Đõy là phương phỏp phõn lập vi khuẩn S. aureus từ mụi trường khụng khớ. Vi khuẩn S. aureus được phõn lập trờn mụi trường thạch Schapman. Tại khu vực phõn lập (cỏc phũng thuộc Bệnh viện Đa khoa tỉnh Bắc Ninh), tiến hành đặt cỏc đĩa mỗi trường đặc hiệu tại 4 gúc phũng và chớnh giữa căn phũng. Đĩa thạch được mở ra và đặt ngoài mụi trường khụng khớ trong vũng 30 phỳt, sau đú đem nuụi cấy trong điều kiện 37 oC trong 24h. Cỏc khuẩn lạc xuất hiện trờn đĩa được xỏc định là vi khuẩn S. aureus dựa trờn khả năng phõn hủy cơ chất trong mụi trường thạch Schapman để tạo ra màu vàng của khuẩn lạc và mụi trường. Cỏc khuẩn lạc S. aureus được kiểm tra lại bằng cỏch thử khả năng dung huyết trờn mụi trường thạch mỏu.
2.2.1.3. Cỏc phương phỏp xỏc định hoạt tớnh khỏng sinh.
- Phương phỏp thỏi thạch: Phương phỏp này được dựng để sơ tuyển xạ khuẩn.
Xạ khuẩn được nuụi trờn mụi trường Gauze1 trong hộp lồng. Sau 5-7 ngày, khi xạ khuẩn mọc đó tốt, dựng khoan nỳt chai khoan lấy cỏc thỏi thạch. Cỏc thỏi thạch được đặt vào trong cỏc hộp lồng đó cấy cỏc vi sinh vật kiểm định. Đặt hộp lồng vào tủ lạnh ở 4 - 8o
C trong 2 - 5 giờ. Sau đú, cỏc hộp lồng này được đặt vào tủ ấm 30oC đối với vi sinh vật kiểm định là vi khuẩn, 280
C đối với nấm mốc. Sau 24 giờ hoặc 48 -72 giờ lấy ra xỏc định đường kớnh vũng vụ khuẩn.
- Phương phỏp đục lỗ: Dựng phương phỏp này để xỏc định hoạt tớnh khỏng sinh trong dịch thể.
Vi sinh vật được cấy trờn cỏc mụi trường thạch (vi khuẩn được cấy trờn mụi trường MPA, nấm được cấy trờn mụi trường Czapeck). Dựng khoan nỳt chai đục cỏc lỗ, nhỏ vào đú dung dịch khỏng sinh cần thử hoạt tớnh. Đặt vào tủ lạnh cú nhiệt độ 4o
C – 60C trong 2– 5 giờ, cỏc bước tiếp theo làm giống phương phỏp khối thạch.
- Phương phỏp khoanh giấy: Cắt cỏc khoanh giấy lọc theo hỡnh trũn đường kớnh 6 mm, tẩm dịch lờn men hoặc dịch khỏng sinh thụ và để khụ tự nhiờn ở nhiệt độ phũng. Cỏc khoanh giấy, khi đó khụ, được đặt vào trong hộp Petri đó cấy vi sinh vật kiểm định.
Cỏc bước tiếp theo làm giống phương phỏp khối thạch.
2.2.1.4. Tuyển chọn xạ khuẩn.
Từ cỏc chủng xạ khuẩn phõn lập được, ta dựng phương phỏp thỏi thạch để xỏc định sơ bộ chủng xạ khuẩn cú khả năng ức chế đối với vi sinh vật kiểm định cần nghiờn cứu. Cỏc chủng giống khụng cú khả năng ức chế vi sinh vật kiểm định sẽ được loại bỏ, chỉ cỏc chủng xạ khuẩn cú khả năng ức chế vi sinh vật kiểm định mới được giữ lại để thực hiện cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
Cỏc chủng xạ khuẩn cú hoạt tớnh khỏng sinh mạnh nhất được chọn để phõn loại và nghiờn cứu cỏc đặc tớnh sinh học.
