Khảo sát hoạt tính sinh học và tách chiết hợp chất saponin steroid của loài bảy lá một hoa paris yunanensis franch trilliacea ở kon tum

BỘ Y TẾ VIỆN DƢỢC LIỆU oOo Báo cáo nghiệm thu đề tài nghiên cứu cấp Viện KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT SAPONIN STEROID CỦA LOÀI BẢY LÁ MỘT HOA (PARIS YUNANENSIS FRANCH, TRILLIACEA) Ở KON TUM Chủ nhiệm đề tài : CN Lâm Bích Thảo Cơ quan chủ trì đề tài : Trung Tâm Sâm Dược Liệu TP HCM Hợp đồng : Số 07-2015/HĐ-ĐTCS Thời gian thực : Từ tháng 03/2015 đến tháng 03/2016 (gia hạn đến tháng 05/2017) 2017 BỘ Y TẾ VIỆN DƢỢC LIỆU oOo Báo cáo nghiệm thu đề tài nghiên cứu cấp Viện KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT SAPONIN STEROID CỦA LOÀI BẢY LÁ MỘT HOA (PARIS YUNANENSIS FRANCH, TRILLIACEA) Ở KON TUM CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI CƠ QUAN CHỦ TRÌ i 2017 MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC SƠ ĐỒ iii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v PHẦN A: TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI PHẦN B: NỘI DUNG BÁO CÁO CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU I ĐẶT VẤN ĐỀ II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đại cương thực vật học………………………………………………………….3 2.1.1 Vị trí phân loại thực vật học 2.1.2 Đặc điểm thực vật họ Trọng Lâu (Trilliaceae) 2.1.2.1 Đặc điểm thực vật học Bảy hoa 2.1.2.2 Phân bố, sinh thái 2.1.2.3 Thành phần hóa học 2.1.2.4 Tác dụng dược lý III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.1 Vật liệu 11 3.1.1 Nguyên liệu 11 3.1.2 Thiết bị - dụng cụ 11 3.1.3 Hoá chất 12 3.2 Phương pháp nghiên cứu 12 3.2.1 Chiết xuất cao tổng cao phân đoạn 12 3.2.2 Thử hoạt tính sinh học cao tổng cao phân đoạn 12 3.2.4 Thử hoạt tính sinh học hợp chất saponin steroid phân lập 16 IV KẾT QUẢ 17 4.1 Chiết xuất cao tổng cao phân đoạn 17 4.1.1 Chiết xuất cao tổng 17 4.1.2 Chiết xuất cao phân đoạn 17 i 4.2 Thử hoạt tính sinh học cao tổng cao phân đoạn 19 4.2.1 Thử nghiệm sàng lọc sơ hoạt tính cao chiết 19 4.2.2 Thử nghiệm xác định IC50 cao chiết dòng tế bào ung thư 21 4.3 Tách chiết hợp chất saponin steroid từ phân đoạn cao có hoạt tính 22 4.3.1 Tách chiết hợp chất saponin steroid 22 4.3.2 Biện giải cấu trúc hợp chất cô lập 25 4.3.2.1 Hợp chất SG1 25 4.3.2.2 Hợp chất SG2 28 4.4 Thử hoạt tính sinh học hợp chất saponin steroid phân lập 31 V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 5.1 Kết luận 33 5.2 Kiến nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 ii DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 4.1: Sơ đồ điều chế cao tổng 20 Sơ đồ 4.2: Sơ đồ điều chế cao phân đoạn 21 Sơ đồ 4.3: Q trình lập hợp chất SG1 SG2 26 DANH