Khóa luận tốt nghiệp Sư phạm Sinh học: Phân lập và khảo sát hoạt tính sinh học của nấm cộng sinh địa y (Nigrovothelium Tropicum)

Với sự phát triển của kỹ thuật hiện đại, địa y khiến giới khoa học cảng bat ngờ hon với những hoạt tính sinh học do hợp chất chuyên hóa thứ cap ma chúng sản xuất, mở ra hướng đi mới day

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRUONG ĐẠI HỌC SƯ PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

NGUYEN HONG LINH

KHOA LUẬN TOT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGANH SƯ PHAM SINH HỌC

THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH - 2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

NGUYEN HONG LINH

KHOA LUAN TOT NGHIEP DAI HOC

NGANH SƯ PHAM SINH HOC

NGUOI HUONG DAN KHOA HOC

TS TRAN THỊ MINH ĐỊNH

THÀNH PHO HO CHÍ MINH - 2024

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan khóa luận là công trình do tôi nghiên cứu, đưới sự hướng dẫn

của Tiền sĩ Tran Thị Minh Định, không sao chép của ai do tôi tự nghiên cứu, doc, dich tài liệu, tang hợp và thực hiện Nội dung lý thuyết trong khóa luận tôi có sử dụng một

số tài liệu tham khảo như đã trình bay trong phân tai liệu tham khảo Các số liệu,

chương trình phần mềm và những kết quả trong khóa luận là trung thực và chưa được

công bỏ trong bat kỳ một công trình nào khác

LOI CAM ON

Em xin gửi lời cam ơn chân thành đến Tiến sĩ Tran Thị Minh Dinh, giảng viên

hướng dan dé tài, đã định hướng và dan đất em trong qué trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp Sự giúp đỡ và động viên của cô là một món quà to lớn doi với em trong

suốt thời gian thực hiện dé tài

Bên cạnh đó, em xin được gửi lời cảm ơn đến cô Trân Thị Hiểu, chuyên viên

phòng thí nghiệm Sinh hóa - Vi sinh khoa Sinh học cũng như các thay cô, anh chị,

bạn bè nghiên cứu thuộc khoa Hóa học Thường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chi

Minh va Trung tam Khoa học và Công nghệ Sinh học Trưởng Dai học Khoa học tự

nhiên đã hồ trợ em mau chóng hoàn thành thí nghiệm.

Sự có mặt của các bạn sinh viên thực hiện đề tài ở phòng thí nghiệm Sinh hỏa —

Vi sinh cũng như các bạn cùng khóa 46 Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm

Thành phỏ Hồ Chi Minh là sự chia sẻ và động viên quan trong về mặt tinh thần đổi với em, giúp khóa luận của em có thé hoàn thành đúng tiền độ.

Em xin chân thành cảm ơn thay cô khoa Sinh học = Trường Đại hoe Sư phạm

Thành phổ Hồ Chí Minh đã xây dựng cho em nền tang kiến thức vững vàng, tạo điều

kiện tốt nhất dé em thực hiện khóa luận Những lời nhận xét và góp ý của thay cô là

bài học kinh nghiệm qui báu dành cho em.

Cuối cùng không thé dùng từ ngữ nào dé thể hiện lòng biết ơn vô bờ của con

đổi với gia đình, cha mẹ, người đã sinh thành, nuôi nẵng, tạo mọi điều kiện tốt nhất

dé con được học hành, tiếp cận với thể giới to lớn và tươi sáng, cho con tự tin dé theo

đuối ước mơ của mình.

Thành phổ Hà Chi Minh, ngày 26 tháng 04 năm 2024

SINH VIÊN

NGUYEN HONG LINH

4 Nhiệm vụ nghiên CỨU c << (Si nọ HH gọn 0g 2

5 Phạm vi nghiên Cứu «Ăn ng ng ngang 2

6 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - «5< 5 << ssess+xeexeeseserxee 3 CGHƯƠNGH.,TÔNG QUẦN Ga be nkeieeedskoiodtobiiii64040L0014830463H600386 4

1:1: TÔNB quant VỀ ONY occkccicteeoteeotioiet201020000001120336006300386023680363634183606388588 4 1.2 Tổng quan về nắm Nigrovothelium tropicum -.-ce«©s«c5s<5ssxescsee 5 1.3 Tổng quan về hoạt tính sinh học s ssssssssssesseesseessesssesssessscssscsssessseese 6

1.3.1.1 Tổng quan về enzyme ứ-glu€0SÏđiAS€ -.«e©55<55<5ssscecsee 6 1.3.1.2 Tông quan về bệnh đái tháo đường tuýp 2 và các biến chứng

QUIS DON cst6tátsit6i46616511665163544663403565544335665865505535ã65664634559163858635533858535033ã63343535653358 7

1.3.1.3 Các chất ức chế enzyme G-glUCOSIGASE sccsecseessessecsseenecseesersses 8 1.3.2.1 Tổng quan về vi khuẩn Staphylococcus aureus - 9

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƯỚC Ă S522 9

CHƯƠNG 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Vật liệu nghiên cứu o0 no gu HH 908906 12

2.2 Thiết bị và dụng CỤ Ăn nh HH HH ng nen ng gen rgge 12

2.3 Phương pháp co HH TH TH TH TH TH HH H000 0100104080816 84 13

2.3.4.1 Hoạt tinh ức chế enzyme G-glucosidase cc.sssscssscsseecssecsseesne 15CHUONG 3 KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN «os<5ssecscsscsssrsesne 18

3.1 Kết quả phân lập nam cộng sinh địa y Nigrovothelium tropicum 18

3.2 Kết quả nuôi cấy nắm ¿V fF0jĐỈCHPH e< 56c ve+vcxvetseetseerseresvee 18

3.2 Kết quả tạo cao chiết Cthy] aC€(AC., cceĂeĂSĂSSSẴSsenHe ng ng ng re 21 3.3 Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế enzyme ơ-glueosidase 23 3.4 Kết qua khảo sát hoạt tính kháng khuẩn S aureus - 30