2.2.1.5. Bảo quản chủng giống.
Xạ khuẩn được cấy trờn mụi trường Gauze1 trong ống thạch nghiờng, nuụi ở 28-30oC. Khi xạ khuẩn phỏt triển tốt, cỏc ống giống này được đưa vào giữ bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4-6oC nhằm hạn chế sự sinh trưởng của chỳng. Sau khoảng 2-3 thỏng, giống được cấy truyền sang ống mụi trường mới.
Tuy nhiờn, để cú thể bảo quản được chủng giống trong thời gian dài, người ta thường giữ trong cỏt, trong parafin lỏng vụ trựng hay đụng khụ chủng giống. Khi sử dụng, giống được cấy truyền sang mụi trường mới.
2.2.2. Phõn loại xạ khuẩn.
Xạ khuẩn được phõn loại theo phương phỏp của ISP [18, 19, 20] của Gauze và cộng sự[12]
2.2.2.1. Đặc điểm hỡnh thỏi. 1. Cuống sinh bào tử 1. Cuống sinh bào tử
Xạ khuẩn được nuụi cấy trờn cỏc mụi trường Gauze1, ISP- 1, ISP- 2, ISP- 3, ISP- 4, ISP- 5, ISP- 6,ISP-7, ISP- 8, cú cắm lamen nghiờng 45o ở 28- 30oC. Sau 7, 14, 21, 28 ngày lấy ra quan sỏt hỡnh dạng chuỗi bào tử dưới kớnh hiển vi quang học.
Hỡnh dạng chuỗi bào tử cú thể cú dạng thẳng hoặc hơi lượn súng (RF), hỡnh múc cõu (RA), xoắn hoàn toàn (S),...
2. Bề mặt bào tử
Dựng băng dớnh đặt trực tiếp lờn bề mặt khuẩn ty khớ sinh cú bào tử. Khi đú, bào tử xạ khuẩn sẽ bị dớnh lờn băng dớnh. Quan sỏt và chụp ảnh dưới kớnh hiển vi điện tử tại Viện 69(quõn đội) của hóng Jeol.
Bào tử cú thể cú dạng trũn, oval, que,... Bề mặt bào tử cú thể nhẵn, xự xỡ, dạng gai, dạng túc,...
2.2.2.2. Đặc điểm nuụi cấy.
1. Hỡnh dạng và kớch thước khuẩn lạc.
Xạ khuẩn được nuụi cấy trờn cỏc mụi trường Gauze1, ISP- 1, ISP- 2, ISP- 3, ISP- 4, ISP- 5, ISP- 6,ISP-7, ISP- 8, cú cắm lamen nghiờng 45o ở 28-
30oC. Sau 7, 14, 21, 28 ngày lấy ra quan sỏt hỡnh dạng mộp khuẩn lạc xạ khuẩn và đo kớch thước của chỳng.Cỏc dạng khuẩn lạc cú thể là dạng thụ rỏp, dạng phấn, khụng trong suốt, cú nếp tỏa ra theo hỡnh phúng xạ, dạng bụng, dạng nhăn nheo,..
2. Màu sắc khuẩn ty và sắc tố tan.
Xạ khuẩn được nuụi cấy trờn cỏc mụi trường Gauze1, ISP- 1, ISP- 2, ISP- 3, ISP- 4, ISP- 5, ISP- 6, ISP-7, ISP- 8, cú cắm lamen nghiờng 45o ở 28- 30oC. Sau 7, 14, 21, 28 ngày lấy ra quan sỏt màu sắc khuẩn ty khớ sinh, khuẩn ty cơ chất và màu sắc của sắc tố tan do xạ khuẩn tiết ra mụi trường nuụi cấy.
