BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CÔNG TY VACCINE PASTEUR ĐÀ LẠT BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NHÁNH KC10-10/06-10/01 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÂN LẬP GIÁM ĐỊNH HÌNH THÁI HỌC LOÀI MẠT BỤI NHÀ ACARIEN D.P
Trang 1BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CÔNG TY VACCINE PASTEUR ĐÀ LẠT
BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NHÁNH
KC10-10/06-10/01
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÂN LẬP GIÁM ĐỊNH HÌNH THÁI HỌC LOÀI MẠT BỤI NHÀ ACARIEN
D.PTERONYSSINUS GÂY CÁC BỆNH DỊ ỨNG:
HEN PHẾ QUẢN, VIÊM MŨI DỊ ỨNG, VIÊM KẾT MẠC
Chủ nhiệm đề tài nhánh: PGS TS Nguyễn Đức Trọng
TS Nguyễn Văn Châu
Thời gian thực hiện: 01/4/2007- 28/5/2007
7598-1
20/01/2010
HÀ NỘI-2009
Trang 2BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CÔNG TY VACCINE PASTEUR ĐÀ LẠT
BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NHÁNH
KC10-10/06-10/01
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÂN LẬP GIÁM ĐỊNH HÌNH THÁI HỌC LOÀI MẠT BỤI NHÀ ACARIEN
D.PTERONYSSINUS GÂY CÁC BỆNH DỊ ỨNG:
HEN PHẾ QUẢN, VIÊM MŨI DỊ ỨNG, VIÊM KẾT MẠC
Chủ nhiệm đề tài nhánh: PGS TS Nguyễn Đức Trọng
TS Nguyễn Văn Châu
Cán bộ thực hiện:
GS TSKH Vũ Minh Thục
TS Nguyễn Văn Châu
TS Võ Thanh Quang
Ths Huỳnh Quang Thuận
KS Đinh Văn Minh
Trang 3Nghiên cứu quy trình phân lập giám định hình thái học loài
mạt bụi nhà Acarien D pteronyssinus gây các bệnh dị ứng:
Hen phế quản, viêm mũi dị ứng, viêm kết mạc
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Voorhorst và Spieksma 1964, lần đầu tiên chứng minh được rằng mạt sống trong nhà là nguyên nhân gây ra hen phế quản do bụi nhà Sau này Fain (1965, 1966) chứng minh trong bụi nhà có 3 loài gây ra dị ứng và viêm phế quản là:
Dermatophagoides pteronyssinus, D farinae và Euroglyphus maynei mà trước đó
chưa được xác định Công bố của Fain đã mở đầu cho việc tập trung nghiên cứu mạt bụi nhà và vai trò của chúng trong việc gây bệnh dị ứng và hen phế quản Sau này hàng trăm công trình nghiên cứu trên khắp thế giới đều ghi nhận vai trò của mạt bụi nhà với bệnh dị ứng và hen phế quản Bởi vì thành phần quan trọng nhất của bụi nhà quyết định kháng nguyên của nó và cho rằng dị nguyên bụi nhà chỉ mang tính kháng nguyên khi có sự hiện diện của mạt ở trong bụi Trong các loài
mạt có trong bụi nhà thì D pteronyssinus đóng vai trò quan trọng vì hoạt tính
kháng nguyên của nó cao và là loài sống phổ biến trên toàn thế giới Loài này cũng
là loài chủ yếu để sản xuất vacxin chống dị ứng Ở nước ta gần đây cũng có nhiều công trình nghiên cứu thành phần mạt bụi nhà, phương pháp nhân nuôi và một số
đặc tính sinh hóa của dị nguyên mạt bụi nhà D pteronyssinus [1,3,4,5,7,10] Nhưng việc điều tra, thu thập, phân tích xác định hình thái D pteronyssinus ít được chú ý
Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu quy trình phân lập, giám định hình thái
mạt bụi nhà Acarien D pteronyssinus thu thập ở một số địa phương ở miền Bắc
Việt Nam
Mục tiêu: Cung cấp chủng mạt bụi nhà D pteronyssinus để nhân nuôi trong
phòng thí nghiệm
