầm lẫn (Cevit và cs, 2007)

Do vậy, nghiên cứu giám định sinh học một cách chính xác để có loài thuần khiết nuôi sản xuất dị nguyên là cần thiết Muốn vậy, cần phải xác định chỉ thị phân tử chuẩn từ (các) loài mạt chuẩn sinh học để có dữ liệu so sánh đối chiếu trong giám định phân loại (Lê Thanh Hoà, 2007) Chúng tôi đã tiếp nhận ADN của 2 loài mạt Dp

và Df được xác định chuẩn sinh học từ Mỹ, từ đó thu nhận và chọn gen 12S và gen

cox1 để biến đổi thành phần nucleotide và acid amin nhằm có dữ liệu cơ bản làm chỉ

thị phân tử trong giám định gen dị nguyên acarien của Việt Nam sau này

Tóm tắt kết quả nhóm kết quả I

Xác định chỉ thị phân tử chuẩn từ (các) loài mạt chuẩn sinh học quốc tế để có

dữ liệu so sánh đối chiếu trong giám định phân loại acarien của Việt Nam là cần thiết

Đoạn gen 12S (395 bp) và cox1 (378 bp) hệ gen ty thể của các loài mạt

cấp) được chọn làm chỉ thị phân tử để xác định Sản phẩm PCR được tinh sạch dòng hoá, giải trình trình tự và phân tích tương đồng Kết quả cho thấy, trình tự gen 12S

thu nhận từ các clone thuộc loài D pteronyssinus mẫu của Mỹ có sự tương đồng cao

về thành phần nucleotide với nhau và với trình tự tương ứng của các loài mạt D pteronyssinus có trong Ngân hàng gen, từ đó cung cấp chỉ thị chắc chắn để giám định, phân loại và chẩn đoán mạt tại Việt Nam Trái lại, mức độ tương đồng gen cox1 giữa hai loài D pteronyssinus và D farinae quá cao, do vậy, cox1 không sử dụng cho

chẩn đoán phân biệt; trong khi đó, gen 12S phù hợp để xây dựng phương pháp giám

định về gen giữa các loài mạt

3.1.2 Kết quả thu nhận, giải trình trình tự, xác định gen 12S và cox1 của các mẫu chuẩn D pteronyssinus và D farinae của Mỹ

Mẫu ADN tổng số của 2 loài mạt chuẩn sinh học D pteronyssinus và D farinae (do GS.TS Slater JA, Center for Biologics Evaluation and Research, US Food

and Drug Administration, Bethesda; và Hãng Biopol, USA) cung cấp Mạt Dp và Df hiện nay được các Công ty sinh học của Mỹ (Biopol) nuôi và sản xuất dị nguyên thương mại.Hai mẫu ADN tổng sau khi tiếp nhận, được kiểm tra bằng điện di trên thạch agarose 1% (Hình 3.1A) Kết quả trình bày ở Hình 3.1 cho thấy, ở cả hai giếng

tra mẫu ADN tổng số của mẫu D pteronyssinus (ký hiệu: DpA-US) và D farinae (ký

hiệu: DfA-US), đều cho kết quả là một băng sáng, rõ nét, chứng tỏ ADN tổng số được tách chiết có chất lượng tốt, từ đó được sử dụng làm khuôn cho PCR, nhằm thu

nhận phân đoạn gen 12S và cox1

Hình 3.1 Kết quả kiểm tra ADN tổng số của các mẫu chuẩn (A); gen 12S của D pteronyssinus (B)

và gen cox1 của D pteronyssinus và D farinae (C)

Với cặp mồi Dp12F-Dp12R, đoạn ADN của gen 12S có độ dài 395 bp trên

khuôn D pteronyssinus và với cặp mồi DpF-DpR, gen cox1 có độ dài 378 bp trên

khuôn cả hai loài D pteronyssinus và D farinae thu được bằng phản ứng PCR được

trình bày ở Hình 3.1B và 3.1C Kết quả kiểm tra bằng điện di trên thạch agarose 1% cho thấy độ dài của các đoạn ADN là hoàn toàn tương ứng và đặc hiệu