MỤC HÌNH Hình 3.1: Thân rễ rễ củ Bảy hoa 13 H nh 4.1: Sắc í đồ sắc í l p m ng iểm tra phân đoạn phân lập từ cao ethyl acetate 27 H nh 4.2: Sắc í đồ sắc í l p m ng hợp chất SG1 cô lập từ phân đoạn cao ethyl acetat 27 H nh 4.3: Sắc í đồ sắc í l p m ng hợp chất S2 cô lập từ phân đoạn cao ethyl acetat 28 Hình 4.4: Cấu tr c (25R -spiros-5-en-3β-ol (diosgenin) (SG1) 29 Hình 4.5: Cấu tr c (25R -spirost-5-en-3-β-ol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2 -O-[βD-glucopyranosyl-(1→3 ]-β-D-glucopyranoside 30 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Các phân đoạn tách từ cao ethyl acetate 18 Bảng 4.1: Tỷ lệ (% gây độc tế bào dòng tế bào ung thư v MCF-7 nồng độ 100 µg/ml 22 Bảng 4.2: Tỷ lệ (% gây độc tế bào dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa nồng độ 100 µg/ml 22 Bảng 4.3: Tỷ lệ (% gây độc tế bào dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 nồng độ 100 µg/ml 22 Bảng 4.4: Tỷ lệ (% gây độc tế bào dòng tế bào ung thư gan HepG2 nồng độ 100 µg/ml 23 Bảng 4.5: Tỷ lệ % gây độc tế bào chứng dương Camptothecin đối chiếu 23 Bảng 4.6:Tổng hợp tỷ lệ (% gây độc tế bào dòng tế bào ung thư nồng độ 100 µg/ml 23 Bảng 4.7: Kết xác định IC50 dòng tế bào ung thư v MCF-7 24 Bảng 4.8: Kết xác định IC50 dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela 24 Bảng 4.9: Kết xác định IC50 dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 24 Bảng 4.10: Kết xác định IC50 dòng tế bào ung thư gan HepG2 25 Bảng 4.11: IC50 (µg/ml mẫu dịng tế bào ung thư 25 Bảng 4.12: Dữ liệu phổ 1H and 13C NMR SG1 so v i diosgenin 29 Bảng 4.13: Dữ liệu phổ 1H and 13C NMR SG4 so v i (25R -spirost-5-en-3β-ol 3-Oα-L-rhamnopyranosyl-(1→2 -O-[β-D-glucopyranosyl-(1→3 ]-β-D-glucopyranoside 32 Bảng 4.14: Kết xác định IC50 hợp chất SG2 dòng tế bào ung thư v MCF-7 34 Bảng 4.15: Kết xác định IC50 hợp chất SG2 dòng tế bào ung thư phổi NCIH460 35 Bảng 4.16: Kết xác định IC50 hợp chất SG2 dòng tế bào ung thư gan HepG2 35 Bảng 4.17: IC50 (µg/ml mẫu dòng tế bào ung thư 35 iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CHCl3 cloroform Et2O diethyl ether EtOAc ethyl acetat EtOH ethanol HPLC high - performance liquid chromatography (sắc ý l ng hiệu cao IC inhibitory concentration (nồng độ ức chế MeOH methanol MIC minimum inhibitory concentration (nồng độ ức chế tối thiểu n-BuOH n-butanol Rf ratio of flow (tỉ lệ dịch chuyển hoạt chất dung môi m ng sắc ký) RSD relative standard deviation (độ lệch tiêu chuẩn tương đối SD standard of deviation (độ lệch tiêu chuẩn SKLM sắc ký l p m ng UV-Vis ultraviolet-visible (ánh sáng thuộc vùng tử ngoại - khả kiến) v PHẦN A: TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI Kết bật đề tài (a) Đóng góp đề tài Kết nghiên cứu đề tài phân lập hợp chất steroid loài Bảy hoa Kon Tum Diosgenin Gracillin góp phần phục vụ cho cơng tác iểm nghiệm, nghiên cứu loài Bảy hoa nư c ta (b) Kết đạt đƣợc: - Từ 2,5 g nguyên liệu hô phương pháp chiết ngấm iệt v i dung môi EtOH 70% chiết xuất 300 g cao tổng - Từ 300g cao tổng phương pháp chiết l ng – l ng v i dung môi diethyl ether, ethyl acetate, n-butanol nư c thu cao phân đoạn - Thử hoạt tính sinh học cao tổng cao phân đoạn dòng tế bào ung thư lựa chọn (MCF-7, HepG2, Hela NCI-H 460 Kết cho thấy, cao phân đoạn ethyl acetate cho hoạt tính chống ung thư dịng tế bào lựa chọn v i số IC50 (µg/ml (58.45 ± 4.20, 38.40 ± 0.50, 46.54 ± 1.70, 41.72 ± 1.42) - Từ 50g cao phân đoạn ethyl acetate phân lập hợp chất steroid Diosgenin Gracillin - Thử hoạt tính sinh học hợp chất Gracillin dòng tế bào ung thư lựa chọn (MCF-7, HepG-2 NCI-H460 Kết hợp chất Gracillin cho hoạt tính chống ung thư dòng tế bào lựa chọn v i số IC50 (µg/ml (15.57 ± 1.57, 2.97 ± 0.12, 3.88 ± 0.66 Riêng đối v i dòng tế bào Hela, hợp chất Gracillin tách chiết hông đủ mẫu thực (c) Hiệu đào tạo: đào tạo 01 cử nhân (d) Hiệu xã hội: phục vụ mục tiêu nghiên cứu tạo thuốc m i (e) Đánh giá việc thực đề tài: - Tiến độ: hoàn thành thực nghiệm đ ng tiến độ chậm báo cáo - Thực mục tiêu: hoàn thành 100% mục tiêu đề - Đánh giá việc sử dụng inh phí: vừa đủ cho việc thực PHẦN B: NỘI DUNG BÁO CÁO CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU I ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, ung thư, nguyên nhân gây tử vong hàng đầu gi i Để điều trị bệnh ung thư, bệnh nhân phải dùng dược phẩm tây y kết hợp v i phương pháp mổ, hóa trị, xạ trị Tuy nhiên, ngồi vấn đề tốn tiền bạc phải điều trị suốt đời, dược phẩm tây y thường để lại tác dụng phụ đáng ể ảnh hưởng đến thể trạng chung cho người bệnh, đặc biệt gây tổn hại gan, quan lọc chất độc cho thể Một xu hư ng chữa trị gi i nghiên cứu sử dụng thuốc có nguồn gốc từ hợp chất tự nhiên Những năm gần đây, nhiều nghiên cứu nư c ngồi tìm thấy nhiều hoạt chất sinh học có giá trị cao loài chi Paris (Trilliaceae) Trong y học dân gian, Bảy hoa (Paris yunnanensis) sử dụng làm thuốc nhiệt giải độc, tiêu thủng thống, lương can định kinh Thân rễ giã đắp chữa rắn cắn, ngã bị sưng… Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu tác dụng dược lý Bảy hoa cho thấy tác dụng kể cịn có nhiều tác dụng hác ức chế khả tăng trưởng tế bào ung thư v , ung thư đường ruột, ung thư buồng trứng, ức chế co bóp tử cung, tác dụng kháng nấm Paris yunnanensis mọc nhiều Ấn Độ, Myanma, Trung Quốc Tại Việt Nam, loài thường phân bố Lào Cai (Sa Pa), Lai Châu (Phong Thổ , chưa có