3. Khả năng tạo thành melanin.
Xạ khuẩn được cấy trờn mụi trường ISP- 6 và nuụi ở 28o
C. Trong quỏ trỡnh sinh trưởng và phỏt triển của xạ khuẩn, nếu cú sự tạo thành melanin, màu của mụi trường sẽ chuyển dần từ màu vàng nhạt, nõu đậm cho đến đen.
4. Khả năng đồng húa nguồn cacbon.
Xạ khuẩn được nuụi trờn mụi trường ISP- 9 cú bổ sung thờm cỏc nguồn cacbon (Glucoza, arabinose, saccaroza, manitol, fructoza, xenluloza, inositol, xyloza, lactoza). Sau 5-7 ngày, quan sỏt và đỏnh giỏá sự sinh trưởng của xạ khuẩn. Xạ khuẩn sinh trưởng và phỏt triển tốt trờn mụi trường cú bổ sung nguồn cascbon mà chỳng cú thể sử dụng dễ dàng.
5. Khả năng thủy phõn tinh bột.
Xạ khuẩn được cấy vạch trờn mụi trường Gauze ở 28oC,sau 3 ngày, trỏng Lugol và xỏc định vựng phõn giải tinh bột. Vựng phõn giải đo được càng rộng thỡ chứng tỏ chủng xạ khuẩn thớ nghiệm cú khả năng sinh enzyn amilaza mạnh.
6. Khả năng phõn giải xenluloza.
Xạ khuẩn được nuụi trờn mụi trường ISP – 4( thay bột tan bằng CMC) nuụi ở 28oC, sau 3 ngày trỏng Lugol và xỏc định độ rộng vựng phõn giải CMC.
Mụi trường ISP -1 cú bổ sung NaCl với cỏc nồng độ: 0,5; 1; 3; 5; 7 và 10 (%).Cấy xạ khuẩ trờn mụi trường thạch nghiờng và nuụi ở 280
C. Sau 7-10
lấy ra quan sỏt sự sinh trưởng.
2.2.2.3. Phương phỏp xỏc định trỡnh tự đoạn gene 16S rRNA. 2.2.2.3.1. Tỏch DNA tổng số. 2.2.2.3.1. Tỏch DNA tổng số.
Quy trỡnh tỏch chiết DNA theo kit của hóng QIAamp DNA Mini Kit với cỏc vi khuẩn Gram dương cú cải tiến:
(1) XK được nuụi cấy trong mụi trường Gauze-1 ở 300
c trong 5-7 ngày. Dựng que cấy vũng lấy toàn bộ sinh khối từ đĩa thạch chuyển sang ống eppendorf.
(2) Bổ sung 180 μl dung dịch enzyme thớch hợp. Ủ ớt nhất 30 phỳt ở 370C.
(3) Bổ sung 20 μl proteinase K và 200 μl Buffer AL, vortex nhẹ nhàng. Ủ ở 560C trong 30 phỳt và sau đú tiếp tục ủ ở 950
C trong 15 phỳt.
(4) Ly tõm thu tủa, bổ sung 4 μl Rnase (100mg/ml), vortex khoảng 15 giõy và ủ nhiệt độ phũng trong 2 phỳt. Ly tõm loại bỏ dịch, sau đú bổ sung 200 μl Buffer AL vào mẫu. Vortex khoảng 15 giõy, ủ ở 700C trong 10 phỳt.
(5) Bổ sung 200 μl ethanol (96%), vortex 15 giõy rồi chuyển sang cột QIAamp Mini spin. Ly tõm 8.000 vũng/phỳt. Đặt cột sang ống 2 ml sạch.
(6) Bổ sung 500 μl Buffer AW1 vào cột, ly tõm 8.000 vũng/phỳt. Đặt cột sang ống 2ml sạch và loại bỏ ống cũ chứa dịch lọc. Bổ sung 500 μl Buffer AW2. Ly tõm 14.000 vũng trong 3 phỳt.