Phụ lục 1: Kết quả khảo sát hoạt tinh kháng khuẩn S aureus của các mẫu cao

ethyl acetate thu được từ nắm cộng sinh địa y N /F0DÏCHIM ««.e«« PLI

Phụ lục 2: Hình ảnh kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn S aureus của

các mẫu cao ethyl acetate thu được từ nắm cộng sinh địa y N tropicum PL2

Phụ lục 3: Kết qua phân tích tương quan phi tuyến tính giữa ty lệ ức chế enzyme ơ-glueosidase với nồng độ cao chiết thu được từ sinh khối nam ở môi

trường | | ee PLS

Phụ lục 4: Kết qua phân tích tương quan phi tuyến tinh giữa ty lệ ức chế

enzyme ơ-glucosidase với nồng độ cao chiết thu được từ sinh khối nắm ở môi

trưừng PDA: 12 THẰNG: kcccccnticeiiccie20120122020000202110201221006003655606612502600386188833623055888 PL6

Phụ lục 5: Kết quả phân tích tương quan phi tuyến tính giữa tỷ lệ ức chế

enzyme ơ-glucosidase với nồng độ cao chiết thu được từ sinh khối nắm ở môi

^

trường S412 tuậần co Họ HT c4 cọ 0019008 98008900089 PL7

DANH MUC CAC TU VIET TAT

Chú giải

International Diabetes Federation

Malt-yeast Agar 10% sucrose

Sabouraud 4% D-glucose

Mueller Hinton agar

Enzyme a-glucosidase inhibitors

DANH MỤC HÌNH ANH

Hình 1.1 Ban đô phân bé địa y Nigrovothelium tropicum trên thé giới [19} 5

Hình 2.1 Mau địa y N trepicum được thu tại thành phố Quang Ngai, tinh Quang

II TU 12

Hình 2.2 Sơ đồ mô tả quy trình phân lập nắm cộng sinh địa y - 14

Hình 2.3 Sơ đồ mô tả quy trình tạo cao ethyl acaetate từ nắm cộng sinh địa y 15

Hình 2.4 Sơ đồ mô tả quy trình khảo sát hoạt tinh kháng khuân 16Hinh 3.1 Khuan lac N tropicum sau 2 tuần nuôi cay ——— 18

Hình 3.2 Khuan lạc N øpicwm sau 10 tuần nuôi cấy - cccccscccscccc2 18

Hình 3.3 Kết quả nuôi nam N /opicum trên môi trường MY10 - 19

Hình 3.4 Kết quả nuôi cấy nam N fropicum trên môi trường S4 20 Hình 3.5 Kết quả nuôi cay nam N tropicum trên môi trường PDA 21 Hình 3.6 Đồ thị thé hiện sự tương quan giữa tỷ lệ ức chế enzyme a-glucosidase với

logarit nồng độ cao từ sinh khôi nắm được nuôi ở môi trường PDA 6 tuần 27

Hình 3.7 Đồ thị thể hiện sự tương quan giữa tỷ lệ ức chế enzyme a-glucosidase với

logarit nồng độ cao từ sinh khối nắm được nuôi ở môi trường PDA 12 tuần 28

Hình 3.8 Đồ thị thé hiện sự tương quan giữa tỷ lệ ức chế enzyme a-glucosidase với logarit nòng độ cao từ sinh khối nắm được nuôi ở môi trường S4 12 tuần 30

Hình 3.9 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn đối với S aureus của cao ethyl

acetate thu được tử nắm cộng sinh địa y FOĐÍCHUH àà-SàccSieeeieeesieeerree 31

Hình 3.10 Kết qua khảo sát hoạt tinh kháng khuẩn S aureus của cao ethyl acctate

thu được từ nắm cộng sinh địa y N rropicum trên môi trường MY10 PL2

Hình 3.11 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn S aureus của cao ethyl acetatethu được từ nắm cộng sinh địa y N /opicum trên môi trường PDA PL3

Hình 3.12 Kết qua khảo sát hoạt tính kháng khuẩn S aureus của cao ethyl acetate

thu được từ nắm cộng sinh địa y N /opicum trên môi trường S4 PL4

DANH MUC BANG Bang 2.1 Danh sách thiết bị đùng trong đề tai cc ccseecssecssscessessscssecstsssssseesnesneensees 12 Bang 2.2 Danh sách hóa chất được sử dụng trong đề tài -2-©-22-5csc552zs> 13 Bảng 2.3 Thanh phan môi trường nuôi cay nam cộng sinh địa y 14

Bang 3.1 Bang trình bay sinh khối cao chiết ethyl acetate của nam cộng sinh địa y N

tropieum ở ba môi trường nuôi cây khác nhau 5¿55cccccccccccccccceccce - 22

Bảng 3.2 Tỉ lệ ức chế enzyme œ-glucosidase của cao chiết ethyl acetate của nam cộng

nuôi ở môi trường S4 trong 12 tuần - 2 2+ 2+2 ES222131221172110 1012111211211 2 29

Bang 3.6 Hoạt tính kháng khuẩn của cao ethyl acetate thu được từ nắm cộng sinh địa

y ẤN tropicum Abi với vi khuẩn S @11r€WS, c2 ch H012 1 1 2 ye 32

Bang 3.7 Kết quả khảo sát hoạt tinh kháng khaaum S aureus của các mẫu cao ethyl

acetate thu được tir nắm cộng sinh địa V N fPO/ĐÍCHỨH c se ccccvs<veeeerrererce PLI

Bảng 3.8 Kết quả phân tích tương quan phi tuyến tính giữa tỷ lệ ức chế enzyme

ơ-glucosidase với nông độ cao chiết thu được từ sinh khối nam ở môi trường PDA 6

Bảng 3.9 Kết quả phân tích tương quan phi tuyến tính giữa tỷ lệ ức chế enzyme glucosidase với nồng độ cao chiết thu được từ sinh khối nam ở môi trường PDA 12

ơ-Bang 3.10 Kết qua phân tích tương quan phi tuyến tính giữa tỷ lệ ức chế enzyme

a-glucosidase với nông độ cao chiết thu được từ sinh khối nam ở môi trường S4 12

MO DAU

1 Lý do chon đề tài

Địa y là dạng sống cộng sinh của nam (mycobiont) với một (hoặc một số) tảo

hay vi khuẩn lam có kha năng quang hợp (photobiont), đóng vai trò quan trọng trong

quá trình sinh địa hóa [1] Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rang, địa y có khả năng tạo ra các chất chuyên hóa thứ cấp hiểm hoặc không thé tìm thấy ở sinh vật khác [2], [3].

