- Chuẩn bị đĩa thạch pH gradient
+ Đệm pH 8 gồm cú: Dung dịch K2HPO4 1M (174,2 gram K2HPO4 + 1 lớt H2O).
+ Đệm pH 5,6: Dung dịch KH2PO4 1M (136,12 gram KH2PO4 + 1 lớt H2O).
- Khử trựng 3 lần trong 30 phỳt, ở 1210
C.
- Để tạo pH 8: trộn 5 ml dung dịch K2HPO4 và 15 ml dung dịch thạch đúi đó làm núng chảy rồi đổ vào đĩa và để nghiờng để tạo gradient (hỡnh 2.1)
- Để tạo pH 5,6: ta trộn 5 ml dung dịch KH2PO4 và 15 ml dung dịch thạch đúi đó làm núng chảy rồi đổ vào đĩa đó cú pH 8 (hỡnh 2.1).
Từ đú ta thu được 1 đĩa thạch cú pH thay đổi liờn tục từ pH 8 đến pH 7 và đầu cũn lại cú pH 5,6 (xem hỡnh 2.1).
Sau đú, đổ 10 ml mụi trường cú chứa vi sinh vật kiểm định trờn mặt đĩa thạch pH Gradent đục 6 lỗ và tiến hành nhỏ dịch khỏng sinh thụ để thử hoạt tớnh. Sự khuyếch tỏn của khỏng sinh được tớnh theo đường kớnh của vũng vụ khuẩn tạo thành.
Hỡnh 2.1. Đĩa thạch Gradient pH 2.2.5.3. Phương phỏp xỏc định giỏ trị Rf.
Dịch khỏng sinh thụ được sắc kớ trờn giấy theo Blinov và Khokhlop, 1970 [30].
Chấm dịch khỏng sinh thụ lờn giấy sắc kớ Whatman No2, để khụ rồi chạy sắc kớ với cỏc hệ dung mụi sau:
1. Butanol bóo hoà nước 2. Nước bóo hoà butanol
Lớp thạch cú pH 5,6 Mụi trường cú chứa vi khuẩn
Xanthomonas oryzae
Khu vực cú pH 7 Lớp thạch
3. Butanol bóo hoà dung dịch pirydine 2% 4. Butanol: axit axetic: nước theo tỷ lệ 2:1:1
Phương phỏp xỏc định giỏ trị Rf: sau khi chạy sắc kớ trờn giấy, sử dụng phương phỏp hiện hỡnh sinh học, băng giấy sắc kớ được làm khụ tự nhiờn, đặt lờn bề mặt thạch đó trộn vi sinh vật kiểm định là vi khuẩn Xanthomonas oryzae, nuụi cấy sau 24 h ở nhiệt độ 28 oC giỏ trị Rf được xỏc định bằng tỷ số giữa khoảng cỏch từ vạch xuất phỏt đến tõm điểm hiện hỡnh với khoảng cỏch từ vạch xuất phỏt tới vạch dung mụi chạy đến. Rf= a/b
a: khoảng cỏch từ vạch
Đo giỏ trị Rf với mỗi hệ dung mụi.
Hỡnh 2.2. Băng sắc kớ trờn giấy Điểm nhỏ dịch kháng sinh Vạch kháng sinh dừng lại trùng với điểm hiện hình Vạch chạy đến của dung môi a b Vạch mức mặt thoáng của dung môi
Phần 3. Kết quả và thảo luận
3.1. Phõn lập và tuyển chọn.
3.1.1. Phõn lập xạ khuẩn từ đất rừng ngập mặn.
Từ 39 mẫu đất thuộc đất rừng ngập mặn tỉnh Thỏi Bỡnh (TB) và 34 mẫu đất thuộc đất rừng ngập mặn tỉnh Nam Định (NĐ) đó phõn lập và thuần khiết được 47 chủng xạ khuẩn thuộc tỉnh Thỏi Bỡnh và 79 chủng xạ khuẩn thuộc tỉnh Nam Định. Cỏc chủng xạ khuẩn phõn lập được quan sỏt chia thành cỏc nhúm cú màu sắc khỏc nhau theo bảng màu của Tresner và Backus, 1963. Kết quả được trỡnh bày ở bảng 3.1và bảng 3.2.
