3.2.1. Đặc điểm hỡnh thỏi chủng xạ khuẩn TB10.2.
Để mụ tả đặc điểm hỡnh thỏi và tớnh chất nuụi cấy của chủng TB10.2 ,
chỳng tụi nuụi cấy chủng này trờn cỏc mụi trường Gauze1, Gauze 2, ISP-3, ISP-6, Glyxerin – nitrat và hữu cơ – Agar. Hỡnh thỏi khuẩn lạc và kớch thước khuẩn lạc, hỡnh dạng cuống sinh bào tử được mụ tả theo phương phỏp của Gauze và cộng sự ,1983.
Bảng 3.10. Đặc điểm hỡnh thỏi của chủng TB10.2
Đặc điểm hỡnh thỏi Chủng TB10.2
- Kớch thước khuẩn lạc 1 – 2 mm - Cuống sinh bào tử xoắn - Bề măt bào tử Trơn
Hỡnh 3.7. Hỡnh dạng và bề mặt bào tử chủng TB10.2
Bảng 3.11. một số đặc điểm hỡnh thỏi của chủng xạ khuẩn TB110.2 Mụi trường Khả năng
sinh trưởng Màu sắc KTCC Màu sắc KTKS Sắc tố tan Gauze1 ++ Vàng Hồng Khụng Gauze2 + Khụng ISP-3 +++ Vàng chanh Trắng Khụng ISP -6 +++ Trắng Khụng A B
Hữu cơ Agar +++ Glyxerin- Nitrat +++ Vàng xanh Trắng Vàng yếu
Ghi chú: + : sinh tr-ởng yếu, ++ : sinh tr-ởng trung bình +++ :sinh tr-ởng tốt, ++++: sinh tr-ởng rất tốt
KTKS: khuẩn ty khí sinh KTCC: khuẩn ty cơ chất
Kết quả trờn cho thấy trờn cỏc mụi trường khỏc nhau thỡ chủng TB10.2 cú màu sắc khỏc nhau, nhưng chủ yếu từ trắng đến vàng chanh, sinh trưởng tốt trờn hầu hết cỏc mụi trường phõn loại. Trờn mụi trường ISP-6, màu của mụi trường khụng thay đổi, như vậy chủng TB10.2 khụng sinh sắc tố melanin.
3.2.2. Đặc điểm sinh lý sinh hoỏ. 3.2.2.1. Khả năng chịu muối. 3.2.2.1. Khả năng chịu muối.
Kết quả thớ nghiệm cho thấy chủng TB10.2 phỏt triển ở mức độ yếu trờn mụi trường 5% muối NaCl. Trờn mụi trường 7% muối NaCl thỡ chủng TB10.2 phỏt triển mạnh, trờn mụi trường với 10 % NaCl thỡ chủng TB10.2 phỏt triển hơi yếu. Điều này là hoàn toàn hợp lý vỡ đõy là chủng xạ khuẩn phõn lập được từ vựng đất ngập mặn của tỉnh Thỏi Bỡnh.
3.2.2.2. Khả năng đồng húa nguồn đường.
Để thử khả năng đồng hoỏ một số nguồn cacbon khỏc nhau, xạ khuẩn được nuụi trờn mụi trường ISP-9 với cỏc nguồn đường khỏc nhau, xạ khuẩn sinh trưởng phỏt triển tốt trờn mụi trường cú bổ sung nguồn cacbon phự hợp với chỳng.
Bảng 3.12. Khả năng đồng húa cỏc nguồn đường
Stt Nguồn đường Phỏt triển
1 Glucoza ++++ 2 Arabinoza ++ 3 Saccaroza + 4 Xyloza + 5 Inositol ++++ 6 Manitol ++ 7 Fructoza ++++ 8 Lactoza ++
9 Xenluloza +
10 Đối chứng -
Chỳ thớch: Khụng phỏt triển (-), phỏt triển yếu (+), phỏt triển trung bỡnh (++), phỏt triển khỏ (+++), phỏt triển rất tốt (++++).
