Khóa luận tốt nghiệp Bảo vệ thực vật: Phân lập và đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. với các nấm gây bệnh lở cỗ rễ trên cây họ cà

đã phân được với các namgây bệnh lở cô rễ Rhizoctonia bicornis, Fusarium oxysporum, Pythium vexans trên môi trường nuôi cấy trong phòng thí nghiệm, bằng phương pháp cấy kép 2 loại nam củ

TRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM TP HO CHÍ MINH

KHOA NONG HOC

3€ 26 2s 2s 3k sịc 2

KHOA LUAN TOT NGHIEP

PHAN LAP VÀ ĐÁNH GIA KHẢ NANG DOI KHANG CUA

NAM Trichoderma spp VOI CAC NAM GAY BENH

LO CO RE TREN CAY HO CA

SINH VIEN THUC HIEN : HUYNH DINGANH : BAO VE THUC VATKHOA : 2019 - 2023

Thành phố Hồ Chi Minh, tháng 11 năm 2023

PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐÓI KHÁNG CỦA

NAM Trichoderma spp VOI CAC NAM GAY BENH

Thanh Phố Hồ Chí Minh

Tháng 11 năm 2023

1

LỜI CẢM ƠN

Con xin khắc ghi công ơn sinh thành, dưỡng dục của Cha Mẹ Cảm ơn cha mẹ

và những người thân trong gia đình đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con, là nguồn động

lực to lớn dé con có thé vượt qua mọi khó khăn, vấp ngã và có được như ngày hôm nay

Công lao to lớn này con sẽ không bao giờ quên ơn.

Em xin gửi lời cảm ơn đến quý Thầy Cô đã giảng dạy em, cùng Ban lãnh đạoKhoa Nông học Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điềucho em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn đến TS Lê Khắc Hoàng và ThS Nguyễn Thị Minh Thi

đã hỗ trợ, giúp đỡ em thực hiện đề tài

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Võ Thị Ngọc Hà và ThS.Phạm Kim Huyền đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho em nhiều kiến thức chuyên môn

và nhiều kinh nghiệm quý báo trong suốt quá trình thực hiện khoá luận

Tôi xin gửi lời cảm ơn Trần Minh Quang và Danh Trương Trung Đính là người

luôn đồng hành và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài Tôi xin gửi lời gửi lờicảm ơn đến Trương Thi Ngọc Hân, Nguyễn Quang Hiền, Lê Hoàng Thương và các bạntại phòng thí nghiệm bệnh cây của Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Trường Đại học Nông Lâm

Thành phố Hồ Chí Minh đã luôn hỗ trợ và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận

Gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp DH19BV đã đồng hành với tôi trong 4 năm học

tập và nghiên cứu ở Trường Đại học Nông Lâm Thành phô Hồ Chi Minh

Tran trọng cảm on!

Thành phố Hô Chí Minh, tháng 11 năm 2023

Sinh viên

Huỳnh Di

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Phân lập và đánh giá khả năng đối kháng của nam

Trichoderma spp với các nam gây bệnh lở cô rễ trên cây họ cà” đã được thực hiện tai

Bộ môn Bảo vệ Thực vật — Khoa Nông học, Trường Dai học Nông Lâm Thành phố HồChí Minh, thực hiện từ tháng 4 năm 2023 đến tháng 10 năm 2023 Mục tiêu nghiên cứu:

Phân lập và đánh giá khả năng đối kháng của các dòng nam Trichoderma spp với các

nắm gây bệnh lở cổ rễ trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới

Từ phương pháp bay nắm bằng phương pháp giây lọc của Soytong và Quimio

(1989), đã phân lập được 15 dòng nam Trichoderma spp., từ 9 mẫu đất được thu thập

tại 3 tỉnh Bình Dương, Lâm Đồng và Tây Ninh Sau đó tiến hành các thí nghiệm đánhgiá kha năng đối kháng của các dòng nam Trichoderma spp đã phân được với các namgây bệnh lở cô rễ (Rhizoctonia bicornis, Fusarium oxysporum, Pythium vexans) trên

môi trường nuôi cấy trong phòng thí nghiệm, bằng phương pháp cấy kép 2 loại nam của

Soytong (1988), gồm 15 nghiệm thức tương ứng với 15 dòng Trichoderma spp đỗikháng với nam Rhizoctonia bicornis, Fusarium oxysporum, Pythium vexans với 3 LLLlai, mỗi LLL là 1 dia petri Sau đó chọn 2 dòng nam Trichoderma spp có hiệu suất đốikháng tốt nhất thực hiện các thí nghiệm ngoài nhà lưới Tiến hành thí nghiệm đối khángtrong điều kiện nhà lưới, được bồ trí độc lập hoàn toàn ngẫu nhiên với 9 nghiệm thức,

mỗi NT là 10 chậu cà chua và | nghiệm thức, 1 nghiệm thức là 3 LLL

Từ 15 dòng nắm Trichoderma spp đôi kháng phòng thí nghiệm đã chọn ra được

dòng nam T8 và T12 có hiệu suất đối kháng cao nhất Trong đó, thu được dong nắm T§

và T12 có hiệu suất đối kháng cao nhất lần lượt với các nam Rhizoctonia bicornis lầnlượt là 72,38% và 70,54, nắm Fusarium oxysporum là 81,28% và 84,23%, nắm Pythiumvexans là 59,59% và 68,33% Qua kết qua đối khang nhà lưới cho thấy tác động củanắm gây bệnh lở cổ rễ ở nghiệm thức hỗn hợp nắm bệnh là 33,33% tương đối cao sau 9NSCB, so với nghiệm thức chế phẩm Trichoderma + hỗn hợp nam bệnh là 3,33%

Nghiệm thức T8 + T9 có chủng nắm Trichoderma giúp cây có chiều dài rễ là 7,04 cm,chiều cao cây là 12,69 cm cao hơn nghiệm thức H2O tương ứng lần lượt là 6,03 em va

8,41 cm, ở thời điểm 18 ngày sau chủng nam

1H

MỤC LỤC

(CO EO ii

\/18/900/9a ẦÃẼỶẲẢÁẢÁẢÁ4Á IVKISNH SÁCH OA BAG gaennoarnndnonntbodiasiiodiistltisgGtZ4-41G09000.)60001405099340070003488 vii

a ete a: | 5 v11 vi

Đặt vấn đề - 2+ + 2s 2 221221211211211211211112112111111211121121211121221 22a Í

Mục tiêu đề tài 55-52 s S2 12122121211212151121111121111111111211011121111211111 2111211 ce re 5

REC đồ HÃ cece nsec st eg cs tin teatro 2

Chương 1 TONG QUAN TÀI LIỆU 2: 222222E22EE2EE22E22EE22E22EE22E222E2EEz2Ezcre 3

1.1 Sơ lược về cây cà chua và triệu chứng bệnh trên cây họ Cà - - -+ 31.1.1 Sơ lược về cây cả chua -2+- 2 52222222122E22EE22312212232221271 2112717122212 22c e2 31.1.2 Triệu chứng bệnh lở cô rễ trên CA) NG) C el bu sttronoortuaigloitittiisbgitGIREEEREEEEBEGIDSMSEBiDENdSS 31.2 Tổng quan về nắm bệnh lở cổ rễ trên cây họ Ca ecscscesssesseessesssessecsesssesseessssseeseeenes 41.2.1 Nắm Rhizoctonia bicornis gây bệnh lở cô rễ -. 22-22-55252222scczscse2 4L.2.0.1 Vi tri pln load 41.2.1.2 Đặc điểm của mam o eccecccccccccccessessessessessessessessessessessessessessessessessessessessessessessessees 41.2.1.3 Điều kiện phát triển va gây hai cceccccccecsssssesssssscesessseesecssccsecsecssscsecsneeseeseaneess 51.2.1.4 Sự tồn Wu occ ecccccccccccccsessessesessesscsessesscsnssessessssesscsusaesacsnssesecssssessesussnsacsssnssesecees 51.2.1.5 Sự lan truyền và xâm mie oon ccc cece ec sseesesesseseesesseseesessesseeseseseeessneeeeeeees 51.2.2 Nam Fusarium oxysporum gây bệnh lở cô rễ -2-22-52z52z22sc>zscsc2 6

1.2.2.2 Đặc điểm sinh học của nam Fusarium 6 AY 10) 2) 1 eee ee ee 61.2.2.3 Điều kiện phát triển và gây hại 2-22 2 22222122E222E22122122212212221221 222 22Xe2 71.2.2.4 Sự tồn WW oecccccccccccccccscsessessesecsesscsscecsscescessessssessesusavsscssssessssassesesssansecsssesseeecees 7

1.2.2.5 Sự lan nhiễm và xâm nhidm o00 ccc ececsecessesessssesceesesecsesecessesssesssessesessesesesseees 8

1.2.3 Nam Pythium vexans gây bệnh lở cỗ 16 oo ccccececcccecsesseessesseessecseeseeeseesesseeeeesseesees 8L231, Wii plat 10a aces sree ence eran mene emer 8

1.2.3.2 Đặc điểm của nắm Pythium V€XđH 5-5552 SS EEEEE2EEEEEE21E21211211 21122 xe 8

1.2.3.3 Điều kiện gây hại và phổ ki chủ 2-2 2 2S2SE£2E+EE£2E22E22E2212232212122 22 91.2.3.4 Sự tồn lưu cc2tt Hee 91.2.3.5 Sự lan truyền và xâm nhiễm 2: 2©22+2S+2E2EE22E12E122122212212221221221222Xe2 91.3 Tổng quan về nắm 77ichodÏ@F/4 -2222©22©2222+22222EE22E22EE2ES222E22Ec2Evzrxe 101.3.1 Phân loại và phân bồ - 2-©22+SS+2E22EE2EE22E122122112712112711211211271211211 2112 e6 10

1.3.2 Cau tạo tế bào của Trichoderma Spp -2-©22©22©52552222222222222E2Ezxzszve2 111.3.3 So lược về cơ chế và vai trò của nắm Trichoderma ccccccccccsseessesesseseesesveceseeee 11

1.3.4 Đặc điểm hình thái chung của một số loài Trichoderma Spp - - 12

1.3.5 Mô tả đặc điểm một số loài Trichoderma Spp -. -: 2©52©525525525525525522 13

1.3.6 Một số nghiên cứu trong nước về nắm Trichoderma Spp . - 151.3.7 Một số nghiên cứu nước ngoài về nấm Trichoderma Spp - 16Chương WAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHẬP sua sneesoinseeiodnGinddGi6/60608.636000/600.800360 18Del Tội GUAGE ighHIỂH GỨU ssresessssssnsisvsssssxïTS21391655855E9NG95S075S93SEXGHIĐSGDSSSGESEBSSSHSSEESSHEAEGS53-98S3 182.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2-2 2+22222E22E+2EE22E2EE22E2EE22xczrxerrres 182.3 Đối tượng và vật liệu, dung cụ nghiên cứu 55 ++c s2 s+scssssererersrrrrrrs 18

