Nghiên cứu quy trình tinh sạch exopolysaccharide từ môi trường nuôi cấy ophiocordyceps sinensis bổ sung dầu ô liu và khảo sát hoạt tính sinh học của chúng

ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ “NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH EXOPOLYSACCHARIDE TỪ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY OPHIOCORDYCEPS SINENSIS BỔ SUNG DẦU Ơ LIU VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHÚNG” Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ Chủ nhiệm nhiệm vụ: ThS Lê Thị Thúy Hằng Thành phố Hồ Chí Minh - 2017 ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TRẺ CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ “NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH EXOPOLYSACCHARIDE TỪ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY OPHIOCORDYCEPS SINENSIS BỔ SUNG DẦU Ô LIU VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHÚNG” (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày 25/01/2018) Chủ tịch Hội đồng nghiệm thu Chủ nhiệm nhiệm vụ Lê Thị Thúy Hằng Cơ quan chủ trì nhiệm vụ Đồn Kim Thành Thành phố Hồ Chí Minh- 2017 THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc ., ngày tháng năm 200 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN I THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: Nghiên cứu quy trình tinh exopolysaccharide từ môi trường nuôi cấy Ophiocordyceps sinensis bổ sung dầu ô liu khảo sát hoạt tính sinh học chúng Thuộc: Chương trình/lĩnh vực (tên chương trình/lĩnh vực): Vườn ươm Sáng tạo Khoa học Công nghệ trẻ Chủ nhiệm nhiệm vụ: Họ tên: Lê Thị Thúy Hằng Ngày, tháng, năm sinh: 19/07/1986 Nam/ Nữ: Nữ Học hàm, học vị: Thạc Sỹ Chức danh khoa học: Chức vụ: Điện thoại: 0905 417 404 Fax: E-mail: hangltt@cntp.edu.vn Tên tổ chức công tác: Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm TP HCM Địa tổ chức: 140 Lê Trọng Tấn, p Tây Thạnh, Quận Tân Phú, TP HCM Địa nhà riêng: 111 Lô B, chung cư Tây Thạnh, p Tây Thạnh, Quận Tân Phú, TP HCM Tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm phát triển Khoa học trẻ Công nghệ Trẻ Điện thoại: 028.230.780 Địa chỉ: Số Phạm Ngọc Thạch, P Bến Nghé, Quận 1, TP HCM Họ tên thủ trưởng tổ chức: ĐOÀN KIM THÀNH Số tài khoản: 3713.0.1083277.00000 Kho bạc: Nhà nước Q1, TP HCM Tên quan chủ quản đề tài: II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng 6/ năm 2017 đến tháng 12/ năm 2017 - Thực tế thực hiện: từ tháng 1/năm 2017 đến tháng 12 /năm 2017 - Được gia hạn (nếu có): KHƠNG Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 80 tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học: 80 tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác: tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Số TT … Theo kế hoạch Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 08/2017 40 11/2017 24 Thực tế đạt Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 08/2017 40 11/2017 24 Ghi (Số đề nghị toán) c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đối với đề tài: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Trả công lao động (khoa học, phổ thông) Nguyên, vật liệu, lượng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa nhỏ Chi khác Tổng cộng Theo kế hoạch Tổng NSKH 47,5 32,5 Thực tế đạt Tổng NSKH 47,5 Nguồn khác 47,5 47,5 Nguồn khác 32,5 32,5 32,5 0 0 0 80 80 - Lý thay đổi (nếu có): Đối với dự án: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Thiết bị, máy móc mua Nhà xưởng xây dựng mới, cải tạo Theo kế hoạch Tổng NSKH Nguồn khác Thực tế