tiêu chuẩn hóa phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh hóa của trung tâm học liệu đh cần thơ @ tài liệu học tập và nghiên cứu vi khuẩn aeromonas hydrophila tại khoa thủy sản

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứuTÓM TẮT Đề tài được thực hiện nhằm tìm hiểu những chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa sai khác từ phương pháp truyền thống và sử d

Trang 1

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

VI KHUẨN Aeromonas hydrophila TẠI KHOA THỦY SẢN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2008

Trang 2

LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần Thơ Đặc biệt là các thầy cô thuộc bộ môn Sinh học và Bệnh học Thủy sản đã truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình em học tập và nghiên cứu tại trường

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh và chị Nguyễn Thị Tiên đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp

Đồng thời xin gởi lời cám ơn đến cô cố vấn Nguyễn Thị Thu Hằng cùng gia đình

và các bạn lớp Bệnh học Thủy sản K30 đã động viên và hỗ trợ cho em trong thời gian học tập cũng như thực hiện đề tài tốt nghiệp

Trang 3

TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện nhằm tìm hiểu những chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa sai khác

từ phương pháp truyền thống và sử dụng kít API 20E Đồng thời cũng so sánh với những kết quả định danh của các nghiên cứu trước đây tại bộ môn và một số tài

liệu nghiên cứu khác Qua đó, đề xuất các chủng vi khuẩn A hydrophila tham

khảo cùng với phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa dùng để khi định danh vi khuẩn trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa được chọn để định

danh dựa theo hệ thống phân loại của Baumann et al(1984) Các đặc điểm sinh lý,

sinh hóa được xác định dựa theo cẩm nang Cowan và Steel (Barrow và Feltham,

1993) và phương pháp của West và Colwell (1984) Tám chủng Aeromonas hydrophila (A hydrophila) gồm CAF 2 (LMG 2844, chủng chuẩn), CAF 23,

CAF25, CAF 131, CAF 132, CAF 133, CAF 134 và CAF 135 là các chủng đã được phân lập và định danh từ các đề tài trước và được trữ trong tủ âm 800C

Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ Các chủng A hydrophila đều là vi

khuẩn gram âm, hình que ngắn, di động, catalase dương tính, oxidase âm tính và

có khuẩn lạc dạng tròn, nhẵn Đặc điểm khác cơ bản ở các chủng A hydrophila

này với các nghiên cứu trước là các chủng đều cho kết quả oxidase âm tính Phương pháp định danh truyền thống và API 20E thể hiện ở các chỉ tiêu giống nhau thì kết quả thể hiện giống nhau nhưng chỉ khác ở phản ứng của các chủng nghiên cứu đối với chỉ tiêu arginine và ornithine trong cùng điều kiện phòng thí nghiệm Các chủng nghiên cứu qua kiểm tra bằng phương pháp PCR (Panangala

et al, 2007) chưa cho sản phẩm đặc hiệu (không hiện vạch 209bp)

Trang 4

MỤC LỤC

Trang PHẦN 1

GIỚI THIỆU 01

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 03

2.1 Bệnh trên động vật thủy sản 03

2.2 Bệnh do vi khuẩn trên động vật thủy sản 04

2.3 Vi khuẩn Aeromonas sp 05

2.4 Phương pháp định danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila 08

PHẦN 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 11

3.2 Vật liệu 11

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu 11

3.2.2 Thiết bị 11

3.2.3 Hóa chất, thuốc thử và môi trường để kiểm tra các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn 11

3.2.4 Các hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR 13

3.2.5 Các chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila 13

3.3 Phương pháp nghiên cứu 13

3.3.1 Định danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila bằng phương pháp truyền thống 14

3.3.2 Định danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20E 14

3.3.3 Phát hiện vi khuẩn bằng phương pháp PCR 16

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

Trang 5

4.1 Kết quả 19

4.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng vi khuẩn A hydrophila xác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống 19

4.1.2 Kiểm tra kết quả định danh vi khuẩn A hydrophila theo bộ kít API 20E 23

4.1.3 Kết quả kiểm tra bằng phương pháp PCR 25

4.2 Thảo luận 26

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 29

5.1 Kết luận 29

5.2 Đề xuất 29

TÀI LIỆU THAM KHẢO 30

PHỤ LỤC 35

Trang 6

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 3.1: Các nguồn vi khuẩn 13 Bảng 3.2: Bảng đọc kết quả bộ kít API 20E 16 Bảng 3.3: Thành phần tham gia phản ứng PCR 17 Bảng 4.1: Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá của chủng vi khuẩn

chuẩn và 7 chủng tham khảo 19 Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra bằng bộ kít API 20E chủng vi khuẩn chuẩn