2.3.1 Đối tượng nghiên cứu ¿- 2 2¿+222E22E22E12211221221221122121121121211 22121 ee 18

23.2, Vat Hểu:wv3;dung eụ THÍ mel Sn y»¿s-ssss6ssss816sp64©scg065001y D8100 1688898615a16098100E98/88- we 18

2:4.PhữØñip PHẩpP nphiến GỨsseeeseesensetneinodatidtstdintgdSEOigHn092509SH0000308E.Đ48E.0.I2G48%29801000-0gG0222802g08 192.4.1 Phương pháp thu mẫu, phân lập và định danh nam Trichoderma spp 19

2.4.1.1 Phương pháp thu thập mẫu đất - 2 2©2222S22E+EE+EE£2EE2EE22E222Ez2zzzxee 192.4.1.2 Phương pháp phân lập nắm Trichoderma spp từ mẫu đất - 212.4.1.3 Dinh danh nam Trichoderma spp dựa vào đặc điểm hình thái 212.4.2 Phuong pháp đánh giá tính đối kháng trong điều kiện phòng thí nghiệm va trong

điền kiện ti ee 22

2.4.2.1 Phương pháp đánh giá tính đối kháng trong điều kiện phòng thí nghiệm 22

2.4.2.2 Phương pháp đánh giá đối kháng trong điều kiện nhà lưới 24

2.5 XU Ly 0n 27

Chương 3 KET QUA VA THẢO LUẬN 2222222222222E222222122122222212222 xe 28

3.1 Kết qua phân lập nắm Trichoderma spp .- -. -:©22©75z©522722252222+2sc>zscsce 283.1.1 Bay nắm Trichoderma spp . -©2+©22©22©52222222S222E22E2E22E2E2EZEczEzrczrrzei 28

Vv

3.1.2 Kết quả phân lập nắm Trichoderma spp . -2 2-©22©7222522222c+c2z+zcsze 293.1.3 Định danh nam Trichoderma spp dựa vào đặc điểm hình thái - 313.2 Kết quả đối kháng của các dòng nắm Trichoderma spp với các nam gây bệnh lở cô

3.2.1 Kết quả đối kháng của các dòng nam Trichoderma spp với nam Rhizoctonia

3.2.3 Kết qua đối kháng của các dòng nam Trichoderma spp với nam Fusarium

SSO cers re re re cr re lo ee eee a oe ee 403.2.3 Kết quả đối khang của các dòng nam Trichoderma spp với nam Pythium vexans

"“=— ` ` 433.3 Kha năng phòng bệnh của Trichoderma spp trong điều kiện nhà lưới 473.3.1 Về tỉ lệ bệnh ở điều kiện nhà lưới 2 2 s+2E+E£EE£EE+Ez£E£EE+EEEeExzrrrerxee 473.3.2 Về chỉ số bệnh và hiệu lực phòng bệnh ở điều kiện nhà lưới 493.3.5 Về chỉ tiêu sinh trưởng ở điều kiện nhà lưới - 2 s2+s2+£2z£z+zzzzzzzzzzzzsz 5]

Kết luận - + Ss S123 121121521211211111121111112111111211112111111112111121121111112111 12c rceg 54

0121007 54

TÀI LIEU THAM KHẢO 2-22 22S222E92E22EE£EE22E1221523222127121121121121111 22.2 xe 55PHU LỤC 2©2222222222212211221221121121121121121121111121111211211111211212121 2e 62

DANH SÁCH CHU VIET TAT

HSĐK : Hiệu suất đối kháng

Lit, : Lan lặp lại

NSC : Ngày sau cay

NT : Nghiệm thức

PDA : Potato Dextro Agar

PGA : Potato Glucose Agar

WA : Water Agar

Vil

DANH SÁCH CAC BANGBảng 2.1 Mau dat thu thập trên các ruộng rau - 22 2222222z222+2£+2zxzzxzzrez 20Bang 3.1 Kết qua phân lập nam Trichoderma Spp -. -22-52-©52©5255z55+255z<: 29Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái, màu sắc của các dòng nam Trichoderma spp đã phân lậpđược trếm một trường PDA seeesseseaeessietiessiabilesoksgdtoiglbscsbocaotskpilsbilikási006SG148u50103g881805gg.0:080 32

Bảng 3.3 Bán kính tản nam và hiệu suất đối kháng của 15 dòng nam Trichoderma spp

đã phân lập với nam Rhizoctonia bicornis trong phòng thí nghiệm .- 34Bang 3.4 Bán kính tan nam và hiệu suất đối khang của 15 dòng nam Trichoderma spp

đã phân lập với nam Fusarium oxysporum trong phòng thí nghiệm - 40Bang 3.5 Bán kính tan nam và hiệu suất đối kháng của 15 dòng nam Trichoderma spp

đã phân lập với nam Pythium vexans trong phòng thí nghiệm -5 2-52: 43

Bang 3.6 Kết quả tỷ lệ bệnh cây bị nhiễm bệnh lở cô rễ trong điều kiện nhà lưới 48

Bảng 3.7 Chỉ số bệnh (%) và hiệu lực phòng trừ (%) ở thí nghiệm phòng bệnh trong

SE a 49Bảng 3.8 Chỉ tiêu sinh trưởng, chiều cao cây va chiều dai rễ ở thời điểm 18 NSCB 51

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hinh 2.1 Mẫu Rhizoctonia bicornis chủng ODT02 (A), Fusarium oxysporum KTDT01

(B), Pythium vexans KTDT22 (C) c5 2 32222212 SH HH tre 19Hình 2.2 Bồ trí thí nghiệm đồng nuôi cay Trichoderma với nam gây bệnh 23Hình 3.1 Nắm Trichoderma spp xuất hiện trên giấy lọc ở thời điểm 14 ngày đặt bay;

Hình 3.2 Hình thái tản nam ở 5 NSC của các dòng nam phân lập được: - 30Hình 3.3 Hình úp đĩa, hình thái tản nam ở 5 NSC của các dòng nam phân lập được: 31Hình 3.4 Đặc điểm hình thái dòng nắm T12 - ĐBD01 được nuôi trên môi trường PDA,

BỊ TSS C2 raccoisaresciasctaseesestnes sein se ects ceiver tr a ERR Re nn sR Raa 32Hình 3.5 Kha năng đối khang của các dòng 7richoderma spp đôi với nam Rhizoctoniabicornis ở thời điểm 5 NSC -c5ccc Hee 39Hình 3.6 Kha năng đối kháng Trichoderma spp đôi với nam Fusarium oxysporum ở

HE ire TINH nưeneeeninnuttointdptdiotgttrisiBiifogioistngbpiglusiodpssiyEimaplnroiedasbrdiionibotensrt 42Hình 3.7 Khả năng đối kháng Trichoderma spp đôi với nam Pythium vexans ở thờiđiểm 60 GSC -.2-222+2222+22222222211222111271111221112211112111121112.11121111.111.1 re 45Hình 3.8 Biéu đồ biểu hiện hiệu suất đối kháng của 15 dòng nam Trichoderma spp đốivới các nam Rhizoctonia bicornis, Fusarium oxysporum, Pythium vexaws 46Hình 3.9 Triệu chứng cây cà chua bị lở cổ rễ ở nghiệm thức hỗn hợp nam bệnh giai(Hi NI 6: sexeesse=tsosiesgessicbis2Eos2338402/5121383i324”230igi05g8g3g.8582t-2020230-H2z01G30 43g13u616il322.88 L0n6i80E2C 47Hình 3.10 Các triệu chứng được đánh giá bị nam lở cô rễ gây bệnh 50Hình 3.11 Cây cà chua sau khi tách khỏi chậu dé lay các chỉ tiêu sinh trưởng, phát trién

LỆ 0GIâÄ558EHồ G838 SEEĐIEESSJSRESE TE.HS9EEBRLEEINSESEER ĐEEEEBSSISHESEEDPSSSSHSBĐXLEESHEEGHEENEHISSSSUVGESRESWGHSSSGS.RĐSRG185S889186 33

Hình PL 1.1 Hình ảnh vườn rau hữu cơ và dat phân lập nam Trichoderma spp 62Hình PL 1.2 Bay nam Trichoderma spp bằng phương pháp giấy lọc trên dia petri .62Hình PL 1.3 Kính hiển vi dùng dé xem bào tử nam đã phân lập được - 63-Hinh PL 1.4 Bào tử Trichoderma spp được xem ở mức 100X 63Hình PL 1.5 Hình anh bao tử, cuống bào tử va thé bình của dòng T§ được xem ở mứcNees ic ci mt ee ec i i eh a et i coe aa 64

Hình PL 1.6 Khả năng đối kháng của 15 dòng nam Trichoderma spp đôi với nam

1X

'4/1z2o1ørri28271e0xr18651 0mm .ÔỎ 65Hình PL 1.7 Hình ảnh khả năng đối kháng của 15 dòng nam Trichoderma spp đôi với

nắm Rhizoctonia bicornis 3 NSC, ccccccccscscscssscsvsesesesesesesesesesesesesesesesesesesssesevevsveveveees 66

Hình PL 1.8 Hình ảnh mặt dưới dia khả năng đối kháng của 15 dòng nam Trichoderma

spp đối với nam Rhizoctonia bieornis 5 INSC,, 2-52-©52272252222222ssccccsc2 67Hình PL 1.9 Hình ảnh khả năng đối kháng của 15 dòng nam Trichoderma spp đôi với

nam Fusarium oxysporum 3 NSC, - 55-52252222 2222122122122 221221211 222v, 68Hình PL 1.10 Hình anh khả năng đối kháng của 15 dòng nắm Trichoderma spp đối vớinam Fusarium oxysporum 5 INSC,, -55-55222222222222212211221221221211 2112 Xe 69

Hình PL 1.11 Hình anh mặt dưới đĩa khả năng đối kháng của 15 dòng nam Trichodermaspp đối với nam Fusarium oxysporum 7 NSC, -25255525752cscccscccscccev 70

Hình PL 1.12 Hình anh khả năng đối khang của 15 dong nắm Trichoderma spp đối vớinam JY[tinm'Vewts TS Cũng se cas asus seagrass ce sia e3 EPA ASAHI AE ETC EET TNETEISEDS 71Hình PL 1.13 Hình ảnh khả năng đối khang của 15 dòng nam Trichoderma spp đối vớinam Pythium vexans 36 GSC, ccccceccescsesseseeeseeseesseeseesceesecsceeacesceeseeseeaeeeeeaeenseeaeeseenss 12Hình PL 1.14 Hình anh mặt dưới đĩa khả năng đối khang của 15 dòng nam Trichoderma

spp đối với nam Pythium vexans 60 GSC, -522-2522222222 22x22 cErkrrrrrrrkrrrev 73

Hình PL 1.15 Giống cả chua được chọn làm thí nghiệm - 5 +=+-=52 74Hình PL 1.16 Nhân sinh khối nam trước khi chủng bệnh - ¿22552252552 74Hình PL 1.17 Bố trí thí nghiệm trong nhà lưới với 9 nghiệm thức và 3 LLL theo kiểuHoan 0n 0010 VN 7Hinh PL 1.18 Ché pham sinh hoc Trichoderma được sử dung trong thí nghiệm nha lưới

GIỚI THIỆU

Đặt vân đê

Việt Nam là quốc gia nông nghiệp, đa dạng về giống cây trồng với nhiều loại chủ

lực có giá trị kinh tế cao Trong đó các loại cây họ cà (Solanaceae) đóng vai trò quan

trong trong cau trúc cây trồng, cân bằng sinh thái và chiếm ty trọng cao trong cơ cau câytrồng trong nước Cà chua đạt sản lượng xuất khâu đem về cho Việt Nam gần 600.000USD Đồng thời cà tím được xuất khâu 31 tan mang về hơn 40.000 USD Các cây họ càđược trồng ở tỉnh Lam Đồng với hơn 13.000 hecta (Chi cục TT&BVTV tỉnh Lâm Đồng,2018).