Các chất chuyên hóa thứ cap thường chiếm từ 0,1% đến 50% khối lượng khô của tán

và phan lớn trong số đó được tạo ra bởi nắm cộng sinh địa y [4] Với sự phát triển của

kỹ thuật hiện đại, địa y khiến giới khoa học cảng bat ngờ hon với những hoạt tính

sinh học do hợp chất chuyên hóa thứ cap ma chúng sản xuất, mở ra hướng đi mới day tiềm năng cho ngành y dược bởi tính ứng dụng cao của những hợp chất đó trong việc

ức chế nhiều loại enzyme

Việc ức chế enzyme được ghi nhận là hoạt tính có giá trị trong điều trị của địa y

bởi hoạt động mat kiểm soát của một số enzyme tạo ra các bệnh ảnh hưởng nghiêm

trọng đến đời sông con người, ví dụ như enzyme a-glucosidase Hiện nay, việc ức chế

hoạt động của enzyme a-glucosidase dang là một phương hướng điều trị bệnh đáitháo đường tuýp 2, một trong những bệnh không lây truyền phô biến nhất thế giới

Pai tháo đường dan phát nhiều biến chứng đe doa sức khỏe và tính mạng người bệnh

như: nhiễm toan ceton, các biến chứng liên quan đến mắt, thận nhôi mau cơ tim, độtquy [Š] Thuốc điều trị đái tháo đường tuýp 2 đường uống được sử dụng phô biến

trong lâm sàng là acarbose, miglitol và voglibose với phương hướng chính là ức chếa-glucosidase ở vi nhung mao ruột non Song, tác dụng phụ của các loại thuốc này

ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống người dùng như chán ăn, ảnh hưởng đến chức năng của gan, buôn nôn, tiêu chảy, nhiễm lactic acid [6], [7] Với những ảnh hưởng tiêu cực đó, nhiều công trình nghiên cứu đã được triển khai nhằm tìm kiếm các hợp

chất mới có it tác dụng phụ hơn trong việc ức chế enzyme a-glucosidase và dia y là

một đối tượng nghiên cứu day tiềm năng trong số những đôi tượng có nguồn gốc tự nhiên.

Bên cạnh tiềm năng điều trị đái tháo đường tuýp 2, địa y còn nôi bật với khả

năng tiêu điệt vi khuẩn khi tinh trạng kháng penicillin - thuốc kháng sinh phố biến

hiện nay - ở vi khuân đang ngày càng trở nên pho biến và trở thành vấn đề toàn cầu,

đòi hỏi những hợp chất khác đề điều trị hiệu quả các bệnh liên quan đến nhiễm khuẩn

Cho đến hiện tại đã có nhiều đề tài công bố hoạt tính ức chế enzyme

ơ-glucosidase và kháng khuẩn mạnh của các loài địa y, chứng minh tiềm năng to lớn

của dia y trong ứng dụng y học [3] Tuy nhiên đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nao

khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất chuyên hóa thứ cấp của nam cộng sinh địa y

Nigrovothelium tropicum Dé tìm hiểu thêm về hoạt tính sinh học của nắm cộng sinhđịa y này, dé tài Phân lập và khảo sát hoạt tính sinh học của nam cộng sinh địa y

Nigrovothelium tropicum được thực hiện.

2 Mục đích nghiên cứu

Phân lập và khảo sát hoạt tinh sinh học của nam cộng sinh từ địa y N opiecum.

3 Đối tượng nghiên cứu

Nắm cộng sinh địa y N tropicum.

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Phân lập nam từ địa y N tropicum.

- Nuôi nắm địa y đã phân lập được trên môi trường MY 10, PDA và S4.

- Thu sinh khối nắm N tropicum ở sau khoảng thời gian 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần,

10 tuần va 12 tuân sau khi nuôi cấy

- Tạo cao ethyl acetate từ sinh khối nam

- Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme a-glucosidase và hoạt tính kháng khuẩn đối

với Staphylococcus aureus của cao chiết ethyl acetate.

5 Pham vi nghiên cứu

Nghiên cứu chi tiến hành phân lập nam cộng sinh Nigrovothelium tropicum từ

01 mẫu địa y thu ở thành pho Quang Ngãi, tinh Quang Ngãi (15.1042, 108.8060) vào tháng 4 năm 2023 và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus và hoạt

tính ức chế enzyme a-glucosidase của cao ethyl acetate từ sinh khối nam cộng sinh

địa y N tropicum.

6 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: 6 tháng (10/2023 — 3/2024)

Địa điểm: Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh hóa — Vi

sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố H6 Chí Minh

trong giới nam theo quan điểm tiến hóa [2] [8] Song, địa y vẫn nhạy cảm với sự thay

doi đột ngột của thời tiết nên chúng thường được xem là một nhân tố dé các nhà

nghiên cứu đánh giá mức độ ô nhiễm trong khu vực.

Có khoảng 100 loài vi sinh vật quang hợp cộng sinh với 13.500 loải nam hình thành nên địa y, trong đó có hơn 98% nam thuộc ngành Ascomycota, số còn lại là

Basidiomycota [9], [10] Tên của địa y tương ứng với loài nam cộng sinh của chúng

[8].