và 7 chủng tham khảo 24

Trang 7

DANH SÁCH HÌNH

Trang Hình 3.1 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR theo

quy trình Panangala et al (2007) có chỉnh sửa 18

Hình 4.1 Hình dạng A hydrophila (100X) 21

Hình 4.2 A hydrophila trên môi trường TSA 21

Hình 4.3 A hydrophila trên môi trường Aeromonas agar 22

Hình 4.4 Phản ứng citrate (+) 22

Hình 4.5 Phản ứng VP (+) 23

Hình 4.6 Phản ứng indole (+) 23

Hình 4.7 Kết quả định danh API 20E của dòng CAF2 (a) và dòng CAF25 (b) 25

Hình 4.8 Kết quả điện di 5 chủng A hydrophila 26

Trang 8

PHẦN 1

GIỚI THIỆU

Nghề nuôi thủy sản trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng đang phát triển rất nhanh Ở Việt Nam trong báo cáo tháng 12 năm 2007 của Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn thì sản lượng nuôi thủy sản đạt 2.085 nghìn tấn tăng 23% so với năm 2006 Tuy nhiên, do lợi nhuận cao nên diện tích nuôi trồng thủy sản tăng cũng rất nhanh và mật độ nuôi cũng tăng dẫn đến tình trạng ô nhiễm môi trường, dịch bệnh xảy ra tràn lan và mầm bệnh ngày càng đa dạng nhất là bệnh do vi khuẩn Trong số các mầm bệnh vi khuẩn ở thủy sản thì vi

khuẩn Aeromonas hydrophila là một trong những tác nhân gây bệnh nổi bật

Chúng xuất hiện cũng như gây chết trên nhiều đối tượng thủy sản khác nhau

Hiện nay có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để định danh vi khuẩn

A hydrophila Các phương pháp phổ biến là phương pháp sinh hóa truyền thống

hoặc bộ kít API 20E để kiểm tra các đặc tính sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn Tuy nhiên, các đặc điểm sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn thường biến đổi tùy thuộc vào điều kiện của từng phòng thí nghiệm, loại hóa chất sử dụng, hãng cung cấp và chủng vi khuẩn chuẩn hay chủng tham khảo được sử dụng Hiện tại, các

kỹ thuật phân tử như PCR (phản ứng trùng hợp), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) và AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

cũng được sử dụng để định danh A hydrophila nhằm khẳng định kết quả định

danh bằng phương pháp sinh hóa

Đề tài “Tiêu chuẩn hóa phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa

của vi khuẩn Aeromonas hydrophila” được thực hiện tại Khoa Thủy sản nhằm

mục đích tìm hiểu những chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa sai khác từ phương pháp truyền thống và sử dụng kít API 20E Đồng thời cũng so sánh với những kết quả định danh của các nghiên cứu trước đây tại bộ môn Mục đích cuối cùng của đề

tài là đề xuất các chủng vi khuẩn A hydrophila tham khảo cùng với phương pháp

xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa dùng định danh vi khuẩn trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ

Trang 9

Đề tài được thực hiện với các nội dung sau:

- Kiểm tra các chỉ tiêu về sinh lý và sinh hóa vi khuẩn A hydrophila bằng

phương pháp truyền thống;

- Kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa vi khuẩn A hydrophila sử dụng bộ kít

API 20E;

- Dùng phương pháp PCR phát hiện các chủng vi khuẩn A hydrophila được

định danh bằng phương pháp sinh hóa

Trang 10

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bệnh trên động vật thủy sản

Khác với các hình thức nuôi và thu hoạch khác cây trồng và vật nuôi đều nhìn thấy được, các động vật thủy sản cần được chú ý nhiều hơn để theo dõi sức khỏe của chúng Chúng không dễ quan sát thấy được, trừ khi nuôi ở trong bể, và chúng lại sống trong một môi trường phức tạp và biến động Ngoài ra, việc tiêu thụ thức

ăn và tử vong có thể đều ẩn náu kỹ ở dưới nước Mặt khác, nuôi trồng thủy sản có một lượng loài nuôi và môi trường nuôi đa dạng

Hiện nay bệnh cho là một trong những thách thức quan trọng nhất mà ngành nuôi trồng thủy sản đang phải đang đối mặt Số lượng các bệnh tìm thấy trong nuôi trồng thủy sản cũng thay đổi, một số đặc điểm bệnh của vật chủ khó nhận ra hoặc không nhận ra, và nhiều bệnh lại có các triệu chứng không đặc trưng Điều này là

do tác nhân gây bệnh trên động vật thủy sản không chỉ một mà có thể có nhiều tác nhân (môi trường, tác nhân chính, tác nhân cơ hội,…) cùng tác động Theo Từ

Thanh Dung và ctv (2005) tác nhân gây bệnh trên động vật thủy sản chủ yếu là vi

khuẩn, virút, nấm và nguyên sinh động vật

Ở Đài Loan 80% sản lượng tôm của quốc gia này đã bị thất thoát vào những năm 1987-1988, gần đây vào các năm 1990-1991 dịch bệnh liên tiếp gây thiệt hại cho nghề nuôi tôm ở Philippin, cụ thể với sản lượng tôm nuôi giảm từ 90.000 tấn năm

1994 xuống còn 340.527 tấn năm 1999 Thái Lan việc xuất khẩu thủy sản cũng gặp khó khăn do dịch bệnh đốm trắng đã làm giảm sản lượng tôm nuôi từ 225.000 tấn năm 1995 xuống chỉ còn 16.000 tấn năm 1996 và đã làm thiệt hại khoảng 500 triệu USD đến năm 1997 tình trạng này vẫn chưa được cải thiện (trích dẫn bởi Triệu Thanh Tuấn, 2006)