(7) Đặt cột sang ống 1,5 ml mới và loại bỏ ống chứa dịch. Bổ sung 200 μl Buffer AE, ủ ở nhiệt độ phũng trong 1 phỳt, sau đú ly tõm ở 8.000 vũng/phỳt và thu tủa.
2.2.2.3.2. Nhõn đoạn gene 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR.
Trỡnh tự cặp mồi 27F và 1492R được sử dụng để nhõn đoạn gene 16S rRNA từ DNA tổng số của xạ khuẩn:
27F 5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 1492R 5’- GGTTACCTTGTTACCACTT-3’ Thành phần phản ứng: Buffer Taq (10X): 2,5 μl; dNTPs (2,5mM): 2,5 μl; MgCl2 (25mM): 3 μl; Mồi xuụi (20 μM): 1 μl; Mồi ngược (20 μM): 1 μl; DNA khuụn: 1 μl;
Taq DNA polymerase (5U/ μl): 0,2 μl; Nước khử ion: 13,8 μl;
Tổng thể tớch: 25 μl;
Chu trỡnh nhiệt của phản ứng PCR được sử dụng để nhõn đoạn gene 16S rRNA của xạ khuẩn như sau:
1. Biến tớnh DNA ở 940C trong 3 phỳt. 2. Tổng hợp (30 chu kỡ)
- Biến tớnh: 940C trong 1 phỳt - Gắn mồi: 450C trong 45 giõy - Kộo dài: 720C trong 1 phỳt
3. Tổng hợp bổ sung ở 720C trong 10 phỳt 4. Bảo quản ở 40C
Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng phương phỏp điện di trờn gel agarose 1%.
Sản phẩm PCR được làm sạch bằng bộ kớch AccuPrep Gel Purification theo quy trỡnh của nhà sản xuất bioneer.
2.2.2.3.3. Phương phỏp xỏc định trỡnh tự đoạn gene 16S rRNA.
Sản phẩm PCR được sau khi đó được tinh sạch được gửi xỏc định tự trờn mỏy đọc tự động ABI PRISM 3100 Avant Geneetic Analyzer sử dụng bộ kit BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing. Trỡnh tự nucleotide được xử lý bằng phần mềm ABI PRISM 3100 Avant Data Collection v 1.0 và DNA
Sequencing Analysis đú được so sỏnh với trỡnh tự gene 16S rRNA của cỏc prokaryote đó được cụng bố trờn ngõn hàng gene thế giới bằng chương trỡnh BLAST.
2.2.3. Nghiờn cứu động thỏi của quỏ trỡnh lờn men.
Xạ khuẩn được nuụi cấy trong 100 ml mụi trường Gauze-1 dịch thể trong cỏc binh tam giỏc 500 ml, lắc với tốc độ 200 vũng/phỳt. Tại cỏc thời điểm khỏc nhau 24h
, 48h, 72h, 96h, 120h, dịch nuụi cấy đựơc lấy ra để xỏc định cỏc thụng số như độ pH, sinh khối khụ và hoạt tớnh khỏng sinh.
Cỏch xỏc định sinh khối khụ: dịch lờn men được lọc lấy sinh khối, rửa sạch, rồi sấy khụ ở 105 oC đến trọng lượng khụng đổi và xỏc định bằng cõn phõn tớch.
2.2.4. Tỏch chiết chất khỏng sinh.
2.2.4.1. Tỏch chiết chất khỏng sinh từ sinh khối.
Sau khi lờn men, dịch nuụi được lọc bằng giấy lọc và sinh khối được tỏch riờng. phần sinh khối được rửa 3 - 4 lần bằng nước cất sau đú bổ sung dung mụi hữu cơ với tỷ lệ 1 : 3. Hỗn hợp dung mụi sinh khối này được lắc trong 30 phỳt, sau đú ly tõm loại sinh khối. Cuối cựng dung mụi chiết được thử khỏng sinh trờn vi sinh vật kiểm định bằng phương phỏp khoanh giấy lọc.