báo cáo cơng bố lồi tìm thấy tỉnh phía Nam[4][5] Lồi Bảy hoa Paris yunnanensis loài chi thuốc thuộc diện quý cần bảo vệ Vì vậy, nghiên cứu “Khảo sát hoạt tính sinh học tách chiết hợp chất saponin steroid loài Bảy hoa (Paris yunanensis Franch, Trilliaceae) Kon Tum” thực để góp phần làm rõ thêm thành phần hố học hoạt tính sinh học loài Bảy hoa tạo thuận lợi cho việc dùng, sử dụng thuốc làm dược liệu nguyên liệu cho nghiên cứu II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đại cƣơng thực vật học 1, 2,3,4,5 2.1.1 Vị trí phân loại thực vật học Giới thực vật Ngành Mộc lan (Magnoliophyta L p hành (Liliopsida Phân l p hành (Liliidae Bộ củ nâu (Dioscoreales Họ Trọng Lâu (Trilliaceae Chi Paris Paris yunanensis Franch 2.1.2 Đặc điểm thực vật họ Trọng Lâu (Trilliaceae) Họ thực vật hạt ín mầm, thảo, thân rễ ngắn, dày, mọc riêng rẽ, gốc có số thối hố Lá mọc thành vịng đỉnh, hình mũi mác bầu dục Hoa lưỡng tính, thuỳ bao hoa rời, số nhị số thuỳ hoa, bao phấn đính gốc Bầu trên, ống Quả mọng nang Phân bố gi i có chi, 50 lồi, chủ yếu bắc ơn đ i Ở Việt Nam có chi, lồi, phổ biến Bảy hoa (Paris polyphylla), thảo nh , sống lâu năm, thân rễ ngắn chia nhiều đốt Hoa mọc cành, đầu cuống dài 15 -30 cm, thường có đài lá; bao phấn vàng nâu, bầu tím, ngăn Cây mọc rải rác Lào Cai, Hà Nam, Nam Định, Bắc Ninh, Bắc Giang, Ninh Bình, Hà Giang Thân rễ dùng làm thuốc chữa sốt, mụn nhọt, giảm tính độc nọc rắn Bảng 4.10: Kết xác định IC50 dòng tế bào ung thư gan HepG2 Mẫu Cao ethyl acetate Nồng độ (µg/ml) 50 40 30 20 10 Phần trăm gây độc tế bào (%) Lần Lần Lần TB ± ĐLC 63.46 62.40 63.90 63.26 ± 0.77 52.60 58.71 58.23 56.51 ± 3.40 34.65 30.61 30.43 31.90 ± 2.38 18.11 23.75 18.71 20.19 ± 3.10 9.76 15.96 15.02 13.58 ± 3.34 IC50 = 38.40 ± 0.50 Bảng 4.11: IC50 (µg/ml mẫu dòng tế bào ung thư STT Tên Cao Cao ethyl acetate Dòng tế bào MCF-7 58.45 ± 4.20 HeLa NCI-H460 HepG2 46.54 ± 1.70 41.72 ± 1.42 38.40 ± 0.50 → Nhận xét: Qua ết hảo sát IC50 cao ethyl acetate dòng tế bào ung thư lựa chọn MCF-7, Hela, HepG-2 NCI-H460, nhận thấy cao ethyl acetate cho ết độc tế bào ung thư cao v i dòng tế bào gan Hep G2, ế dịng ung thư phổi NCI – H460, dòng tế bào cổ tử cung HeLa cuối dòng tế bào ung thư v MCF-7 4.3 Tách chiết hợp chất saponin steroid từ phân đoạn cao có hoạt tính 4.3.1 Tách chiết hợp chất saponin steroid Lấy 50 g cao phân đoạn etyl acetate để thực sắc í cột hấp phụ silica gel pha thường v i nhiều hệ dung môi giải li có độ phân cực hác nhau, bư c đầu ch ng phân tách phân đoạn từ lập hợp chất tinh SG1 (5 mg) SG2 (13 mg) Quá trình lập hợp chất SG1 SG2 trình bày sơ đồ sau: 22 Phân đoạn ethyl acetate (50 g) Sắc í cột silicagel Ethyl acetat : methanol