đạt Tổng NSKH Nguồn khác Kinh phí hỗ trợ cơng nghệ Chi phí lao động Nguyên vật liệu, lượng Thuê thiết bị, nhà xưởng Khác Tổng cộng - Lý thay đổi (nếu có): Các văn hành q trình thực đề tài/dự án: (Liệt kê định, văn quan quản lý từ cơng đoạn xét duyệt, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực có); văn tổ chức chủ trì nhiệm vụ (đơn, kiến nghị điều chỉnh có) Số Số, thời gian ban TT hành văn Số 12/2017/HĐKHCN-VƯ, 30/6/2017 22/8/2017 … Tên văn Ghi Hợp đồng thuê khoán Thẩm tra toán năm 2017 Đợt Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: Số TT Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh Tên tổ chức tham gia thực Nội dung tham gia chủ yếu Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, không 10 người kể chủ nhiệm) Số TT Tên cá nhân đăng ký theo Thuyết minh ThS Lê Thị Thúy Hằng ThS Bạch Thị Bích Phượng Tên cá nhân tham gia thực ThS Lê Thị Thúy Hằng ThS Bạch Thị Bích Phượng ThS Trần Minh Trang ThS Trần Minh Trang Nội dung tham gia Xây dựng thuyết minh Tối ưu hóa mơi trường bổ sung dầu liu Tách chiết EPS Sản phẩm chủ yếu đạt Thuyết minh đề tài Xác định MT tối ưu Số liệu Ghi chú* CN Hà Bảo Châu ThS.Lê Thị Thúy Hằng CN Hà Bảo Châu ThS Huỳnh Thư CN Hà Bảo Châu ThS.Lê Thị Thúy Hằng CN Hà Bảo Châu ThS Huỳnh Thư ThS Lê Thị Thúy Hằng TS Đinh Minh Hiệp ThS Lê Thị Thúy Hằng ThS Lê Thị Thúy Hằng TS Đinh Minh Hiệp ThS Lê Thị Thúy Hằng Tinh EPS Số liệu Đánh giá hoạt Số liệu tính kháng oxy hóa Đánh giá khả Số liệu kháng phân bào Viết báo cáo tổng kết Báo cáo Tình hình hợp tác quốc tế: Số TT Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đồn, số lượng người tham gia ) Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Theo kế hoạch Thực tế đạt Số (Nội dung, thời gian, kinh phí, (Nội dung, thời gian, TT địa điểm ) kinh phí, địa điểm ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tóm tắt nội dung, cơng việc chủ yếu: (Nêu mục 15 thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát nước nước ngồi) Số TT Các nội dung, cơng việc chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) Tối ưu hóa mơi trường bổ sung dầu liu Thời gian (Bắt đầu, kết thúc - tháng … năm) Theo kế Thực tế đạt hoạch 07/2017 07/2017 Người, quan thực ThS Bạch Thị Bích Tách chiết EPS 08/2017 08/2017 Tinh EPS 09/2017 09/2017 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa Đánh giá khả kháng phân bào 10/2017 10/2017 11/2017 11/2017 Phân tích mononaccharide 11/2017 11/2017 Viết báo cáo tổng kết 12/2017 12/2017 Phượng ThS Trần Minh Trang CN Hà Bảo Châu ThS.Lê Thị Thúy Hằng CN Hà Bảo Châu ThS Huỳnh Thư ThS Lê Thị Thúy Hằng TS Đinh Minh Hiệp ThS Lê Thị Thúy Hằng ThS Lê Thị Thúy Hằng - Lý thay đổi (nếu có): III SẢN PHẨM KH&CN CỦA NHIỆM VỤ Sản phẩm KH&CN tạo ra: a) Sản phẩm Dạng I: Số TT Tên sản phẩm tiêu chất lượng chủ yếu Đơn vị đo Số lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt - Lý thay đổi (nếu có): b) Sản phẩm Dạng II: Số TT Tên sản phẩm Nghiên cứu quy trình tinh exopolysaccharide từ môi trường nuôi cấy Ophiocordyceps sinensis bổ sung dầu ô liu khảo sát hoạt tính sinh học chúng Yêu cầu khoa học cần đạt Theo kế hoạch Thực tế đạt Quy trình tách Đạt chiết tinh exopolysaccharide từ môi trường nuôi cấy Ophiocordyceps sinensis bổ sung dầu liu Các phân đoạn EPS có hoạt tính sinh học Ghi - Lý thay đổi (nếu có): c) Sản phẩm Dạng III: Số TT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học cần đạt Theo Thực tế kế hoạch đạt Số lượng, nơi công bố (Tạp chí, nhà xuất bản) Số lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt phần kết Đạt NCS Ghi (Thời gian kết thúc) - Lý thay đổi (nếu có): d) Kết đào tạo: Số TT Cấp đào tạo, Chuyên ngành đào tạo Tiến sỹ - Lý thay đổi (nếu có): đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu cơng nghiệp: Số TT Tên sản phẩm đăng ký Kết Thực tế đạt Theo kế hoạch Ghi (Thời gian kết thúc) - Lý thay đổi (nếu có): e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN ứng dụng vào thực tế Số TT Tên kết ứng dụng Thời gian Địa điểm (Ghi rõ tên, địa nơi ứng dụng) Kết sơ 2 Đánh giá hiệu nhiệm vụ mang lại: - Ý nghĩa khoa học: + Cung cấp thông tin hàm lượng thành phần phân đoạn polysaccharid ngoại bào (EPS) từ dich ̣ nuôi cấ y nấ m Đông trùng Hạ thảo (Cordyceps sinensis) bổ sung dầu ô liu thông qua sắc ký lọc gel + Tạo sở khoa học cho việc mở rộng phạm vi nghiên cứu, tạo nguồn nguyên liệu nhằm khảo sát hoạt tính sinh học tiềm kháng oxy hóa, điề u hòa ̣ thố ng miễn dich, ̣ giảm cholesterol máu, giảm đường huyế t, kháng ung thư và chố ng di - Hiệu mặt kinh tế xã hội: + Đề tài tạo sở cho việc khai thác nhóm hoạt chất phát triển số dòng sản phẩm thực phẩm chức phục vụ sức khỏe cộng đồng + Tận dụng nguồn dịch nuôi cấy sau thu sinh khối hệ sợi nấ m Đông trùng Hạ thảo (Ophiocordyceps sinensis) nhằm tối ưu quy trình sản xuất, tăng lợi nhuận, giảm chi phí xử lý môi trường so với việc thải bỏ dịch ni cấy theo quy trình sản xuất Tình hình thực chế độ báo cáo, kiểm tra nhiệm vụ: Số TT I II III Nội dung Báo cáo tiến độ Thời gian thực 10/2017 Ghi (Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…) Tình hình thực đề tài đạt 70% Lần … Báo cáo giám định Lần … Nghiệm thu sở …… Chủ nhiệm đề tài (Họ tên, chữ ký) Thủ trưởng tổ chức chủ trì (Họ tên, chữ ký đóng dấu) MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Ophiocordyceps sinensis 1.1.1 Giới thiệu Ophiocordyceps sinensis 1.1.2 Các hợp chất có hoạt tính sinh học O sinensis 1.1.3 Nuôi cấy nhân tạo nấm O sinensis 1.2 Tổng quan exopolysaccharide 1.2.1 Giới thiệu chung polysaccharide 1.2.2 Exopolysaccharide nấm O sinensis 10 1.2.3 Cơ chế sinh tổng hợp exopolysaccharide 11 1.2.4 Hoạt tính sinh học exopolysaccharide 13 1.2.5 Hoạt tính sinh học phức hợp polysaccharide-protein 14 1.3 Tối ưu hóa mơi trường ni cấy 16 1.3.1 Giới thiệu 16 1.3.2 Thiết kế thí nghiệm 16 1.4 Tình hình nghiên cứu Cordyceps Việt Nam 18 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 20 2.2 Phương Pháp 21 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy lỏng tĩnh môi trường bổ sung dầu ô liu 21 2.2.2 Tối ưu hố mơi trường ni cấy bổ sung dầu ô liu 23 2.2.2.1 Phương pháp sàng lọc yếu tố có ý nghĩa Plackett – Burman 23 2.2.2.2 Phương pháp tối ưu hóa đáp ứng bề mặt Box – Behnken 24 2.2.3 Tách chiết exopolysaccharide từ dịch nuôi cấy Ophiocordyceps sinensis có bổ sung dầu liu 26 2.2.3.1 Khảo sát dung môi hữu loại dầu khỏi dịch kĩ thuật chiết lỏng-lỏng 26 2.2.3.2 Khảo sát tỷ lệ tủa ethanol 960 để thu nhận exopolysaccharide 27 2.2.4 Quy trình tinh EPS 28 2.2.4.1 Phương pháp loại protein 28 2.2.4.2 Phương pháp phân tách phân đoạn EPS từ dịch nuôi cấy O sinensis 29 2.2.5 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa EPS khả bắt gốc tự ABTS+ 29 2.2.6 Phương pháp xác định khả kháng phân bào 31 2.2.7 Các phương pháp định lượng 32 i [10] Cui, J.D and Jia, S.R (2010), "Optimization of medium on exopolysaccharides production in submerged culture of Cordyceps militaris", Food Science and Biotechnology, 19(6), pp 1567-1571 [11] Dong, C.H and Yao, Y.J (2005), "Nutritional requirements