Tuy nhiên, việc canh tác và sản xuất cây họ cà trong những năm gần đây gặp

nhiều khó khăn, sự tích lũy, lan truyền của các tác nhân gây bệnh trong nước tưới vàthoát nước kém, cây giống không sạch bệnh khí hậu nhiệt đới là những yếu tố tạo điềukiện thuận lợi cho sự phát triển của bệnh chết cây con (lở cô rễ cây con, thối rễ và thối

thân) có nguồn góc từ dat, gây ra bởi các loại nắm có phổ ký chủ rộng như Pythium Spp

Rhizoctonia spp., Fusarium spp (gây bệnh chết cây con), có thé anh hưởng từ 5 — 80%thiệt hại đối với cây con, do đó gây thiệt hại nặng nề cho sản xuất nông nghiệp (Đỗ TanDũng, 2013).

Ngày nay các nghiên cứu khoa học về cây trồng và các tác nhân ảnh hưởng đếnsinh trưởng và năng suất đang ngày được quan tâm Trong đó, việc đây mạnh nghiêncứu các biện pháp sinh học — biện pháp an toàn ngày càng được ứng dụng phô biến vàhầu như không gây hại cho cây, tăng tính phòng ngừa trước khi các tác nhân gây bệnh

có thé xâm nhập vào gây hại cho cây trồng Nam và vi khuẩn đối kháng được sử dụng

rộng trên thế giới và ở Việt Nam đề phòng trừ bệnh hại cây trồng nhằm thân thiện vớimôi trường phù hợp với tình hình sản xuất nông nghiệp hữu cơ hiện nay (Đỗ Tan Dũng,2013).

Đất là nguồn cung cấp vi sinh vật có lợi phục vụ cho nông nghiệp hữu cơ Nhiều

loại nam đất tham gia vào quá trình phân hủy chất hữu cơ dé cung cấp dinh dưỡng cho

1

cây trồng (Frac và cs, 2018) Trong số các vi sinh vật đối kháng, nam Trichoderma spp.

là một trong các chỉ nam quan trọng của vi sinh vật có lợi trong đất nông nghiệp và được

sử dụng rộng rãi trong trồng trọt sản xuất (Oskiera và cs, 2017) Nam Trichoderma spp.được sử dụng phổ biến như một tác nhân phân hủy tự nhiên (Amira và cs, 2011), chất

kích thích tăng trưởng thực vật (Hyakumachi và cs, 2003) Một số chủng namTrichoderma spp đã được nghiên cứu rộng rãi do kha năng cạnh tranh chất dinh dưỡng

và không gian (Sunpapao và cs, 2018; Baiyee và cs, 2019), ký sinh các loại nắm khác

(Bailey và cs, 2008; John và cs, 2010) và thúc đây tăng trưởng thực vật (HalifU và cs,2019) Các dong nam Trichoderma spp ở Việt Nam được biết đến với vai trò là nam

đối kháng với nắm bệnh được dùng dé tạo ra các chế phẩm sinh học rất được yêu thích

bởi nhiều lợi ích mà nó mang lại và là biện pháp an toàn, hiệu quả

Vì vậy, đề tài “Phân lập và đánh giá khả năng đối kháng của nấmTrichoderma spp với các nam gây bệnh lở cỗ rễ trên cây họ cà” được thực hiện

Mục tiêu đề tài

Phân lập, định danh được nam Trichoderma spp và đánh giá kha năng đối khángcủa nam Trichoderma spp đôi với các nam gây bệnh lở cô rễ trên cây họ cà trên môitrường nuôi cấy

Yêu cầu đề tài

Thu thập và phân lập các dòng Trichoderma spp từ đất trồng cây hữu cơ

Đánh giá khả năng đối kháng của các dòng Trichoderma spp phân lập được có

khả năng đối kháng mạnh đối với các nắm gây bệnh lở cổ rễ trên cây họ cà

Giới hạn đề tài

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm bệnh cây khoa Nông học Trường Đạihọc Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, phân lập các dòng nam Trichoderma spp từ

các mẫu đất thu thập tại khu vườn rau ở các tỉnh Bình Dương, Lâm Đồng và Tây Ninh

Nam bệnh Rhizoctonia bicornis chủng ODT02, Fusarium oxysporum chủng

KTDT22, Pythium vexans chủng KTDT22.

Chương 1

TỎNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Sơ lược về cây cà chua và triệu chứng bệnh trên cây họ Cà

1.1.1 Sơ lược về cây cà chua

Cây cà chua có tên khoa hoc là Solanum lycopersicum L., thuộc họ Cà

(Solanaceae) là một loại rau ăn quả có nguồn gốc từ Nam Mỹ (Somraj va cs, 2017) cùngvới (Nalla và cs, 2016), thì cà chua là một loại cây rau quan trọng, phô biến và đượctrồng rộng rãi khắp nơi trên thế giới, đặc biệt là ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và

ôn đói.

Theo tổ chức nông lương thế giới (FAO), năm 2020 diện tích trồng cà chua trên

thế giới vào khoảng 5.051.983 ha với sản lượng 186.821.216 tấn Là cây rau có giá trị,

có sản lượng chiếm 1/6 tổng sản lượng rau hàng năm trên thế giới và luôn đứng ở vị trí

số 1 về sản lượng Cà chua có tam quan trọng chi sau khoai tây ở nhiều quốc gia và đứng

thứ nhât về rau được bảo quản, chê biên và cả mục đích sử dụng tươi.

Bệnh lở cô rễ cây họ cà do nam Rhizoctonia gây ra là chủ yếu Tuy nhiên, tùyđiều kiện thời tiết, chế độ canh tác có thé do nhiều loại nắm có trong đất gây ra nhưPythium, Fusarium (Burgess va cs, 2009).

1.1.2 Triệu chứng bệnh lở cỗ rễ trên cây họ Cà

Bệnh phát triển gây hại làm ảnh hưởng lớn đến số cây trên diện tích gieo trồng,

đến sự sinh trưởng và phát triển của cây Một số triệu chứng bệnh hại do bệnh lở cô rễđối với cây họ cà như: chết rạp cây con, thối rễ, thối gốc, thối thân, thối quả

Chết rap cây con: cây con có thể bị hại trước hoặc sau khi mọc khỏi mặt đất.

Trước khi nảy mầm, bệnh gây chết đỉnh sinh trưởng Sau khi nảy mầm, nắm gây ra các

vết bệnh màu nâu đậm, nâu đỏ hoặc hơi đen ở gốc cây sát mặt đất, phần thân non bị thắt

lại, trở nên mềm, cây con bị đô gục và chết

Cây lớn cũng bị hại nhưng chủ yếu chỉ bị hại ở phần vỏ Bệnh có thể xuất hiện

3

gây hại ở cả cây trưởng thành gây hiện tượng thối rễ hoặc thối gốc thân khi điều kiện

ngoại cảnh thích hợp cho nam phát triển Ở gốc cây, triệu chứng ban đầu là vét lõm màu

nâu hoặc hơi nâu đỏ sát mặt đất, vết bệnh có thé lan rộng quanh gốc thân và lan xuống

rễ, góc thân bị lở loét

Bệnh chủ yếu gây hại ở phần cổ rễ, phần gốc sát mặt đất Khi mới xuất hiện, nếu

quan sát kỹ có thê thấy những vét bệnh có màu khác với vỏ cây, phần vỏ này bị rộp lên,

sau đó lan dần bao quanh toàn bộ phần cổ rễ hoặc gốc cây Dần dần phần vỏ này khôteo lại, khi gặp trời mưa hoặc độ 4m cao sẽ bị thối nhũn, bong ra, trơ lại phần lõi gỗ củacây có màu thâm đen, cây sẽ héo dần và chết

1.2 Tong quan về nắm bệnh lở cỗ rễ trên cây họ Cà

1.2.1 Nắm Rhizoctonia bicornis gây bệnh lở cỗ rễ

1.2.1.1 Vị trí phân loại

Chi Rhizoctonia thuộc giới Fungi, ngành Basidiomycota, lớp Agaricomycetes,

bộ Cantharellales, họ Ceratobasidiaceae (Sneh va cs, 1991).

1.2.1.2 Đặc điểm của nắm

Nam Rhizoctonia có rất nhiều loài, nam Rhizoctonia bieornis thuộc lớp nam battoàn (Deuteromyces) Ở giai đoạn sinh sản hữu tính loài này có tên gọi là Thanatephoruscucumeris thuộc lớp nam dam (Basidiomycetes), được phát hiện rất sớm, nắm phát triển

nhanh, phân nhánh tại điểm gần vách ngăn giữa hai tế bào và vuông góc với sợi nam

chính (Mezies, 1970) Sinh sản hữu tính tạo đảm don bao, không màu, hình bầu dục, có

từ 2 — 4 bào tử đảm, hình trứng hoặc hình bầu dục đẹp Ở nước ta chưa thay dang sinhsan hữu tính (Vũ Triệu Man va Lê Luong Té, 1998)

Ở giai đoạn vô tính, nam phat trién 6 dang soi, soi nam Rhizoctonia bicornis khimới hình thành không màu, khi gia có mau nâu dam, đường kính 7 — 12 um với nhữngvách ngăn không liên tục (Ou, 1983) Sợi nắm thường phân nhánh xiên tạo góc 45° —90° tại vị trí phân nhánh có vách ngăn và hơi thắt lại (Van Bruggen và cs, 1986), váchcủa sợi nam có màu trắng đến nâu, chiều rộng của sợi nam là từ 4— 5 uum và phân nhánh

ở góc phải Trên mô kí chủ hoặc vách ống nghiệm nuôi cấy, sợi nắm đôi khi mọc ranhững tế bào ngắn, phình to và phân nhiều nhánh Các tế bào đó có thê liên quan đến

quá trình gây bệnh hoặc tới giai đoạn sinh sản bao tử (Ou, 1983) Rhizoctonia bicornis

có 3 loại sợi nam: sợi nắm bò, sợi nắm phân nhánh và các tế bào dạng chuỗi (moniloid

cells) (Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005)

