4.1. Công đoạn 1- Thu thập mẫu mạt
Mạt được nuôi cấy theo lô từ một quần thểđược xác định hình thái học từ trước, lô nào cần chẩn đoán phân tử thì thu từng cá thể vào ống Eppendorf để tách chiết khuôn ADN riêng biệt để xác định cá thể; đồng thời thu 10-20 con vào ống mẫu khác để xác định quần thể.
4.2. Công đoạn 2- Tách chiết ADN tổng số
Mục đích: Thu nhận ADN tổng số của mạt cần chẩn đoán (đó là D. pteronyssinus) với hàm lượng cao, và đảm bảo độ tinh khiết làm khuôn cho PCR. ADN tổng sốđược tách ra bao gồm ADN của hệ gen nhân và hệ gen ty thể của riêng loài mạt cần chẩn đoán và có thể lẫn tạp ADN nhiều loài khác cần phân biệt.
Cách tiến hành: Quy trình tách chiết DNA tổng số sử dụng QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) được mô tả tóm tắt như sau: mẫu bảo quản -20oC được lấy ra và để ở nhiệt độ phòng. Mẫu vật được nghiền kỹ và xử lý với các dung môi của bộ kit, rồi hấp phụ lên màng và ly chiết ADN theo qui trình tách chiết của hãng sản xuất như sau: - Mẫu mạt (một cá thể hay nhiều cá thể) cho vào ống nghiền, dùng chày chuyên biệt nghiền nhỏ.
Thu thập mẫu mạt
Tách chiết DNA tổng số
Thực hiện PCR đặc hiệu gen 12S
(cặp mồi: Dp12F - Dp12R)
Xác định độdài trên agarose
(0,4 kb)Dermatophagoides pteronyssinus Dermatophagoides pteronyssinus Thu thập mẫu mạt Tách chiết DNA tổng số Thực hiện PCR đặc hiệu gen 12S (cặp mồi: Dp12F - Dp12R)
Xác định độdài trên agarose
(0,4 kb)
)
- Cho 180 µl Buffer ATL, tiếp tục dùng chày nghiền nhỏ mẫu để thu được dung dịch đồng nhất.
- Thêm 20 µl Proteinase K, trộn đều, ủở 56oC trong 1-2 giờ. - Thêm 4 µl Rnase và 200 µl Buffer AL, ủở 70oC trong 30 phút. - Thêm 200 µl Ethanol (96- 100%), trộn đều.
- Chuyển dịch lên cột, ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch dưới. - Thêm 500 µl Buffer AW1, rồi ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch dưới - Thêm 500 µl Buffer AW2, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ dịch dưới, ly tâm thêm một lần nữa.
- Chuyển cột sang ống Eppendorf sạch. Cho 60 Buffer AE lên màng cột lọc, để nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sau đó ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch bên dưới là ADN tổng số của mẫu mạt. Ký hiệu mẫu, bảo quản ở -20oC.
- ADN tổng số tách chiết ra được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên thạch agarose 1%, ở hiệu điện thế 100V trong 25 phút. Chụp ảnh dưới ánh sáng tia tử ngoại của máy soi chụp gel Dolphin- Doc (WEALTEC, USA) và ghi vào máy vi tính.
4.3. Công đoạn 3- Thực hiện phản ứng PCR đặc hiệu thu gen 12S
- Mục đích: Thu nhận đoạn gen 12S nhờ phản ứng PCR đặc hiệu với cặp mồi Dp12F-Dp12R. Đây là cặp mồi bám đặc hiệu trên gen 12S của riêng loài D. pteronyssinus. Nếu có xuất hiện sản phẩm, chứng tỏ có tồn tại loài mạt D. pteronyssinus.
- Lựa chọn mồi: Cặp mồi dùng để thực hiện việc nhân đoạn gen 12S là Dp12F- Dp12R là cặp mồi đã được xác định đặc hiệu cho riêng D. pteronyssinus trong phản ứng PCR đơn gen (uniplex-PCR). Chúng tôi đang xây dựng phản ứng PCR đa loài (multiplex-PCR), nhằm chẩn đoán phân biệt cùng lúc nhiều loài mạt thường gặp.