of mycelial growth of Cordyceps sinensis in submerged culture", Journal of Applied Microbiology, 99(3), pp 483-492 [12] Dong, C.H and Yao, Y.J (2008), "In vitro evaluation of antioxidant activities of aqueous extracts from natural and cultured mycelia of Cordyceps sinensis", Lebensmittel-Wissenschaft & Technologie-Food Science and Technology, 41(4), pp 669-677 [13] Dubois, M., Gilles, K.A., Hamilton, J.K., Rebers, P and Smith, F (1956), "Colorimetric method for determination of sugars and related substances", Analytical Chemistry, 28(3), pp 350-356 [14] Gunstone, F (2011), Vegetable oils in food technology: composition, properties and uses, John Wiley & Sons, Blackwell Publishing Ltd [15] Hidalgo Cantabrana, C., Sánchez, B., Milani, C., Ventura, M., Margolles, A and Ruas Madiedo, P (2014), "Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp", Applied and Environmental Microbiology, 80(1), pp 9-18 [16] Holliday, J and Cleaver, M (2004), "On the trail of the yak ancient Cordyceps in the modern world", Online posting June [17] Hsieh, C., Wang, H.L., Chen, C.C., Hsu, T.H and Tseng, M.H (2008), "Effect of plant oil and surfactant on the production of mycelial biomass and polysaccharides in submerged culture of Grifola frondosa", Biochemical Engineering Journal, 38(2), pp 198-205 [18] Hu, C., Zou, Y and Zhao, W (2009), "Effect of soybean oil on the production of mycelial biomass and pleuromutilin in the shake-flask culture of Pleurotus mutilis", World Journal of Microbiology and Biotechnology, 25(10), pp 1705-1711 [19] Khondkar, P (2009), "Effect of different carbon sources on the extra-cellular polysaccharide production by Tremella cinnabarina in submerged culture", Dhaka University Journal of Pharmaceutical Sciences, 8(2), pp 147-152 [20] Kim, H and Yun, J (2005), "A comparative study on the production of exopolysaccharides between two entomopathogenic fungi Cordyceps militaris and Cordyceps sinensis in submerged mycelial cultures", Microbiology, 99(4), pp 728-738 64 Journal of Applied [21] Krishna, A.G., Raj, G., Singh, B.A., Kumar, P.P and Chandrashekar, P (2010), "Coconut oil: chemistry, production and its applications-a review", Indian Coconut Journal, 53(3), pp 15-27 [22] Lehninger, A.L., Nelson, D.L and Cox, M.M (1993), "Principles of biochemistry", New York: Worth, 38 [23] Leung, P.H and Wu, J.Y (2007), "Effects of ammonium feeding on the production of bioactive metabolites (cordycepin and exopolysaccharides) in mycelial culture of a Cordyceps sinensis fungus", Journal of Applied Microbiology, 103(5), pp 1942-1949 [24] Leung, P.H., Zhao, S., Ho, K.P and Wu, J.Y (2009), "Chemical properties and antioxidant activity of exopolysaccharides from mycelial culture of Cordyceps sinensis fungus Cs-HK1", Food Chemistry, 114(4), pp 1251-1256 [25] Lin, S., Liu, Z.Q., Baker, P.J., Yi, M., Wu, H., Xu, F., Teng, Y and Zheng, Y.G (2016), "Enhancement of cordyceps polysaccharide production via biosynthetic pathway analysis in Hirsutella sinensis", International Journal of Biological Macromolecules, 92, pp 872-880 [26] Lo, H.C., Hsieh, C., Lin, F.Y and Hsu, T.H (2013), "A systematic review of the mysterious caterpillar fungus Ophiocordyceps sinensis in Dong-ChongXiaCao (冬蟲夏草 Dōng Chóng Xià Cǎo) and related bioactive ingredients", Journal of Traditional and Complementary Medicine, 3(1), pp 16-32 [27] Mahapatra, S and Banerjee, D (2013), "Fungal exopolysaccharide: production, composition and applications", Microbiology Insights, 