Gần đây, ở Việt Nam vào khoảng tháng 4 và tháng 8 năm 2007 có hiện tượng tôm chết rải rác do bệnh đốm trắng và phân trắng Bên cạnh đó, từ đầu năm 2007 xuất hiện bệnh lạ “bệnh sữa” trên tôm hùm, đến đầu quý 2/2007 dịch bệnh bùng phát, gây chết hàng loạt tôm nuôi tại các tỉnh miền Trung (đặc biệt tại Phú Yên, Khánh Hoà) gây thiệt hại trên 161 tỷ đồng cho người nuôi (http://www.fistenet.gov.vn) Trong khi đó, trong khảo sát của Nguyễn Chính (2005) ở các vùng nuôi cá tra thâm canh ơ An Giang và Cần Thơ thì cá tra bị mắc nhiều loại bệnh với các tần suất bắt gặp khác nhau Bệnh thường gặp và gây thiệt hại lớn là bệnh gan thận có

mủ, xuất hiện trên 82% ao và 100% bè nuôi cá, đồng thời tỉ lệ cá chết có thể lên

Trang 11

đến 80-90% nếu không chữa trị kịp thời Trong khi đó, bệnh xuất huyết dưới da (bệnh đốm đỏ) cũng xuất hiện ở tất cả các ao và bè nuôi khảo sát nhưng thiệt hại chỉ khoảng từ 20-30% Tuy tần số suất hiện của bệnh phù đầu không cao bằng 2 bệnh (78% ở ao nuôi và 22% ở bè nuôi ) trên nhưng tỉ lệ chết ở bệnh này lại ở mức cao 60-70% Bên cạnh đó, các bệnh như trắng mang, trắng đuôi; lồi mắt, nổ mắt; vàng da; nấm thủy mi; xuất huyết đường ruột, ký sinh trùng;… cũng được ghi nhận trong khảo sát này

Ngoài ra, trong Báo cáo dịch bệnh của Sở thủy sản An Giang 9 tháng đầu năm

2007 bệnh xuất hiện rải rác ở tất cả các tháng và tập trung nhiếu nhất vào đầu mùa nước đổ (khoảng cuối tháng 6 đến đầu tháng 8) Cũng từ báo cáo này ghi nhận được một số bệnh trên các đối tượng nuôi chính ở tỉnh (cá tra, cá lóc, cá

điêu hồng,…) như: bệnh đốm trắng ở gan thận (do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri); bệnh xuất huyết, lở loét, đốm đỏ (do vi khuẩn: Aeromonas hydrophila, Pseudomonas sp., Streptococus sp ); bệnh trắng gan-trắng mang; bệnh do ký sinh

trùng (trùng bánh xe, trùng quả dưa, sán lá 16 móc, sán dây, sán lá song chủ,…) Đặc biệt, trong các bệnh trên thì bệnh đốm trắng ở gan, thận và bệnh trắng gan-trắng mang có tỷ lệ chết ở cá nhỏ vào mùa nước đổ có thể đến 50%

2.2 Bệnh do vi khuẩn trên động vật thủy sản

Vi khuẩn là một trong những nhóm tác nhân gây bệnh trên động vật thủy sản mà chủ yếu thường gặp nhất là nhóm vi khuẩn gram âm Tác nhân vi khuẩn có thể được coi là tác nhân sơ cấp hoặc là tác nhân thứ cấp gây bệnh cho các loài thủy

Trang 12

nhiễm trùng máu cấp tính trên cá nheo Mỹ với tỉ lệ hao hụt rất cao (Autin và Autin, 1993)

Mặt khác vi khuẩn không chỉ tồn tại trên vật chủ mà còn tồn tại ngay trong môi trường nước với mật độ tùy theo chất lượng nước (Buler, 2004) Trong nghiên

cứu về thành phần loài của nhóm vi khuẩn gây bệnh Vibrio của Trần Thị Tuyết Hoa và ctv (2004), phân lập được 50 chủng Vibrio spp từ ấu trùng và nước ương

tôm càng xanh giống ở Trại sản xuất giống Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần Thơ và ở Long Mỹ-Cần Thơ

Một nhóm vi khuẩn thuộc loài Vibrio gây thiệt hại kinh tế trong nuôi tôm công

nghiệp ở Philippin, Ấn Độ và Indonesia là nhóm vi khuẩn phát sáng Bệnh phát

sáng do một số vi khuẩn có khả năng phát sáng gây ra như Vibrio harveyi, V splendida, V orientalis, V fischeri, V vulnificus Ở Việt Nam, những dạng nhiễm

vi khuẩn phát sáng thường thấy ở trại sản xuất hoặc ương tôm giống Khi vi khuẩn phát sáng hiện trong cơ thể tôm với số lượng lớn có thể làm tôm nhiễm

bệnh phát sáng trong bóng tối Vibrio phát sáng có thể phát thành dịch và gây chết đến 100% ấu trùng tôm, tôm giống và kể cả tôm trưởng thành (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv, 2006)

Ngoài các dòng vi khuẩn gram âm thường gặp trên, bệnh do vi khuẩn gram

dương cũng gây nguy hiểm không kém Loài vi khuẩn Srteptococcus sp có khả

năng gây bệnh chủ yếu trên cá nước lợ và mặn, đồng thời trên một số loài cá nước

ngọt Trong khi đó, loài vi khuẩn Mycobacterium spp gây bệnh ở nhiều loài cá

nước ngọt và cá ở vùng biển nhiệt đới, nguy hiểm hơn chúng còn có khả năng gây bệnh cho người (Từ Thanh Dung, 2006)

