4.1. Công đoạn 1- Thu thập mẫu mạt
Nuôi cấy theo lô, lô nào cần xác định phân tử thì thu từng con vào ống Eppendorf để tách chiết khuôn DNA riêng biệt; đồng thời thu 10-20 con vào ống mẫu khác.
4.2. Công đoạn 2- Tách chiết DNA tổng số
Mục đích: Thu nhận DNA tổng số của mạt cần giám định (D. pteronyssinus) với hàm lượng cao, và đảm bảo độ tinh khiết làm khuôn cho PCR. DNA tổng số được tách ra bao gồm DNA của hệ gen nhân và hệ gen ty thể của loài mạt cần giám
định.
- Cách tiến hành: Quy trình tách chiết DNA tổng số sử dụng QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) được mô tả tóm tắt như sau: mẫu bảo quản -20oC được lấy ra và đểở nhiệt độ phòng. Mẫu vật được nghiền kỹ và xử lý với các dung môi của bộ
kit, rồi hấp phụ lên màng và ly chiết ADN theo qui trình tách chiết của hãng sản xuất như sau:
- Cho 180 µl Buffer ATL, tiếp tục dùng chày nghiền nhỏ mẫu để thu được một dung dịch đồng nhất.
- Thêm 20 µl Proteinase K, trộn đều, ủở 56oC trong 1-2 giờ. - Thêm 4 µl Rnase và 200 µl Buffer AL, ủở 70oC trong 30 phút. - Thêm 200 µl Ethanol (96- 100%), trộn đều.
- Chuyển dịch lên cột, ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch dưới. - Thêm 500 µl Buffer AW1, rồi ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch dưới
- Thêm 500 µl Buffer AW2, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ dịch dưới, ly tâm thêm một lần nữa.
- Chuyển cột sang ống Eppendorf sạch. Cho 60 Buffer AE lên màng cột lọc, để
nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sau đó ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch bên dưới là DNA tổng số của mẫu mạt Ký hiệu mẫu, bảo quản ở -20oC.
- ADN tổng số tách chiết ra được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên thạch agarose 1%, ở hiệu điện thế 100V trong 25 phút. Chụp ảnh dưới ánh sáng tia tử ngoại của máy soi chụp gel Dolphin- Doc (WEALTEC, USA) và ghi vào máy vi tính.
4.3. Công đoạn 3- Thực hiện phản ứng PCR và kiểm tra sản phẩm
- Mục đích: Thu nhận một lượng lớn các phân tử ADN của gen 12S và cox1, sản phẩm được nhân lên nhờ phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu, làm nguyên liệu cho quá trình tách dòng.
- Thiết kế mồi: Cặp mồi dùng để thực hiện việc nhân đoạn gen 12S là Dp12F-Dp12R ; và nhân đoạn gen cox1 là DpF-DpR, được thiết kế dựa trên các dữ
liệu gen 12S, cox1 của loài mạt Dermatophagoides spp. có trong Ngân hàng gen. *Hai cặp mồi Dp12F-Dp12R và DpF-DpR Tên mồi Trình tự Độ dài (mer) Độ dài của sản phẩm thu được Dp12F 5’ AAACTAGGATTAGATACCCTAG 3’ 22 Dp12R 5’ TACTATGTTACGACTTATCTATC 3’ 23 395 bp (một phần gen 12S) DpF 5’ GTTTTGGGATTATCTCTCATA 3’ 21 DpR 5’ GAGCAACAACATAATAAGTATC 3’ 22 378 bp (một phần gen cox1) - Cách tiến hành: Phản ứng PCR sử dụng ADN tổng số làm khuôn, cặp mồi Dp12F-Dp12R để nhân đoạn gen 12S, cặp mồi DpF-DpR để nhân đoạn gen cox1, sử dụng bộ kit PCR (Promega), trên máy PCR (PTC-100).
*Thành phần cho một phản ứng PCR
Tên hóa chất Thể tích (µl)
PCR Master mix (Promega) 25
Mồi xuôi 3
DNA tổng số 2 Nước tinh khiết vô trùng 17
Tổng thể tích 50
*Chu trình nhiệt của phản ứng:
Sau kết thúc, chuyển về 4oC bảo quản cho đến khi kiểm tra.
ADN sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên thạch agarose 1%, nếu có kích thước đúng như tính toán của cặp mồi thiết kế, được tiến hành tinh sạch sản phẩm bằng bộ hóa chất QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN).
