tiêu chuẩn hóa phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh hóa của trung tâm học liệu đh cần thơ @ tài liệu học tập và nghiên cứu vi khuẩn aeromonas hydrophila tại khoa thủy sản

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN NGUYỄN HÀ GIANG TIÊU CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU SINH HÓA CỦA VI KHUẨN Aeromonas hydrophila TẠI KHOA THỦY SẢN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2008 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu i LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần Thơ. Đặc biệt là các thầy cô thuộc bộ môn Sinh học và Bệnh học Thủy sản đã truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình em học tập và nghiên cứu tại trường. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh và chị Nguyễn Thị Tiên đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp. Đồng thời xin gởi lời cám ơn đến cô cố vấn Nguyễn Thị Thu Hằng cùng gia đình và các bạn lớp Bệnh học Thủy sản K30 đã động viên và hỗ trợ cho em trong thời gian học tập cũng như thực hiện đề tài tốt nghiệp. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu ii TÓM TẮT Đề tài được thực hiện nhằm tìm hiểu những chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa sai khác từ phương pháp truyền thống và sử dụng kít API 20E. Đồng thời cũng so sánh với những kết quả định danh của các nghiên cứu trước đây tại bộ môn và một số tài liệu nghiên cứu khác. Qua đó, đề xuất các chủng vi khuẩn A. hydrophila tham khảo cùng với phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa dùng để khi định danh vi khuẩn trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ. Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa được chọn để định danh dựa theo hệ thống phân loại của Baumann et al(1984). Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa được xác định dựa theo cẩm nang Cowan và Steel (Barrow và Feltham, 1993) và phương pháp của West và Colwell (1984). Tám chủng Aeromonas hydrophila (A. hydrophila) gồm CAF 2 (LMG 2844, chủng chuẩn), CAF 23, CAF25, CAF 131, CAF 132, CAF 133, CAF 134 và CAF 135 là các chủng đã được phân lập và định danh từ các đề tài trước và được trữ trong tủ âm 80 0 C Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ. Các chủng A. hydrophila đều là vi khuẩn gram âm, hình que ngắn, di động, catalase dương tính, oxidase âm tính và có khuẩn lạc dạng tròn, nhẵn. Đặc điểm khác cơ bản ở các chủng A. hydrophila này với các nghiên cứu trước là các chủng đều cho kết quả oxidase âm tính. Phương pháp định danh truyền thống và API 20E thể hiện ở các chỉ tiêu giống nhau thì kết quả thể hiện giống nhau nhưng chỉ khác ở phản ứng của các chủng nghiên cứu đối với chỉ tiêu arginine và ornithine trong cùng điều kiện phòng thí nghiệm. Các chủng nghiên cứu qua kiểm tra bằng phương pháp PCR (Panangala et al, 2007) chưa cho sản phẩm đặc hiệu (không hiện vạch 209bp). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu iii MỤC LỤC Trang PHẦN 1 GIỚI THIỆU 01 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 03 2.1 Bệnh trên động vật thủy sản 03 2.2 Bệnh do vi khuẩn trên động vật thủy sản 04 2.3 Vi khuẩn Aeromonas sp. 05 2.4 Phương pháp định danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila 08 PHẦN 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 11 3.2 Vật liệu 11 3.2.1 Vật liệu nghiên cứu 11 3.2.2 Thiết bị 11 3.2.3 Hóa chất, thuốc thử và môi trường để kiểm tra các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn 11 3.2.4 Các hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR 13 3.2.5 Các chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila 13 3.3 Phương pháp nghiên cứu 13 3.3.1 Định danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila bằng phương pháp truyền thống 14 3.3.2 Định danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20E 14 3.3.3 Phát hiện vi khuẩn bằng phương pháp PCR 16 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu iv 4.1 Kết quả 19 4.