6, pp 1-16 [28] Mao, X.B., Eksriwong, T., Chauvatcharin, S and Zhong, J.J (2005), "Optimization of carbon source and carbon/nitrogen ratio for cordycepin production by submerged cultivation of medicinal mushroom Cordyceps militaris", Process Biochemistry, 40(5), pp 1667-1672 [29] Mozzi, F., Rollan, G., De Giori, G.S and De Valdez, G (2001), "Effect of galactose and glucose on the exopolysaccharide production and the activities of biosynthetic enzymes in Lactobacillus casei CRL 87", Journal of Applied Microbiology, 91(1), pp 160-167 [30] Nie, S., Cui, S.W., Xie, M., Phillips, A.O and Phillips, G.O (2013), "Bioactive polysaccharides from Cordyceps sinensis: Isolation, structure features and bioactivities", Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre, 1(1), pp 38-52 [31] No, A and Committee, A.M (2013), "Experimental design and optimisation (4): Plackett–Burman designs", Analytical Methods, 5(8), pp 1901-1903 65 [32] Oh, J.Y., Cho, E.J., Nam, S.H., Choi, J.W and Yun, J.W (2007), "Production of polysaccharide–peptide complexes by submerged mycelial culture of an entomopathogenic fungus Cordyceps sphecocephala", Process Biochemistry, 42(3), pp 352-362 [33] Paek, K.Y., Hosakatte, N.M and Zhong, J.J (2014), Production of biomass and bioactive compounds using bioreactor technology, Springer [34] Park, J.P., Kim, S.W., Hwang, H.J., Cho, Y.J and Yun, J.W (2002), "Stimulatory effect of plant oils and fatty acids on the exo-biopolymer production in Cordyceps militaris", Enzyme and Microbial Technology, 31(3), pp 250-255 [35] Paterson, R.R.M (2008), "Cordyceps–A traditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory?", Phytochemistry, 69(7), pp 1469-1495 [36] Plackett, R.L and Burman, J.P (1946), "The design of optimum multifactorial experiments", Biometrika, 33(4), pp 305-325 [37] Shashidhar, G., Giridhar, P and Manohar, B (2015), "Functional polysaccharides from medicinal mushroom Cordyceps sinensis as a potent food supplement: extraction, characterization and therapeutic potentials–a systematic review", Royal Society of Chemistry Advances, 5(21), pp 16050-16066 [38] Shashidhar, M., Giridhar, P., Sankar, K.U and Manohar, B (2013), "Bioactive principles from Cordyceps sinensis: A potent food supplement–A review", Journal of Functional Foods, 5(3), pp 1013-1030 [39] Stasinopoulos, S and Seviour, R (1990), "Stimulation of exopolysaccharide production in the fungus Acremonium persicinum with fatty acids", Biotechnology and Bioengineering, 36(8), pp 778-782 [40] Sudha, G., Priya, M.S., Shree, R.I and Vadivukkarasi, S (2011), "In vitro free radical scavenging activity of raw pepino fruit (Solanum muricatum aiton)", International Journal of Current Pharmaceutical Research, 3(2), pp 137-140 [41] Sung, G.H., Hywel Jones, N.L., Sung, J.M., Luangsa-ard, J.J., Shrestha, B and Spatafora, J.W (2007), "Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi", Studies in Mycology, 57, pp 5-59 [42] Thelen, J.J and Ohlrogge, J.B (2002), "Metabolic engineering of fatty acid biosynthesis in plants", Metabolic Engineering, 4(1), pp 12-21 [43] Wang, J., Kan, L., Nie, S., Chen, H., Cui, S.W., Phillips, A.O., Phillips, G.O., Li, Y and Xie, M (2015), "A comparison of chemical composition, bioactive components and antioxidant activity of natural and cultured Cordyceps sinensis", LWT-Food Science and Technology, 63(1), pp 2-7 66 [44] Waterman, E and Lockwood, B (2007), "Active components and clinical applications of olive oil", Alternative