Ở địa y, nam đám nhiệm vai trò hấp thụ nước và khoáng chất cho tản, bên cạnh

đó còn tạo ra nhiều chất chuyền hóa thứ cap trong quá trình sinh trưởng giúp bảo vệtảo cộng sinh khỏi ánh nắng gay gắt [3]; cụ thé là từ các con đường acetylpolymalonyl, mevalonic và shikimate Cho đến năm 2020, hon 1.000 chất chuyên hóa

thứ cấp thu được từ địa y trong các công trình nghiên cứu Người ta đã phát hiện nhiều

chất depside, depsidone, dibenzofura, quinon, chromone, carotenoid, polysaccharide,

monosaccharide, acid béo, chi được tìm thay trong địa y [2] [3] Khoảng 100 loài

địa y đã được nghiên cứu về thành phần polysaccharide trong hợp chất chuyên hóathứ cấp, phát hiện có ba loại cau trúc polysaccharide chính bao gồm: a-glucan, [-

glucan và galactomannan [II], [12], [13] Trong đó polysaccharide thuộc loại

J-glucan va galactomannan đã được cho là có ý nghĩa trong phân loại hóa học [11],

[14], [15] Điều này được chứng minh qua một số công trình nghiên cứu tách nắm và

tảo của địa y dé nuôi cay riêng biệt, người ta phát hiện nắm cộng sinh tạo ra các hợp

chất chuyển hóa thứ cấp — polysaccharide - tương tự như địa y, trong khi tảo thi tạo

ra những loại khác [15] Việc sản xuất các chất chuyên hóa thứ cấp ở địa y chịu ảnh

hưởng bởi các yếu tố môi trường bao gồm ánh sáng, tác động của tia UV, độ cao, nhiệt

độ và mùa [16] Bên cạnh môi trường thì tudi của địa y cũng đóng vai trò quan trọng trong khả năng sản xuất các hợp chất chuyên hóa thứ cấp.

các loại hoạt tính sinh học khác.

1.2 Tổng quan về nắm Nigrovothelium tropicum

Phân loại sinh học Giới: Fungi

Hình 1.1 Bản đồ phân bố địa y Nigrovothelium tropicum trên thé giới [19]

Địa y V rropicum, thuộc chỉ Nigrovothelium, họ Trypetheliaceae, được cho là

có quan hệ gan gũi với loài 7rypethelium tropicum Địa y N tropicum được Robert

Liicking va cộng sự phân loại vào nam 2016, được xem 1a loài điển hình của chỉ

Nigrovothelium với các điểm đặc trưng như sau:

Tan địa y N.tropicum có lớp vỏ cứng bao quanh bên ngoài, màu xanh 6 liu hoặc

nau 6 liu, đường kính <10 em, bên trên có các hạt như mụn cóc; trên vỏ có thé thấy

lớp sun dày, lớp vo photobiont và phân tủy day.

Thể quả mọc đơn độc nhưng day đặc và thường hợp lại với nhau, trên mỗi thẻ

quả có một lỗ nhỏ; đường kính thê quả từ 0.2-0.3 mm, không cuống, cao < 0.25 mm,

lồi lên bề mặt tản, màu đen, vùng trung tâm có màu xám; miệng của túi bào tử có thê

nhìn thấy dưới dạng những cham đen nhỏ Phần đề thé quả (excipulum) day 50 — 100

tim, bị carbon hóa Có § bào tử hình thoi trong mỗi túi bào tử Hiện vẫn chưa có

nghiên cứu nào xác định thành phan các chất chuyên hóa thứ cấp của nam cộng sinh

1.3 Tổng quan về hoạt tính sinh học

1.3.1 Tổng quan về hoạt tinh ức chế enzyme a-glucosidase

1.3.1.1 Tổng quan về enzyme a-glueosidase Enzyme, bản chat là protein, có tính chọn lọc cao đối với chất nén, hiện điện

trong mọi tế bào sinh vật, đóng vai trò xúc tác cho các phản ứng sinh học Hầu như

tất cả phản ứng trong cơ thể chúng ta đều có sự tham gia của enzyme và các phản ứng

được xúc tác bởi chúng thường có tốc độ nhanh hơn nhiều so với khi không có

Enzyme a-glucosidase (EC 3.2.1.20, maltase) là một enzyme thuộc nhóm

glycosidase có khả năng thủy phân liên kết 1,4-a-glycoside và thủy phân

oligosaccharide và giải phóng a-D-glucose tự do, làm tang lượng đường trong máu

[22], [23] Enzyme này được tìm thay nhiều trong ruột non và còn được biết đến với

tên gọi maltase, glucoinvertase, glocosidosurase, maltase-glucoamylase,

d-glucopyranosidase, glucosidoinvertase, D-glucosidase, glucosidase hydrolase,

a-1,4-glucosidase.

Sau khi enzyme œ-glucosidase tạo ra các đường đơn từ thức ăn đã được nạp vào

cơ thẻ, insulin với bản chất là một loại hormone được sản xuất bởi tế bào beta của đảotụy sẽ thúc đây quá trình hấp thụ các đường đơn từ máu vào các tế bảo gan, mỡ và cơ

xương Ở các mô này, glucose được chuyên hóa thành glycogen như nguồn nănglượng dự trữ của cơ thể Tuy nhiên, những bệnh nhân mắc bệnh đái tháo đường tuýp

2 gặp tình trạng không thê sử dung insulin hoặc insulin không thé thực hiện chức nang

trong cơ thé Tình trạng này còn khiến cơ thé không thé nap insulin ngoại sinh, khiến

việc giảm hấp thu glucose trong cơ thé bằng các phương pháp can thiệp liên quan

cũng trở nên khó khăn Chính vi vậy, đường huyết của họ rất cao sau khi ăn do glucose

không được hấp thụ vào tế bảo [24]

1.3.1.2 Tổng quan về bệnh đái tháo đường tuýp 2 và các biến chứng của bệnhDai tháo đường (DTD) là một trong những bệnh không lây nhiễm phổ biến trêntoàn cầu Trên toàn thé giới có 415 triệu người mắc bệnh PTD và ước tính có khoảng

193 triệu người mắc bệnh DTD chưa được chan đoán Bệnh DTD có hai thé phé biến Nguyên nhân của bệnh DTD tuýp | là do cơ thê không thê tự sản xuất insulin vì tế bao beta của tụy bị phá hủy, chịu ảnh hưởng bởi tính di truyền Bệnh PTD tuýp 2,

chiếm hơn 90% số bệnh nhân mắc bệnh DTD, bị gây ra bởi tình trang khang insulin

Bệnh DTD tuýp 2 dẫn đến các biến chứng vi mach và mạch máu lớn, gây đau khô sâu

sắc vé tâm lý và thé chat cho cả bệnh nhân và người chăm sóc, đồng thời đặt gánh

nặng lớn lên hệ thông chăm sóc sức khỏe [24], [24].