4.4. Công đoạn 4- Tách dòng và chọn lọc DNA tái tổ hợp
- Mục đích: Thu nhận một số lượng lớn bản sao ADN sản phẩm PCR một cách chính xác, làm nguyên liệu cho giải trình trình tự.
- Cách tiến hành: Plasmid mang (còn gọi là vector dẫn truyền) được sử dụng là pCR®2.1-TOPO® với bộ Kit TOPO-TA cloning của hãng Invitrogen. Đây là loại vector được thiết kế có đầu lồi T (Thymine) phù hợp gắn với các ADN có đầu lồi A (Adenine) sản phẩm của PCR sử dụng enzym Taq-polymerase, theo nguyên tắc bổ
sung tạo nên plasmid tái tổ hợp mang đoạn ADN ngoại lai. Sản phẩm sau phản ứng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
được chuyển nạp vào các tế bào khả biến E. coli DH5α-T1 (Invitrogen), và được nuôi cấy để chọn lọc các dòng tế bào tái tổ hợp nhằm thu nhận mốt số lượng lớn plasmid tái tổ hợp chính xác. Các bước như sau:
* Thực hiện phản ứng nối ADN ngoại lai và sản phẩm của PCR (Bảng 3) Bảng 3. Thành phần phản ứng nối
Tên hóa chất Thể tích (µl)
Nước tinh khiết vô trùng 2,5
Vector pCR®2.1-TOPO® 0,5
Sản phẩm PCR 2
Salt solution 1
Tổng thể tích 6
* Chuyển nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến DH5α-T1
Lấy 2- 3 µl hỗn hợp nối plasmid cho trộn với 50 µl tế bào khả biến E. coli
DH5α-T1, rồi ủ trong đá trong 45 phút. Sau đó hỗn hợp được xử lý sốc nhiệt ở 42°C trong 45 giây và ngay lập tức chuyển vào ủ trên đá lạnh trong 2 phút. Cho vào hỗn dịch tế bào nói trên 250 µl môi trường dinh dưỡng SOC [thành phần: Trypton (20 g/l); dịch chiết nấm men (5 g/l); NaCl (10 mM); KCl (2.5 mM); MgCl2 (10 mM); MgSO (10 mM) và glucose (20 mM)]. Toàn bộ hỗn hợp này được lắc 220
95oC – 5 phút 95oC – 1 phút
50oC – 10 giây 35 chu kì 72oC – 1 phút 30 giây
vòng/phút ở nhiệt độ 37°C trong 1 giờđể vi khuẩn tái tổ hợp nhân lên trong vài chu kỳ sinh trưởng và phát triển.
* Nuôi cấy chọn lọc tế bào tái tổ hợp
Lấy khoảng 100- 150 µl của toàn bộ hỗn hợp sau khi nuôi 1 giờ này trải đều trên mặt thạch LB-agar 1,5% đã chuẩn bị sẵn (bổ sung Kanamycin 50 µl (40mg/ml) và 100µl X-gal (40mg/ml), ghi nhãn), và ủở 37°C trong 18- 20 giờ.
* Chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp
Sau ủ 18-20 giờ, các đĩa thạch được lấy ra để chọn lọc các dòng vi khuẩn tái tổ hợp (các khuẩn lạc màu trắng là các khuẩn lạc của vi khuẩn có khả năng mang plasmid tái tổ hợp, theo cơ chế chọn lọc X-gal). Tiếp tục cấy các khuẩn lạc trong các ống môi trường LB lỏng có bổ sung Kanamycin, sau đó được lắc trong máy lắc
điều nhiệt (200 vòng/phút, 370C) trong 10-20 giờđể các tế bào sinh trưởng và nhân lên với số lượng lớn.
* Tách chiết ADN plasmid tái tổ hợp
Sử dụng bộ hoá chất QIA Prep Spin Kit của hãng QIAGEN để tách chiết ADN plasmid tái tổ hợp. Cụ thể như sau:
- Chuyển dung dịch từ ống nuôi sang ống Eppendorf. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ dịch trong, thu được cặn tế bào.
- Thêm 250 µl Buffer P1 (đã thêm ethanol), trộn đều bằng pipet cho tan cặn tế
bào.
- Thêm 250 µl P2, lắc đều, để nhiệt độ phòng 4-5 phút.