Cặp mồi Dp12F-Dp12R và sản phẩm PCR : Tên mồi Trình tự Độ dài (bp) Độ dài của sản phẩm thu được Dp12F 5’ AAACTAGGATTAGATACCCTAG 3’ 22 Dp12R 5’ TACTATGTTACGACTTATCTATC 3’ 23 395 bp (một phần gen 12S) đặc hiệu riêng D. pteronyssinus - Cách tiến hành: Phản ứng PCR sử dụng ADN tổng số làm khuôn, cặp mồi Dp12F-Dp12R để nhân đoạn gen 12S, sử dụng dung môi của bộ kit PCR (Promega), trên máy PCR (ví dụ: PTC-100). Bố trí phản ứng đối chứng dương với khuôn là ADN plasmid chứa đoạn gen 12S của D.pteronyssinus.
)
*Thành phần cho một phản ứng PCR:
Tên hóa chất Thể tích (µl)
PCR Master mix (Promega) 25
Mồi xuôi (10pmol/ul) 3
Mồi ngược (10pmol/ul) 3
ADN tổng số (50ng/ul) 2
Nước tinh khiết vô trùng 17 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tổng thể tích 50
*Chu trình nhiệt của phản ứng:
Sau kết thúc, chuyển về 4oC bảo quản cho đến khi kiểm tra.
4.4. Công đoạn 4- Kiểm tra sản phẩm PCR trên thạch agarose
ADN sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên thạch agarose 1%. Thạch agarose 1% được chuẩn bị bằng cách cho 0,4 g bột thạch agarose trong 40 ml dung dịch 1xTAE, rồi cho vào lò vi sóng trong 3 phút. Khi thạch tan chảy cho thêm Ethidium Bromide, tiến hành đúc thạch bằng dụng cụ chuyên dùng, cài răng lược và để nguội cho thạch đông trong 2-3 giờ. Trộn mẫu kiểm tra với chất chỉ thị màu (loading dye) và tra mẫu sản phẩmảPC cùng với chỉ thị ADN (ADN của Lamda cắt bằng
HindIII), rồi điện di với hiệu điện thế 90-100 Volt, 250 miliAmpe, trong khoảng 30-35 phút. Sau đó, quan sát dưới ánh sáng tia tử ngoại trong hệ thống máy soi gel và chụp ảnh Dolphin - DOC (Wealtec- Mỹ).
4.5. Công đoạn 5-Đánh giá kết quả chẩn đoán D. pteronyssinus
*Trường hợp dương tính: Sản phẩm PCR hiển thị trên thạch agarose 1% có kích thước khoảng 0,4 kb (chính xác là 395 bp) từ nguồn khuôn là ADN của lô (cá thể) mạt cần chẩn đoán, giống nhưđộ dài của đối chứng dương thực hiện với khuôn là ADN của
D. pteronyssinus và đối chứng âm không sản phẩm.
Kết luận cá thể (lô nuôi) mạt đó chính là D. pteronyssinus.
*Trường hợp âm tính: Sản phẩm PCR không hiển thị trên thạch agarose 1% có kích thước khoảng 0,4 kb (chính xác là 395 bp) từ nguồn khuôn là ADN của lô (cá thể) mạt cần chẩn đoán, trong khi đó đối chứng dương, thực hiện với khuôn là ADN của D. pteronyssinus, có đoạn ADN đơn nhất kích thước 0,4 kb và đối chứng âm không sản phẩm.
Kết luận cá thể (lô nuôi) mạt đó không có loài D. pteronyssinus.
95oC – 5 phút 95oC – 1 phút
50oC – 10 giây 35 chu kì 72oC – 1 phút 30 giây
)
*Trường hợp không hiển thị ADN: Trên thạch agarose 1% không thấy hiển thị bất kỳ ADN nào, từ mẫu nghiên cứu, đối chứng dương, đối chứng âm. Cần thực hiện lại phản ứng đểđánh giá.