Hỡnh 3.8. Khả năng đồng hoỏ cỏc nguồn đường của chủng TB10.2.
Kết quả bảng trờn cho thấy, chủng TB10.2 sử dụng tốt nhất nguồn cacbon từ đường glucoza, inositol và fructoza. Trờn cỏc nguồn cacbon khỏc, chủng này chỉ phỏt triển ở mức trung bỡnh. Với nguồn cacbon là xenluloza, chủng TB10.2 cú khả năng đồng hoỏ yếu, bằng chứng là chỳng phỏt triển kộm trờn mụi trường cú nguồn cacbon duy nhất là xenluloza. Điều này cú nghĩa rằng chủng TB10.2 cú khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza ở mức độ yếu (hỡnh 3.8 và bảng 3.12). 3.2.3. Mụ tả đặc điểm phõn loại. * Mụ tả phõn loại TB10.2 CS 1983: 1: màu
của hệ sợi khớ sinh (KT hồng nhạt TB10.2
Roreus (Hỡnh 3.9). Chỳ thớch 1 Glucoza 6 Manitol 2 Arabinoza 7 Fructoza 3 Saccaroza 8 Lactoza 4 Xyloza 9 Xenluloza 5 Inositol 10 Đối chứng
Hỡnh 3.9. Màu của KTKS (A) và màu của KTCC (B) của chủng TB10.2 trờn mụi trường Gause 1 sau 7 ngày nuụi.
3.7A -
3.7B). Trờn mụi trường khoỏng Gause-1, khụng tạo
Streptomyces padanus. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Từ những thụng tin về cỏc đặc điểm hỡnh thỏi, tớnh chất sinh lý sinh húa
và nuụi cấy cú thể kết TB10.2 thuộc chi
Streptomyces.
Streptomyces padanus.
So sỏnh cỏc đặc điểm hỡnh thỏi và sinh lý húa của chủng xạ khuẩn TB10.2 với cỏc đặc điểm hỡnh thỏi và sinh lý sinh húa của chủng xạ khuẩn
Streptomyces pandanus cho thấy chủng xạ khuẩn TB10.2 cú đặc điểm rất giống với chủng xạ khuẩn Streptomyces pandanus nhưng cú một số ớt điểm khỏc biệt về màu sắc khuẩn ty. Kết quả so sỏnh đặc điểm phõn loại chủng xạ khuẩn TB 10.2 và chủng Streptomyces pandanus trỡnh bày ở bảng 3.13.
Bảng 3.13. So sỏnh đặc điểm hỡnh thỏi của chủng TB10.2 với chủng S. padanus
Mụi trường Đặc điểm Chủng
TB 10.2 S. Padanus
Gauze-1 KTCC Vàng Vàng
B A
KTKS Hồng Hồng
CSBT Xoắn tạo sợi Xoắn tạo sợi
Bề mặt bào tử Trơn Trơn
Sắc tố tan - -
Glyxerin- Nitrat KTCC Vàng xanh Vàng xanh
KTKS Trắng Trắng
Sắc tố tan Vàng yếu Vàng yếu
ISP-6 Sinh melanin - -
Chỳ thớch:
KTCC: Khuẩn ty cơ chất KTKS: Khuẩn ty khớ sinh CSBT: Cuống sinh bào tử
Như vậy chủng TB10.2 là một chủng thuộc loài Streptomeces padanus
và được đặt tờn là S. padanus TB10.2.
3.3. Phõn loại bằng phương phỏp sinh học phõn tử.
Từ cỏc đặc điểm hỡnh thỏi và nuụi cấy nờu trờn dựa trờn khúa phõn loại của ISP, của Gauze và cộng sự chỳng tụi đó phõn loại chủng TB10.2 thuộc dưới loài Streptomyces padanus, để khẳng định lại kết quả trờn phõn loại bằng phương phỏp sinh học phõn tử dựa trờn độ tương đồng của đoạn gen 16S rRNA của chủng này với cỏc chủng xạ khuẩn trờn ngõn hàng gene quốc tế từ đú cú thờm căn cứ để phõn loại.