Hình 3.2 Kết quả kiểm tra ADN gen 12S và cox1 từ plasmid tái tổ hợp Ghi chú: A 3 clone tế bào

chứa plasmid tái tổ hợp mang gen 12S của mẫu D pteronyssinus; B Giếng 1, 2, 3: các clone tế bào chứa plasmid tái tổ hợp mang gen cox1 của D pteronyssinus; giếng 4, 5: các clone tế bào chứa plasmid tái tổ hợp mang gen cox1 của D farinae

Các gen 12S và cox1 sản phẩm PCR của hai mẫu chuẩn D pteronyssinus và D farinae được dòng hoá và cắt kiểm tra bằng enzyme EcoRI, sau đó được điện di trên

thạch argarose 1% (Hình 3.2) Kết quả trên Hình 2 cho thấy, ADN tái tổ hợp đã chứa đúng các đoạn gen đích làm nguyên liệu cho giải trình tự Như vậy, các sản phẩm gen

12S và cox1 thu nhận được từ các loài Dp và Df đã được dòng hoá vào plasmid thành

đoán phân biệt với các loài mạt khác nhau Kết quả so sánh các trình tự gen 12S của

mẫu D pteronyssinus hoàn toàn tương ứng với các chuỗi gen của D pteronyssinus

đăng ký trong Ngân hàng gen Như vậy, mẫu ADN của Mỹ cung cấp là chính xác của

loài D pteronyssinus

Như vậy, loài mạt của Mỹ chính xác là Dermatophagoides pteronyssinus

(European house dust mite) thuộc hệ thống phân loại: Eukaryota; Metazoa; Arthropoda; Chelicerata; Arachnida; Acari; Acariformes; Sarcoptiformes; Astigmata; Psoroptidia; Analgoidea; Pyroglyphidae; Dermatophagoidinae; Dermatophagoides

3.1.4 Kết quả so sánh, phân tích trình tự của chuỗi gen cox1 thu nhận với chuỗi

gen tương ứng của các loài mạt được lựa chọn

Kết quả so sánh các trình tự gen cox1 của mẫu D pteronyssinus của Mỹ gồm 2

chuỗi chúng tôi thu được ký hiệu là DpA-US(cl58-3), DpA-US(cl59-2) và 1 chuỗi

của D farinae của Mỹ, ký hiệu là DfA-US(cl76-2), với các trình tự tương ứng của

các loài mạt được chọn lựa, bằng chương trình GENEDOC2.5, được thể hiện trên

Hình 3.3

Trình tự gen cox1 của các mẫu DpA-US(cl58-3), DpA-US(cl59-2) và

DfA-US(cl76-2) so với trình tự tương ứng của DpCO1-AY525570 có sự tương đồng cao

về thành phần nucleotide Trái lại, khi so sánh với trình tự gen cox1 của A.siro(str001)-AY525560 cũng như với trình tự gen cox1 của C.berlesei-AY525571,

thì giữa chúng có nhiều sai khác hơn, tuy nhiên những sai khác này không mang tính chất đặc trưng (Hình 3.3).

Hình 3.3 Kết quả so sánh thành phần nucleotide gen cox1 của US(cl58-3)12S và

DpA-US(cl59-2)12S với các loài mạt được lựa chọn so sánh Ghi chú: Dấu (.) biểu thị nucleotide giống

với trình tự chuỗi cox1 của DpA-US(cl60-1)12S, nucleotide sai khác được biểu thị bằng chữ cái ký

hiệu của chúng

3.1.5 Kết luận

1 Như vậy, quá trình giải mã và thu nhận chuỗi gen 12S (kích thước 395 bp)

và cox1 (kích thước 378 bp) của hai loài mạt chuẩn D pteronyssinus và D farinae có

nguồn gốc từ Mỹ đã được thực hiện thành công, cung cấp chỉ thị di truyền phân tử cho việc giám định, phân loại và chẩn đoán mạt tại Việt Nam sau này