Theo Liên đoàn ĐTĐ Quốc tế (IDF), đến năm 2019, toàn thế giới đã có 463

triệu người trong độ tuôi 20 - 79 bị mắc bệnh DTD, dự kiến sẽ dat 578 triệu người

vào năm 2030 và 700 triệu người vào năm 2045 Tuy nhiên, gần một nửa trong số đó không được chân đoán (46,5%), tỷ lệ nay ở khu vực Tây Thái Bình Dương là 52,1%.

Chỉ xét riêng nhóm tuôi từ 20 - 79, ước tín đã có hơn 4 triệu người tử vong vì các

nguyên nhân liên quan đến DTD trong năm 2019 [25] Ngoài ra, còn có khoảng 541

triệu người bị rỗi loạn dung nap glucose, trình trạng lượng đường glucose trong máu

tăng cao hơn so với mức bình thường nhưng lại thấp hơn so với người bị bệnh DTD.

Bên cạnh đó sé lượng trẻ em và thanh thiếu niên (dưới 19 tuôi) sông chung với bệnh

DTD cũng đang tăng lên hang năm [26].

Bệnh DTD tuýp 2 có thé gây ra cho người bệnh các biển chứng nguy hiểm danđến tử vong cụ thé là nhiễm toan ceton, các biến chứng liên quan đến mắt, thận, nhôimáu cơ tim va đột quy do lượng đường huyết tăng cao làm thoái hóa mạch máu [27]

Sự tôn thương trên hệ thông vi mạch có thé lam giảm khả nang chữa trị vết thương

của cơ thé, thậm chí tổn thương nhỏ trên đa lành cũng có khả năng phát triển thànhloét sâu hơn và dé bị nhiễm khuan, đặc biệt ở chỉ đưới Còn tồn thương ở hệ thốngmạch máu lớn có thé gây xơ vữa động mach, dẫn đến tinh trạng thiếu máu cục bộ,

hoặc rối loạn chức năng miễn dịch [24].

Vi tỷ lệ mắc bệnh DTD ngày cảng tăng cũng như các biến chứng của nó, năm

2013, IDF đã dé xuất các chiến lược hữu ich dé điều trị bệnh DTD, tập trung vào việc

phát hiện và điều trị tình trạng tăng đường huyết sau khi ăn Bên cạnh các biện phápkhông dùng thuốc (tự kiểm soát đường huyết và chế độ ăn kiêng), các loại thuốc như

thuốc tác động vào insulin trong thời gian ngắn (sulfonylurea và glinide), thuốc ức

chế enzyme glucosidase (AGIs), insulin va các liệu pháp dựa trên incretin cũng đượcứng dụng lâm sản nhằm tác động lên mức đường huyết tăng lên sau bữa ăn

1.3.1.3 Các chất ức chế enzyme a-glucosidase Trong điều trị lâm sàng, thuốc điều trị bệnh DTD thường hướng đến mục tiêu

làm giảm lượng đường trong máu thông qua việc trì hoãn quá trình tiêu hóa và hấp

thu carbohydrate từ thức ăn, giảm sự gia tăng nồng độ glucose trong máu sau bữa ăn.

Cơ chế tác động của AGIs, một nhóm thuốc điều trị DTD phê biến hiện nay, được

cho là chat ức chế cạnh tranh với enzyme a-glucosidase ở vi nhung mao ruột non, có nhiệm vụ phân giải các đường đa thành đường đơn Ba loại AGIs đường uống phô biến hiện nay là acarbose, miglitol va voglibose đều hoạt động theo cách nảy Trong

số ba loại AGIs đó, acarbose có hiệu quả nhất trong việc ức chế glucoamylase,

Sucrase, maltase và dextranase Trong khi miglitol có kha năng ức chế sự hoạt động

của sucrase va maltase hơn acarbose và cũng hoạt động trên isomaltase, nhưng lại

không có tác dụng với ơ-amylase Voglibose được phân lập từ môi trường nuôi cấyStreptomyces, đây là loại thuốc ức chế enzyme phân giải đường mạnh với đối tượng

chủ yếu là œ-amylase Cho đến hiện tai, ba loại thuốc nay vẫn đóng vai trò quan trọng

trong liệu trình điều trị ĐTĐ, tùy vào đặc điểm ca bệnh và nhu cầu của người bệnh

Tuy nhiên, việc sử dụng AGIs thường xuyên trong thời gian dài đã mang lại

nhiều tác dụng phụ không mong muốn cho bệnh nhân Ví dụ như chán ăn, buồn nôn,tiêu chảy, nhiễm lactic acid, [28] Dé gia tăng hiệu quả điều trị lên mức tối ưu với

những tác dụng phụ bị hạn ché tối thiêu, nhiều công trình nghiên cứu tìm kiếm chat

ức chế enzyme a-glucosidase được tiên hành Trong sô những nguôn chat ức che

enzyme a-glucosidase tự nhiên, địa y đang là một đối tượng đây tiềm năng dé nghiên

cứu [29].

1.3.2 Tổng quan về hoạt tính kháng khuẩn

1.3.2.1 Tổng quan về vi khuẩn Staphyloeoeeus aureus

S aureus là một loại tụ khuân cau Gram dương, thuộc ho Bacillales Khuan lac

S aureus thường có màu vàng, phát triển trong điều kiện hiểu khí hoặc ki khí khôngbat buộc ở nhiệt độ 18°C - 40°C [30]

S aureus (bao gồm cả các chủng kháng thuốc như S.aureus kháng methicillin)

được tìm thay trên da và màng nhay, con người được xem là 6 chứa chính của chúng[31] Mặc dù S aureus thường ton tại như một phần của hệ vi sinh vật cộng sinh ở

người nhưng ở điều kiện nhất định, nó cũng có thẻ trở thành mam bệnh cơ hội, gây ra nhiêu loại bệnh từ nhiễm trùng đa nhẹ, chăng hạn như mụn nhot, chốc lở, viêm mô tế bảo, viêm nang lông, nhot, hội chứng bỏng da và áp xe đến các bệnh đe doa tính

mạng như viêm phôi, viêm mang não, viêm tủy xương, viêm nội tâm mạc, hội chứngsốc nhiễm độc, nhiễm khuẩn huyết và nhiễm trùng huyết [32]

S aureus là một trong những mầm bệnh hang đầu gây tử vong liên quan đến

kháng kháng sinh Sự xuất hiện của các chủng kháng kháng sinh trở thành vẫn đề toàn cau trong y học lâm sàng Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu và phát triển nhưng vẫn

chưa có vaccine nao được phê duyệt sử dụng lâm sàng dé chống lại S aureus [32]

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Dia y là đôi tượng các nhà sinh thái va phân loại học chú ý nghiên cứu từ lau.