Trang 42 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tình hình nghiên cứu mạt bụi nhà trên thế giới
Năm 1964, Voorhorst và Spieksma lần đầu tiên chứng minh rằng mạt bụi nhà (MBN) là nguyên nhân gây viêm phế quản do bụi nhà Các tác giả cho rằng do một
loài mạt chưa xác định thuộc giống Dermatophagoides (Bogdanov, 1864)
Sau này một số tác giả đã xác định được một số loài mạt gây dị ứng, hen phế
quản thuộc các giống loài sau: Dermatophagoides pteronyssinus (Trouessart), D
farinae Hughes và Euroglyphus maynei (Cooreman) Ba loài mạt này được công bố
lần đầu tiên do Fain, 1965 và 1966 Các phát hiện trên mở đầu cho các công trình nghiên cứu sau này về vai trò của mạt bụi nhà với bệnh dị ứng và hen phế quản Mạt sống trong bụi nhà gồm một số họ, nhưng quan trọng nhất là họ
Pyroglyphidae vì nó gồm nhiều loài mạt gây ra hội chứng hen phế quản Họ Pyroglyphidae hiện nay trên thế giới đã phát hiện được 18 giống và 46 loài, trong
số này có 13 loài đã được phát hiện trong bụi nhà Một số trong các loài này đã phân bố trên toàn thế giới, một số loài chỉ phân bố ở một số nước Các công trình nghiên cứu về phân loại mạt bụi nhà phải kể đến các tác giả: Bogdanov (1864) đã
mô tả giống Dermatophagoides với loài D scheremetewskyi, ông phát hiện loài này
ở da một bệnh nhân ở Mạc Tư Khoa
Đến năm 1928, Oudemans phát hiện Dermatophagoides trên cây cảnh của một gia đình ở Hà Lan, sau này được xác định chính là loài D pteronyssinus (Fain,
1964)
Năm 1947, Sasa đã phát hiện ra mạt ở nước tiểu và đờm của bệnh nhân ở Nhật
Bản Ông đã đưa ra giống Visceroptes có 2 loài: V saitoi và V takeuchii Sau này
năm 1950, chính ông hiệu đính lại giống của ông đã phát hiện chính là
Dermtophagoides Đến năm 1958 ông lại phát hiện ra loài D scheremetewskyi ở
một kho dược phẩm Tuy nhiên khi xem xét về hình vẽ thì chính là D farinae
Trang 5Năm 1956, Baker và cộng sự phát hiện D schemerementeskyi ở ghế sofa, đệm,
gối long vũ, tổ chim sẻ, thức ăn ngũ cốc cho khỉ
Năm 1964, Voorhorst và Spieksma đã khám phá ra Dermatophagoides rất phổ
biến ở Hà Lan và là nguyên nhân gây ra hen phế quản ở nước đó
Colloff MJ 1987, nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ và độ ẩm đến sự phát triển của mạt ở phòng thí nghiệm và quần thể mạt sồng hoang dã tại Châu Âu Sau này nhiều tác giả đã liên tiếp công bố ra các loài mạt khác nhau Tuy vậy công trình hoàn chỉnh nhất về mạt bụi nhà phải kể đến cuốn: “Mạt và các bệnh dị ứng của A.Fain, B.Guerin, B.J.Hart, 1990” Các tác giả nêu đầy đủ về hình thái học, bệnh lý học do mạt bụi nhà gây nên Tài liệu này giúp ích rất nhiều cho chúng tôi trong việc định loại mạt bụi nhà, nghiên cứu sinh học, sinh thái và nhân nuôi mạt bụi nhà Tuy vậy, việc giám định tên các loài mạt bụi nhà là rất khó, đòi hỏi phải có trang thiết bị hiện đại như kính hiển vi điện tử và chính xác hơn phải dùng đến công nghệ gen
2.2 Tình hình nghiên cứu mạt bụi nhà ở Việt Nam
Ở Việt Nam, có một số công trình nghiên cứu về mạt bụi nhà được tiến hành trong những năm gần đây, cụ thể như sau:
Năm 1982, Nguyễn Văn An, Nguyễn Văn Hướng, Vũ Minh Thục đã Nghiên cứu dị nguyên toàn phần bụi nhà