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng vi khuẩn A. hydrophila xác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống 19 4.1.2 Kiểm tra kết quả định danh vi khuẩn A. hydrophila theo bộ kít API 20E 23 4.1.3 Kết quả kiểm tra bằng phương pháp PCR 25 4.2 Thảo luận 26 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 29 5.1 Kết luận 29 5.2 Đề xuất 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 PHỤ LỤC 35 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu v DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 3.1: Các nguồn vi khuẩn 13 Bảng 3.2: Bảng đọc kết quả bộ kít API 20E 16 Bảng 3.3: Thành phần tham gia phản ứng PCR 17 Bảng 4.1: Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá của chủng vi khuẩn chuẩn và 7 chủng tham khảo 19 Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra bằng bộ kít API 20E chủng vi khuẩn chuẩn và 7 chủng tham khảo 24 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu vi DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 3.1 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR theo quy trình Panangala et al (2007) có chỉnh sửa 18 Hình 4.1 Hình dạng A. hydrophila (100X) 21 Hình 4.2 A. hydrophila trên môi trường TSA 21 Hình 4.3 A. hydrophila trên môi trường Aeromonas agar 22 Hình 4.4 Phản ứng citrate (+) 22 Hình 4.5 Phản ứng VP (+) 23 Hình 4.6 Phản ứng indole (+) 23 Hình 4.7 Kết quả định danh API 20E của dòng CAF2 (a) và dòng CAF25 (b) 25 Hình 4.8 Kết quả điện di 5 chủng A. hydrophila 26 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Trang 1 PHẦN 1 GIỚI THIỆU Nghề nuôi thủy sản trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng đang phát triển rất nhanh. Ở Việt Nam trong báo cáo tháng 12 năm 2007 của Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn thì sản lượng nuôi thủy sản đạt 2.085 nghìn tấn tăng 23% so với năm 2006. Tuy nhiên, do lợi nhuận cao nên diện tích nuôi trồng thủy sản tăng cũng rất nhanh và mật độ nuôi cũng tăng dẫn đến tình trạng ô nhiễm môi trường, dịch bệnh xảy ra tràn lan và mầm bệnh ngày càng đa dạng nhất là bệnh do vi khuẩn. Trong số các mầm bệnh vi khuẩn ở thủy sản thì vi khuẩn Aeromonas hydrophila là một trong những tác nhân gây bệnh nổi bật. Chúng xuất hiện cũng như gây chết trên nhiều đối tượng thủy sản khác nhau. Hiện nay có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để định danh vi khuẩn A. hydrophila. Các phương pháp phổ biến là phương pháp sinh hóa truyền thống hoặc bộ kít API 20E để kiểm tra các đặc tính sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn. Tuy nhiên, các đặc điểm sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn thường biến đổi tùy thuộc vào điều kiện của từng phòng thí nghiệm, loại hóa chất sử dụng, hãng cung cấp và chủng vi khuẩn chuẩn hay chủng tham khảo được sử dụng. Hiện tại, các kỹ thuật phân tử như PCR (phản ứng trùng hợp), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) và AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) cũng được sử dụng để định danh A. hydrophila nhằm khẳng định kết quả định danh bằng phương pháp sinh hóa. Đề tài “Tiêu chuẩn hóa phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn Aeromonas hydrophila” được thực hiện tại Khoa Thủy sản nhằm mục đích tìm hiểu những chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa sai khác từ phương pháp truyền thống và sử dụng kít API 20E. Đồng thời cũng so sánh với những kết quả định danh của các nghiên cứu trước đây tại bộ môn. Mục đích cuối cùng của đề tài là đề xuất các chủng vi khuẩn A. hydrophila tham khảo cùng với phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa dùng định danh vi khuẩn trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Trang 2 Đề tài được thực hiện với các nội dung sau: - Kiểm tra các chỉ tiêu về sinh lý và sinh hóa vi khuẩn A. hydrophila bằng phương pháp truyền thống; - Kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa vi khuẩn A. hydrophila sử dụng bộ kít API 20E; - Dùng phương pháp PCR phát hiện các chủng vi khuẩn A. hydrophila được định danh bằng phương pháp sinh hóa. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Trang 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bệnh trên động vật thủy sản Khác với các hình thức nuôi và thu hoạch khác cây trồng và vật nuôi đều nhìn thấy được, các động vật thủy sản cần được chú ý nhiều hơn để theo dõi sức khỏe của chúng. Chúng không dễ quan sát thấy được, trừ khi nuôi ở trong bể, và chúng lại sống trong một môi trường phức tạp và biến động. Ngoài ra, việc tiêu thụ thức ăn và tử vong có thể đều ẩn náu kỹ ở dưới nước. Mặt khác, nuôi trồng thủy sản có một lượng loài nuôi và môi trường nuôi đa dạng. Hiện nay bệnh cho là một trong những thách thức quan trọng nhất mà ngành nuôi trồng thủy sản đang phải đang đối mặt. Số lượng các bệnh tìm thấy trong nuôi trồng thủy sản cũng thay đổi, một số đặc điểm bệnh của vật chủ khó nhận ra hoặc không nhận ra, và nhiều bệnh lại có các triệu chứng không đặc trưng. Điều này là do tác nhân gây bệnh trên động vật thủy sản không chỉ một mà có thể có nhiều tác nhân (môi trường, tác nhân chính, tác nhân cơ hội,…) cùng tác động. Theo Từ Thanh Dung và ctv (2005) tác nhân gây bệnh trên động vật thủy sản chủ yếu là vi khuẩn, virút, nấm và nguyên sinh động vật. Ở Đài Loan 80% sản lượng tôm của quốc gia này đã bị thất thoát vào những năm 1987-1988, gần đây vào các năm 1990-1991 dịch bệnh liên tiếp gây thiệt hại cho nghề nuôi tôm ở Philippin, cụ thể với sản lượng tôm nuôi giảm từ 90.000 tấn năm 1994 xuống còn 340.527 tấn năm 1999. Thái Lan việc xuất khẩu thủy sản cũng gặp khó khăn do dịch bệnh đốm trắng đã làm giảm sản lượng tôm nuôi từ 225.000 tấn năm 1995 xuống chỉ còn 16.000 tấn năm 1996 và đã làm thiệt hại khoảng 500 triệu USD đến năm 1997 tình trạng này vẫn chưa được cải thiện (trích dẫn bởi Triệu Thanh Tuấn, 2006). Gần đây, ở Việt Nam vào khoảng tháng 4 và tháng 8 năm 2007 có hiện tượng tôm chết rải rác do bệnh đốm trắng và phân trắng. Bên cạnh đó, từ đầu năm 2007 xuất hiện bệnh lạ “bệnh sữa” trên tôm hùm, đến đầu quý 2/2007 dịch bệnh bùng phát, gây chết hàng loạt tôm nuôi tại các tỉnh miền Trung (đặc biệt tại Phú Yên, Khánh Hoà) gây thiệt hại trên 161 tỷ đồng cho người nuôi (http://www.fistenet.gov.vn). Trong khi đó, trong khảo sát của Nguyễn Chính (2005) ở các vùng nuôi cá tra thâm canh ơ An Giang và Cần Thơ thì cá tra bị mắc nhiều loại bệnh với các tần suất bắt gặp khác nhau. Bệnh thường gặp và gây thiệt hại lớn là bệnh gan thận có mủ, xuất hiện trên 82% ao và 100% bè nuôi cá, đồng thời tỉ lệ cá chết có thể lên [...]... phả Trung Cùng sử dụng phương pháp truyền thống để định danh vi khuẩn A hydrophila, các nghiên cứu ở Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần Thơ cũng được thực hiện Chẳng hạn ĐH Cần khoa @ Tài liệu Thị tập và (2005), đề tài tâm Học liệunhư, Báo cáoThơ học của Nguyễnhọc Thu Hằngnghiên cứu “Khảo sát bệnh ký sinh trùng và vi khuẩn trên tôm càng xanh nuôi trong ao và ruộng lúa mật độ thấp” của Nguyễn Tấn Đạt (2002),... phương pháp của West và Colwell (1984) Mỗi chỉ tiêu được lặp lại 3 lần, kết quả được ghi nhận là kết quả có ít nhất 2 lần lặp lại Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá của các chủng vi khuẩn A tâm Học trong đề tài Cầntrình bày ở Bảng liệu học tập và nghiên cứu liệu ĐH được Thơ @ Tài 4.1 hydrophila Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá của chủng vi khuẩn chuẩn và 7 chủng tham khảo VI KHUẨN... các chỉ tiêu cơ bản gồm hình dạng, khả năng di động, oxidase, catalase và và phản ứng O/F cho cả hai phương pháp định danh (truyền thống và API 20E) 4.