Để xỏc định trỡnh tự đoạn gene mó húa 16S rRNA của chủng xạ khuẩn TB.10.2 chỳng tụi đó tiến hành cỏc bước nghiờn cứu như đó nờu ở 2.2.4 và thu được kết quả sau:
Hỡnh 3.10. Điện di DNA của chủng TB10.2 sau khi tỏch từ kit QIAamp DNA Mini Kit
DNA tổng số của chủng xạ khuẩn TB 10.2 được tỏch chiết theo Kit của hóng QIAamp DNA Mini Kit cú cải tiến đó được trỡnh bày ở mục 2.2.4.1. DNA tổng số được điện di kiểm tra trờn gel agarose 1% phổ điện di thu được thể hiện trờn hỡnh 3.10 cho thấy DNA hàm lượng đủ lớn, để cú thể sử dụng để nhõn gene bằng phản ứng PCR.
DNA tổng số được sử dụng làm khuụn để xỏc định trỡnh tự gen 16S rRNA với căp mồi 27F và 1492R khuếch đại đoạn gen ~1500bp. Kết quả thu được như sau:
Hỡnh 3.11. Điện di sản phẩm PCR gen 16S rRNA của chủng TB10.2 Giếng 1: TB10.2; Giếng 2: marker (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Từ hỡnh 3.11 cho thấy sản phẩm của phản ứng PCR chỉ thu được một băng cú kớch thước ~1500bp điều này hoàn toàn đỳng với tớnh toỏn lý thuyết. Vỡ vậy, phản ứng PCR được thực hiện lại với thể tớch lớn để tinh sạch với bộ kit AccuPrep gel purification theo quy trỡnh của nhà sản xuất.
Gene mó húa 16S rRNA của chủng TB10.2 được giải trỡnh tự trực tiếp từ sản phẩm PCR với cặp mồi như đó dựng nhõn đoạn gene đú từ DNA tổng số trờn mỏy đọc trỡnh tự tự động ABI PRISM 3100. Sau khi phõn tớch và xử lý số liệu, trỡnh tự đoạn gene 16S rRNA của chủng dược so sỏnh với cỏc chuỗi
1500
rRNA 16S đó được cụng bố trờn ngõn hàng gene quốc tế bằng chương trỡnh BLAST. Bảng 3.14. so sỏnh trỡnh tự 16S rRNA của chủng TB10.2 trờn ngõn hàng gen quốc tế Description Max score Total score Query cover E value Max ident Accession
Streptomyces padanus 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence 2791 2791 100% 0.0 99% AF455813.1 Streptomyces sp. 2482 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence 2785 2785 99% 0.0 99% EU864311.1 Streptomyces sp. P127 16S ribosomal RNA
gene, complete sequence 2785 2785 99% 0.0 99% EU797798.1 Streptomyces sp. MD1 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence 2780 2780 99% 0.0 99% HM641908.1 Streptomyces sp. NRRL 30562 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence 2736 2736 98% 0.0 99% AY127079.1 Streptomyces sp. TP-A0274 gene for 16S
rRNA, partial sequence 2732 2732 97% 0.0 99% AB088069.1 Streptomyces costaricanus strain NBRC
100773 16S ribosomal RNA, partial sequence 2717 2717 97% 0.0 99% NR_041414.1 Streptomyces graminearus gene for 16S
rRNA, partial sequence, strain: NBRC 15420 2710 2710 97% 0.0 99% AB184667.1 Streptomyces griseofuscus strain NBRC
12870 16S ribosomal RNA, partial sequence 2710 2710 97% 0.0 99% NR_041084.1 Streptomyces murinus strain NBRC 12799