2.3 Vi khuẩn Aeromonas sp

Do có các đặc điểm tương tự nhau nên lúc đầu giống Aeromonas và Vibrio nằm chung họ Vibrionaceae Giữa thập niên 80 Aeromonas lại được tách ra một họ

riêng là Aeromonadaceae (Horneman và Moris, 2007) do có các chỉ tiêu sinh hóa,

sinh lý khác biệt như không mẫn cảm với phản ứng O/129 (150 µg) (ngoại trừ A caviae )

Theo Barrow và Feltham (1993) Aeromonas được chia ra thành 2 nhóm dựa trên khả năng di động và ngưỡng nhiệt độ phát triển của chúng Nhóm vi khuẩn A hydrophila, A sobria và A caviae có các đặc điểm là có khả năng di động, 2 đầu

hơi tròn, gram âm, hình que ngắn, hiếu khí không bắt buộc, phát triển được ở

370C Nhóm thứ hai là A salmonicida (3 loài phụ gồm: A salmonicida, A

Trang 13

achromogenes và A nova) có đặc điểm tương tự nhưng chúng chỉ phát triển tốt

nhất ở 220C hoặc thấp hơn và không có tiêm mao cũng như chúng không có khả năng di động

Bệnh do nhóm vi khuẩn Aeromonas sp đã gây thiệt hại không kém nghiêm trọng

cho nghề nuôi thủy sản nước ngọt ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung Bệnh nhiễm trùng máu (bệnh đốm đỏ, xuất huyết…) do nhóm vi khuẩn này gây ra và thường gặp ở các động vật thủy sản nước ngọt như: trắm cỏ, ba sa, chép, tai tượng, Mặt khác, chúng còn có thể gây bệnh ở ba ba, cá sấu, bệnh đỏ chân ở ếch, đốm nâu ở tôm càng xanh Tỷ lệ tử vong thường từ 30-70% (Đỗ Thị

Hòa và ctv, 2004) Ngoài ra, Bộ môn bệnh động vật thủy sản Viện nghiên cứu

Nuôi trồng thủy sản I cũng phân lập vi khuẩn gây bệnh chủ yếu trên nhiều loài

nuôi thủy sản là A hydrophila 57,5%, A caviae 25% và Pseudomonas flourescens 17,5% (Bùi Quang Tề và Phạm Thị Yên, 2002)

Nhóm gây bệnh thường gặp là A hydrophila, A caviae, A sobria được phát hiện

đầu tiên trên cá chình trong báo cáo dịch bùng phát bệnh của Sanarelli (1891) Kế đến trong các nghiên cứu sau trên cá chép của Schaperclaus (1930), phân lập

được vi khuẩn A hydrophila và cho đây là tác nhân gây bệnh cho cá (trích dẫn của Inglis et al, 1993)

Gần đây, thiệt hại do nhóm vi khuẩn này lại được phát hiện trong ghi nhận của Phan Anh (09/01/2006), Đồng Tháp là tỉnh bị thiệt hại lớn nhất do trong hơn 1 tuần có lượng cá chết nhiều với tỷ lệ 5-10% cá trong ao, ước tính khoảng 75 tấn Các tỉnh Tiền Giang, An Giang, Vĩnh Long cá chết nằm trong mức cho phép 2-3% Bộ Thủy sản cùng thời gian này cho biết, theo kết luận chính thức từ Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, nguyên nhân cá chết là do môi trường nước

trong ao bị nhiễm vi khuẩn A sobria, mật độ nuôi dày đặc (40 con/m2), cùng thói quen sử dụng thức ăn tươi sống trộn lẫn hóa chất bảo quản của ngư dân đã làm bẩn môi trường nước trong ao (http://vnexpress.net)

A salmonicida đây là nhóm gây bệnh chủ yếu cho cá vùng nước lạnh như gây

bệnh Furunculosis cho loài cá hồi và lở loét một số loài cá khác hoặc chứng phù

đỏ ở họ cá chép Bệnh Furunculosis được báo cáo đầu tiên ở các trại giống cá hồi

ở Đức bởi Emmerich và Weibel (1984) Bệnh xuất hiện ở hầu hết các quốc gia có loài cá hồi, như Châu Âu, Bắc Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Úc, Nam Phi, nhưng lại không có ở Nam Mỹ Bệnh có thể xâm nhập vào cơ thể cá do môi trường kém chất lượng, mật độ nuôi quá dày, cá bị sốc do nhiệt độ cao hoặc cá bị tổn thương

(trích dẫn của Inglis et al, 1993)

Trang 14

A hydrophila được cho là tác nhân gây bệnh đốm đỏ hay còn gọi là bệnh sởi,

xuất huyết do nhiễm trùng máu, (Bergey, 1957, được trích dẫn bởi Từ Thanh

Dung, 2005) Theo Horneman và Moris (2007), vi khuẩn A hydrophila không

những gây bệnh trên người mà còn xuất hiện trên nhiều loài động vật thủy sản như các loài cá, loài bò sát, lưỡng cư