- Thêm 350 µl N3, ly tâm lạnh 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Chuyển 850 µl dịch trong lên màng cột lọc, rồi ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, sau đó bỏ dịch dưới.
- Thêm 500 µl PB, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch dưới.
- Thêm 750 µl PE, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, sau đó bỏ dịch dưới, ly tâm thêm lần nữa cho màng khô và chuyển cột lọc sang ống Eppendorf mới.
- Thêm 50 µl, để nhiệt độ phòng 3 phút, sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 4 phút. Dịch bên dưới là DNA plasmid tái tổ hợp. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- ADN plasmid tái tổ hợp được cắt kiểm tra bằng enzym giới hạn EcoRI, khi
điện di trên thạch agarose 1%, sẽ cho 1 đoạn có kích thước 3,9 kb của vector pCR®2.1TOPO®, và 1 (hoặc 2) đoạn có kích thước tương đương với đoạn ADN sản phẩm của PCR. Soi gen và chụp hình kết quảđiện di trên máy Dolphin-DOC, phần mềm Wealtec Dolphin 1.1.
- Sản phẩm sau cắt được điện di kiểm tra trên thạch agarose 1%, nếu sản phẩm cắt cho kết quả tương ứng với kích thước ADN sản phẩm PCR, thì ADN plasmid tái tổ hợp được thu nhận và được giải trình trình tự.
4.5. Công đoạn 5-Giải trình trình tự
Quá trình giải trình trình tựđoạn sản phẩm thu nhận sau tách dòng được tiến hành hoặc với mồi xuôi (hoặc với mồi ngược) là các chuỗi oligonucleotide được thiết kế bám vào các trình tự vector ở hai đầu đoạn ADN ngoại lai được gài vào. Mồi dùng để giải trình trình tự ADN plasmid tái tổ hợp gồm:
- Mồi ngược (M13R): 5’-CAGGAAACAGCATTGAC-3’ * Thành phần phản ứng giải trình trình tự (Bảng 4).
Bảng 4. Thành phần phản ứng giải trình trình tự
Tên hóa chất Thể tích (µl)
Big Dye 1
ADN plasmid tái tổ hợp 3
Mồi (1 pmol/µl) 3,2
Nước tinh khiết 3,8
Enhance (hóa chất kích hoạt) 10
Tổng thể tích 20
*Chu trình nhiệt của phản ứng giải trình trình tự:
Sau kết thúc, chuyển về 4oC bảo quản cho đến khi kiểm tra. * Thực hiện phản ứng giải trình trình tự:
Phản ứng giải trình trình tự được tinh sạch bằng bộ hoá chất Dye-Ex 2.0 Spin Kit (QIAGEN); sản phẩm sau khi tinh sạch, được đông khô và đọc trình tự trên máy tựđộng ABI-3100 Avant Genetic Analyzer (Mỹ).
4.6. Công đoạn 6-Phân tích gen 12S và cox1để giám định gen
Thực hiện cùng lúc 2 phương thức giám định sau đây:
*Giám định gen bằng phương pháp so sánh đối chiếu : Chuỗi nucleotide của phản ứng giải trình trình tự gen 12S và cox1, được xử lý để có chuỗi cuối cùng. Thành phần nucleotide chuỗi gen 12S và cox1, và amino acid của cox1 được sử
dụng để truy cập Ngân hàng gen, đồng thời so sánh đối chiếu với các gen tương ứng hiện có. Từ kết quả so sánh, nếu có mức độ tương đồng nucleotide và amino acid cao (>98%) với D. pteronyssinus thì kết luận cá thể (lô nuôi) mạt đó chính là D. pteronyssinus.
*Giám định gen bằng phương pháp phân tích phả hệ : Chuỗi nucleotide của gen 12S và cox1, và amino acid của cox1được sử dụng để phân tích phả hệ nguồn gốc với các chuỗi gen tương ứng của các loài mạt/côn trùng có trong Ngân hàng gen, bằng chương trình GENEDOC2.5 và MEGA4.0 (phương pháp NJ, Neighbour- Joining ; 1000 bootstrap). Trên cây phả hệ, nếu vị trí của chuỗi gen cần so sánh sắp xếp cùng nhóm, trong một nhánh, gần kề với chuỗi gen của D. pteronyssinus, thì kết luận cá thể (lô nuôi) mạt đó chính là D. pteronyssinus.
V. Tài liệu hướng dẫn và trích dẫn 92oC – 5 phút