16S ribosomal RNA, partial sequence 2710 2710 97% 0.0 99% NR_041072.1 Streptomyces griseofuscus 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence 2708 2708 97% 0.0 99% AY207605.1 Streptomyces sp. WZ1-5019 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence 2700 2700 97% 0.0 99% HQ456134.1 Streptomyces sp. MV2 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence 2697 2697 96% 0.0 99% GU220453.1 Bacterium TOPO-cloneB 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence 2695 2695 97% 0.0 99% HM243131.1 Streptomyces griseofuscus strain LS-H1 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence 2691 2691 97% 0.0 99% GU138373.1 Streptomyces murinus gene for 16S rRNA,
partial sequence, strain: NBRC 14802 2686 2686 96% 0.0 99% AB184622.1 Kết quả so sỏnh trỡnh tự gene 16rRNA cho thấy trỡnh tự 16S rRNA của chủng TB10.2 cú độ tương đồng 99% với một số dưới loài thuộc chi
Streptomyces như Streptomyces padanus AF455813.1, Streptomyces graminearus AB184667.1, Streptomyces murinus NR_041072.1…Vỡ võy,
chỳng tụi tiến hành dựng cõy phõn loại để xỏc định chủng TB10.2 thuộc dưới loài nào.
Hỡnh 3.12. Cõy phỏt sinh chủng loại của chủng TB10.2
Từ cõy phỏt sinh chủng loại nhận thấy chủng TB10.2 cú quan hệ gần gũi nhất với chủng S. padanus. điều này hoàn toàn hợp lý với khúa phõn loại cổ điển của ISP hoặc Gauze và cộng sự khi dựa vào đặc điểm nuụi cấy và đặc điểm hỡnh thỏi. Từ đú chỳng tụi đưa ra kết luận cuối cựng chủng TB10.2 thuộc loài Streptomyces padanus và cú tờn là Streptomyces padanus TB10.2.
Hiện nay, trờn thế giới một số cỏc chủng xạ khuẩn thuộc loài
Streptomyces padanus cú khả năng sinh chất khỏng sinh đó được cụng bố. Theo Waksman, cỏc xạ khuẩn thuộc loài Streptomyces padanus cú khả năng sinh chất khỏng sinh etabetacin hoạt phổ rộng ức chế cỏc vi sinh vật thụng qua ức chế tổng hợp vật chất di truyền của chỳng. Ngoài ra, đõy cũng là khỏng sinh đầu tiờn cho thấy cú hoạt tớnh diệt tế bào ung thư.
3.4. Nghiờn cứu động thỏi lờn men của chủng TB10.2.
3.4.1. Lựa chọn mụi trường lờn men chủng xạ khuẩn TB10.2.
Chủng S. padanus TB10.2 được nuụi lắc trờn cỏc mụi trường Gauze-1, ISP-4, A-4H với cỏc thụng số: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Thể tớch: 100ml/bỡnh tam giỏc 500 ml
- Nhiệt độ: 28 - 30 o
C
Kết quả thử hoạt tớnh khỏng sinh cỏc dịch lờn men của ba mụi trường thấy rằng hoạt tớnh khỏng sinh mạnh nhất ở mụi trường Gauze - 1. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.15.
Bảng 3.15. Hoạt tớnh khỏng sinh của chủng xạ khuẩn S. padanus TB10.2 trờn cỏc mụi trường nghiờn cứu
Mụt trường Hoạt tớnh khỏng sinh (D-d), mm
Gauze-1 22
ISP-4 17
A-4H 16
Vỡ vậy, chọn mụi trường Gauze-1 để tiến hành nghiờn cứu tiếp theo.
3.4.2. sự biến động của pH, tốc độ sinh trưởng và sinh chất khỏng sinh của chủng xạ khuẩn TB10.2.