1.2.1.3 Điều kiện phát triển và gây hại

Nhiệt độ cho sự xâm nhiễm của nam có thé xảy ra là 23°C — 25°C, nhưng tối hảonhất là 30°C — 32°C, âm độ phải từ 96% — 97% Ở 32°C nam xâm nhiễm vào trong vòng

18 giờ (Võ Thanh Hoàng, 1993) Ở nhiệt độ thấp dưới 10°C và cao hơn 38°C sợi nắmngừng phát triển Bệnh gây hại nặng ở giai đoạn cây con Ảnh hưởng của các điều kiện

thời tiết khí hậu, kỹ thuật chăm sóc, địa thế đất đai, chế độ luân canh cây trồng đến sự

phát sinh và gây hại bệnh cũng rất khác nhau

Trong phòng thí nghiệm, nam Rhizoctonia bicornis có thé mọc tốt trên nhiều loại

môi trường khác nhau như PGA, PDA, PGB, không đòi hỏi môi trường chuyên biệt.trên môi trường PDA nam sinh trưởng rất nhanh, sau 7 ngày nuôi cấy, đường kính tannam lên đến 8,12 em Nam có thé phát triển được trong phạm vi pH rộng từ 4 — 8, pháttriển thuận lợi nhất ở pH 6 - 7 (Võ Thị Dung và cs, 2017)

sống được 2 năm, khi ngập 7 cm trong nước có thé sống từ 1 — 4 tháng, điều kiện âm

hạch nắm có thé sống 7 tháng hoặc khi thiếu thành phần dinh dưỡng hay hóa chất độchại (Võ Thanh Hoàng, 1993; Ghaffar, 1993) Nắm Rhizoctonia bicornis có thê sống sót

qua thời gian dài trong trường hợp không có cây ký chủ bằng nguồn dinh dưỡng từ cácchất hữu cơ đang phân hủy

1.2.1.5 Sự lan truyền và xâm nhiễm

Nam có khả năng lan truyền theo 2 chiều: thang đứng hoặc ngang Lan truyền

theo chiều thắng đứng chủ yếu là sợi nắm, vết bệnh phát triển dần lên lá, chồi và các bộphận khác Bệnh lan truyền theo chiều ngang từ nơi này sang nơi khác bằng hạch nắm

5

và sợi nắm, sự lan truyền chủ yêu nhờ dòng nước, hạch nắm bị nước cuốn đi gặp kí chủ

thích hợp sẽ bám vào hay do nước mưa (Tô Thị Thùy Hương, 1993) Nam được lan

truyền chủ yếu thông qua hạch nam, vết bệnh thực vật hoặc trong đất Khi hạch nam

bám vào bẹ lá sẽ nảy mam ra sợi nam rất nhỏ, sợi nắm có thể xâm nhập trực tiếp quabiểu bì hay khí không Nó được lây lan bởi gió, nước hoặc thông qua các hoạt động nông

nghiệp như làm đất và vận chuyền hạt giống (Kareem và cs, 2018)

Sự xâm nhiễm của Rhizoctonia bicornis bắt đầu khi sợi nam hay tan nam từ mộthạch nam nay man bat đâu phát triên hướng về ký chủ phù hợp như là sự thu hút củacác hóa chất được tiết ra ở rễ, amino acids, đường, acids hữu cơ và phenol của cây trông

1.2.2.2 Đặc điểm sinh học của nắm Fusarium oxysporum

Nam Fusarium oxysporum thuộc lớp nam bat toàn (Deuteromycetes), /usariumgồm nhiều loài khác nhau, có kha năng gây nhiều loại bệnh trên những cây trồng khácnhau Chúng hoại sinh hoặc ký sinh trên nhiều cây trồng, cây ăn trái và rau Nó là nguyênnhân chính làm héo rũ Hệ sợi nắm lan tỏa khắp mô mạch và lấp kín mạch gỗ Sự lấp

mach go sẽ cản trở quá trình vận chuyên nước làm héo cây.

Hệ sợi nam phân nhánh, có vách ngăn, sợi nam thường không màu, chuyên màu

nâu khi già Hệ sợi nam sản sinh độc tố tiết vào hệ mạch gây héo cây chủ Cơ thể dinhdưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, vách ngăn có lỗ thủng đơn giản ở giữa.Trong một tế bào có một nhân hoặc nhiều nhân Vách tế bào bằng chitin, glucan

Bệnh lây lan qua thân rễ, đất bị nhiễm bệnh và truyền qua giống, ngoài sự lây lan

thứ cấp của bệnh có thé được thực hiện qua nguồn nước và cơ giới Fusarium thường tan

công cây trồng dé dàng khi bị thiếu ánh sáng

Fusarium oxysporum có thé tồn tại trong đất dưới dang bao tử áo qua thời gian

dai, bào tử áo có thê lưu ton trong đất từ 15 — 20 ngày Nhiệt độ thích hợp cho nắm phat

triển là 25°C — 30%C Nam Fusarium oxysporum phát triển nhanh chóng trên môi trường

PDA ở nhiệt độ 25°C và hình thành tản nam có hình thé tơi xốp như bông hoặc bangphẳng hoặc lan rộng trên môi trường nuôi cay Mặt trên của tản nam có thé có màu trắng,kem, vàng, vàng cam, đỏ, tim hong hoặc tím Mặt dưới nó có thé không mau, vàng cam,

màu đỏ, mau tia sam, hay màu nâu (Seifert, 1996)

1.2.2.3 Điều kiện phát triển và gây hai

Loài Fusarium oxysporum: loài này phô bién tròn đất canh tác ở vùng ôn đới vànhiệt đới Loài này gồm có nhiều vòng khác nhau và gây bệnh nghiêm trọng: gây héomach dẫn (Beckman va cs, 1987), gây thôi rạp cây con (Nelson va cs, 1981), gây thối rễ

và cô rễ (Jarvis và Shoemmaker, 1978) Loài này có hơn 100 dòng khác nhau và bệnhhéo là một vân đê quan trọng.

Nhiệt độ tối ưu cho nam Fusarium oxysporum phát triển là 27 — 30°C, tối đa là

36 — 40°C và tối thiểu là 7 — 8°C, nhưng nhiệt độ thích hợp cho sự xâm nhiễm là 35°C(Ou, 1985).

Nam Fusarium oxysporum sống phô biến trong đất, lưu tồn đưới dang bao tử áohoặc khuẩn ty sống trên xác bã thực vật dư thừa hay những chất hữu cơ Một số loài tạobào tử đính bay trong không khí, đây là nguyên nhân gây ra những bệnh trên thân, lá và bông (Burgess và cs, 1994).

Các tác nhân gây bệnh héo Fusarium tồn tại đưới dạng bao tử hậu trong đất qua

thời gian dai Các tác nhân gây bệnh héo Fusarium cũng có thé có mặt ở vỏ rễ một sốcây không phải là ky chủ, kế cả cỏ dai và cây trồng Bao tử hậu hình thành trong vỏ rễkhi cây chết Fusarium oxysporum tân công chủ yếu vào bộ rễ Đặc biệt, bệnh gây hạinặng nề trong điều kiện stress nước, dùng phân bón quá nhiều hay rễ cây bị tốn thương.1.2.2.4 Sự tồn lưu

Các tác nhân gây bệnh héo Fusarium fồn tại dưới dạng bao tử hậu trong đất quathời gian dài Bào tử hậu có hình tròn, là các bào tử một tế bào với vách tế bào dày và

có sức chống chịu cao, được hình thành trong mô bệnh Các tác nhân gây bệnh héoFusarium cũng có thé có mặt ở vỏ rễ một số cây không phải là ký chủ, ké cả cỏ dai vàcây trồng Bào tử hậu hình thành trong vỏ rễ khi cây chết (Burgess và cs, 2009)

1.2.2.5 Sự lan nhiễm và xâm nhiễm

Soi nắm và bao tử vô tính nảy mam trong tàn dư cây bệnh và đất xâm nhiễm vào

rễ con còn non và lan dần vào các mạch xylem Nắm bệnh sau đó sẽ phát triển trongmạch xylem và lan lên hệ thống mạch dẫn trong thân Quá trình này gây phản ứng củacây, tạo ra các hợp chat phenol và thé san có mau nâu Những hợp chat này gây hiện

tượng hóa nâu của mạch dẫn, một dấu hiệu dễ nhận thấy của bệnh héo khi cắt ngang

thân Hiện tượng tắc mạch xylem làm giảm lượng nước di chuyên lên cây, khiến chocây bệnh bị héo rồi chết (Burgess và cs, 2009)

1.2.3 Nam Pythium vexans gây bệnh lở cỗ rễ

1.2.3.1 Vị trí phần loại

Chi Pythium thuộc giới Chromista, ngành Oomycota, lớp Oomycetes, bộ

Peronosporales, họ Pythiaceae (Theo Burgess và cs, 2009).

1.2.3.2 Đặc điểm của nam Pythium vexans

Pythium vexans thuộc lớp Oomycetes, lớp nam này có những đặc trưng về hìnhthái và chu kỳ sống gần giống nam thực, tuy nhiên chúng được phân biệt rõ ràng vớinam thực bởi di truyền học và cơ chế sinh sản của chúng (Erwin và Riberiro, 1996).Chúng sinh sản ra các sợi nam không vách ngăn, một đặc điểm chính dé phân biệt chúngvới các nam chi khác Một đặc diém của lớp nằm Oomycetes là sinh các du động bao tử

qua sinh sản vô tính và sinh bảo tử noãn thông qua sinh sản hữu tính (Võ Thị Thu Oanh,

2007).

Phan lớn Pythium vexans sông trong dat, một vài loài liên quan tới nắm rễ, hiệndiện trong nước như những thực vật hoại sinh và một số loài sống ký sinh trên thực vậthay động vật sống dưới nước Pythium vexans hiện diện thông thường trong đất canhtác hơn là đất tự nhiên, nhất là cây con trong vườn ươm mát hay vườn ươm rau Pythium

sp có phố ký chủ rộng, có loài gây hại trên nhiều loại cây trồng và cũng có loài chi gây

hại trên một loại ký chủ như Pythium busimaninae (Plaats và Niterink, 1981).

Hon 330 loài Pythium đã được xác định cho đến nay trong đó có nhiều loài

gây bệnh cho cây trồng Những loại nam gia này gây ra nhiều bệnh cho cây trồng, bao

gôm bệnh chét cây, thôi rê, thôi cô ré, thôi mêm và thôi thân trong các hệ thông sản xuat

khác nhau như vườn ươm, nhà kính và ruộng nông nghiệp (Weiland và cs, 2020; Sharma

và cs, 2020).