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng vi khuẩn A hydrophila xác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống Trung Kiểm tra các đặc điểm sinh lý sinh hóa được xác định dựa theo cẩm nang Cowan và Steel (Barrow và Feltham, 1993) và phương. .. vàng vàng xanh vàng vàng vàng vàng vàng - Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập +và nghiên+ cứu Arabinose + + + + + + Lactose Aeromonas agar Ghi chú: (+): Phản ứng dương tính, (-): Phản ứng âm tính Theo bảng kết quả test các chỉ tiêu sinh hoá (Bảng 4.1), các dòng vi khuẩn A hydrophila đều là vi khuẩn gram âm, hình que ngắn (Hình 4.1), di động, catalase dương tính, oxidase âm tính và có khuẩn. .. khảo: 7 chủng từ bộ sưu tập vi khuẩn của Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ Bảng 3.1: Các nguồn vi khuẩn Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Mã mới CAF 2 CAF23 CAF25 CAF131 CAF132 CAF133 CAF134 CAF135 Mã cũ A .hydrophila LMG 2844 V402 V425 60 Lei.1.10.99 BSL3172000 69 (Tam 2L) BSK Nguồn gốc Ngân hàng gen Bỉ CAF CAF CAF CAF CAF CAF CAF 3.3 Phương pháp nghiên cứu Các thao tác phải thực... chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa: được chọn để định danh dựa theo hệ thống phân loại của Baumann et al (1984) Các đặc điểm sinh lý sinh hóa được xác định dựa theo cẩm nang Cowan và Steel (Barrow và Feltham, 1993) và phương pháp của West và Colwell (1984) Các chỉ tiêu về hình thái - Hình dạng và màu sắc của khuẩn lạc - Khả năng di động của vi khuẩn - Nhuộm gram để kiểm tra tính ròng của vi khuẩn. .. nhiều tâm ường (glucose, mannitol ,Thơ @lactose,….) ,học gas t và nghiên cứu loại Học liệu ĐH Cần sucrose, Tài liệu sinh tập glucose nhưng lại không sinh khí H2S Bên cạnh đó, chúng có khả năng sinh indole (Hình 4.6) và cho phản ứng dương tính với VP (Hình 4.5), arginine, lysin và cả ornithin Hình 4.4 Phản ứng citrate (+) Trang 22 Hình 4.5 Phản ứng VP (+) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và. .. pháp dùng trong định danh vi khuẩn Trong đó phương pháp định danh vi khuẩn truyền thống và dùng bộ kít API 20E là một cách thể hiện cụ thể các đặc tính của vi khuẩn và xác định tương đối chính xác các loài vi khuẩn được phân lập trên mẫu bệnh phẩm Bên cạnh đó, hai phương pháp này cũng thường được dùng để hỗ trợ phương pháp PCR giúp định danh chính xác loài vi khuẩn, nhất là về xác định kiểu gen (Nielsen... của vi khuẩn - Nhuộm gram để kiểm tra tính ròng của vi khuẩn Các chỉ tiêu về sinh lý - Phản ứng oxidase - Phản ứng catalase - Khả năng phát triển của vi khuẩn ở liệu học tập và nghiên Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài 0%, 3%, 6%, 7% và 10% NaCl cứu Các chỉ tiêu về sinh hóa - Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose - Khả năng tạo acid từ các loại đường: glucose, arabinose, cellobilose, galactose,... với 41 chỉ tiêu và bộ kít API 20E cho các chủng chuẩn A hydrophila để kiểm tra các đặc tính sinh lý, sinh hóa Cùng với vi c định danh này thì theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2006) cũng đã dùng phương pháp truyền thống kiểm tra các đặc điểm sinh hóa và sinh lý với 41 chỉ tiêu Nghiên cứu này có sự kết hợp định danh giữa các chủng vi khuẩn chuẩn và các chủng phân lập thể hiện mối quan hệ qua sơ đồ gia phả Trung . Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN . nghiệm tại Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Trang 2 Đề tài được thực hiện với các nội