Cỏc thụng số nghiờn cứu là sự biến đổi của pH, sự tăng sinh khối trong quỏ trỡnh lờn men, hoạt tớnh khỏng sinh của dịch lờn men. Sau 24, 48,...và 144 giờ nuụi cấy dịch được lấy mẫu để xỏc định cỏc thụng số pH, hoạt tớnh khỏng sinh, sinh khối. Kết quả được trỡnh bày ở bảng 3.16 và hỡnh 3.13.
Bảng 3.16. Sự biến đổi pH, hoạt tớnh khỏng sinh, sinh khối của chủng S. padanus TB10.2 trờn mụi trường Gauze-1
Thụng số Thời gian lờn men ( giờ)
0 24 48 72 96 120 144 pH 7,0 6 6,8 7 7,2 7,5 7,5 Hoạt tớnh khỏng sinh 0 6 18 20 24 30 25 Sinh khối 0,4 5 6,8 7,3 8,7 5 5
0 5 10 15 20 25 30 35 0 24 48 72 96 120 144 pH hoạt tinh kháng sinh ( mm) sinh khối
Hỡnh 3.13. Động thỏi của quỏ trỡnh lờn men sinh tổng hợp chất khỏng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces padanus TB10.2 trờn mụi trường
Gauze-1.
Kết quả trỡnh bày ở bảng 3.15 và hỡnh 3.13 cho thấy pH của dịch lờn men giảm dần sau 48 giờ lờn men và sau đú lại tăng trở lại cho đến khi kết thỳc quỏ trỡnh lờn men.
Khối lượng sinh khối của chủng xạ khuẩn TB10.2 được tớch luỹ cao nhất tại thời điểm 96h nuụi cấy (8,7 mg/ml) và giảm dần sau đú.
Hoạt tớnh khỏng sinh của dịch lờn men đạt cực đại sau 5 ngày nuụi cấy cú thể giải thớch do chất khỏng sinh là những chất trao đổi thứ cấp được hỡnh thành sau 1-2 ngày nuụi cấy.
3.5. Nghiờn cứu một số tớnh chất của dịch khỏng sinh thụ. 3.5.1. Tỏch chiết chất khỏng sinh. 3.5.1. Tỏch chiết chất khỏng sinh.
Dịch nuụi cấy chủng xạ khuẩn S. Padanus TB10.2 sau 120 giờ nuụi cấy được lọc qua giấy lọc và tỏch làm 2 phần:
Phần dịch lọc được điều chỉnh về pH=7 và chiết bằng n-butanol cho bay hơi butanol ở nhiệt độ 40oC. Chất khỏng sinh thụ của chủng xạ khuẩn TB10.2 tuyển chọn cú màu vàng nghệ.
3.5.2. Độ bền nhiệt của dịch khỏng sinh thụ.
Để xỏc định độ bền nhiệt của dịch khỏng sinh thụ do chủng TB10.2 sinh ra, xử lý dịch khỏng sinh thụ ở cỏc nhiệt độ khỏc nhau: 40o
và 100oC trong cỏc khoảng thời gian 5 phỳt, 10 phỳt, 15 phỳt và 30 phỳt. Sau đú, dịch khỏng sinh đó xử lý nhiệt được thử hoạt tớnh khỏng sinh với vi khuẩn
S.aureus. Kết quả được tỡnh bày ở bảng 3.17.