* 20 * 40 * 60 * DpA-US(58- : GTTTTGGGATTATCTCTCATACAGTAAGGTTTTATAGCAATAAAATTGAGCCATTTGGATCTTTAGGGATGATTTATG : 78 DpA-US(59- : T : 78 DfA-US(76- : T : 78 DpCO1(378b : T T G C G A : 78 A.siro(str : C T CA T GG.C.T T : 78 C.berlesei : G T G.CG T CAGA G T G.G C : 78

80 * 100 * 120 * 140 * DpA-US(58- : CTATAATCTCTATTGCTACTTTAGGTTTTATTGTATGGGCTCATCATATATTTACTGTAGGGTTGGATGTAGACACTC : 156 DpA-US(59- : : 156 DfA-US(76- : : 156 DpCO1(378b : : 156 A.siro(str : T A C.G.GT T A A C A G : 156 C.berlesei : T G.GTG G G A C T T : 156

160 * 180 * 200 * 220 * DpA-US(58- : GGGCTTATTTTACATCAGCTACTATAATTATCGCTGTTCCTACGGGAGTTAAGGTTTTCAGATGATTGGCAACTATAT : 234 DpA-US(59- : : 234 DfA-US(76- : : 234 DpCO1(378b : T T : 234 A.siro(str : T TG.T A C T A T T T A T C C : 234 C.berlesei : G.T G T A C T G T T G T C : 234

240 * 260 * 280 * 300 * DpA-US(58- : TAGGTGGAAAGTTGGACTTTAGGCCATCATTCTTATGGTCTATAGGATTTGTTTTTCTTTTTACTGTTGGGGGTTTAA : 312 DpA-US(59- : C : 312 DfA-US(76- : C : 312 DpCO1(378b : C G G G : 312 A.siro(str : T G T C.T T C T T T.AT A G.T G C T.A G T C.T : 312 C.berlesei : C T C.A T C T C G.AT A G.G C G C C G : 312

2 Trình tự gen 12S thu nhận từ hai clone thuộc loài D pteronyssinus mẫu của

Mỹ có sự tương đồng cao về thành phần nucleotide với nhau và với trình tự tương

ứng của các loài mạt D pteronyssinus trong Ngân hàng gen (AY525570), từ đó cung

cấp chỉ thị chắc chắn để giám định, phân loại và chẩn đoán mạt tại Việt Nam

3 Đối với gen cox1, giữa hai loài D pteronyssinus và D farinae, mức độ

tương đồng rất cao, do vậy, gen này không sử dụng cho chẩn đoán phân biệt; mà nên dùng gen 12S phù hợp hơn để xây dựng phương pháp giám định gencác loài mạt

4 Trong việc xây dựng qui trình giám đinh và chẩn đoán, sau khi thu nhận gen 12S cần thực hiện giải trình tự, để có chuỗi gen so sánh phân tích xác định loài Dp hoặc Df cho chính xác

2 NHÓM KẾT QUẢ II: GIÁM ĐịNH GEN MẠT CỦA VIỆT NAM (LÔ DPT4) ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ 12S TRONG PHÂN TÍCH VÀ SO SÁNH VỚI CÁC CHỦNG CỦA MỸ VÀ THẾ GIỚI

3.2.1 Đặt vấn đề

Mạt nhà, trong đó đặc biệt là hai loài Dermatophagoides pteronyssinus Trouessart 1897 (Dp) và Dermatophagoides farinae Hughes (Df), thuộc họ Pyroglyphidae, có vai trò chính gây dị ứng đối với cộng đồng trên toàn thế giới

(Fleming, 1999; Suarez-Martinez và cs, 2005) Giám định loài mạt nhà, cho đến gần đây, chủ yếu vẫn dựa vào đặc điểm hình thái học và một số phân biệt kiểu hình phát triển của ấu trùng, mà không phải loài nào cũng dễ dàng phân biệt được (Teplitsky và

cs, 2008) Chỉ có 3 loài là D pteronyssinus, D farinae và Euroglyphus maynei (họ

Pyroglyphidae) có vẻ dễ phân biệt hình thái nhưng nhiều khi cũng nhầm lẫn với nhau

và với các loài khác, ảnh hưởng đến chất lượng dị nguyên sản xuất (Suarez-Martinez

và cs, 2005) Phương pháp giám định sinh học phân tử cho phép xác định chính xác loài dựa trên chuỗi gen chọn lọc làm chỉ thị phân tử, mà một trong số đó là gen 12S của hệ gen ty thể và chỉ thị này đã được sử dụng trong giám định phân loại, xác định quan hệ phả hệ của nhiều loài vi chân đốt thuộc lớp Arachnida (Suarez-Martinez và

cs, 2005)