Medicine Review, 12(4), pp 331-343 [45] Xiao, J.H., Xiao, D.M., Xiong, Q., Liang, Z.Q and Zhong, J.J (2010), "Nutritional requirements for the hyperproduction of bioactive exopolysaccharides by submerged fermentation of the edible medicinal fungus Cordyceps taii", Biochemical Engineering Journal, 49(2), pp 241-249 [46] Yan, J.K., Wang, W.Q and Wu, J.Y (2014), "Recent advances in Cordyceps sinensis polysaccharides: Mycelial fermentation, isolation, structure, and bioactivities: A review", Journal of Functional Foods, 6, pp 33-47 [47] Yang, F.C., Ke, Y.-F and Kuo, S.-S (2000), "Effect of fatty acids on the mycelial growth and polysaccharide formation by Ganoderma lucidum in shake flask cultures", Enzyme and microbial technology, 27(3), pp 295-301 [48] Yang, H and He, G (2008), "Influence of nutritional conditions on exopolysaccharide production by submerged cultivation of the medicinal fungus Shiraia bambusicola", World Journal of Microbiology and Biotechnology, 24(12), pp 2903-2907 [49] Yu, R., Yang, W., Song, L., Yan, C., Zhang, Z and Zhao, Y (2007), "Structural characterization and antioxidant activity of a polysaccharide from the fruiting bodies of cultured Cordyceps militaris", Carbohydrate Polymers, 70(4), pp 430-436 [50] Zhang, Y., Li, E., Wang, C., Li, Y and Liu, X (2012), "Ophiocordyceps sinensis, the flagship fungus of China: terminology, life strategy and ecology", Mycology, 3(1), pp 2-10 67 PHỤ LỤC 1P 6P 2P 7P 3P 8P 4P 9P 5P 10P 68 11P 12P 13P, 14P, 15P Hình 5.1 Nấm O.sinensis thu sau 40 ngày theo Plackett – Burman 69 Hình 5.2 Nấm O sinensis thu sau 40 ngày theo thí nghiệm Box – Behnken Bảng 5.1 Hàm lượng sinh khối khơ EPS theo thí nghiệm Plackett – Burman Lô Sinh khối khô (g/L) EPS (g/L) Lần Lần TB STD Lần Lần TB STD 1P 31,28 29,63 30,46 1,17 5,53 5,98 5,76 0,32 2P 29,34 30,18 29,76 0,59 5,22 5,27 5,25 0,04 3P 23,15 23,65 23,40 0,35 1,68 1,72 1,70 0,03 4P 9,18 9,58 9,38 0,28 0,75 0,75 0,75 0,00 5P 31,28 29,63 30,46 1,17 5,53 5,98 5,76 0,32 6P 19,99 20,68 20,34 0,49 2,75 2,84 2,80 0,06 7P 33,07 37,49 35,28 3,13 4,18 4,23 4,205 0,04 8P 12,13 16,96 14,55 0,49 1,40 1,41 1,405 0,01 9P 31,14 31,08 31,11 0,042 5,62 5,59 5,605 0,02 10P 14,79 14,16 14,48 0,45 1,26 1,19 1,225 0,05 11P 19,68 19,32 19,500 0,25 2,33 2,11 2,220 0,16 70 12P 9,18 9,58 9,380 0,283 0,75 0,75 0,750 0,00 13P 31,84 31,95 31,90 0,07 5,85 5,76 5,805 0,06 14P 31,14 31,08 31,11 0,00 5,62 5,59 5,605 0,02 15P 30,65 31,01 30,83 0,25 5,56 5,51 5,535 0,04 Bảng 5.2 Hàm lượng sinh khối khơ EPS theo thí nghiệm Box – Behnken Lô Sinh khối khô (g/L) EPS (g/L) Lần Lần TB STD Lần Lần TB STD 26,32 22,55 24,44 3,55 2,88 2,29 2,59 0,09 26,11 24,11 25,11 1,00 3,51 3,41 3,46 0,00 23,38 25,33 24,36 0,95 3,82 2,55 3,19 0,40 30,13 28,57 29,35 0,61 4,19 4,56 4,38 0,03 22,01 18,22 20,12 3,59 2,01 1,38 1,70 0,10 23,82 25,51 24,67 0,71 2,95 3,58 3,27 0,10 27,79 30,38 29,09 1,68 5,55 4,95 5,25 0,09 26,41 30,35 28,38 3,88 4,42 4,95 4,69 0,07 22,32 23,91 23,12 0,63 2,14 3,21 2,68 0,29 10 26,11 23,34 24,73 1,92 2,73 2,15 2,44 0,08 11 24,29 27,41 25,85 2,43 4,23 2,63 3,43 0,64 12 30,35 27,55 28,95 1,96 4,23 5,54 4,89 0,43 13 30,12 32,18 31,15 1,06 5,78 5,72 5,75 0,00 14 29,38 32,91 31,15 3,12 5,72 5,79 5,76 0,00 15 33,11 29,18 31,15 3,86 5,50 6,01 5,76 0,07 Bảng 5.3 Kết dựng đường chuẩn polysaccharide Nồng độ saccharose 0,1 % (µg/mL) OD 490 nm ΔOD 0,069± 0,00 0,00 10 0,180 ± 0,00 0,111 20 0,271 ± 0,00 0,202 30 0,368 ± 0,00 0,318 40 0,490 ± 0,00 0,421 50 0,592 ± 0,00 0,523 60 