Bảng 3.17. Hoạt tớnh của dịch khỏng sinh thụ của chủng S. Padanus
TB10.2 sau khi xử lý nhiệt với vi sinh vật kiểm định S. aureus (mm) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thời gian Nhiệt độ 40oC 60oC 80oC 100oC 5 phỳt 13 10 10 10 10 phỳt 13 10 10 10 15 phỳt 10 9 8 8 30 phỳt 10 8 7 7 Tỷ lệ (%) 2,307 2 3 3
1: hoạt tớnh khỏng sinh của dịch khỏng sinh thụ sau khi xử lý 5 phỳt 2: hoạt tớnh khỏng sinh của dịch khỏng sinh thụ sau khi xử lý 10 phỳt 3: hoạt tớnh khỏng sinh của dịch khỏng sinh thụ sau khi xử lý 15 phỳt 4: hoạt tớnh khỏng sinh của dịch khỏng sinh thụ sau khi xử lý 30 phỳt
Qua bảng 3.17 cho thấy hoạt tớnh khỏng sinh của chủng xạ khuẩn chủng S. padanus TB10.2 ở cựng một nhiệt độ xử lý, hoạt tớnh khỏng sinh ớt bị ảnh hưởng bởi thời gian xử lý nhưng giảm dần khi nhiệt độ tăng. Tuy nhiờn, vũng vụ khuẩn vẫn xuất hiện với độ rộng khỏ cao và lỷ lệ giảm thấp từ 2 -3% trong 30 phỳt sử lý nhiệt độ. Điều đú chứng tỏ đõy là một chất khỏng sinh chịu nhiệt và cần được tiếp tục nghiờn cứu sõu hơn.
3.5.3. Ảnh hưởng của pH đến độ khuyếch tỏn của dịch khỏng sinh thụ. 2 2
3 1
4
Hỡnh 3.14. hoạt tớnh của dịch khỏng sinh thụ với vi khuẩn S.aureus sau khi xử lý nhiệt ở 100 0C
Để xỏc định ảnh hưởng của pH đến độ khuyếch tỏn của khỏng sinh, chủng S. padanus TB10.2 được tiến hành thử hoạt tớnh bằng phương phỏp đục lỗ với vi sinh vật kiểm định S. aureus trờn mụi trường pH gradient gồm 3 lớp. Lớp dưới cựng là thạch cú chứa K2HPO4 để tạo pH = 8 và để nghiờng, lớp thứ 2 là thạch cú chứa KH2PO4 pH= 5,6 và lớp trờn cựng là mụi trường LBA cú chứa vi sinh vật kiểm định. Sau 24 giờ đo đường kớnh vũng vụ khuẩn, kết quả được thể hiện ở bảng 3.18.
Qua bảng 3.18 ta thấy chất khỏng sinh khuyếch tỏn tốt nhất ở pH = 7 và ở pH axit (pH = 5,6) độ khuyếch tỏn kộm hơn so với pH kiềm ( pH= 8).
3.5.4. Đặc điểm sắc kớ của dịch khỏng sinh thụ của chủng xạ khuẩn chủng
S. padanus TB10.2 trong một số hệ dung mụi.
Giỏ trị Rf của chất khỏng sinh thụ của chủng TB10.2 được xỏc định bằng cỏch chấm dịch khỏng sinh thụ lờn giấy sắc kớ, chạy sắc kớ trờn một số hệ dung mụi. Sau đú hiện hỡnh bằng phương phỏp hiện hỡnh sinh học với vi sinh vật kiểm định là vi khuẩn S. aureus kết quả thu được trỡnh bày ở bảng 3.19, hỡnh 3.16 và hỡnh 3.17. pH Hoạt tớnh khỏng sinh (D-d, mm) 8 30 7 35 5,6 27
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của pH tới sự khuyếch tỏn của chất khỏng sinh
Hỡnh 3.15. Ảnh hưởng của pH tới sự khuếch tỏn khỏng sinh
Bảng 3.19. Giỏ trị Rf của dịch khỏng sinh thụ trờn một số hệ dung mụi
Hệ dung mụi Rf
Butanol bóo hoà nước 0,227
Butanol: axetic:nước ( 2:1:1) 0,486 butanol bóo hoà pyridine 2% 0,963
Nước bóo hoà butanol 0,909
Kết quả thớ nghiệm cho ta thấy chất khỏng sinh do chủng TB10.2 sinh ra cú khả năng hũa tan tốt nhất trong hệ dung mụi n-Butanol bóo hũa pyridine 2%. Vỡ vậy cú thể dựng hệ dung mụi này để tỏch chiờt chất khỏng sinh khi