Vũ Minh Thục và Pariadin đã tiến hành điều tra thành phần loài mạt bụi nhà tại Hà Nội (từ tháng 9/1984 - 7/1986), đã rút ra kết luận: mạt bụi nhà thu thập ở Hà
Nội gồm 5 loài (Dermatophagoides pteronyssinus, Glycyphagus domesticus,
Tyrophagus sp., Tyrophagus putresceniae, Chyletidae), chúng có trong 80% số
mẫu bụi nhà Hai loài D pteronyssinus và Glycyphagus domesticus nhiều nhất
trong bụi nhà ở Hà Nội
Năm 1987, Vũ Minh Thục, Nguyễn Văn An, Nguyễn Chí Phi đã Nghiên cứu
về thành phần hóa sinh miễn dịch của dị nguyên bụi nhà
Trang 6Năm 1990, Vũ Minh Thục đã nghiên cứu vai trò của mạt bụi nhà trong bệnh dị ứng (luận văn Phó tiến sĩ)
Năm 1993, Nguyễn Văn Hướng và cộng sự đã nghiên cứu điều chế, tiêu chuẩn hóa và ứng dụng trong lâm sàng của dị nguyên bụi nhà tòan phần
Năm 1996, Nguyễn Văn An, Vũ Minh Thục, Phạm Quang Đoàn, Lê Văn Khang đã nghiên cứu độ mẫn cảm của dị nguyên bụi nhà và hiệu quả của chúng Nhìn chung nhóm các tác giả kể trên ít đề cập đến điều tra các loài, hình thái sinh học của mạt bụi nhà Mãi tới năm 2001 trở đi mới có các công trình công bố
về một số loài mạt bụi nhà ở nước ta
Năm 2001, Vũ Minh Thục, Phạm Quang Chinh, Lưu Tham Mưu, Đái Duy
Ban đã điều tra, nghiên cứu 2 loài mạt bụi nhà gây bệnh dị ứng: D pteronyssinus
và Glycyphacus domesticus ở Hà Nội và các vùng lân cận
Năm 2002, Vũ Minh Thục, Phạm Quang Chinh, Đái Duy Ban đã nuôi cấy mạt
bụi nhà D pteromyssinus tạo nguồn dị nguyên góp phần chẩn đoán và điều trị bệnh
dị ứng do mạt bụi nhà Các tác giả điều tra thu thập mạt bụi nhà tại Hà Nội và vùng phụ cận, đã rút ra nhận xét: ở Hà Nội và vùng phụ cận 91,59% số mẫu bụi đều có
mạt bụi nhà; hai loài D domesticus và D pteronyssinus phổ biến nhất ở đây, tỉ lệ của chúng là 52,19% và 40,93% so với tổng số mạt cho mỗi loài Mật độ D
domesticus và D pteronyssinus trong bụi nhà nông thôn nhiều hơn trong bụi nhà
thành phố Mùa phát triển thuận lợi nhất của mạt bụi nhà ở Hà Nội và vùng phụ cận
là mùa xuân và thu đông[1]
Các công trình công bố ở trong và ngoài nước là cở sở cho chúng tôi nghiên
cứu phân loại D pteronyssinus và sinh học, sinh thái để nhân nuôi loài này trong
phòng thí nghiệm với quy mô đủ để sản xuất dị nguyên
3 Thời gian, địa điểm, vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.1 Thời gian thực hiện : từ tháng 4/2007 đến tháng 3/2008
Trang 73.2 Điểm điều tra
- Hà Nội (Nghĩa Tân - Cầu Giấy và Trung Văn, Từ Liêm)
- Vĩnh Phúc (Xã Ngọc Thanh - Phúc Yên)
- Hòa Bình (Đa Phúc-Yên Thủy)
- Sơn La (Mộc Châu)
- Hải Dương (Sao Đỏ, Chí Linh)
3.3 Vật liệu thu thập mạt bụi nhà
- Máy hút bụi National MC-4500
- Chổi quét bụi (chổi quét sơn)
- Lọ nhựa có nắp đựng bụi (0,5 lit)
- Bình nón thủy tinh 0,5 lit
3.4 Phương pháp điều tra
Điều tra cắt ngang, chọn thời gian ở địa phương có nhiệt độ và độ ẩm phù hợp với mùa phát triển của mạt bụi nhà (độ ẩm: 75% - 85%, nhiệt độ 28-300 C) Thường mỗi năm có hai thời điểm: tháng 2 đến tháng 4 và tháng 9 đến tháng 11
Tại các điểm ở nông thôn, chọn các nhà dân tương đối ẩm thấp, nền đất, mái tranh; ở vùng thành thị chọn những nhà cấp bốn để điều tra mạt bụi nhà Ngoài ra, chúng tôi đã thu thập mạt bụi nhà ở một số nhà nghỉ khu vực Đại Lãi (Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc)