Cá nhiễm bệnh đốm đỏ do A hydrophila có các dấu hiệu bệnh lý như bị sẫm màu

từng vùng ở bụng; xuất hiện từng mảng đỏ trên cơ thể; hoại tử đuôi, vây, xuất hiện các vết thương trên lưng, các khối u trên bề mặt cơ thể, vẩy dễ rơi rụng; mắt lồi, mờ đục và phù ra; xoang bụng chứa dịch, nội tạng hoại tử (Từ Thanh Dung, 2006)

Trong vài năm gần đây bệnh đốm đỏ ở cá nuớc ngọt đã phát triển rộng rãi, gây nhiều thiệt hại và trở thành mối nguy cho người nuôi cá ở khu vực Châu Á-Thái Bình Dương Theo thống kê của một số công trình nghiên cứu bệnh trên nhiều

loài cá bệnh ở Trung Quốc vi khuẩn phân lập được khoảng 42% đều là A hydrophila (Nielsen et al, 2001) Bên cạnh đó, bệnh đốm đỏ cũng đe dọa đến sản

xuất cá ở Bangladesh Theo Chowdhury (1998) trong 150 cuộc điều tra ở ao nuôi

và 40 trại cá khắp Bangladesh có 50-60% bệnh đốm đỏ, 40-70% xuất hiện chấm

đỏ trên da và các vết thương khác chiếm 20-30%, vây và đuôi bị thối rửa là 20%

10-Ở Việt Nam bệnh xuất huyết xuất hiện ở hầu hết các tỉnh, trên các loài cá như: trắm cỏ, chép, rô phi, mè, trê Một trong những nguyên nhân gây ra bệnh là do vi

khuẩn A hydrophila, ngoài ra còn do một số loài vi khuẩn khác (A sorbia, Pseudomonas flourescens, ) (Nguyễn Thị Thu Hằng, 2005) Bệnh xảy ra quanh

năm nhưng thường tập trung vào mùa Xuân và mùa Thu ở miền Bắc, ở miền Nam nhưng tần số xuất hiện cao nhất là đầu mùa mưa (giao mùa) và tỉ lệ tử vong từ 30-70% Bệnh có thể xuất hiện ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá (Từ Thanh

Dung và ctv, 2005)

Ngoài ra, trong nghiên cứu của Cipriano et al (2001) còn thấy hiện tượng cá chép (Cyprinus carpio) và cá vàng (Carassius auratus) vảy bị xù lên cùng với hiện

tượng xuất huyết trên da Trong khi đó, qua khảo sát của Nguyễn Thành Tâm

(2006) ở Cần Thơ, Hậu Giang, Vĩnh Long và Long An thì phân lập được A hydrophila trên cá rô đồng (Ansbas rtestudineus) bị xù vảy chiếm 50% và trên cá khoẻ (trong ao nuôi cá bệnh) là 10% Mặt khác, A hydrophila không chỉ là tác

nhân chính gây ra bệnh trên các sinh vật mà còn là tác nhân thứ cấp gây bệnh,

Trang 15

chẳng hạn như cùng A caviae gây bệnh tuột nhớt trên cá bống tượng (Nguyễn

Thị Như Ngọc, 1997)

Vi khuẩn A hydrophila không những gây ảnh hưởng cho nghề cá mà chúng còn

gây ảnh hưởng không kém trên giáp xác (tôm càng xanh) Bệnh do vi khuẩn này xảy ra trên tôm càng xanh thường là bệnh đốm nâu Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể tôm khi có tổn thương trên lớp ngoại bì Vì thế nên môi trường bị nhiễm bẩn hay các yếu tố môi trường không ổn định cũng gây ảnh hưởng sức khỏe của tôm Tôm mới bị bệnh thường yếu hoạt động chậm chạp và nằm yên ở đáy ao, kém ăn hoặc bỏ ăn Trên các phần phụ như (râu, chân bò, chân bơi và đuôi), vỏ có các vết

ăn mòn chuyển từ màu nâu sang đen và các phần phụ cụt dần Phía trong vỏ kitin của mang có đốm đen (Bùi Quang Tề, 2003)

Một nghiên cứu về bệnh trên tôm càng xanh của Nguyễn Tấn Đạt (2002) ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ cũng cho kết quả phân lập được 50 dòng

vi khuẩn từ tôm bị cụt râu và mòn phụ bộ Trong đó có 18 dòng được định danh

là vi khuẩn A hydrophila Ngoài ra, trong đề tài nghiên cứu này cũng ghi nhận có

sự hiện diện của loài vi khuẩn này trong môi trường nước và gây hiện tượng cụt râu, mòn phụ bộ ở hậu ấu trùng khi gây cảm nhiễm chủng 1.081514 ở mật độ 2.1.10 4 CFU/ml và khả năng gây bệnh cũng tăng lên khi mật độ tăng đến 2.1.10 7 CFU/ml

2.4 Phương pháp định danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila

Mỗi loài vi khuẩn đều có rất nhiều đặc tính sinh lý, sinh hóa khác nhau Có rất nhiều phương pháp dùng trong định danh vi khuẩn Trong đó phương pháp định danh vi khuẩn truyền thống và dùng bộ kít API 20E là một cách thể hiện cụ thể các đặc tính của vi khuẩn và xác định tương đối chính xác các loài vi khuẩn được phân lập trên mẫu bệnh phẩm Bên cạnh đó, hai phương pháp này cũng thường được dùng để hỗ trợ phương pháp PCR giúp định danh chính xác loài vi khuẩn,

nhất là về xác định kiểu gen (Nielsen et al, 2001; Vila et al, 2002)