2.2.4.2. Tỏch chiết chất khỏng sinh từ dịch lọc.
Dịch lờn men sau khi loại bỏ sinh khối được chỉnh về 3, 7, 10 rồi bổ sung cỏc loại dung mụi hữu cơ: n_butanol, methanol, propanol, axeton với tỷ lệ 1:10 thể tớch lờn men và lắc định kỳ. Trộn hai pha trờn sau đú phõn ly bằng phương phỏp lắng gạn. Dịch thu được cho vào mỏy lắc cho bay hết dung mụi. Sau 24 h, thử hoạt tớnh khỏng sinh bằng phương phỏp khoanh giấy lọc.
2.2.5. Xỏc định một số tớnh chất hoỏ lý và phõn loại khỏng sinh. 2.2.5.1. Xỏc định độ bền nhiệt của dịch khỏng sinh thụ. 2.2.5.1. Xỏc định độ bền nhiệt của dịch khỏng sinh thụ.
Dịch khỏng sinh thụ được đưa đi xử lý ở cỏc nhiệt độ khỏc nhau 40, 60, 80, 100 oC trong thời gian 10, 20, 30, 60 phỳt, sau đú làm nguội ở nhiệt độ 28
oC rồi tiến hành thử hoạt tớnh khỏng sinh bằng phương phỏp đục lỗ.
- Chuẩn bị đĩa thạch pH gradient
+ Đệm pH 8 gồm cú: Dung dịch K2HPO4 1M (174,2 gram K2HPO4 + 1 lớt H2O).
+ Đệm pH 5,6: Dung dịch KH2PO4 1M (136,12 gram KH2PO4 + 1 lớt H2O).
- Khử trựng 3 lần trong 30 phỳt, ở 1210
C.
- Để tạo pH 8: trộn 5 ml dung dịch K2HPO4 và 15 ml dung dịch thạch đúi đó làm núng chảy rồi đổ vào đĩa và để nghiờng để tạo gradient (hỡnh 2.1)
- Để tạo pH 5,6: ta trộn 5 ml dung dịch KH2PO4 và 15 ml dung dịch thạch đúi đó làm núng chảy rồi đổ vào đĩa đó cú pH 8 (hỡnh 2.1).
Từ đú ta thu được 1 đĩa thạch cú pH thay đổi liờn tục từ pH 8 đến pH 7 và đầu cũn lại cú pH 5,6 (xem hỡnh 2.1).
Sau đú, đổ 10 ml mụi trường cú chứa vi sinh vật kiểm định trờn mặt đĩa thạch pH Gradent đục 6 lỗ và tiến hành nhỏ dịch khỏng sinh thụ để thử hoạt tớnh. Sự khuyếch tỏn của khỏng sinh được tớnh theo đường kớnh của vũng vụ khuẩn tạo thành.
Hỡnh 2.1. Đĩa thạch Gradient pH 2.2.5.3. Phương phỏp xỏc định giỏ trị Rf.
Dịch khỏng sinh thụ được sắc kớ trờn giấy theo Blinov và Khokhlop, 1970 [30].
Chấm dịch khỏng sinh thụ lờn giấy sắc kớ Whatman No2, để khụ rồi chạy sắc kớ với cỏc hệ dung mụi sau:
1. Butanol bóo hoà nước 2. Nước bóo hoà butanol
Lớp thạch cú pH 5,6 Mụi trường cú chứa vi khuẩn
Xanthomonas oryzae
Khu vực cú pH 7 Lớp thạch
3. Butanol bóo hoà dung dịch pirydine 2% 4. Butanol: axit axetic: nước theo tỷ lệ 2:1:1
Phương phỏp xỏc định giỏ trị Rf: sau khi chạy sắc kớ trờn giấy, sử dụng phương phỏp hiện hỡnh sinh học, băng giấy sắc kớ được làm khụ tự nhiờn, đặt lờn bề mặt thạch đó trộn vi sinh vật kiểm định là vi khuẩn Xanthomonas oryzae, nuụi cấy sau 24 h ở nhiệt độ 28 oC giỏ trị Rf được xỏc định bằng tỷ số giữa khoảng cỏch từ vạch xuất phỏt đến tõm điểm hiện hỡnh với khoảng cỏch từ vạch xuất phỏt tới vạch dung mụi chạy đến. Rf= a/b
a: khoảng cỏch từ vạch
Đo giỏ trị Rf với mỗi hệ dung mụi.