EA1 (4,3g) - EA2 (2,7g) EA3 (1,5g) EA4 (2,3g) EA6 (3,4g) EA5 (2,2g) EA7 (1,8g) Sắc í cột silicagel RB18 Hệ: Methanol: nư c Tủa acetone Lọc rửa tủa nhiều lần methanol EA5.2 (30 mg) Hợp chất SG1 (5 mg) Sắc í cột silicagel Hệ: Chloroform: methanol Hợp chất SG2 (13 mg) Sơ đồ 4.3: Quá trình lập hợp chất SG1 SG2 23 EA8 (0,9g) EA9 (1,2g) Ethyl acetat : aceton (7:3) Cao ethyl acetat Chloroform : methanol (8 : 2) Phân đoạn Cao ethyl acetat Phân đoạn Phân đoạn Phân đoạn Phân đoạn Phân đoạn Phân đoạn Phân đoạn Phân đoạn Phân đoạn Phân đoạn Phân đoạn Phân đoạn Phân đoạn Phân đoạn 10 Phân đoạn Phân đoạn 10 Phân đoạn H nh 4.1: Sắc í đồ sắc í l p m ng iểm tra phân đoạn phân lập từ cao ethyl acetate Dichloromethan : methanol (8,5 : 1,5) Hexan : aceton (6 : 4) Phân đoạn EA1 Chất tinh SG1 H nh 4.2: Sắc í đồ sắc í l p m ng hợp chất SG1 cô lập từ phân đoạn cao ethyl acetat 24 Chloroform : methanol n-butanol : acid acetic : nư c (8 : 2) (7 : : 2) Phân đoạn EA5 Chất tinh SG2 H nh 4.3: Sắc í đồ sắc í l p m ng hợp chất S2 cô lập từ phân đoạn cao ethyl acetat 4.3.2 Biện giải cấu trúc hợp chất cô lập đƣợc 4.3.2.1 Hợp chất SG1 Hợp chất SG1 cô lập từ phân đoạn EA1 cao chiết ethyl acetate (Sơ đồ 4.3) v i liệu vật lí trình bày bên dư i - Chất bột vơ định hình, màu trắng - Phổ 1H and 13C NMR (phụ lục 1, xem bảng 4.12 25 Biện luận cấu trúc 21 O 25 26 18 17 12 11 19 13 14 23 27 24 16 10 HO 22 O 20 15 Hình 4.4 Cấu tr c (25R)-spiros-5-en-3β-ol (diosgenin) (SG1) Phổ 1H-NMR xuất hai nhóm methyl tứ cấp δH 0,79 (s, H-18), 1,03 (s, H-19 hai nhóm methyl bậc hai δH 0,79 (d, J = 6,3 Hz, H-27), 0,97 (d, J = 7,0 Hz, H-21 tương ứng v i nhóm methyl steroid sapogenin Ngồi ra, phổ 1HNMR hiển thị tín hiệu δH 5,35 (m, H-6 , đặc trưng sterol có nối đơi vị trí số Dữ liệu phổ 13C-NMR có 27 tín hiệu carbon Trong có tín hiệu carbon δC 14,16 (C-21), 16,8 (C-18), 17,28 (C-27), 19,57 (C-19 tương ứng v i tín hiệu nhóm methyl cấu tr c steroid sapogenin Ngoài ra, vùng trường 120 - 141 ppm có hai tín hiệu carbon δC 121,58 140,97 tương ứng v i hai carbon olefin C-5 C6 Tín hiệu 13C-NMR δC 109,44 cho biết tồn spiroketal carbon Hợp chất dự đoán diosgenin Từ việc so sánh liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất SG1 v i tài liệu tham khảo, cấu tr c SG1 xác định (25R -spiros-5-en-3β-ol (diosgenin) Bảng 4.12: Dữ liệu phổ 1H and 13C NMR SG1 so v i diosgenin STT SG1 (pyridine-d5) Diosgenin (pyridine-d5) δH (J/Hz) δC δH (J/Hz) δC 1,85; 1,07; 2H 37,40 1,84 (eq); 1,08 (ax); 2H 37,17 1,86; 1,51; 2H 32,22 1,84 (eq); 1,5 (ax); 2H 31,98 3,52; 1H (m) 71,91 3,49; 1H (br) 71,61 26 42,46 140,97 2,30 (eq); 2,23 (ax); 2H 42,24 140,83 5,35; 1H (m) 121,58 5,35; 1H (br d, J = 