Với nhiều tiềm năng sinh học chưa được khai thác, ngày nay, nghiên cứu các chất chuyên hóa thứ cấp cia địa y dần trở thành một xu hướng mới của khoa học nhằm tim ra các nguồn dược liệu mới cho y học.

Ve các nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của địa y, các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước đã có nhiều thành tựu nồi bật.

Trong nghiên cứu của Lauinger và cộng sự vào năm 2013 [33], các tác giả đã so

sánh khá năng ức chế của chiết xuất địa y vao giai đoạn xâm nhập trong gan của

Plasmodium berghei, ký sinh trùng sốt rét, với (+)-usnic, vulpic, evernic acid và psoromic acid Nghiên cứu phát hiện usnic acid thẻ hiện hoạt động ở giai đoạn nhiễm trùng gan và độ đặc hiệu ở giai đoạn cao nhất (giai đoạn nhiễm trùng gan có ICso là

2,3 uM, giai đoạn máu có ICso là 47,3 uM) Các tác giả đã báo cáo rằng 3 hợp chat

khác đã ức chế ít nhất 01 enzyme (beta-ketoacyl-ACP reductase, enoyl-ACP

reductase, betahydroxyacyl-ACP dehydratase) từ con đường sinh tông hợp acid béo (FAS-II) của trùng sốt rét Ngoài ra, các hợp chat này cũng được đánh giá dựa trên

toàn bộ tế bào và các chất tương đồng Fabl của S aureus, Mycobacterium tuberculosis

va Escherichia coli Theo các nghiên cứu in vitro, các hợp chất hoạt động gián tiếp

bằng cách gắn vào các vị trí di lập thê trên bê mặt protein của enzyme FAS-H Ba danxuất usnic acid và muối kim loại của chúng đã được tổng hợp và thử nghiệm trên 10

loại vi sinh vật gây bệnh, các nhà nghiên cứu báo cáo rằng các dan xuất usnic acid và phức hợp kim loại có tác dụng kháng khuan mạnh.

Năm 2016, tác dụng điều trị của usnic acid, một trong những chất chuyên hóa địa y được nghiên cứu rộng rai nhất và hiện diện trong các chi địa y Alectoria, Cladonia, Evernia, Lecanora, Ramalina và Usnea, chong lai bệnh cau trùng đã được

thử nghiệm trên ga thịt và so sánh với tác dụng cua toltrazuril Gũven và cộng sự đã

báo cáo rằng liều usnic acid 100 mg/kg thể hiện hoạt tính kháng cầu trùng tốt hơn so

với toltrazuril [34].

Trong một nghiên cứu khác, Shrestha và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng kháng

sinh của 34 chiết xuất địa y ở Bắc Mỹ trong ức chế vi khuẩn S aureus, Pseudomonasaeruginosa, S aureus khang methicillin và vi khuẩn E coli Chiết xuất acetone của

Vulpicida canadensis, Letharia vulpina và L columbiana đã được chứng minh có khả

nang ức chế E coli, Ngoại trừ L pulmonaria, tat cả các chiết xuất địa y đều có tácdung ức chế vi khuẩn Gram đương với giá trị MIC nằm trong khoảng 3,9 - 500 pg/mL

[35].

Năm 2018, Tatipamula và cộng sự đã khảo sát khả năng ức chế enzyme glucosidase của cao ethyl acetate được tách chiết từ địa y Parmotrema tinctorum,

a-khang định rang P tinctorum có kha năng kiêm soát bệnh DTD [36]

Năm 2020, Dương Thúc Huy và các cộng sự đã tiền hành nghiên cứu điều tra

các hợp chat hóa học loài địa y Parmotrema tsavoense, phân lập thành công 5

depsidone mới Trong đó có 3 hợp chất được đánh giá cao về khả năng ức chế

a-glucosidase với giá trị ICso nằm trong khoảng từ 10,7 đến 17,6 4M, thấp hơn nhiều

so với acarbose đối chứng dương (ICso 449 4M) [37] Năm 2021, một nghiên cứu

khác của Dương Thúc Huy đã tìm thấy C43-spiroterpenoid mới - reticulatin (1), được

phan lập từ địa y P reticulatum, năm hợp chất được phân lập từ đó bao gồm: zeorin

(2), leucotylin (3), lupeol (4), betulinic acid (5) va dihydroreynosin(6) Tat cả các hợp

chất được đánh giá là có khả năng ức chế a-glucosidase Hợp chất 1 cho thay sự ức

chế mạnh nhất, với giá trị [Cso là 3,90 uM, thấp hơn nhiều so với đối chứng dương

tính acarbose (ICso 165 HM) [38].

Gan day, năm 2022, tai Việt Nam, Đỗ Thanh Hùng va đồng nghiệp đã khảo sat

các hợp chất đơn chất từ nguồn địa y được phân lập và xác định trước đó:

3,5-dihydroxybenzoic acid (1), 3,5-dihydroxybenzoate methyl (2),

3,S-dihydroxy-4-methylbenzoic acid (3) 3,5-dihydroxy-4-methoxylbenzoic acid (4),

3-hydroxyorcinol (5), atranol (6), methyl hematommate (7) va methyl] B-orsellinate (8),

methyl orsellinate (9) và D-montagnetol (10) đã brom hóa Quá trình brom hóa được

áp dụng cho các hợp chất (8), (9), (10) sử dung thuốc thử NaBr/H2O2, thu được sản

pham methyl 5-bromo-f-orsellinate (8a), methyl 3,5-dibromo-orsellinate (9a),

3-bromo-D-montagnetol (10a) và 3,5-di3-bromo-D-montagnetol (10b) Các hợp chất

được đánh giá về khả năng ức chế œ-glucosidase và hoạt tính kháng khuẩn chống lại

vi khuân gây bệnh, Enterococcus faecium kháng kháng sinh, S aureus và Acinetobacter baumannii Hợp chat (4) cho thay khả năng ức chế a-glucosidase mạnh

hơn các hợp chất khác có giá trị ICso là 24,0 pg/mL Hợp chat (9a) thé hiện hoạt tinh

đáng chú ý ức chế S aureus với giá trị MIC là 4 pg/mL [39].