Trên thế giới cũng như ở Việt Nam nói riêng đã có nhiều tác giả sử dụng phương

pháp truyền thống để định danh đối với vi khuẩn Aeromonas phân lập từ các mẫu

bệnh thủy sản Theo cẩm nang của Cowan và Steel (Barrow và Feltham, 1993), dùng phương pháp truyền thống kiểm tra các đặc điểm về hình thái, các phản ứng

về sinh lý và sinh hóa để định danh các loài vi khuẩn khác nhau Ngoài cẩm nang trên còn có tác giả đã nghiên cứu về loài vi khuẩn này dựa vào phương pháp này như Austin và Austin (1993), ở bài viết này thể hiện rõ hơn về các phản ứng sinh

Trang 16

lý cũng như sinh hóa nhưng về nhóm vi khuẩn Aeromonas di động thì nghiên cứu nhiều hơn đối với A hydrophila Bên cạnh đó tác giả còn sử dụng phương thức

khác để định danh vi khuẩn (bộ kít API 20E, ELISA,…) đồng thời sử dụng các hóa chất trong nghiên cứu đa số đều ghi hãng cung cấp (Difco, Oxoid, ) Một tài

liệu khác có liên quan đến loài vi khuẩn A hydrophila là “Bacterial diseases of fish” (Inglis et al, 1993), các nhà khoa học cũng đưa ra những kết quả định danh

bằng phương pháp truyền thống tương tự của Austin và Austin (1993), nhưng phần miễn dịch học (về huyết thanh, kháng thể,…) được nghiên cứu sâu hơn Một nghiên cứu gần đây của Buller (2004) là đã dùng phương pháp định danh

truyền thống với 41 chỉ tiêu và bộ kít API 20E cho các chủng chuẩn A hydrophila để kiểm tra các đặc tính sinh lý, sinh hóa Cùng với việc định danh

này thì theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2006) cũng đã dùng phương pháp truyền thống kiểm tra các đặc điểm sinh hóa và sinh lý với 41 chỉ tiêu Nghiên cứu này

có sự kết hợp định danh giữa các chủng vi khuẩn chuẩn và các chủng phân lập thể hiện mối quan hệ qua sơ đồ gia phả

Cùng sử dụng phương pháp truyền thống để định danh vi khuẩn A hydrophila,

các nghiên cứu ở Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần Thơ cũng được thực hiện Chẳng hạn như, Báo cáo khoa học của Nguyễn Thị Thu Hằng (2005), đề tài

“Khảo sát bệnh ký sinh trùng và vi khuẩn trên tôm càng xanh nuôi trong ao và ruộng lúa mật độ thấp” của Nguyễn Tấn Đạt (2002), luận văn về thử nghiệm vaccin phòng bệnh xuất huyết trên cá chép của Đoàn Nhật Phương (2001),… Gần đây, trong Báo cáo khoa học Đặng Thị Hoàng Oanh (2006) đã sưu tầm và thiết lập hệ thống lưu trữ các loài vi khuẩn phân lập trên tôm, cá bệnh thu được từ các

đề tài và dư án thực hiện trước tại Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần Thơ Từ

kết quả nghiên cứu trên thu được đa số là hai giống vi khuẩn Vibro và Aeromonas Trong đó, các chủng vi khuẩn được định danh trước và sau khi sưu tập gồm có 11 chủng vi khuẩn A hydrophila phân lập trên cá chép bị xuất huyết

và 20 chủng Aeromonas sp phân lập từ tôm càng xanh bị cụt râu và mòn phụ bộ

Ngoài ra, còn có rất nhiều tác giả nghiên cứu loài vi khuẩn này như: Đỗ Thị Hòa

và ctv (2004), Bùi Quang Tề (2006), Từ Thanh Dung và ctv (2005),…

Bên cạnh phương pháp định danh truyền thống vi khuẩn như của Baumann et al

(1984), phương pháp này đã được dùng phổ biến nhưng tốn nhiều công và môi trường để chuẩn bị ngoài ra thời gian kiểm tra cũng kéo dài, nên người ta đã sử dụng nhiều phương pháp kiểm tra nhanh khác (API-zym, API-NFT, API-RE, API 20E,…) Trong đó, hệ thống kiểm tra nhanh API 20E do phương pháp sử dụng

Trang 17

đơn giản và tiết kiệm được thời gian nên hiện nay đang được sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm (Nguyễn Thị Thu Hằng, 2005)

Kozinska et al (2002) dùng bộ kít API 20E để định danh các chủng vi khuẩn Aeromonas như A hydrophila, A caviae và A sobria, các chủng này được phân lập từ cá chép Ngoài ra, Kara et al (2000) cũng định danh vi khuẩn A hydrophila, A caviae và A sobria trên cá hồi Ông cũng đã so sánh với kết quả