1.2.3.3 Điều kiện gây hại và pho kí chủ

Pythium vexans chủ yêu ảnh hưởng đến các mô còn non, chưa phát triển bất kỳlớp bảo vệ nào; do đó, sự lây nhiễm chỉ giới hạn ở hạt giống, cây con và rễ non Cây con

sau khi bị nhiễm bệnh thường đi kèm với các triệu chứng như giảm sinh trưởng, ngâm

nước, héo, đổi màu đen hoặc nâu và thối rễ Ở những cây trưởng thành hơn cây pháttriên còi cọc và ré chuyên màu nâu là phô biên (Nawaz va cs, 2016)

Pythium vexans có thê sống hoại sinh hoặc kí sinh, sống ki sinh thường phụ thuộc

vào nhiều yếu tố Có nhiều loài gây hại trên một số cây trong khi những loài khác như

P ultimum có phố kí chủ rộng Một vài loài Pythium như P aphanidermatum chỉ gây

hại ở nhiệt độ cao khoảng 40°C và một quai loài chỉ hoạt động ở nhiệt độ thấp, Pythium

có thé lây lan ở âm độ đất khoảng 70% hoặc cao hơn

1.2.3.4 Sự tồn lưu

Các loài Pythium tồn tại dưới dạng bào tử trứng được tạo thành qua quá trình sinhsản hữu tính Trong các điều kiện thuận lợi, những bào tử vách dày này nảy mầm và bắtđầu quá trình xâm nhiễm vào rễ con (Burgess và cS, 2009)

1.2.3.5 Sự lan truyền và xâm nhiễm

Pythium spp sản sinh ra các bao tử di chuyên được, hay còn gọi là du động bào

tử, có vai trò rất quan trọng Đây cũng là đặc điểm dé phân biệt những nam này với nấm

thực trong giới Nắm Du động bào tử vô tính tạo điều kiện cho những nam nay lan truyén

trong dat ướt và nước tưới (Burgess va cs, 2009)

Trong đất ướt, du động bào tử được thu hút tới đầu rễ con, ở đó chúng tạo ra các

ống mam (sợi nắm còn non) xâm nhập qua đầu rễ con và khởi đầu quá trình làm thối rễ

(Burgess và cs, 2009).

Chi: Trichoderma

Loài: Trichoderma spp.

Theo Persoon (1974)Theo nghiên cứu của Samuel và Hebbar (2015), chi nam Trichoderma lần đầutiên được công bồ là một trong những chi nam mốc cốt lõi bởi nhà vi sinh vật học người

Hà Lan Cristiaan Hendrik Persoon cách đây hơn 200 năm Ngoài các loại nắm cốt lõiđược công bồ trên còn bao gồm: Aspergillus, Cladosporium, Erinaceum và Penicillium.Chúng xuất hiện khắp mọi nơi và được biết đến với nhiều chức năng phục vụ cho đờisông của con người.

Các loài nam thuộc loài Trichoderma spp là các loài nam phổ biến sống trong

đất và các loài cộng sinh thực vật, có phạm vi phân bố rộng khắp ở hệ sinh thái vùng rễcây trồng, chúng có thê ảnh hưởng đến chất lượng đất và hiệu suất cây trồng (Phoka và

cs, 2020) Chi Trichoderma bao gom 254 loài đã được xác định (Amira va cs, 2011),

hiện diện khắp nơi trong đất rừng và đất nông nghiệp, nơi chúng có khả năng tương tác

cao với ré và các vi sinh vat vùng rê (Baiyee và cs, 2019).

Những nghiên cứu trước đây cho thấy nam Trichoderma spp có tác dụng đối

kháng chống lại ít nhất 18 chi và 29 loài nắm gây bệnh cây, cũng như một loạt các vikhuẩn gây bệnh cây Cơ chế đối kháng của Trichoderma spp chủ yếu bao gồm cạnhtranh dinh đưỡng, ký sinh nắm gây bệnh, tạo kháng sinh, tăng sinh tưởng và kích thíchphản ứng kháng của cây trồng (Harman, 2006) Nhiều loài Trichoderma spp có tốc độphát triển nhanh và khả năng đối kháng một số loài nắm bệnh hại vùng rễ cây trồng cónguồn gốc trong đất như nam Rhizoctonia solani gây bệnh lở cỗ rễ (Anees và cs, 2010;

Asad va cs, 2014), Sclerotium rolfsii gây bệnh héo rũ gốc mốc trang cà chua, khoai tây,

đậu tương, dua chuột (Kotasthane và cs, 2015), Fusarium solani gây bệnh thôi gốc thân

lạc (Rojo va cs, 2007).

Chúng nổi tiếng với sự tàn pha với các loại nam được trồng thương mai nhưngcũng ký sinh ở các loại nam khác trong rừng và môi trường tự nhiên khác Ngoài ra,nam Trichoderma spp còn được phân lập từ nhiều khác nhau như: nước thải xây dựng,thức ăn gia súc.

Trichoderma là một trong các chi nắm được sử dụng phổ biến được biến đượctìm thấy trong cây Theobroma gileri ở Mỹ Latin (Evans và cs, 2003) Các loài của chỉnam này cũng thường sống nội sinh trong thân và lá của một số cây khác, trong đó baogồm: cao su (Hevea brasiliensis) ở Peru (Gazis và cs, 2011), ca cao (Theobroma cacao)

ở Nam Mỹ, trung Mỹ, va châu Phi (Chaverri va cs, 2013) và rễ cà phê (Coffe arabica) ởEthiopia (Mulaw va cs, 2010).

1.3.2 Cấu tao tế bào của Trichoderma spp

Thành phan cau tạo chủ yếu của Trichoderma spp là chitin và chitosan (chitin bịdeacetyl hóa) Chitin có công thức hóa học (CsHisNOs)n trong đó C chiếm 47,29%, Hchiếm 6,45%, N chiếm 6,89%, O chiếm 39,37% và các thành phần khác gồm § - glucan,

œ - glucan, mannoprotein (Siu-Wai Chiu và David Moore, 2001), chất màu, lipid (§ —

33%) (Lâm Thanh Hiền, 1999) Màng tế bào dày khoảng 7 um thành phan chủ yếu là

lipid (40%) và protein (38%) Nhân phân hóa, thường hình tròn, đôi khi kéo dài, đường

kính khoảng 2 - 3 im Ty thể hình elip, luôn di động dé tham gia vào quá trình hô hapcủa tế bào (Lâm Thanh Hiền, 1999)

1.3.3 Sơ lược về cơ chế và vai trò của nắm Trichoderma spp

Trichoderma sinh san vô tính bằng bào tử (Rifari, 1969), chúng tồn tại và pháttrién bằng cách tăng nhanh về số lượng bào tử một cách có hệ thống Nam Trichodermađược ứng dụng bảo vệ cây trồng thông qua nhiều cơ chế bao gồm ký sinh, chất khángsinh enzyme phân hủy Các cơ chế này được tận dụng đề mang lại lợi ích cho con người

(Nguyễn Văn Đĩnh và cs, 2007)

Sản xuất các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi (VOC) được coi là cơ chế kháng sinhhiệu quả của loài Trichoderma spp Các loài Trichoderma spp sản sinh và thai ra các

11

chat có giá trị chất dé bay hơi liên quan đến khả năng kháng khuẩn, gây ra phản ứng

phòng vệ ở thực vật và thúc đây tăng trưởng thực vật (Wonglom và cs, 2020) VOC do

một số loài vi sinh vật thải ra trực tiếp ức chế sự phát triển của mầm bệnh hoặc gây ra

những thay đôi bất thường của mầm bệnh, dẫn đến về điểm yếu của mầm bệnh tươngtác với vật chủ thực vật (Elsherbiny và cs, 2020; Intana và cs 2021) Wonglom và cs,

2019 cũng báo cáo rằng Trichoderma sp T76-12/2 tạo ra VOC dé ức chế sự phát triển

của Sclerotium rolfsii.

Một loài nắm đối khang mới, 7 asperellum, đã được phát hiện trong những nămgan đây 7 asperellum có tốc độ phát triển nhanh, hình thành số lượng bào tử phân sinhlớn và có khả năng đối kháng cao đối với các tác nhân gây bệnh thối rễ do nắm Pythium

myriotylum (Mbaga va cs, 2012), bệnh héo Fusarium trên cây cà chua (Komy và cs, 2015), bệnh héo Fusarium trên cây dưa chuột (Mei va cs, 2019) Hơn nữa, 7 asperellumtiết ra chitinase, glucanase va protease, có thé làm pha hủy vách tế bào của nam va ký

sinh trong sợi nam gây bệnh Ngoài ra, chat xylanases do 7 asperellum tiết ra có tácdụng làm tinh kháng và miễn dich của cây trồng đối với tac nhân gây bệnh (Mei va cs,2019).

Tác động đối kháng hoặc tiết kháng sinh của các loài Trichoderma chỗng lại cácloài nắm, tuyến trùng gây bệnh thực vật do tạo ra được các enzyme đường phân, enzymephân giải chitin, peptaibiotics và tiết kháng sinh nam Ở trên các bộ phận của thực vật,các loài Trichoderma có khả năng xâm nhập và song nội sinh trong thân cây Ngày nay,các loài Trichoderma được áp dụng là một thành phần kiểm soát sinh học trong quản lýcây trồng tong hợp, trong đó bao gồm cả quản lý nông trại sạch và kích kháng cây trồng,sống cộng sinh và các cây ký chủ được biéu hiện qua cấp độ hình thái Chúng có thể cảithiện độ chống chịu của cây trồng đồng thời tạo ra hệ thống kháng lại tấn công của cáctác nhân gây bệnh cây trồng

1.3.4 Đặc điểm hình thái chung của một số loài Trichoderma spp

Soi nắm của Trichoderma spp không mau, có tốc độ phát triển rất nhanh, trên

môi trường PDA ban đầu có màu trắng, khi sinh bào tử thì chuyển sang xanh đậm, xanh

vàng hoặc lục trắng Ở một số loài còn có khả năng tiết ra một số chất làm thạch của

môi trường PDA hóa vàng.

Khi cấy ra trên môi trường PDA tản nam có mau trắng, đôi khi có màu vàng nhạt

và có mùi thạch dừa đặc trưng Tốc độ tăng trưởng của soi nam rất nhanh, trên môi

trường PDA ban đầu có màu trắng, khi sinh bào tử chuyền sang xanh đậm, xanh vàng

hoặc lục trắng Ở một số loài còn có khả năng tiết ra một số chất làm thạch của môi

trường PDA hóa vàng.

Bào tử của Trichoderma spp là một khối tròn mọc lên ở đầu cuối của cuống sinhbào tử phân nhiều nhánh, mang các bào tử trần bên trong không có vách ngăn, khôngmàu, liên kết nhau thành chùm nhỏ nhờ chất nhày Đặc điểm nổi bật của namTrichoderma là bào tử có màu xanh lục đặc trưng, một số ít có màu trắng, vàng hay xanhxám Chủ yếu hình cau, hình ellip hoặc hình oval với tỉ lệ đài : rộng từ 1 — 1,1 um hayhình chữ nhật với tỉ lệ dài : rộng là hơn 1,4 um, đa số các bảo tử trơn lắng Kích thướckhông quá 5 um.