Dau tháng 9 năm 2022, Nguyễn Thị Hoài Thu và cộng sự đã nghiên cứu địa yParmotrema tsavoense và phân lập được chất mới là Parmosidone K có hoạt tính ứcchế enzyme œ-glueosidase với giá trị ICs» là 3,12 uM [40]

Tuy nhiên, cho đến đầu năm 2024 vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào khảosát hoạt tính oxy hóa, kháng khuẩn hay ức chế enzyme ơ-glucosidase của các hợpchất chuyên hóa thứ cấp thu được từ địa y NV tropicum

CHƯƠNG 2 VẶT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Nắm cộng sinh địa y được phân lập từ mẫu địa y Nigrovothelium tropicum thu tại thành phó Quang Ngãi, tinh Quang Ngãi (15.1042N, 108.8060E) vào tháng 4 năm 2023.

Hình 2.1 Mẫu địa y ¿V tropicum được thu tại thành phố Quang Ngãi,

tinh Quang Ngãi

2.2 Thiết bị và dung cu

Dé tai có sử dụng những những thiết bị và dụng cụ như sau:

Bảng 2.1 Danh sách thiết bị dùng trong đề tài

Máy cô quay chân không Heidolph

Cân phan tích điện tr Sartorius

12 | Máy đọc đĩa BMG L.abtech

Các hoá chất sử dụng trong đề tài được trình bay trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Danh sách hóa chất được sử dụng trong đề tài

Dimethyl sulfoxide VWR International Pháp

Guangdong Guanghua Trung Quéc

2.3.1 Phương pháp phân lập nắm cộng sinh địa y

Quy trình phân lập nắm cộng sinh địa y được tham khảo từ tài liệu [41] trình

bày trong hình 2.2.

Tach quả thế chứa

bào tử năm cộng sinh

Nam cộng sinh với địa y ra khỏi địa v

hằng dao m5 và để lên

lim kính tiệt tròng

Nuôi cấy trong tối với

nhiệt độ 18°C (+2|

Nuéi cấy trong Hút bằng micropipette

môi trường MYA

bằng nước cất và dé khô tự nhiên trong tủ cay Qua thé được tách ra khỏi địa y bang

dao tiệt trùng, cắt thành lát mỏng va dé lên lam kính đã tiệt trùng; soi trên kính hiển

vi dé xác định bảo tử nam Sau khi được xác định, bao tử nắm cộng sinh địa y được hút bằng micropipette và chuyên lên các đĩa môi trường MYA Các đĩa này được ủ trong tdi ở nhiệt độ 18 + 1°C.

2.3.2 Phương pháp nuôi nắm cộng sinh địa y

Nam địa y sau khi được phân lập, được chuyên sang nuôi cấy trong tôi với nhiệt

độ 18 + 1°C trên các môi trường có thành phan như trong Bảng 2.3.

Bảng 2.3 Thành phần môi trường nuôi cấy nắm cộng sinh địa y

ae Malt-yeast Agar Khoai tay Sabouraud Tên môi '

trata 10% sucrose 4% D-glucose

Cô đặc bằng máy cô quay

ở 40°C

Hình 2.3 Sơ đồ mô tả quy trình tạo cao ethyl acaetate từ nam cộng sinh địa y

Sau khi được loại bỏ khỏi thạch, nắm cộng sinh địa y được sây khô trong tủ sây

ở nhiệt độ 45°C và nghiên thành bột sau khi khô hoàn toàn Phan nam đã xay nhuyễn được mang đi cân, ghi nhận sinh khối nắm Tiếp theo đó, sinh khối nắm được ngâm trong ethyl acetate với tỷ lệ 1:1; hỗn hợp được lọc qua giấy lọc và cô đặc bang máy

cô quay ở 40°C Sau khi đã bay hơi dung môi hoàn toàn, hỗn hợp được mang đi cân

dé ghi nhận khối lượng cao.

2.3.4 Phương pháp khảo sát hoạt tinh sinh học

2.3.4.1 Hoạt tinh ức chế enzyme a-glucosidaseNguyên tắc của phương pháp được dựa theo cơ chế hoạt động của enzyme ơ-glucosidase Enzyme a-glucosidase phân giải cơ chất pNPG thành p-nitrophenol, taomàu vàng cho hỗn hợp sau phản ứng Khả nang hoạt động của chất ức chế enzyme a-

glucosidase tỷ lệ nghịch với lượng p-nitrophenol, như vậy nghĩa là sau phản ứng màu

vàng của hỗn hợp cảng nhạt chứng tỏ kha nang ức chế enzyme a-glucosidase của mẫu

là 6,9 Dau tiên, cao thé ethyl acetate từ nam cộng sinh dia y được pha loãng trong

DMSO thành néng độ 200 pg/mL và thêm vào mỗi dia của dia 96 giếng 50 WL; sau

đó mỗi giếng được thêm 40 uL enzyme và ủ ở 37°C trong 20 phút Sau 20 phút, hỗn

hợp được bỗ sung 40 pL cơ chất và tiếp tục ủ trong 20 phút ở 37°C dé phản ứng diễn

ra Cuối củng, phản ứng được kết thúc bang cách cách thêm 130 pL Na;CO:

0,2M Hoạt tinh ức chế enzyme a-glucosidase được định lượng bằng cách đo độ hap

thụ ở bước sóng 405 nm Tất cá các mẫu được phân tích ba lần ở 10 nòng độ khác

nhau xung quanh giá trị ICso.

Tỷ lệ phần trăm ức chế (%) được tính theo phương trình:

OD miu

OD đối cae x 100

Phan tram tre ché (%)=(1

-Trong đó, OD mẫu là giá tri ODsos của hỗn hợp phan ứng khi có chat ức chế,

OD đổi chứng là giá trị OD4os của hỗn hợp phản ứng khi không có chất ức chẻ.