Chúng tôi đã giải trình trình tự phân tích chuỗi gen 12S và cox1, của các loài

mạt chuẩn sinh học nhận được từ hãng Biopol (Mỹ), để làm chuỗi so sánh trong giám định gen các lô mạt sản xuất dị nguyên tại Việt Nam (Lê Thanh Hòa và cs, 2009) Chúng tôi trình bày kết quả giám định gen một số lô của loài mạt nuôi tại Việt Nam đang sử dụng làm nguồn sản xuất dị nguyên điều trị dị ứng và khẳng định chắc chắn

về phân loại học đó là loài Dermatophagoides pteronyssinus Trouessart 1897

Phương pháp giám định gen bằng giải trình tự và phân tích chuỗi gen 12S sẽ là công

cụ cần thiết trong xác định acarien tại Việt Nam đối với các lô giống sản xuất dị nguyên

Tóm tắt nhóm kết quả II

Đoạn gen 12S (395 bp) hệ gen ty thể của loài mạt làm dị nguyên tại Việt Nam (ký hiệu DpT4) được thu nhận bằng PCR, tách dòng và giải trình trình tự Chuỗi gen được phân tích tương đồng và phả hệ trên cơ sở so sánh với các chủng

Dermatophagoides pteronyssinus Trouessart 1897, Dermatophagoides farinae Hughes và Blomia tropicalis của thế giới Kết quả cho thấy, trình tự gen 12S thu nhận

từ 2 dòng mạt, DpT4(117)VN và DpT4(118)VN của Việt Nam có tương đồng

98-99% với các chủng thuộc loài D pteronyssinus của Mỹ, trong khi đó chỉ có 84-85% với D farinae và 68-69% với một số chủng của loài mạt B tropicalis Loài mạt nuôi

tại Việt Nam (lô DpT4) đang sử dụng để chế kháng nguyên dị ứng được giám định

phân tử chính xác là Dermatophagoides pteronyssinus Trouessart 1897, trên cơ sở

phân tích và so sánh với chỉ thị phân tử 12S từ các mẫu chuẩn quốc tế Phân tích phả

hệ cũng cho thấy các dòng DpT4(117)VN và DpT4(118)VN của Việt Nam thuộc

nhóm Dermatophagoides (Dp và Df) trong khi đó nhóm B tropicalis tách làm thành

một nhóm riêng Cơ sở của giám định gen đã khẳng định loài acarien của Việt Nam là

D pteronyssinus (vị trí phân loại: Animalia, Arthropoda, Arachnida, Acarina, Acariformes, Pyroglyphidae, Dermatophagoides, Dermatophagoides pteronyssinus

Trouessart, 1897)

3.2.2 Nguyên liệu và yêu cầu giám định

- Mạt được nuôi theo từng lô tại Viện Tai-Mũi-Họng trung ương, được giám

định hình thái học là thuộc loài D pteronyssinus (xem Phạm Quang Chinh và cs, 2003) (Hình 3.4) Tuy nhiên, do yêu cầu sản xuất dị nguyên cần phải tinh khiết, cần giám định gen chính xác có thuộc loài D pteronyssinus hay không Mẫu sinh học

cung cấp nguồn ADN tổng số là từng cá thể được lấy đơn lẻ, từ đó, nếu có chuỗi gen thuần nhất thì làm cơ sở để xác định quần thể

Hình 3.4 Mạt nhà nuôi tại Việt Nam sử dụng để giám định gen theo từng lô để sản xuất dị nguyên

- ADN của 2 loài mạt chuẩn sinh học D pteronyssinus và D farinae (đang sản

xuất dị nguyên tại Mỹ) do Công ty sinh học Biopol cung cấp để thu nhận chuỗi gen giám định và so sánh đối chiếu