Hỡnh 2.2. Băng sắc kớ trờn giấy Điểm nhỏ dịch kháng sinh Vạch kháng sinh dừng lại trùng với điểm hiện hình Vạch chạy đến của dung môi a b Vạch mức mặt thoáng của dung môi
Phần 3. Kết quả và thảo luận
3.1. Phõn lập và tuyển chọn.
3.1.1. Phõn lập xạ khuẩn từ đất rừng ngập mặn.
Từ 39 mẫu đất thuộc đất rừng ngập mặn tỉnh Thỏi Bỡnh (TB) và 34 mẫu đất thuộc đất rừng ngập mặn tỉnh Nam Định (NĐ) đó phõn lập và thuần khiết được 47 chủng xạ khuẩn thuộc tỉnh Thỏi Bỡnh và 79 chủng xạ khuẩn thuộc tỉnh Nam Định. Cỏc chủng xạ khuẩn phõn lập được quan sỏt chia thành cỏc nhúm cú màu sắc khỏc nhau theo bảng màu của Tresner và Backus, 1963. Kết quả được trỡnh bày ở bảng 3.1và bảng 3.2.
Bảng 3.1. Phõn loại xạ khuẩn TB theo màu sắc KTKS
Trắng Xỏm nõu Hồng Xanh Tổng Thỏi Bỡnh 22 (46,80%) 15 (31,91%) 4 (8,51%) 4 (8,51%) 2 (4,25%) 47 (100%)
Bảng 3.2. Phõn loại xạ khuẩn NĐ theo màu sắc KTKS
Trắng Xỏm Hồng Xanh Nõu Vàng Tổng Nam Định 47 (59,49% ) 8 (10,12% ) 12 (15,13%) 3 (3,8% ) 6 (7,6,8%) 3 (3,8% ) 79 (100% )
Qua bảng 3.1 và 3.2 ta thấy cỏc chủng XK phõn lập ở cỏc vựng này rất đa dạng về màu sắc. Kết quả phõn lập và tuyển chọn dụa trờn màu sắc của khuẩn ty khớ sinh (KTKS) thu được từ 47 chủng xạ khuẩn TB chia thành 5 nhúm màu. Trong đú, nhúm cú màu trắng chiếm tỷ lệ cao nhất 46,8%, nhúm cú màu xanh chiếm tỷ lệ thấp nhất 4,25%, cỏc nhúm cũn lại là màu xỏm, màu xỏm và màu hồng chiếm tỷ lệ lần lượt là 31,91%, 8,51%, 8,51%. Đồng thời thu được 79 chủng NĐ được chia thành 6 nhúm. Trong đú, nhúm xạ khuẩn màu trắng chiếm tỷ lệ cao nhất 59,49%, tiếp sau đú là nhúm màu hồng 15,13%; nhúm màu xỏm chiếm 10,12%; cỏc nhúm màu xanh, vàng cựng chiếm 3,8% và cuối cựng là nhúm màu nõu chiếm 7,8%. Như vậy, cú thể núi rằng, ở cỏc mẫu đất nghiờn cứu thỡ nhúm xạ khuẩn màu trắng và màu xỏm là phổ biến, những nhúm màu cũn lại là những nhúm ớt gặp, tần số bắt gặp phụ