Bảng 3.1. Phõn loại xạ khuẩn TB theo màu sắc KTKS
Trắng Xỏm nõu Hồng Xanh Tổng Thỏi Bỡnh 22 (46,80%) 15 (31,91%) 4 (8,51%) 4 (8,51%) 2 (4,25%) 47 (100%)
Bảng 3.2. Phõn loại xạ khuẩn NĐ theo màu sắc KTKS
Trắng Xỏm Hồng Xanh Nõu Vàng Tổng Nam Định 47 (59,49% ) 8 (10,12% ) 12 (15,13%) 3 (3,8% ) 6 (7,6,8%) 3 (3,8% ) 79 (100% )
Qua bảng 3.1 và 3.2 ta thấy cỏc chủng XK phõn lập ở cỏc vựng này rất đa dạng về màu sắc. Kết quả phõn lập và tuyển chọn dụa trờn màu sắc của khuẩn ty khớ sinh (KTKS) thu được từ 47 chủng xạ khuẩn TB chia thành 5 nhúm màu. Trong đú, nhúm cú màu trắng chiếm tỷ lệ cao nhất 46,8%, nhúm cú màu xanh chiếm tỷ lệ thấp nhất 4,25%, cỏc nhúm cũn lại là màu xỏm, màu xỏm và màu hồng chiếm tỷ lệ lần lượt là 31,91%, 8,51%, 8,51%. Đồng thời thu được 79 chủng NĐ được chia thành 6 nhúm. Trong đú, nhúm xạ khuẩn màu trắng chiếm tỷ lệ cao nhất 59,49%, tiếp sau đú là nhúm màu hồng 15,13%; nhúm màu xỏm chiếm 10,12%; cỏc nhúm màu xanh, vàng cựng chiếm 3,8% và cuối cựng là nhúm màu nõu chiếm 7,8%. Như vậy, cú thể núi rằng, ở cỏc mẫu đất nghiờn cứu thỡ nhúm xạ khuẩn màu trắng và màu xỏm là phổ biến, những nhúm màu cũn lại là những nhúm ớt gặp, tần số bắt gặp phụ thuộc từng mẫu đất cú thể khỏc nhau.
Để tuyển chọn xạ khuẩn, chỳng tụi tiến hành thử hoạt tớnh khỏng sinh bằng phương phỏp khối thạch với cỏc vi sinh vật kiểm định là vi khuẩn Gram dương: B. subtilis, Staphylococcus aureus; vi khuẩn G (-): E.coli và vi nấm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Fusarium oxysporum. Đồng thời cỏc chủng XK phõn lập cũng được thử hoạt tớnh khỏng sinh với vi khuẩn S.aureus được phõn lập tại bệnh viện đa khoa Tỉnh Bắc Ninh. Với mục đớch kiểm tra sự khỏc nhau về hoạt tớnh khỏng sinh giữa chủng phõn lập và chủng kiểm định nhằm tỡm ra chủng cú khả năng sinh ra khỏng sinh cú thể ứng dụng trong y học diệt vi khuẩn tụ cầu vàng mà chưa bị hiện tượng khỏng thuốc.
3.1.2. Phõn lập vi khuẩn Staphylococcus aureus.
Cỏc chủng vi khuẩn S. aureus được phõn lập tại bệnh viờn đa khoa Tỉnh Bắc Ninh tại cỏc khu vực thuộc 9 phũng mổ, 3 phũng thủ thuật và hành lang phớa trước cỏc phũng trờn. Mụi trường để phõn lập là mụi trường đặc hiệu Chapman và mụi trường thạch mỏu. Kết quả phõn lập được trỡnh bày tại bảng 3.2 và hỡnh 3.1 :
Hỡnh 3.1. phõn lập vi khuẩn S. aureus tại bệnh viện ĐK tỉnh Bắc Ninh Bảng 3.3.Kết quả phõn lập vi khuẩn S. aureus tại cỏc phũng mổ và phũng
thủ thuật.