2.3.4.2 Hoạt tính kháng khuẩnPhương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuan của mẫu nắm phân lập được dùngtrong đẻ tài là phương pháp khoanh giấy khuếch tán trong thạch theo Kirby-Bauer

được tham khảo từ tài liệu [44] và [45], được mô tả trong hình 2.4.

Chuẩn bị đĩa môi trường MHA

pha theo đúng hướng dẫn

Pha hỗn dịch vi khuấn

10° vi khuấn/mL

Trải hỗn dịch vi khuẩn lên bề mặt thạch

Đặt khoanh giấy thấm 1 mg cao chiết ethyl

acetate lên thạch đĩa thạch được ủ ở 37 + 2 °C trong vòng 16 = 18 giờ

Hình 2.4 Sơ đồ mô tả quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Quy trình khảo sát hoạt tính khang khuân chủng S aureus được tiến hành trong

đề tài như sau:

- Chuan bị đĩa thạch Mueller-Hinton (MHA): Các thành phần môi trường đượccân một cách chính xác theo hướng dẫn và hòa tan vào nước cất vô trùng, đun sôi,kiểm tra pH trong khoảng từ 7,2 - 7.4; cuối cùng, môi trường được hap tiệt trùng Sau

khi hap xong, trong lúc còn nóng, môi trường được đô vào đĩa Petri vô trùng với độ

day khoảng 4 mm và đợi đông đặc.

- Chuan bị chủng vi khuẩn S aureus và pha hỗn dịch vi khuẩn nông độ 10° vikhuân/mL

- Trải vi khuẩn lên đĩa thạch: huyền phù chứa vi khuẩn được trải đều lên bề mặt môi trường MHA, dé khô mặt các đĩa thạch bằng cách đặt chúng vào trong tủ ấm 15

phút trước khi đặt giây thắm hợp chất chiết xuất từ địa y

- Các khoanh giấy thấm chứa 1 mg hợp chất chiết xuất từ địa y được đặt lên mặt

thạch (mỗi dia có từ | đến 3 khoanh giấy): các đĩa thạch sau đó được lật ngược và ủ

ở 35 + 2°C trong vòng 16 - 18 giờ.

- Sau khi ủ, các đĩa thạch được lấy ra khỏi tủ ấm, hoạt tính kháng khuẩn được

xác định bằng cách đo đường kính vòng vô khuan tai các vị trí trong ứng của khoanh giấy (dùng thước đo từ mặt sau cia đĩa va không được mở nắp).

Thí nghiệm sử dụng mẫu đối chứng âm là DMSO.

CHƯƠNG 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết qua phan lập nắm cộng sinh địa y Nigrovothelium tropicum

Sau khi chuyên bao tử lên đĩa môi trường MYA, ủ ở 18°C trong 2 tuần, khuân lạc nắm xuất biện có hình dạng chấm nhỏ màu trắng sữa, kích thước đường kính khoảng | - 2 mm (Hình 3.1).

Hình 3.1 Khuẩn lạc N tropicum sau 2 tuần nuôi cấy

Sau 8 tuần, khuân lạc nam phát triển thành ban cầu lôi lên khỏi bề mặt thạch,đường kính khoảng 0,7 cm, màu vàng nhạt Trên bề mặt khuan lạc xuất hiện các lông

to trắng, xen kẽ giữa các tơ là những giọt dịch chiết li ti màu nâu (Hình 3.2)

Hình 3.2 Khuan lạc N tropicum sau 10 tuần nuôi cấyDia phân lập này được dùng làm mẫu nhân giống cho ba môi trường MY 10, S4

và PDA trong đề tài.

3.2 Kết quả nuôi cấy nắm N tropicum

3.2.1 Két quả nuôi nắm N tropicum ở môi trường MY10

Sau 4 tuần sinh trưởng trong môi trường MY 10, khuan lạc nam N trepicum đãbám chặt vào thạch, lồi lên trên bền mặt môi trường; vỏ nắm có màu nâu đến nâu đen,viên bao quanh màu trắng, đường kính khoảng 1,1 cm; các giọt dịch chiết đã xuất

hiện nhưng ít và nhỏ, rat khó quan sát Đến tuần thứ 6, đường kính nam tăng lên 1,3

- 1,4 em; các sợi nam màu trắng xuất hiện, bao phủ toàn bộ bề mặt khuân lạc, giọtdich chiết màu vàng đến nâu nhạt xuất hiện nhiều hơn, to hơn và dễ quan sát hơn Ở

tuần 8, vỏ của khuẩn lạc chuyển màu sang nâu đen, đường kính từ 1,8 — 2,0 em; sợi

tơ xuất hiện vào hai tuần trước bat đầu giả đi, giọt chiết cũng có mau nâu đen, tràn ra

môi trường xung quanh.

MYIO 10 tuần MỸI0 12 tuânHình 3.3 Kết quả nuôi nắm XN fropicum trên môi trường MY10Soi nam đến tuần thứ 10 có thé quan sat rõ rang trên vỏ nắm, dịch chiết màu đen

hiết ra ngoài môi trường nhiều hon; lúc này đường kính khuẩn lạc không có thay đôi

lớn Ở tuần thứ 12, các sợi nam to lên, mọc day đặc trên vỏ khuân lạc, giọt chiết có

màu nâu đến đen; đường kính khuẩn lạc nằm trong khoảng 2,0 — 2,2 em

3.2.2 Kết qua nuôi cay nam N tropicum trên môi trường S4

Trong 4 tuần đầu sinh trưởng trên môi trường S4, khuân lạc nắm N tropicum cóđường kính khoảng 1,5 em; có nhiều lông mau nâu bao phủ khắp bề mặt khuẩn lạc;

giọt chiết đã xuất hiện, mang mau nâu đến nâu sam Đến tuần thứ 6, khuan lạc chuyểnsang màu nâu đen, đường kính hau như không thay đôi; giọt chiết cũng chuyển mau

nâu đen, có thé quan sát bằng mắt thường: môi trường SB quanh khuan lạc bắt đầuđôi sang mau vàng sam, khác với môi trường vàng nhạt ban đầu Ở tuần thứ 8, bề mặt