2.2.2.3.1. Tỏch DNA tổng số.
Quy trỡnh tỏch chiết DNA theo kit của hóng QIAamp DNA Mini Kit với cỏc vi khuẩn Gram dương cú cải tiến:
(1) XK được nuụi cấy trong mụi trường Gauze-1 ở 300
c trong 5-7 ngày. Dựng que cấy vũng lấy toàn bộ sinh khối từ đĩa thạch chuyển sang ống eppendorf.
(2) Bổ sung 180 μl dung dịch enzyme thớch hợp. Ủ ớt nhất 30 phỳt ở 370C.
(3) Bổ sung 20 μl proteinase K và 200 μl Buffer AL, vortex nhẹ nhàng. Ủ ở 560C trong 30 phỳt và sau đú tiếp tục ủ ở 950
C trong 15 phỳt.
(4) Ly tõm thu tủa, bổ sung 4 μl Rnase (100mg/ml), vortex khoảng 15 giõy và ủ nhiệt độ phũng trong 2 phỳt. Ly tõm loại bỏ dịch, sau đú bổ sung 200 μl Buffer AL vào mẫu. Vortex khoảng 15 giõy, ủ ở 700C trong 10 phỳt.
(5) Bổ sung 200 μl ethanol (96%), vortex 15 giõy rồi chuyển sang cột QIAamp Mini spin. Ly tõm 8.000 vũng/phỳt. Đặt cột sang ống 2 ml sạch.
(6) Bổ sung 500 μl Buffer AW1 vào cột, ly tõm 8.000 vũng/phỳt. Đặt cột sang ống 2ml sạch và loại bỏ ống cũ chứa dịch lọc. Bổ sung 500 μl Buffer AW2. Ly tõm 14.000 vũng trong 3 phỳt.
(7) Đặt cột sang ống 1,5 ml mới và loại bỏ ống chứa dịch. Bổ sung 200 μl Buffer AE, ủ ở nhiệt độ phũng trong 1 phỳt, sau đú ly tõm ở 8.000 vũng/phỳt và thu tủa.
2.2.2.3.2. Nhõn đoạn gene 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR.
Trỡnh tự cặp mồi 27F và 1492R được sử dụng để nhõn đoạn gene 16S rRNA từ DNA tổng số của xạ khuẩn:
27F 5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 1492R 5’- GGTTACCTTGTTACCACTT-3’ Thành phần phản ứng: Buffer Taq (10X): 2,5 μl; dNTPs (2,5mM): 2,5 μl; MgCl2 (25mM): 3 μl; Mồi xuụi (20 μM): 1 μl; Mồi ngược (20 μM): 1 μl; DNA khuụn: 1 μl;
Taq DNA polymerase (5U/ μl): 0,2 μl; Nước khử ion: 13,8 μl;
Tổng thể tớch: 25 μl;
Chu trỡnh nhiệt của phản ứng PCR được sử dụng để nhõn đoạn gene 16S rRNA của xạ khuẩn như sau:
1. Biến tớnh DNA ở 940C trong 3 phỳt. 2. Tổng hợp (30 chu kỡ)
- Biến tớnh: 940C trong 1 phỳt - Gắn mồi: 450C trong 45 giõy - Kộo dài: 720C trong 1 phỳt
3. Tổng hợp bổ sung ở 720C trong 10 phỳt 4. Bảo quản ở 40C
Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng phương phỏp điện di trờn gel agarose 1%.
Sản phẩm PCR được làm sạch bằng bộ kớch AccuPrep Gel Purification theo quy trỡnh của nhà sản xuất bioneer.
2.2.2.3.3. Phương phỏp xỏc định trỡnh tự đoạn gene 16S rRNA.
Sản phẩm PCR được sau khi đó được tinh sạch được gửi xỏc định tự trờn mỏy đọc tự động ABI PRISM 3100 Avant Geneetic Analyzer sử dụng bộ kit BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing. Trỡnh tự nucleotide được xử lý bằng phần mềm ABI PRISM 3100 Avant Data Collection v 1.0 và DNA
Sequencing Analysis đú được so sỏnh với trỡnh tự gene 16S rRNA của cỏc prokaryote đó được cụng bố trờn ngõn hàng gene thế giới bằng chương trỡnh BLAST.