STT Khu vực PL Kết quả STT Khu vực PL Kết quả
1 PM 1 - 13 HLPM 1 -
2 PM 2 - 14 HLPM 2 -
3 PM 3 - 15 HLPM 3 +
4 PM 4 - 16 HLPM 4 -
6 PM 6 - 18 HLPM 6 - 7 PM 7 - 19 HLPM 7 - 8 PM 8 - 20 HLPM 8 - 9 PM 9 - 21 HLPM 9 - 10 PTT 1 - 22 HLPTT 1 + 11 PTT 2 - 23 HLPTT 2 + 12 PTT 3 - 24 HLPTT 3 +
Từ kết quả trờn cho chỳng ta thấy vấn đề kiểm soỏt nhiễm khuẩn tại bệnh viện đa khoa Tỉnh Bắc Ninh trong thời gian qua là rất tốt, hiện tại chưa thấy xuất hiện sự cú mặt của vi khuẩn tụ cầu vàng trong cỏc phũng mổ và phũng thủ thuật điều này tạo nờn sự an toàn của bệnh nhõn khi được điều trị tại đõy. Cỏc khu vực cú sự hiện diện của vi khuẩn S.aureus là hành lang thuộc khu vực phũng mổ 3, 5 và hành lang cỏc phũng thủ thuật. Mặc dự tất cả cỏc khu vực trờn đều được thực hiện cụng tỏc kiểm soỏt nhiễm khuẩn định kỳ nhưng vẫn cú sự xuất hiện của vi khuẩn này, lý do đõy là khu vực bệnh nhõn từ mụi trường bờn ngoài bệnh viện đến và qua lại mang theo vi khuẩn. Cỏc vi khuẩn này được dựng khỏng sinh đồ để tỡm ra khỏng sinh cú khả năng tiờu diệt mạnh nhất và so sỏnh sự khỏc nhau với chủng vi khuẩn kiểm định được cung cấp bởi phũng Di truyền Vi sinh vật – Viện Cụng nghệ Sinh học. Kết quả thể hiện trong hỡnh 3.2.
Hỡnh 3.2a. khỏng sinh đồ chủng vi khuẩn S.aureus của bệnh viện đa khoa tỉnh Bắc Ninh B 1 2 3 4 5 6 A 2 1 4 3 5 7 6
Đĩa A
1. CIP ( Ciprofloxacine)
2.AMC ( Amo + axitclavulanic) 3.VA ( Vancomycin) 4.AKN ( Amikacine) 5.CXM ( Cefuroxime) 6.CFM ( Cefixime) 7.GM ( Gentamycine) Đĩa B 1.IPM ( Imipenem) 2. C ( Chloramphenicol) 3.CM ( Clindamycin) 4.OX1 ( Oxacilline) 5.CTX ( Cefotaxime) 6.OFX ( Ofloxacine)
Hỡnh 3.2b. Khỏng sinh đồ chủng vi khuẩn S.aureus do phũng Di truyềnVi sinh vật – Viện Cụng nghệ Sinh học cung cấp
Đĩa A: 1. IPM (Imipenem), 2. C (Chloramphenicol), 3.OFX (Ofloxacine) 4.CTX (Cefotaxime), 5.OX1(Oxacilline), 6. CM (Clindamycin), Đĩa B: 1. VA (Vancomycin),
2. AMC (Amo + axitclavulanic 3.CIP (Ciprofloxacine)
4.GM (Gentamycine) 5.CFM(Cefixime) 6.CXM(Cefuroxime) 7.AKN (Amikacine)
Kết quả khỏng sinh đồ cho thấy chủng S.aureus phõn lập tại Bờnh viện ĐK tỉnh Bắc Ninh cú thể bị diệt mạnh nhất với khỏng sinh IPM (Imipenem) và AKN (Amikacine). Trong khi đú, kết quả khỏng sinh đồ của chủng
S.aureus của phũng Di truyềnVi sinh vật – Viện Cụng nghệ Sinh học cung cấp cú thể bị diệt mạnh với khỏng sinh IPM (Imipenem), AKN (Amikacine), C (Chloramphenicol), CM (Clindamycin), GM (Gentamycine), CFM
A B 1 2 7 5 4 3 6 1 2 7 5 4 3 6
(Cefixime), CXM (Cefuroxime). Từ đú cú thể kết luận rằng chủng S.aureus
phõn lập tại bệnh viện đa khoa tỉnh Bắc Ninh đó cú hiện tượng khỏng thuốc khỏng sinh. Vỡ vậy, cần tiến hành sàng lọc cỏc chủng xạ khuẩn cú khả năng diệt chủng S.aureus đó khỏng thuốc trờn.