1.3.5 Mô tả đặc điểm một số loài Trichoderma spp

Dựa vào đặc điểm hình dạng và màu sắc tan nam, hình dạng bào tử, bào tử hậu,

thể bình, đặc điểm hình dạng và mùi đặc trưng có thể xác định được ở cấp độ loàiTrichoderma spp Samuels và cs, (2015), đã mô tả đặc điểm của 39 loài Trichodermaphân bố nhiều nơi trên thế giới

T asperellum có thê bình phân nhánh kiểu hình chop, mọc vòng hoặc mọc thành

cặp từ nhánh chính, các nhánh chính gần như vuông góc với nhánh phụ Bào tử hình bán

cầu hoặc hình trứng, kích thước 3 - 4(-4,5) x (3-)3,5 — 3,8(-4) um Thể bình dạng bìnhthot cổ mọc trực tiếp từ tục chính, theo cụm từ 2 — 4 cái, kích thước dai x rộng (5-)6 -8(-10) x (3-)3,5 — 3,8(4) um Bao tử vách dày hình bán cầu, thường mọc ở cuối sợi nắm

Đặc điểm nhận biết là bao tử thường đính trên các thể bình thanh mảnh, cuống sinh bào

tử rất đồng đều

T atroviride hình thành tản nam thường có màu trắng, it bao tử tập trung ở tâm.Thẻ bình thường thắng hoặc cong, đôi khi hình móc câu, thường mọc trực tiếp từ trục

chính hoặc nhánh Thể bình ở cuối sợi nắm dạng hình trụ thắng, kích thước dài x rộng

(2.5-)3 - 4 - (5) x (2-)3(-4) um Bào tử hình cau, hình trức hoặc elip, màu xanh lá, nhẫn

min Bao tử vách day nhiéu, hình trứng hoặc hình ban cầu, mọc ở cuối SỢI nam hoặc xen

giữa.

13

T evansii hình thành cụm bao tử, rời rac, rộng, có đường kính 1 - 2 mm, hìnhthành các vòng đồng tâm không hoàn chỉnh Thẻ bình liên kết với nhau, hoặc thành bó

ở đầu sợi nắm, dạng bầu hoặc đặc bình thót cổ có độ dài từ 5 — 6 km, rộng 3,5 — 4,0 um

ở phan rộng nhất Bào tử hình bán cầu, màu xám xanh, nhẫn mịn có kích thước dai xrộng (2,5-)3 — 3,2(-3,7) x (2,7-)3 — 3,5(-4,2) um Bào tử vách dày hình ban cầu hoặchình câu, mọc ở cudi sợi nâm hoặc xen giữa.

T hamatum có các cụm bào tử hình thành vòng đồng tâm, nỗi trên bên mặt môitrường kết dính lại với nhau Các bao tử có màu trang mọc vòng hoặc xoắn ốc dé thay

Thể bình dạng bầu mọc nhiều ở đầu nhánh cấp 2 Bào tử vách dày mọc ở cuối SỢI nắm

hoặc xen giữa có kích thước (3,7-)5 — 7,2(-10,7) x (2,2-)3,2 - 4(-5,5) um Bào tử màuxám xanh, hình elip, nhẫn mịn có kích thước (2-)2,5-3(-3,5) x (3-)3,7 — 4,2(- 5,7) um

Không phát triển được ở nhiệt độ 35°C

T harzianum tiết ra sắc tô màu vàng trong vòng 48 giờ trên môi trường PDA,

không có mùi đặc trưng Thể bình dang bau, từ 3 — 5 cái Bào tử vách day mọc ở cuối

sợi nắm hoặc xen giữa có kích thước 6,2 — 7,5 um x 3,2 — 3,5 um Bao tử hình bán cầu,

có màu xám xanh hoặc xanh, phân tán thành 2 — 3 vòng tròn đồng tâm, cành sinh bào tửchủ yếu phát triển trên không nhưng vẫn bám lại trên mặt thạch, cụm bào tử như bông

bat đầu từ tâm cấy sau đó phát triển ra ngoài có kích thước (2-)2,5 - 3(-3,7) x (2,2-)2,7

— 3,5(-4,2) um.

T koningii có các cụm bào tử hình thành vòng đồng tâm từ tâm cấy nhưng thườngkhông hình thành Thể bình dạng bình thot cô, thang, dài có kích thước (4,2- )6,2 - 10(-15,5) x (2-)2,7 — 3,5(-4,5) um Bào tử chữ nhật có màu xanh đậm có kích thước (2-)2,5

- 3(-3,5) x (3-)3,7 - 3,5(-4,7) um Soi nam như sợi bông mảnh, không dày đặc, thỉnh

thoảng phẳng xẹp trên bề mặt môi trường Thường hình thành các cụm bào tử từ thành

đĩa Ít khi hình thành bào tử vách dày, nếu có, bào tử vách dày hình bán cầu, mọc ở cuối

soi nam hoặc xen giữa.

T longibrachiatum tiết ra sắc tố màu vàng, có cụm bào tử nhiều, phân tán đồng

đều, thường tạo thành các vòng đồng tâm, sợi nắm dạng bông hoặc như len có thể nhìn

thấy được Thé bình hình trụ tròn hoặc hình chai, thường phình ra ở giữa có kích thước(3,5-)5,5 - 10(-17,2) x (1-)2,2 — 3,2(-4,5) um Bao tử màu xanh lá, hình elip có kích

thước (2-)2,5 — 3(-4) x (2-)3,5 — 4,5(-6,2) um Bào tử vách dày xuất hiện nhiều trên môitrường CMA, hình câu hoặc ban câu, mọc ở cuôi sợi nam hoặc xen gitra.

1:reesei tiết ra sắc tố màu vàng, không có mùi đặc trưng trên môi trường PDA,

bề mặt tản nắm thường lan tỏa tròn đều tạo thành vòng tròn đồng tâm Thẻ bình hình trụ

tròn hoặc hình chai, rộng ở phan giữa, kết lai với nhau, thường mọc đơn và đối xứng vớithể bình xen giữa có kích thước (3,5-)5,2 - 9,2(-16) x (1,7-)2,5 - 3,2(-4,5) um Bào tử

có hình elip, màu xanh, nhẫn mịn có kích thước (1,7-)2,5 - 3(-4) x (2-)3,5 — 4,5(-6,2)

Bào tử vách dày có hình cầu hoặc bán cầu, mọc ở cuối sợi nam hoặc xen giữa T reesei

có thé phát triển ở nhiệt độ 40°C trên môi trường PDA và hình thành soi nam ở nhiệt độ25°C dưới ánh sáng trong vòng | tuần

1.3.6 Một số nghiên cứu trong nước về nắm Trichoderma spp

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu nam Trichoderma spp được tiến hành từ năm 1987,

bộ môn bệnh cây thuộc Viện Bảo Vệ Thực Vật đã tiến hành phân lập các chủngTrichoderma spp từ các nguồn khác nhau và xác định được khả năng ức chế của nắmTrichoderma spp d6i với một số nam gây bệnh trên cây trồng, tìm phương pháp nuôicay dé tạo chế phẩm Các chủng nam Trichoderma spp đã thu thập được có hiệu quả ứcchế từ 67,7 — 85,5% đối với các nam gây bệnh như: Rhizoctonia solani, Sclerotiumrolfsii, Fusarium spp

Nam 2005, Tran Tan Dat đã nghiên cứu khả năng sống của nam Trichodermaspp trong môi trường long được sục khí rất tốt, chế pham dạng lỏng này có thé tồn trữđến 30 ngày và chúng có khả năng hạn chế bệnh chết cây con trên cây cải ngọt đồngthời làm tăng năng suất Tiếp đó, các kết quả nghiên cứu của trường Đại học Cần Thơ,Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh họcNhiệt đới đã cho thấy hiệu quả của nam Trichoderma spp trên một số loại cây trồng 0Đồng Bang Sông Cửu Long và Đông Nam Bộ Các nghiên cứu cho thấy, namTrichoderma spp có kha năng tiêu diệt nam Fusarium solani hay một sô loài nam khác.

Các nghiên cứu về tính đa dang của nam Trichoderma tại một số vùng sinh tháikhác nhau ở phía nam Việt Nam Kết quả đã phân được 278 mẫu có nắm Trichoderma,định danh được 14 loài bằng hình thái tản nam, đánh giá 129 mẫu đối kháng với nam

1S

bệnh, ghi nhận được kết quả 20 mẫu kháng mạnh với 4 loại nam bénh phé bién:

Rhizoctonia solani Phytopthora capsici, Sclerotium rolfsii, Fusarium spp., 58 mau

không đối kháng với nam Fusarium Sclerotium (Lê Dinh Đôn va cs, 2010)

Trần Thị Tuyết Lan (2006), đã nghiên cứu về khả năng phòng trừ bệnh chết câycon và tác động đến sinh trưởng trên các loại cây cây dua leo, khổ qua và đậu cove của

T koningii và T Virens Kết quả là cả 2 loài T koningii và T Virens đều có khả nănghạn chê được bệnh chêt rạp cây con trên cây dưa leo, khô qua và đậu cove.

Thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng của một số dong nam Trichoderma đôivới Phytopythium helicodes trong điều kiện phòng thí nghiệm Kết quả cho thấy, các

dòng nam Trichoderma sử dụng trong thí nghiệm đều cho hiệu quả đối kháng cao từ

59% - 69% (Võ Thị Thu Oanh và cs, 2017)

Hiện nay, trong danh mục thuốc BVTV Việt Nam năm 2008 của Bộ Nông Nghiệp

và Phát Triển Nông Thôn đã công bố có 7 loại sản phẩm chứa nam Trichoderma nhưtác nhân phòng trừ sinh học được lưu hành trên thị trường Trong đó Trường Đại họcNông Lâm Tp Hồ Chi Minh với sản pham (NLU-Tri: với hàm lượng 1x10 bao tử/gphòng trừ bệnh chết rạp cây con trên cải ngọt, dưa leo, héo rũ trắng gốc trên cây càchua).