định danh sinh hóa trên ống nghiệm và cho rằng hệ thống này có thể dùng để

phân lập Aeromonas đối với các chủng A hydrophila, A caviae và A sobria

(trích dẫn của Nguyễn Thị Thu Hằng, 2005) Tuy nhiên, theo Buler (2004)

phương pháp này chưa được tối ưu trong việc định danh vi khuẩn Aeromonas Theo ông với loài vi khuẩn Aeromonas thì cần thêm một số chỉ tiêu như:

aesculin, MR và salicin thì kết quả sẽ tương đối chính xác hơn

Ngoài hai phương pháp định danh vi khuẩn nêu trên, hiện nay có khá nhiều kỹ

thuật phân tử được cải tiến và ứng dụng trong định danh nhóm Aeromonas

Phương pháp thường được sử dụng nhất là xác định kiểu ARN ribosom (ribotyning) hay xác định độ dài đa hình các đoạn giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism-RFLP), phản ứng trùng hợp (PCR) 16S DNA ribosom, tính đa hình chiều dài những đoạn khuếch đại (Amplified Fragment Length Polymorphism- AFLP) và thể đa hình khuếch đại ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphic DNA-RAPD) (Laganowska et al, 2004, trích dẫn của Đặng Thị Hoàng Oanh, 2006)

Gần đây nghiên cứu kỹ thuật multiplex-PCR (m-PCR) đang được phát triển và ứng dụng do đặc điểm phát hiện đồng thời nhiều loại mầm bệnh vi khuẩn khác

nhau và tiết kiệm thời gian lẫn chi phí Từ nghiên cứu của Wang et al (2003)

phát hiện đặc tính của hai gen hemolysin (aerolysin và hemolysin) có khả năng

gây bệnh của hai loài A hydrophila và A sorbia bằng phương pháp m-PCR Năm

2007, Panangala et al đã công bố phương pháp m-PCR có thể xác định cùng lúc

cả ba loài vi khuẩn gây bệnh trên cá, đó là Flavobacterium columnare (504bp), Edwardsiella ictaluri (407bp), và Aeromonas hydrophila (209bp) Điều này sẽ

góp phần tăng khả năng phát hiện bệnh trên đối tượng thuỷ sản nhằm giảm thiệt hại tối thiểu cho người nuôi, đặc biệt là khi tốc độ tăng diện tích và mật độ nuôi ngày càng tăng nhanh thì sự gia tăng mầm bệnh cũng tăng nhanh theo tỉ lệ thuận

Trang 18

PHẦN 3

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

 Địa điểm nghiên cứu: các phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản - Khoa Thủy sản - Trường Đại học Cần Thơ

 Thời gian thực hiện: từ tháng 01 đến tháng 05 năm 2008

3.2 Vật liệu

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu

 Que cấy, bình xịt cồn, đèn cồn,

 Đĩa petri, ống nghiệm,

 Ống đong, lame, lamella,

 Chai nấu môi trường, bình tam giác,

 Cá từ, pipet, đầu cole, ống hút, găng tay,

 Các vật liệu nghiên cứu khác, v.v…

3.2.2 Thiết bị

 Kính hiển vi,

 Tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, tủ cấy,

 Bếp nấu môi trường, máy lắc, nồi thanh trùng,

 Máy ly tâm, máy chu kỳ nhiệt, máy ủ nhiệt, máy so màu quang phổ,…

 Cân điện tử, lò viba, bộ điện di…

 Bộ kít API 20E (bộ test + thuốc thử: TDA, IND, VP) (BIO MÉRIEUX)

Trang 19

3.2.3.1 Môi trường và thuốc thử dùng thực hiện các phản ứng sinh hóa theo phương pháp truyền thống

Môi trường

 Các môi trường đường (glucose, arabinose, cellobilose, galactose, glycerol, lactose, manitol, salicin, sucrose, xylose, trehalose) (Merck) dùng

để kiểm tra khả năng lên men của vi khuẩn

 Môi trường OF (Merck) dùng để kiểm tra khả năng oxi hóa và lên men của

vi khuẩn

 Môi trường thạch muller hinton agar (MHA; Merck) dùng cho phản ứng

O/129 để phân biệt 2 giống vi khuẩn Vibrio và Aeromonas

 Môi trường thạch simon citrate (Merck) dùng để kiểm tra khả năng sử dùng nguồn cacbon của vi khuẩn

 Môi trường thạch dưỡng (NA-nutrient agar; Merck) + 0,5% starch (Merck) dùng để kiểm tra khả năng thủy phân tinh bột

 Môi trường MR-VP (voges proskauer; Merck) dùng cho phản ứng VP

 Môi trường nutrient broth (NB; Merck) dùng kiểm tra khả năng sinh indole

 Môi trường decarboxylase (Himedia) + yeast extract (Merck) + 1% acid amin (arginine, lysine và ornithin) (Merck) dùng kiểm tra khả năng khử amino acid

 Môi trường 0,1% pepton (Himedia) + 0,2% KH2PO4 (Merck) + 0,0012% phenol red (Merck) + 0,1% glucose + 2% ure (Merck) dùng kiểm tra khả năng sử dụng urea của vi khuẩn

 Môi trường triple sugar iron (TSI; Merck) dùng kiểm tra khả năng sinh khí

H2S của vi khuẩn

 Môi trường trypton broth (Merck) + 1% hay 3%, NaCl (Merck) dùng kiểm tra khả năng chịu đựng ở các nồng độ muối

Thuốc thử

 Dung dịch H2O2 3% cho phản ứng catalase

 Que thử Oxidase (Merck)

 Đĩa ONPG (Ortho-nitrophenyl galactosidase; Merck)