3.1.2. Sàng lọc hoạt tớnh khỏng sinh của cỏc chủng xạ khuẩn phõn lập.
Bằng phương phỏp khối thạch cỏc chủng XK phõn lập được thử nghiệm hoạt tớnh khỏng sinh với vi sinh vật kiểm đinh gồm vi khuẩn Gram dương:
B.subtilis, S.aureus; vi khuẩn G (-): E.coli và vi nấm Fusarium oxysporum.
Đồng thời cỏc chủng XK phõn lập cũng được thử hoạt tớnh khỏng sinh với vi khuẩn S.aureus được phõn lập tại bệnh viện đa khoa Tỉnh Bắc Ninh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả thử hoạt tớnh khỏng sinh cho thấy rằng cú 22 chủng xạ khuẩn trong tổng số 47 chủng phõn lập tại Thỏi Bỡnh cú khả năng sinh khỏng sinh ức chế sự sinh trưởng phỏt triển của cỏc vi sinh vật kiểm định (bảng 3.4).
Bảng 3.4. Phõn loại xạ khuẩn phõn lập ở Thỏi Bỡnh theo nhúm màu và hoạt tớnh khỏng sinh. Nhúm xạ khuẩn Cỏc chủng thuộc cỏc nhúm Cỏc chủng cú hoạt tớnh khỏng sinh Tỉ lệ chủng cú hoạt tớnh KS so với tổng số (%) Số lượng % Số lượng % Trắng 22 46,8 9 40,9 19,14 Xỏm 15 31,91 8 36,36 17,02 Nõu 4 8,51 3 13,63 6,38 Hồng 4 8,51 1 4,54 2,13 Xanh 2 4,25 1 4,54 2,13 Tổng số 47 100 22 100 46,8
Kết quả thu được qua bảng 3.4 cho thấy cỏc chủng xạ khuẩn phõn lập tại đất rừng ngập mặn Tỉnh Thỏi Bỡnh cú số lượng chủng thuộc nhúm màu trắng chiếm tỷ lệ cao nhất 46,8 %, sau đú đến nhúm màu xỏm (31,91 % ). Do vậy, cỏc chủng cú hoạt tớnh khỏng sinh trong nhúm mỏu trắng cũng chiếm tỉ lệ lớn nhất (40,9 % ), sau đú đến nhúm màu xỏm (51,06 %).
Từ 22 chủng xạ khuẩn phõn lập tại Thỏi Bỡnh chỳng tụi chọn ra 10 chủng cú hoạt tớnh khỏng sinh mạnh hơn cả (trờn 10 mm) để tiếp tục nghiờn cứu. Tuy nhiờn, trong 10 chủng này chỉ cú 4 chủng cú hoạt tớnh diệt vi khuẩn
S. aureus và 2 chủng là TB10.2 và TB32.4 cú hoạt tớnh mạnh lần lượt là 19 mm và 15 mm, kết quả thể hiện qua hỡnh 3.3 và bảng 3.5.
Hỡnh 3.3. hoạt tớnh khỏng sinh của cỏc chủng xạ khuẩn phõn lập tại Tỉnh Thỏi Bỡnh diệt vi khuẩn S. aureus
1: TB6.3, 2: TB12.6, 3: TB10.2, 4: TB8.5, 5: TB7.2, 6: TB9.4
Bảng 3.5. Hoạt tớnh khỏng sinh của cỏc chủng xạ khuẩn phõn lập tại Tỉnh Thỏi Bỡnh khỏng vi khuẩn Staphylococcus aureus
Chủng Xạ khuẩn TB 10.2 TB 32.4 TB 30.8 TB 9.3 HTKS (D-d), mm 19 15 10 12
Với mục đớch tuyển chọn cỏc chủng xạ khuẩn cú hoạt tớnh diệt vi khuẩn
S.aureus phục vụ y học cỏc chủng này được nuụi trờn mụi trường dịch thể Gauze I, lắc trờn mỏy lắc trũn với tốc độ 200 vũng/phỳt, nhiệt độ nuụi cấy 28- 30 oC trong 120 giờ. Bằng phương phỏp khuyếch tỏn trong thạch (sử dụng phương phỏp giếng thạch) chỳng tụi đó tiến hành xỏc định hoạt tớnh khỏng sinh của dịch lờn men cỏc chủng xạ khuẩn đối với cỏc vi sinh vật kiểm định. Kết quả được trỡnh bày ở bảng 3.6 và hỡnh 3.4.