Trang 8Cách thu thập mạt bụi nhà: dùng máy hút bụi lần lượt hút khắp hai bề mặt chiếu, đệm, chăn, gối, giường của từng gia đình; sau đó tháo tụi đựng bụi ra và dùng chổi quét bụi vào tấm ni lon; nhặt bỏ hết rác chỉ còn bụi cho vào lọ có nắp vặn chặt, hay túi ni lông buộc chặt miệng túi bằng dây chun và ghi nhãn cẩn thận (thời gian, tên chủ nhà, tên địa phương) Bụi của từng nhà bỏ riêng từng lọ
Tách chiết mạt từ bụi nhà trong phòng thí nghiệm
Trước hết sàng lọc bụi nhà qua rây có mắt lưới 0,1mm để loại bỏ những chất thô, sau đó tách khỏi bụi bằng hai phương pháp:
- Theo phương pháp Berlese: Cho bụi vào phểu thủy tinh có lót 2 lớp vải màn
để bụi không rơi; đặt phểu vào bình nón (0,5-1lit), trên phểu chiếu một bóng đèn điện công suất 60w, trong thời gian 24h, do tác dụng của nhiệt từ bóng đèn mạt bụi nhà sẽ từ từ chui xuống đáy phểu và xuống bình nón, sau đó ta lấy mạt trong bình nón ra đếm, phân loại và nuôi cấy
- Phương pháp Hart và Fain (196; 1 g bụi mịn ngâm trong cồn 800 qua đêm, nhẹ nhàng gạn phần nổi trên ra cốc và cho dung dịch NaCl bão hoà vào và để yên trong 10 phút Nhẹ nhàng rót phần nỗi lên trên giấylọc trong phểu Boc ơ Dùng nước cất rửa cặn rồi cũng rót lên giấy lọc Chuyển mạt ừ giấy lọc sang lam kính để đếm
- Phương pháp nhân giống mù (của chúng tôi):
Cho khoảng 1-2g bụi mịn sau khi đã rây lọc cho vào lọ nhựa 0,5 lít có nắp đậy
và cho khoảng 1g môi trường thức ăn nuôi mạt vào, để trong phòng thí nghiệm 2-3 tuần Do điều kiện nhiệt độ và độ ẩm thuận lợi, nên mạt sẽ phát triển gia tăng về số lượng, từ đó ta có thể dễ dàng tìm thấy mạt, sau đó san bụi hỗn hợp bụi, mạt và thức ăn trong lọ ra nhiều đĩa petri, cho thức ăn vào để nhân nuôi tiếp Đồng thời chọn các loài mạt cần nuôi cho riêng từng đĩa petri để nuôi thuần chủng từng loài
Trang 9Những loài mạt không phải là D pteronyssinus được làm tiêu bản để định loài Loài D pteronyssinus được tách riêng để nuôi trong phòng thí nghiệm
- Phân loại mạt bằng đặc điểm hình thái ngoài theo tài liệu phân loại của Fain
A, Guerin B, Hart BJ, 1990 ; Colloff and F.Th.M.Sieksma, 1992 và
Bregetova, 1977
4 Kết quả nghiên cứu
4.1 Kết quả thu thập và tách chiết mạt từ bụi nhà
Bảng 1 Tỷ lệ mẫu bụi nhà có mạt ở các điểm nghiên cứu
Trang 10Bảng 2 Mật độ mạt chung các loài trong 1g bụi nhà tại các địa phương
Địa điểm Số mẫu có
Ghi chú : * : địa phương hàng năm có phun và tẩm màn hoá chất diệt muỗi
Nhìn chung, số lượng ca sthể mạt chung các loài trong bụi nhà tại các địa phương điều tra không cao, trung bình 40±34 con/1g bụi Mật độ mạt thấp nhất ở khu vực Hà Nội (23 con/1g bụi) và cao nhất ở Sơn La (42 con/1g bụi) Mật độ mạt trong bụi nhà tại các địa phương điều tra thấp do tác động của nhièu yếu tố, trong
đó có yếu tố vệ sinh (giặt chăn màn, vệ sinh giường đệm…) và tác động của hoá chất diệt côn trùng mà trực tiếp là hoá chất diệt muỗi
Bảng 3 Thành phân loài và tỷ lệ % cá thể các loài mạt bụi nhà tại các điểm
Địa điểm và Tỷ lệ % các thể các loài mạt
TT Tên loài mạt Hà
Nội