0,718 ± 0,00 0,649 70 0,755 ± 0,00 0,686 71 Hình 5.3 Đường chuẩn polysaccharide Bảng 5.4 Kết đường chuẩn albumin Nồng độ albumin OD 595nm ∆ OD 0,079 ± 0,00 10 0,097 ± 0,00 0,018 20 0,113 ± 0,00 0,034 30 0,133 ± 0,00 0,054 40 0,154 ± 0,00 0,075 50 0,176 ± 0,00 0,097 0,01% (µg/mL) Hình 5.4 Đường chuẩn protein Bảng 5.5 Định lượng hàm lượng polysaccharide protein tủa EPS Lô ĐC % polysaccharide % protein Lần Lần TB STD Lần Lần TB STD 30,40 31,78 31,09 0,48 1,41 2,22 1,82 0,16 72 NT1 34,24 33,06 33,65 0,00 0,18 1,83 1,00 0,69 NT2 40,21 33,96 37,08 9,78 2,44 2,50 2,47 0,00 NT3 60,79 61,75 61,27 0,23 3,89 3,46 3,68 0,05 NT4 76,14 75,20 75,67 0,22 5,67 5,66 5,67 0,00 NT5 25,63 30,23 27,93 5,29 3,30 3,15 3,22 0,01 NT6 54,64 52,78 53,71 0,86 4,58 3,67 4,12 0,21 NT7 68,13 61,07 64,60 12,47 0,73 0,91 0,82 0,01 NT8 15,91 17,70 16,80 0,81 1,96 1,48 1,72 0,06 NT9 26,03 26,22 26,12 0,01 3,21 2,00 2,61 0,36 NT10 18,61 20,86 19,73 1,27 1,42 1,36 1,39 0,00 NT11 35,39 32,51 33,95 2,07 4,39 4,26 4,33 0,00 NT12 43,66 44,81 18,82 0,70 2,35 2,64 2,50 0,02 NT13 19,65 17,98 18,82 0,70 1,63 1,41 1,52 0,01 NT14 52,97 53,04 53,01 0,00 4,93 5,11 5,02 0,01 NT15 21,13 23,10 22,12 0,97 1,73 1,76 1,74 0,00 Bảng 5.6 Khả bắt gốc tự ABTS+ mẫu vitamin C Nồng độ (µg/mL) Giá trị OD TB 734nm Tỉ lệ bắt gốc ABTS+ (%) 0,643 ± 0,00 0,00 25 0,561 ± 0,00 12,75 50 0,491 ± 0,00 23,63 100 0,313 ± 0,00 51,40 200 0,004 ± 0,00 99,33 400 0,004 ± 0,00 99,43 IC50 = 160,77 (µg/mL) Bảng 5.7 Khả bắt gốc tự ABTS tủa EPS từ dịch nuôi 15 nghiệm thức nồng độ 4000 µg/mL Lô Tỉ lệ bắt gốc ABTS+ (%) Lần Lần Lần Trung bình NT1 31,07 33,12 22,07 28,75 ± 23,03 NT2 35,47 28,89 40,65 35,00 ± 23,16 NT3 40,61 35,14 38,70 38,15 ± 5,14 NT4 46,88 47,50 55,94 50,11 ± 17,08 73 NT5 45,76 46,20 53,06 48,34 ± 11,17 NT6 15,27 13,02 17,05 15,11 ±2,72 NT7 65,96 72,06 - 69,01 ± 9,30 NT8 17,92 15,52 18,96 17,47 ± 2,08 NT9 19,09 25,35 16,53 20,32 ± 13,73 NT10 39,82 33,29 43,60 38,90 ± 18,14 NT11 35,42 33,23 33,58 34,08 ± 0,92 NT12 48,99 46,97 48,03 48,00 ± 0,68 NT13 81,55 81,93 - 81,74 ± 0,04 NT14 87,49 79,31 - 83,40 ± 16,73 NT15 83,72 83,00 - 83,36 ± 0,13 Bảng 5.8 Khả bắt gốc tự ABTS EPS thu từ môi trường đối chứng Nồng độ Giá trị OD 734nm (µg/mL) Lần 0,596 1000 Lần Độ lệch chuẩn Tỉ lệ bắt gốc % bắt gốc Lần ABTS+ TB(%) 0,606 0,608 0,00 0,00 0,463 0,474 0,471 22,21 0,39 2000 0,407 0,389 0,381 34,95 2,91 3000 0,292 0,317 0,308 49,35 1,66 4000 0,227 0,227 0,228 62,32 0,35 5000 0,197 0,166 0,271 64,99 8,75 6000 0,123 0,116 0,131 79,56 1,21 ABTS+ IC 50 = 3067,71 ± 32,40 (µg/mL) Bảng 5.9 Khả bắt gốc tự ABTS EPS thu từ NT4 Nồng độ Giá trị OD 734nm Lần Tỉ lệ bắt gốc Độ lệch chuẩn ABTS+ TB (%) % bắt gốc ABTS+ (µg/mL) Lần 0,494 0,574 0,00 0,00 250 0,468 0,540 5,57 0,06 500 0,434 0,507 11,95 0,11 1000 0,422 0,478 15,65 1,04 2000 0,372 0,413 26,37 2,87 4000 0,236 0,276 52,11 0,05 74 IC 50 = 3787,88 ± 0,00 (µg/mL) Bảng 5.10 Khả bắt gốc tự ABTS EPS thu từ NT7 Nồng độ (µg/mL) Giá trị OD 734nm Lần Lần Độ lệch chuẩn Tỉ lệ bắt gốc % bắt gốc ABTS+ TB (%) ABTS+ 0,574 0,644 0,00 0,00 250 0,550 0,613 4,47 0,12 500 0,534 0,563 9,74 8,31 1000 0,458 0,495 21,64 2,19 2000 0,403 0,423 32,00 5,31 4000 0,174 0,226 67,29 5,37 IC 50 = 2949,88 ± 75,72 (µg/mL) Bảng 5.11 Khả bắt gốc tự ABTS EPS thu từ NT13 Nồng độ Giá trị OD 734nm Tỉ lệ bắt gốc Độ lệch chuẩn (µg/mL) Lần Lần ABTS+ TB (%) % bắt gốc ABTS+ 0,494 0,674 0,00 0,00 250 0,472 0,644 4,44 0,01 500 0,428 0,598 12,33 1,33 1000 0,337 0,448 32,64 0,66 2000 0,274 0,354 45,95 2,10 4000 0,088 