1.3.7 Một số nghiên cứu nước ngoài về nắm Trichoderma spp

Từ đầu thế ky XIX thì giống Trichoderma spp đã được biết đến và có sự liênquan với đạng teleomorphs Fr, nhưng sự phân loại loài sinh học này là cực kì khó đốivới giống này về mặt hình thái (Kubicek va Harman, 1998)

Đến cuối thế kỷ XX, các dữ liệu phân tử và kết quả phân tích DNA được sử dụngnhiều trong những nghiên cứu về định danh và phân lập Một số kết quả là 7: viride, T.atroviride, T koningii có quan hệ rat gần với T harzianum, nhưng điểm khác là loài này

sản xuất ra mùi dừa có hoạt lực cao (chất khang sinh — pyrone) và loài này không thé

phát triển ở 35°(theo Kuhls và cs, 1997)

Năm 2003, Chaverri va cs đã chứng minh rằng 7 harzianum là một loài phứctap, trong giới hạn của những phô hệ phát sinh loài và hình thái học của loài này tổn tai,

có nhiều sự khác nhau về gen và hình thái trong những loài này 7 harzianum đã được

nhận diện như là nguyên nhân gây bệnh mốc xanh trên những nắm đại được phát triểnthương mại ở Châu Âu và Bắc Mỹ Việc phân tích chuỗi DNA và quan sát một cách cân

thận về hình thái đã cho thay rằng loại nam gây ra mốc xanh trên nam lớn là một loàimới và có quan hệ với 7: harianum Loài mới này là 7: aggressivum, phát trién kém ở

35°C trong khi 7: harzianum phát triển và hình thành bao tử rất tốt

Rất nhiều những nghiên cứu đã cho thấy lợi ich của Trichoderma mang lại Năm

1972, Wells và cs đã chứng minh được 7 harzianum bon vào đất với lượng lớn 1:10theo thé tích có thé ngăn chặn bệnh ở thân và rễ gây ra do một số nam đất Cho biết namTrichoderma không những tiêu diệt được nhiều loài nắm gây hại cây trồng mà còn cótác dụng cải thiện cấu trúc và thành phần hóa học của đất, đây mạnh sự phát triển của vi

khuẩn nốt san có định dam trong đất và kích thích sự phát triển của cây trồng, ức chế

các vi sinh vật gây bệnh.

Lisansky (1983) đã thông báo năm 1921 các nước Châu Âu và Brazil đã đăng ký

chê phâm trên cơ sở nam Trichoderma dé bảo vệ cây trông.

L7

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Nội dung nghiên cứu

Phân lập nam Trichoderma spp từ đất trồng và định danh dựa vào đặc điểm hìnhthái bảo tử, cụm bào tử, cành sinh bảo tử của chúng.

Đánh giá khả năng đối kháng của nam Trichoderma spp đối với các nam gâybệnh lở cô rễ trên cây họ cà trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 5/2023 đến tháng 11/2023

Địa điểm: Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm bệnh cây khoa Nông học

Trường Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh

2.3 Đối tượng và vật liệu, dụng cụ nghiên cứu

2.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Hồ Chí Minh

Hình 2.1 Mẫu Rhizoctonia bicornis chủng ODT02 (A), Fusarium oxysporum

KTDT0I (B), Pythium vexans KTDT22 (C)

Hạt giống cà chua F1(311) của Công ty TNHH Đại Địa

Thiết bị sử dụng: Tủ cấy, nồi hấp khử trùng, cân điện tử (PX224, Ohaus, Mỹ),

tủ cay khử trùng (2AC2 - 6E8, Esco, Singapore), tủ say (MC40L, ALP, Japan), tủ hap,

tủ định ôn, lò vi sóng, bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, kính hiển vi (CX23,

Olympus, Japan), micropipette, ống đong, đèn côn

Hóa chất:

Môi trường PGA (Potato — Glucose — Agar) Thành phan môi trường: Khoai tây(200 g), Agar (20 g), Đường Glucose CøHzOs.HzO (20 g), Nước cat (1000 ml) Hapkhử trùng ở 121°C trong 20 phút.

Môi trường PDA (Potato — Dextrose — Agar) Thành phan môi trường: Khoai tây

200g), Agar (20g), Đường Dextrose CøeHzOs.HaO (20g), Nước cat (1000 ml) Hap khửtrùng ở mức 20 phút.

Môi trường WA (Water Agar medium) Thanh phan: Nước cat (1000 ml), Agar

(20 g) Phương pháp điều chế: Hap khử tring ở mức 121°C, 1 atm, trong 20 phút

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp thu mẫu, phân lập và định danh nấm Trichoderma spp

2.4.1.1 Phương pháp thu thập mẫu dat

Thu thập mẫu đất tại các tỉnh Bình Dương, Lâm Đồng, Tây Ninh chọn các khu

19

trồng cây họ cà lâu năm không sử dụng thuốc hóa học và không sử dụng các chế phẩm

nao có chứa nam Trichoderma spp Tại mỗi khu trồng cây họ cà lấy 5 điểm gồm 4 góc

và giữa vườn Tại các điểm lấy mẫu, lấy mẫu đất quanh vùng rễ cây trồng và không tập

trung vào một điểm duy nhất Lay 200 g/vi trí đất từ mặt đất đến độ sâu 20 — 25 cm, sau

đó tiễn hành trộn các mẫu đất đã lấy vào nhau và lay đại điện 200 g/vườn thu mẫu Mẫu

đất nên được giữ trong túi nilon và ghi chép chỉ tiết thông tin vùng cây trồng, số lượng

mẫu, điểm lay mẫu (Roger Shivas va Dean Beasley, 2005)

Quy ước đặt tên mẫu đất: T — số thứ tự mẫu đất, trong đó T là Trichoderma

Bảng 2.1 Mẫu đất thu thập trên các ruộng rau

STT Tên mẫu Địa điểm thu mẫu Tọa độ

1 TT, 12 Đạ Sar, Đà Lạt, Lâm Đồng 12°00'04.5"N 108°30'18.0"E

2 13, 14 Đạ Sar, Đà Lạt, Lâm Đồng 12°00'06.1"N 108°30'20.8"E

3 15, T6 Da Sar, Da Lat, Lam Đồng 12°00'05.6"N 108°30'21.3"E

4 T7, T8 Phước Sang, Phu Giáo, Binh 11°21'19.8"N 106°45'47.8"E

2.4.1.2 Phương pháp phân lập nắm Trichoderma spp từ mẫu dat

Nắm được phân lập từ đất bằng phương pháp đặt bẫy dùng giấy lọc của Soytong

và Quimio (1989) Các mẫu đất được phơi khô và ghiền nhỏ, sau đó đất nghiền được

cho vào đĩa petri đường kính 8 cm với lượng khoảng 2/3 đĩa, đất được làm âm bằng

nước cất vô trùng Các mảnh giấy lọc vô trùng, kích thước 1 x 1 cm? được đặt trên bềmặt đất trong đĩa petri Các đĩa petri đựng mẫu đất được ủ trong tủ ôn ở điều kiện 28°C

và hàng ngày kiểm tra sự hình thành sợi nắm trên bẫy giấy Khi sợi nắm xuất hiện thìchuyển lên môi trường WA có bổ sung kháng sinh ampicillin (100 mg/l) và

streptomycin, sau đó tiếp tục cấy truyền lên môi trường PDA đề làm thuần

Lưu giữ nguồn bang cách cấy sợi nam Trichoderma spp vào ông thạch nghiêngchứa môi trường PGA.

2.4.1.3 Định danh nam Trichoderma spp dựa vào đặc điểm hình thái

Dựa trên cở sở của thí nghiệm khảo sát đặc điểm sinh học ảnh hưởng đến sự sinhtrưởng, phát triển của nam 7zichoderma spp và các đặc điểm hình thái namTrichoderma spp (Chiristian và Harman, (1998); Samuels va Hebbar, (2015)) đã mô tả:

Hình thai, màu sac tan nam trên môi trường PDA

Hình dang cành sinh bào tử: Canh sinh bao tử của nam Trichoderma là một nhómsợi bén vào nhau, cành sinh bao tử không màu, mọc lên từ những cum doc theo sợi nam.Trên cành sinh bao tử có đính các thé bình là những tế bào hình to có dạng bình thót cô,mọc theo cụm hoặc mọc riêng lẻ tùy loài, trên đầu thê bình có đính bào tử

Hình dạng thé bình: Thẻ bình có thé mọc đơn lẻ hoặc mọc theo cụm 2 — 4 cái/cụm,trên các thé bình có các bào tử

Hình dạng, màu sắc bào tử: bào tử màu xanh, có nhiều dạng khác nhau, có khi

hình tròn, hình cầu, hình trứng, hình elip, một số loại lại có hình chữ nhật

Hình dạng bào tử hậu: Hình cầu, bán cầu hoặc hình trứng

Nam được quan sát hình thái, màu sắc tan nam, bao tử nam, hình dạng cành sinh

bao tử, thé bình, cách mọc trên môi trường PDA Bào tử của nắm Trichoderma spp làmột khôi tròn mọc lên ở dau cuôi của cuông, sinh bao tử và phân nhiêu nhánh, bào tử

21

có màu xanh lục đặc trưng, một số Ít có màu trắng, chủ yếu hình cầu, hình ellip hoặcoval Dưới kính hiển vi ở vật kính 40X, quan sát các loại bào tử, thé bình, đo ngẫu nhiênbào tử và thể bình ở mỗi loại theo kích thước chiều dài và chiều rộng Từ đó tính được

sự biến động chiều, chiều rộng và kích thước trung bình của bảo tử và thể bình Kích

thước bảo tử được tính theo công thức:

2.4.2.1 Phương pháp đánh giá tính đối kháng trong điều kiện phòng thí nghiệm

Các thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng được tiến hành theo phương phápcủa Soytong, 1988.

Chuẩn bị đĩa petri chứa môi trường thạch PDA, tiễn hành cấy đối xứng qua tâm

2 loại nam Trichoderma spp và nam gây bệnh lở cô rễ (Rhizoctonia bicornis, Fusariumoxysporum, Pythium vexans) trên bề mặt môi trường trong dia petri 8em Dùng khoanthạch hình trụ có đường kính 5 mm, vô trùng, khoan lay mot phan thạch ở ria tan nắmTrichoderma spp va đặt vào dia petri (đường kính 8c m) chứa môi trường PDA, khoảngcách đặt khoanh thạch và mép đĩa là 1,5 cm Sau ngày nuôi cấy tiễn hành cấy khoanh

tản sợi nắm bệnh đối xứng vào trong đĩa petri Tiến hành nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ

+ 3: Nam gây bệnh lở cô rễ (Rhizoctonia bicornis, Fusarium oxysporum,

Pythium vexans)

Thí nghiệm được bố tri theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tô với 3 lần lặp

lại mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri

Tricoderma Nắm gây bệnh

Hình 2.2 Bồ trí thí nghiệm đồng nuôi cay Trichoderma với nam gây bệnh

Chỉ tiêu theo dõi:

+ Theo dõi sự phát triển của đường kính của nắm đối kháng, nam gây bệnh và sự

lan at nhau của chúng bằng cách đo đường kính vùng nam phát triển

Chỉ tiêu theo dõi: Do bán kính trung bình theo công thúc:

R= (dị + d2)/2

Trong đó :

dị: bán kính từ tâm gây bệnh nghiên góc 45° về phía trên nắm đối kháng

do: bán kính từ tâm đối xứng nắm gây bệnh về phía tâm nắm đối kháng

Công thức tính hiệu quá ức chế trong phòng thí nghiệm ký hiệu PIRG

PIRG (Percent Inhibition of Radical Growth) = (R1 - R2)/R1 x 100.