Bảng 3.6. Hoạt tớnh khỏng sinh của cỏc chủng xạ khuẩn phõn lập tại Thỏi Bỡnh trong mụi trường dịch thể khỏng vi khuẩn Staphylococcus aureus
Chủng Xạ khuẩn TB 10.2 TB 32.4 TB 30.8 TB 9.3 A 5 1 2 3 4 6
HTKS (D-d), mm
22 18 12 13
Chỳ thớch: HTKS: Hoạt tớnh khỏng sinh, D: Đường kớnh vũng vụ khuẩn, d: Đường kớnh giếng thạch
Hỡnh 3.4. Hoạt tớnh khỏng sinh của cỏc chủng xạ khuẩn tuyển chọn đất ngập mặn tỉnh Thỏi Bỡnh
1: TB9.3, 2: TB10.2, 3: TB32.4, 4: 30.8
Từ kết quả trờn cho thấy chủng xạ khuẩn TB10.2 cú hoạt tớnh mạnh nhất và ổn định với vi khuẩn S. aureus. Vỡ vậy, cú thể sử dụng chủng TB10.2 để tiến hành cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
Đồng thời sàng lọc được 36 chủng xạ khuẩn trong tổng số 79 chủng xạ khuẩn phõn lập tại Nam Định cú hoạt tớnh khỏng sinh ức chế sự sinh trưởng phỏt triển của cỏc vi sinh vật kiểm định (bảng 3.7).
Bảng 3.7. Phõn loại xạ khuẩn phõn lập tại rừng ngập mặn Tỉnh Nam Định theo nhúm màu và hoạt tớnh khỏng sinh.
Nhúm xạ khuẩn Cỏc chủng thuộc cỏc nhúm Cỏc chủng cú hoạt tớnh khỏng sinh Tỉ lệ chủng cú hoạt tớnh KS so với tổng số (%) Số lượng % Số lượng % Trắng 47 59,49 24 51.06 30,38 Xanh 3 3,8 1 2,78 1,27 Hồng 12 15,13 6 16,67 7,6 1 4 3 2
Xỏm 8 10,12 4 11,11 5,06
Nõu 6 7,6 - - -
Vàng 3 3,8 1 2,78 1,27
Tổng số 79 100% 36 100 45,58
Kết quả thu được qua bảng 3.6 cho thấy trong số cỏc chủng cú hoạt tớnh khỏng sinh, cỏc chủng màu trắng vẫn chiếm tỉ lệ lớn nhất (59,49 %), sau đú đến nhúm màu hồng (15,13 %). Tuy nhiờn, cỏc chủng xạ khuẩn phõn lập tại Nam Định cú sự đa dạng hơn về cỏc nhúm xạ khuẩn (6 nhúm) nhưng tỷ lệ cỏc nhúm cú khả năng sinh khỏng sinh là 5/6 và nhúm xạ khuẩn sinh khỏng sinh chiếm tỷ lệ cao nhất là 51,06%.
Với 10 chủng phõn lập tại rừng ngập mặn Nam Định cú hoạt tớnh khỏng sinh mạnh nhất được sử dụng để thử nghiệm hoạt tớnh khỏng sinh với vi khuẩn S. aureus chỉ 6 chủng cú hoạt tớnh xuất hiện vũng vụ khuẩn. Tuy nhiờn cỏc vũng hoạt tớnh cú độ rộng thấp từ 7 – 15mm và chủng cú hoạt tớnh mạnh nhất là NĐ 30.6.