0,116 82,49 0,08 IC 50 = 2304,34 ± 451,92 (µg/mL) Bảng 5.12 Kết phân tích ANOVA hàm lượng EPS Tổng bình Bậc tự Sai số phương chuẩn Mơ hình 24,91 0,551 Y1 1,18 0,337 Y2 0,94 Y3 8,34 Y1Y2 Nguồn Ảnh hưởng F-Value P 25,60 0,001 0,768 10,89 0,021 0,337 0,685 8,68 0,032 0,337 2,043 77,15 0,000 0,026 0,477 0,160 0,24 0,647 Y1Y3 1,13 0,477 -1,065 10,49 0,023 Y2Y3 0,72 0,477 0,850 6,68 0,049 Y1Y2 3,63 0,497 -1,984 33,60 0,002 X2Y2 6,83 0,497 -2,719 63,11 0,001 75 X3Y2 3,97 0,497 Sai số 0,54 0,497 Tổng 25,46 14 -2,074 36,72 0,002 R2 = 0,9788; R2 -điều chỉnh = 0,9405; R2 -dự đoán = 0,6601 Bảng 5.13 Hàm lượng polysaccharide dịch nấm trước sau loại dầu Lơ thí nghiệm Thể Độ pha tích lỗng (ml) (k) Giá trị OD490 Hàm lượng Hàm lượng polysaccharide polysaccharide(g (g/ml) /ml) 0,117 Dịch đối chứng không loại dầu Dịch loại dầu 2000 0,575 0,117 81 2000 0,653 0,134 82 2000 0,649 0,133 81 2000 0,649 0,133 86 2000 0,641 0,131 86 2000 0,643 0,132 85 2000 0,652 0,134 90 2000 0,351 0,068 90 2000 0,355 0,069 93 2000 0,344 0,066 100 dung môi PE Dịch loại dầu dung môi hexan Dịch loại dầu dung môi dietyl ether 0,133±0,001 0,132±0,001 0,068±0,001 Bảng 5.1 Hàm lượng lipid có mẫu EPS sau trước sau loại dầu Lơ thí nghiệm Khối Hàm lượng % hàm lượng % hàm lượng lipid trung lượng lipid (g) lipid có bình có mẫu mẫu (g) mẫu Dịch đối chứng không loại dầu 0,5 0,293 57,77 Dịch loại dầu 0,5 0,245 48,29 dung môi 0,5 0,246 48,92 PE 0,5 0,248 48,54 Dịch loại dầu 0,5 0,207 39,27 dung môi 0,5 0,206 44,89 hexan 0,5 0,207 41,08 76 57,71 48,59±0,32 41,75±2,87 Dịch loại dầu 0,5 0,146 31,50 dung môi 0,5 0,148 29,35 dietyl ether 0,5 0,149 29,43 30,09±1,21 Bảng 5.15 Khối lượng EPS sau tủa với ethanol tuyệt đối Tỉ lệ Thể tích Thể tích Hiệu suất thu Hiệu suất thu tủa EPS tủa dịch (ml) ethanol (ml) tủa EPS (g/ml) trung bình (g/ml) 10 30 0,0155 10 30 0,0153 10 30 0,0154 10 40 0,017 10 40 0,0173 10 40 0,0171 10 50 0,0167 10 50 0,0166 10 50 0,0164 1:3 1:4 1:5 0,0154±0,0001 0,0171±0,0002 0,0166±0,0002 Bảng 5.16 Hàm lượng polysaccharide có mẫu tủa EPS thơ Tỉ lệ tủa Khối lượng Thể tích mẫu (g) (ml) Độ pha OD490 loãng Hàm lượng polysaccharide polysaccharide (%) 1:3 1:4 1:5 Hàm lượng 0,011 100 0,24 34,78 0,0106 100 0,212 36,58 0,0109 100 0,227 31,63 0,0104 100 0,229 34,1 0,0115 100 0,241 31,56 0,0101 100 0,227 37,38 0,011 100 0,25 33,97 0,0109 100 0,243 32,21 0,0107 100 0,248 35,01 77 trung bình(%) 34,33±2,51 34,35±2,92 33,73±1,42 Bảng 5.17 Hàm lượng protein có mẫu tủa EPS thô Tỉ lệ Khối lượng Thể Độ pha tủa mẫu (g) tích lỗng OD595 Hàm lượng Hàm lượng protein (%) protein trung (ml) 1:3 1:4 1:5 bình (%) 0,011 100 0,095 0,58 0,0106 100 0,095 0,69 0,0109 100 0,095 0,56 0,0104 100 0,099 2,98 0,0115 100 0,099 2,62 0,0101 100 0,098 2,64 0,011 100 0,095 0,54 0,0109 100 0,095 0,53 0,0107 100 0,095 0,56 0,61±0,07 2,75±0,20 0,54±0,02 Bảng 5.18 Hàm lượng polysaccharide dịch nuôi cấy trước sau loại dầu Lơ thí nghiệm Hàm lượng polysaccharide (g/ml) Dịch đối chứng không loại dầu 0,117 Dịch loại dầu dung môi PE 0,133±0,001 Dịch loại dầu dung môi hexan 0,132±0,001 Dịch loại dầu dung môi dietyl ether 0,068±0,001 Bảng 5.19 Hàm lượng lipid có mẫu EPS trước sau loại dầu Hàm lượng lipid (%) Lơ thí nghiệm Dịch đối chứng khơng loại dầu 57,77 Dịch loại dầu dung môi PE 41,75±2,87 Dịch loại dầu dung môi hexan 48,59±0,32 Dịch loại dầu dung môi dietyl ether 30,09±1,21 Bảng 5.20 Hàm lượng tủa EPS theo tỷ lệ tủa khác Tỷ lệ tủa Hiệu suất thu tủa EPS (g/ml) 1:3 0,0154±0,0001 1:4 0,0171±0,0002 1:5 0,0166±0,0002 78