23

Trong đó:

+ PIRG: Hiệu suất đối kháng

+ R1: Là bán kính phát triển tan nắm của nam gây bệnh cấy đối chứng.

+R2: Là bán kính phát triển của tan nắm gây bệnh khi cấy với đối kháng.

Hoạt tính đối kháng quy ước và theo dõi quá trình đối kháng, cách thức tấn côngcủa nam 7?ichoderma spp lên nam gây bệnh.

+ Hiệu suất đối kháng rất cao: Soi nam và bào tử của nấm Trichoderma sinh

trưởng va phát triển trên bề mặt của các loại nam gây bệnh (Rhizoctonia bicornis,Fusarium oxysporum, Pythium vexans) hoặc sợi nam và bào tử của nam Trichodermaphát triển bao quanh các loại nắm bệnh hình thành bào tử ngay ria soi nam bénh, ngancan sự phat triển của chúng (PIRG > 75%)

+ Hoạt suất đối kháng cao: Soi nam Trichoderma sinh trưởng và phát triển trên

bề mặt của các loại nam bệnh (Rhizoctonia bicornis, Fusarium oxysporum, Pythiumvexans), hoặc nam Trichoderma phát triên bao quanh các loại nam bệnh hình thành bào

tử ngay ria sợi nắm bệnh, ngăn cản sự phát triển của chúng (PIRG: 61 - 75%)

+ Hiệu suất đối kháng trung bình: Soi nam Trichoderma phát triển qua giữa đĩa,tạo thành hàng rao ngăn can sự phát triển của các loại nắm bệnh (Rhizoctonia bicornis,Fusarium oxysporum, Pythium vexans) nhưng không tác động đến các loại nam gây hại(PIRG: 50 - 60%).

+ Hiệu suất đối kháng kém: Sợi nam Trichoderma và các loại nam gây hại(Rhizoctonia bicornis, Fusarium oxysporum, Pythium vexans) phát triển đều nhau và

không có sự chênh lệch cao (PIRG < 50%).

2.4.2.2 Phương pháp đánh giá đối kháng trong điều kiện nhà lưới

Từ kết quả đánh giá khả năng đối kháng của Trichoderma spp trong điều kiện

phòng thí nghiệm đối với nam gây hai (Rhizoctonia bicornis, Fusarium oxysporum,Pythium vexans), chọn 2 dong Trichoderma spp có hiệu suất đối kháng cao nhất dé thựchiện thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng trong điều kiện nhà lưới (chon dong namđối kháng có hiệu suất đối kháng cao nhất với 2 dòng trong 3 dòng nắm gây hại) Cây

trồng được chọn đề đánh giá khả năng đối kháng là cây cà chua.

Thí nghiệm được tiến hành trong khay hình chữ nhật (13 x 12 x 10 em) với giáthé là hỗn hợp đất : tro trau : xo đừa : phân bò theo tỷ lệ I1 : 1 : 1 : 1 Hỗn hợp đất đượchấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C trong 20 phút trước khi sử dụng

Hạt giống cà chua được ươm trồng và chăm sóc cho đến khi cây nảy mầm có thểtién hành mang đi thí nghiệm

Phương pháp thực hiện

Hai chủng nam Trichoderma đôi kháng mạnh nhất trong phòng thí nghiệm được

nuôi cấy trên môi trường PDA khoảng 7 ngày Cho 10 mL nước cất thanh trùng vào

từng đĩa petri, dùng lam kính sạch cạo nhẹ phần sợi nam, lọc qua vải lọc đã thanh trùng,thu được huyền phù bao tử nam Mật số bào tử nắm được dém trên buồng đếm bao tử

và điều chỉnh đến mật số 105 bảo tử/mL

Tiến hành lây nhiễm và xử lý chế phẩm

Pha dịch bào tử: cho 5 mL nước cat đã thanh trùng vào đĩa petri có chứa nam (đã

hình thành bào tử) nuôi cấy trên môi trường PDA, dùng lam kính cao đi lớp sợi nắm sau

đó loc lấy dịch huyền phù bao tử điều chỉnh mật số bào tử đến nồng độ 10° bào tử/mLbằng buồng đếm hồng cầu

+ Đối với NT có xử lí nắm bệnh: Mầm bệnh được cây trực tiếp giá thể tự nhiên

vỏ trâu và hạt kê (tỉ lệ 1 : 1), tiến hành nhân sinh khối khoảng 18 — 21 ngày và sau đó

bón trực tiếp vào đất trồng

+ Đối với NT có xử lý chế phẩm sinh học: Pha nước cất đã thanh trùng với chế

phẩm sinh học theo các nồng độ đã quy định sẵn ứng với từng nghiêm thức tưới vàochậu ở thời điểm 7 ngày trước khi gieo hạt

+ Đối với NT có xử lý nắm đối kháng và nắm bệnh: Tưới 20 mL dịch huyền phù

bao tử nam đối kháng/chậu mật độ 10° bào tử/mL ở thời điểm 7 ngày trước khi gieo

hạt, sau đó cây sinh trưởng đến lúc đạt 2 lá mầm bắt đầu cấy nắm bệnh trực tiếp đã qua

xử lý bằng vỏ trau và hạt kê trước đó vào bề mặt đất với tỉ lệ 60 gam nắm bệnh/chậu

500 gam đất

Bồ trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được bồ trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 9 nghiệm thức (NT), mỗi NT

là 10 chậu cà chua và 1 NT là 3 LLL.

+ NTI: Nam Trichoderma | và hỗn hợp (R bicornis + F oxysporum + P vexans)

+ NT2: Nam Trichoderma 2 va hỗn hợp (R bicornis + F oxysporum + P vexans)

+ NT3: Nắm Trichoderma 1, Trichoderma 2 và hỗn hop (R bicornis + F.

Chỉ tiêu theo dõi

Quan sát mỗi ngày, theo dõi tỉ lệ bệnh ở thời điểm nghiệm thức đối chứng xuấthiện bệnh đầu tiên, theo dõi tỉ lệ bệnh và chỉ số bệnh ở các thời điểm 9, và 21 ngày sau

xử lý nam, tính hiệu lực tròng trừ (HLPT) tai thời điểm 9, 12, 15, 18 NSCB Đánh giá chỉ

số thôi rễ được ghi lại theo thang điểm 1 — 4, có điều chỉnh của Hwang va Chang (1989),

như sau: 1 = 1 — 10%, 2 = 11 - 25%, 3 = 26 — 50% và 4 = 51 — 100% (cây héo).

Công thức tinh (theo QCVN 01 — 160: 2014/BNNPTNT):

Phương pháp tính toán và xử lí:

Tỷ lệ bệnh (%) = (A/B) x 100

Trong đó: A là số cây bị bệnh nhiễm lở cổ rễ

B là Tổng số cây điều tra

Hiệu lực phòng trừ(%) = [(D — C)/D] x 100

Trong đó: D là số cây nhiễm bệnh ở nghiệm thức đối chứng

C là số cây nhiễm bệnh ở nghiệm thức thí nghiệm

Chỉ số thối rễ = [(1 x Ci+2 x Ca+ 3x Cạ+ 4x C¿)/(Ñx4)] x 100

Trong đó:

N: là tổng số cây theo dõi

Ci: Số cây bị bệnh ở cấp 1 với 1 — 10% diện tích rễ (cổ rễ) bị bệnh

Co: Số cây bị bệnh ở cấp 2 với 11 — 25% diện tích rễ (cổ rễ) bị bệnh

C3: Số cây bị bệnh ở cấp 3 với 26 — 50% diện tích rễ (cô rễ) bị bệnh

C4: Số cây bị bệnh ở cấp 4 với 51 — 100% biến màu rễ (cây héo)

+ Chiều cao cây: Do từ mặt đất đến đỉnh ngọn cao nhất ở thời điểm 18 NSCB

+ Chiều dai rễ: Do từ gốc của cây đến đỉnh của rễ thời điểm 18 NSCB

2.5 Xử lý số liệu

Các số liệu thu thập được tính toán bằng phần mềm Microsoft Excel 2010

Phân tích ANOVA và trắc nghiệm phân hạng bằng phần mềm SAS 9.1

27

Chương 3

KET QUA VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả phân lập nam Trichoderma spp

3.1.1 Bay nắm Trichoderma spp

Sau 10 - 14 ngày bay nam, đất được lay từ độ sâu 20 — 25 cm xuất hiện nhiều loại

nam, khuẩn khác nhau Nam Trichoderma spp có tồn tại trong đất sẽ xuất hiện sau 7

ngày bay nam, giấy loc sẽ xuất hiện màu xanh và sau 14 ngày sẽ nhận thấy rõ hơn nhữngsợi nắm xanh xuất hiện trên giấy lọc Tiến hành cấy riêng lẻ từng sợi nam trên giấy lọcsang môi trường WA có bổ sung kháng sinh ampicillin (100 mg/l) va streptomycin Khi

sợi nam phát triển trên môi trường WA, tiếp tục cấy sợi nam sang môi trường PDA dé

nâm phát triên và làm thuân.

Nhận biết nắm Trichoderma spp đã phân lập được bằng hình dang, màu sắc sợi

nam, hình dang, mau sắc bào tử dưới kính hiên vi.

Hình 3.1 Nam Trichoderma spp xuất hiện trên giấy lọc ở thời điểm 14 ngày đặt bẫy;

(a) Giấy lọc có màu xanh sau 7 ngày bẫy nắm (b) Giấy lọc có nhiều sợi nắm màu

xanh sau 14 ngày bay nam và phân lập ra nam Trichoderma spp

3.1.2 Kết quả phân lập nam Trichoderma spp.

Từ 9 mẫu dat thu thập tại 3 tinh, Bình Dương, Lam Đồng và Tây Ninh đã phân

lập được 15 dòng nam Trichoderma spp Trong đó, có 6 dòng Trichoderma được phân

lập từ mẫu đất tại vườn rau xã Đạ Sar, thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng, có 5 dòng

Trichoderma được phận lập từ mẫu đất tại vườn rau xã Long Mỹ, huyện Long Thành

Bắc, tỉnh Tây Ninh và có 4 dòng Trichoderma được phan lập từ mẫu đất tại xã PhướcSang, huyện Phú Giáo, tỉnh Bình Dương Các dòng nam đã được phân lập nuối cấy trênmôi trường PDA được mô tả trong bang 3.1.

Các mẫu nam Trichoderma đã được phân lập được lưu trữ nguồn trên môi trường

PGA trong ống thạch nghiêng, ký hiệu và đặt tên để thuận lợi trong quá trình theo dõi,

lưu trữ cũng như thực hiện các thí nghiệm khác.

Bang 3.1 Kết quả phân lập nam Trichoderma spp

Địa điểm thu mẫu, Dòng nam „

29