Vĩnh Phúc
Hòa Bình Sơn
La
Hải Dương
Trang 11Ghi chú : Sau khi điều tra thu thập mạt bụi nhà, chúng tôi định loại và gửi mẫu đi giám
định tại Viện Y học nhiệt đới – Vương Quốc Bỉ (người định tên mạt là Andre’ Bochkov* ngày,
14.V.2008; mẫu mạt được Marc Coosemons chuyển giúp từ Việt Nam sang) và Viện Vacxin
Mechnhikop Mạc Tư Khoa (người định danh mạt là Emelianova O.J**)
Điều tra mạt bụi nhà ở 5 địa phương (mỗi tỉnh 1-2 điểm), chúng tôi đã phân
tích xác định được 10 loài mạt bụi nhà Trong đó hai loài phổ biến là
Dermatophagoides pteronyssinus (Trouessart) và Glycyphagus domesticus (De
Geer) đều thu thập ở năm địa phương Loài D pteronyssinus chiếm tỷ lệ các thể so
với các loài ở các điểm từ 31,25% - 43,54% Loài Glycyphagus domesticus chiếm
tỷ lệ các thể so với các loài ở các điểm từ 21,34% - 40,59% Số loài mạt bụi nhà thu
thập ở các điểm không giống nhau; tại Hà Nội 8 loài, ở Vĩnh Phúc được 10 loài,
Hoà Bình và Sơn La đều 9 loài, Hải Dương chỉ thấy 6 loài (bảng 3)
Trang 124 2 Hình thái phân loại mạt bụi nhà
4 2.1 Vị trí phân loại các loài mạt chủ yếu đã thu thập
Như vậy ở bụi nhà có nhiều loài mạt, các loài này phát hiện thấy ở chăn, chiếu, đệm, gối của các nhà dân và ở các nhà nghỉ
Loài Dermatophagoides pteronyssinus thuộc giống Dermatophagoides
Bogdanov, 1864
Phân họ Dermatophagoidinae Fain, 1963
Họ Pyroglyphidae
Bộ PROSTIGMATA Phân bô ACTINEDIDA
Bộ MESOSTIGMATA Phân bộ GAMASINA
DERMANISOIDEA
CHELEYTOIDEA TROMBIDIOIDEA
Bộ Astigmata Phân bộ ACARIDINA
DEMOICOIDEA DERMANISIDAE
Dermanyssus sp
Cheyletiellidae
Cheyltus malaccensis
Acacridae Glycyphagidae Carpoglyphida e
Trang 13Bộ Acariformes
Phân lớp Acarina
Lớp nhện Arachnida
Ngành chân đốt Arthropoda
4.2.2 Đặc điểm hình thái một số loài mạt bui nhà phổ biến
4.2.2.1 Loài Dermatophagoides pteronyssinus (Trouessart, 1897) (H 1, 2,3)
Mạt đực và mạt cái đều có có dạng hình cầu, kích thước chiều dài 420 µm và rộng là 250-320µm Thân có màu trắng kem và các nếp nhăn cuticul, giai đoạn trưởng thành và sau ấu trùng có 8 chân, giai đoạn ấu trùng có 6 chân Có thể nhìn thấy mạt dưới kính lúp tay khi đặt mạt trên nền màu đen
+ Phần miệng (Gmathosoma) gồm 2 phần: mép sau miệng ở phía bụng, kết thúc ở phía bên trong của đôi chân xúc giác (pedipalps) và một cặp kìm ở lưng + Phần đầu bụng (Idiosoma): mang 4 cặp chân ở con trưởng thành và 3 cặp chân ở ấu trùng Phần trước của Idiosoma có miệng, chân xúc giác và cặp kìm Một rãnh ngang nằm ở giữa chân 2 và 3 gọi là rãnh Sejugal
Idiosoma chia làm 4 phần:
+ Prodosoma: vùng này mang cặp chân thứ 1 và 2, nằm giữa Sejugal
+ Metapodosoma: vùng mang đôi chân thứ 3 và 4
+ Opisthosoma: vùng nằm sau cặp chân thứ 4
+ Hysterosoma: nằm ở phía sau cặp chân thứ 2
Các phần trên rất quan trọng trong phân loại
Phân bố : D pteronyssinus là mạt nhà thực sự và phân bố khắp thế giới Ở
phần lớn các nước, nó là loài mạt phổ biến và đông đảo nhất của họ Pyroglyphidae,
nó có trong bụi nhà và giường ngủ Giường ngủ có mức độ nhiễm cao hơn so với thảm hoác nề bụi nhà Ở Viêt Nam loài mạt này có mặt hầu hết các điểm điều tra và chiếm số lượng cá thể ưu thế nhất trong các loài