Hỡnh 3.5. hoạt tớnh khỏng sinh của cỏc chủng xạ khuẩn phõn lập tại Nam Định diệt vi khuẩn S. aureus
1: NĐ2.1, 2: NĐ3.4, 3: NĐ1.7, 4: NĐ9.110, 5: NĐ30.6, 6: NĐ31.10 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.8. Hoạt tớnh khỏng sinh của cỏc chủng xạ khuẩn tuyển chọn khỏng vi khuẩn Staphylococcus aureus
Chủng Xạ
khuẩn NĐ2.1 NĐ8.9 NĐ9.10 NĐ30.6 NĐ31.10 NĐ31.16
HTKS (D-d), mm
7 9 11 15 12 8
Chỳ thớch: HTKS: Hoạt tớnh khỏng sinh, D: Đường kớnh vũng vụ khuẩn, d: Đường kớnh giếng thạch 5 1 2 3 4 6
Tương tự như với cỏc chủng xạ khuẩn phõn lập tại Thỏi Bỡnh sử dụng phương phỏp khuyếch tỏn trong thạch (sử dụng phương phỏp giếng thạch) chỳng tụi đó tiến hành xỏc định hoạt tớnh khỏng sinh của dịch lờn men cỏc chủng xạ khuẩn đối với cỏc vi sinh vật kiểm định. Kết quả được trỡnh bày ở bảng 3.9 và hỡnh 3.6.
Bảng 3.9. Hoạt tớnh khỏng sinh của cỏc chủng xạ khuẩn tuyển chọn trong mụi trường dịch thể khỏng vi khuẩn Staphylococcus aureus
Chủng Xạ khuẩn NĐ2.1 NĐ8.9 NĐ9.10 NĐ30.6 NĐ31.1 0 NĐ31.1 6 HTKS (D-d mm) 9 11 15 19 16 10
Chỳ thớch: HTKS: Hoạt tớnh khỏng sinh, D: Đường kớnh vũng vụ khuẩn, d: Đường kớnh giếng thạch
Hỡnh 3.6. Hoạt tớnh khỏng sinh của dịch nuụi cấy cỏc chủng xạ khuẩn tuyển chọn tại đất rừng ngập mặn tỉnh Nam Định
1: NĐ2.1, 2: NĐ8.9, 3: NĐ31.16, 4: NĐ9.10
Kết quả thử hoạt tớnh dịch lắc của cỏc chủng xạ khuẩn nờu trờn thu được sau khi thử hoạt tớnh với vi khuẩn kiểm định S. aureus cú sự thay đổi về kớch thước vũng vụ khuẩn. Tuy nhiờn, sự thay đổi hoạt tớnh của cỏc chủng trờn là do cỏc chủng được nuụi trong điều kiện lắc cú sự chuyển động trong mụi trường dịch thể và lượng trao đổi khớ nhiều hơn dẫn đến sự phỏt triển nhanh của xạ cỏc chủng xạ khuẩn vỡ vậy lượng khỏng sinh sinh ra nhiều hơn. Từ kết quả trờn, để tiếp tục những nghiờn cứu tiếp theo chỳng tụi đó lựa chọn
1
4 3
chủng TB10.2 cú hoạt phổ và hoạt tớnh khỏng sinh mạnh và ổn định nhất để tiếp tục nghiờn cứu phõn loại.
3.2. Phõn loại xạ khuẩn bằng phương phỏp truyền thống. 3.2.1. Đặc điểm hỡnh thỏi chủng xạ khuẩn TB10.2. 3.2.1. Đặc điểm hỡnh thỏi chủng xạ khuẩn TB10.2.
Để mụ tả đặc điểm hỡnh thỏi và tớnh chất nuụi cấy của chủng TB10.2 ,
chỳng tụi nuụi cấy chủng này trờn cỏc mụi trường Gauze1, Gauze 2, ISP-3, ISP-6, Glyxerin – nitrat và hữu cơ – Agar. Hỡnh thỏi khuẩn lạc và kớch thước khuẩn lạc, hỡnh dạng cuống sinh bào tử được mụ tả theo phương phỏp của