 Thuốc thử Kovac’s (Merck) cho phản ứng sinh indole

 Thuốc thử Lugol’s Iodine (cách pha được trình bày ở phần Phụ lục) cho khả năng thủy phân tinh bột (starch)

Trang 20

 Thuốc thử cho phản ứng VP

 Các dung dịch nhuộm Gram

3.2.4 Các hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR

 LB (10g tryptone, 5g yeast extract và 5g sodium chloride, trong 1L nước cất )

 TE (pH 8.0) gồm 10mM Tris HCl và 1mM EDTA

 Hóa chất dùng trong khuếch đại DNA: Bufer 10X, MgCl2, dNTPs (10mM), Taq polymerase (5u), mồi, nước cất 2 lần

 Dung dịch nạp mẫu 6X, ethidium bromide, agarose, dung dịch chạy diện

di TAE (Tris HCl:acetate:EDTA)

3.2.5 Các chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila

 Chủng chuẩn : 1chủng (LMG 2844- ngân hàng gen của Bỉ)

 Chủng tham khảo: 7 chủng từ bộ sưu tập vi khuẩn của Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ

Bảng 3.1: Các nguồn vi khuẩn

CAF 2 CAF23 CAF25 CAF131 CAF132 CAF133 CAF134 CAF135

A.hydrophila LMG 2844

V402 V425

60 Lei.1.10.99 BSL3172000

69 (Tam 2L) BSK

Ngân hàng gen Bỉ CAF

CAF CAF CAF CAF CAF CAF

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Các thao tác phải thực hiện trong điều kiện vô trùng

Phục hồi vi khuẩn: dùng que cấy lấy vi khuẩn cấy lên môi trường TSA Đem ủ ở 28oC trong 18-24 giờ kiểm tra kết quả

Nuôi tăng sinh vi khuẩn: chọn một khuẩn lạc từ đĩa cấy thuần cho vào ống nghiệm chứa 5 ml NB đặt lên máy lắc 200 vòng/phút sau 18- 24 giờ Kiểm tra kết quả

Mỗi chỉ tiêu kiểm tra sinh hóa được lặp lại 3 lần

Trang 21

3.3.1 Định danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila bằng phương pháp truyền

- Hình dạng và màu sắc của khuẩn lạc

- Khả năng di động của vi khuẩn

- Nhuộm gram để kiểm tra tính ròng của vi khuẩn

Các chỉ tiêu về sinh lý

- Phản ứng oxidase

- Phản ứng catalase

- Khả năng phát triển của vi khuẩn ở 0%, 3%, 6%, 7% và 10% NaCl

Các chỉ tiêu về sinh hóa

- Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose

- Khả năng tạo acid từ các loại đường: glucose, arabinose, cellobilose, galactose, glycerol, lactose, manitol, salicin, sucrose, xylose, trehalose

- Khả năng sinh khí từ glucose và tạo H2S

- Khả năng thủy phân tinh bột

- Khả năng lên men β-galactosidase (ONPG)

Trang 22

3.3.2 Định danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20E

Kiểm tra các các phản ứng sinh lý và sinh hóa của A hydrophila sử dụng bộ kít

API 20E của hãng BIO MÉRIEUX

Các chỉ tiêu cơ bản (hình dạng, khả năng di động, osidase, catalase và phản ứng O/F) được thực hiện trước khi sử dụng bộ kít API 20E

 Ủ trong tủ ấm ở 280C và đọc kết quả sau 24 giờ

Các chỉ tiêu còn lại không cần sử dụng thuốc thử thì đọc kết quả dựa vào bảng bên dưới (Bảng 3.2)

Sau khi cho thuốc thử vào không nên đem ủ trở lại trong tủ ấm

Trang 23

Bảng 3.2: Bảng đọc kết quả bộ kit API 20E

Chỉ tiêu Âm tính Dương tính

Ghi chú: ONPG: ortho-nitrophenyl galactosidase; ADH: arginine dihydrolase; LDC:

lysine decarboxylase; ODC: ornithine decarboxylase; CIT: citrate; H2S: sinh H2S; Urea: ure; TDA: tryptophane deaminase; IND: indole; VP: phản ứng Voges- Proskauer; GEL: gelatin; GLU: glucose; MAN: mannitol; INO: inositol; SOR: sorbitol; RHA: rhamnose; SAC: sucrose; MEL: melibiose; AMY: amygdaline; ARA: arabinnose

Mỗi chủng vi khuẩn được lặp lại ba lần

3.3.3 Phát hiện vi khuẩn bằng phương pháp PCR

Chiết tách acid nucleic (Bartie et al, 2006)

 Nuôi tăng sinh vi khuẩn (16-18 giờ) trong 5ml LB

 Rút 1,5ml dung dịch vi khuẩn và 100µl TE (10mM Tris HCl và 1mM EDTA) vào ống eppendorf

 Đun ở 950C trong vòng 15 phút

 Làm lạnh trong nước đá

Trang 24

 Ly tâm 14000 vòng/phút trong 2 phút Rút phần dung dịch cho vào ống eppendorf mới (trữ ở -20 ºC nếu chưa sử dụng) Đo hàm lượng DNA (OD=260nm)

Khuyếch đại DNA (theo Panangala et al (2007) có chỉnh sửa)

8 Nước cất -

Chu kỳ nhiệt (Hình 3.1)