5,3) 121,29 1,99; 1,55; 2H 31,62 1,99 (eq); 1,55 (ax); 2H 31,42 1,64; 1H 31,81 1,64; 1H 31,57 0,96; 1H 50,25 0,95; 1H 50,14 10 36,81 36,58 11 1,53; 1,48; 2H 21,04 1,52 (eq); 1,47 (ax); 2H 20,81 12 1,76; 1,21; 2H 39,96 1,74 (eq); 1,18 (ax); 2H 39,72 13 40,44 41,56 14 1,10; 1H 56,70 1,10; 1H 56,49 15 1,98; 1,28 (2H) 32,02 1,99 (eq); 1,29 (ax); 2H 31,76 16 4,43; 1H (q, J = 7,55) 80,98 4,41; 1H (q, J = 7,1) 80,73 17 1,26; 1H 62,30 1,18; 1H 62,18 18 0,79; 3H (s) 16,43 0,79; 3H (s) 16,11 19 1,03; 3H (s) 19,57 1,03; 3H (s) 19,26 20 1,87; 1H 41,79 1,87; 1H 41,56 21 0,97; 3H (d, J = 7,0) 14,66 0,97; 3H (d, J = 7,0) 14,34 22 109,44 109,16 23 1,67; 1,58; 2H 31,57 1,67 (eq); 1,59 (ax); 2H 31,35 24 1,63; 1,46; 2H 28,98 1,62 (eq); 1,45 (ax); 2H 28,74 25 1,62; 1H 30,47 1,62; 1H 30,20 26 27 3,37; 1H (t, J = 10,85) 3,45; 1H (m) 0,79; 3H (d, J = 6,3) 67,01 17,28 27 3,38; 1H (t, J = 10,6) 3,47; 1H (d, dd, J = 10,5) 0,79; 3H (d, J = 6,2) 66,76 16,95 4.3.2.2 Hợp chất SG2 Hợp chất SG2 cô lập từ phân đoạn EA5 cao chiết ethyl acetate (Sơ đồ 4.3) v i liệu vật lí trình bày bên dư i - Chất bột vơ định hình, màu trắng - Phổ 1H and 13C NMR (phụ lục 3, xem bảng 4.13 - Phổ DEPT, COSY, HSQC, HMBC (pyridine-d5 (phụ lục 5, 6, 8) 21 O 25 26 18 17 12 11 19 6" 5" 3" 4" HO 27 24 O 15 1" O HO 14 10 O 23 16 22 13 6' 6''' HOH2C HOH2C 4' 5' O 4''' HO 5''' O 2' HO O 2''' HO 1' 3' 1''' O 3''' OH 20 OH 2" Hình 4.5: Cấu tr c (25R)-spirost-5-en-3-β-ol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)O-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranoside Phổ 1H-NMR xuất hai nhóm methyl tứ cấp δH 0,85 (s), 1,09 (s hai nhóm methyl bậc hai δH 0,72 (d, J = 5,65 Hz), 1,16 (d, J = 6,95 Hz tương ứng v i nhóm methyl steroid sapogenin Ngồi ra, phổ 1H-NMR hiển thị tín hiệu mũi đôi H 5,36 (br d, J = 5,15 Hz , đặc trưng sterol có nối đơi vị trí số Phổ 1HNMR cho thấy tín hiệu hydro carbon anomer δH 4,97 (d, J = 7,35 Hz), 5,13 (d, J = 7,8 Hz), 6,41 (br, s chứng t có monosacharide cấu tr c Tín hiệu nhóm methyl δH 1,77 (d, J = 7,1 Hz gắn vị trí deoxyhexose đường Dữ liệu phổ 13 C-NMR làm r tín hiệu hợp chất thu Cụ thể: Tín hiệu nhóm methyl δC 15,27, 16,59, 17,57, 19,66 tương ứng v i cấu tr c steroid sapogenin Các carbon olefin aglycon củng cố tín hiệu δC 122,10 141,08 Dữ liệu 13 C-NMR cho biết cấu tr c nhánh đường: carbon anomer δC 100,3, 102,47, 104,8 nhóm methyl δC 18,9 từ deoxyhexose Tín hiệu 13C- 28 NMR δC 109,5 cho biết tồn spiro etal carbon Hợp chất spirostane glycoside gắn ba đơn vị đường dựa vào phổ ể Qua liệu HMBC hợp chất cô lập được, tín hiệu proton anomer δH 4,97 (H1’ glucose vị trí 2, ; 5,13 (H-1’’’ nhánh glucose 6,41 (H-1’’ rhamnose cho tương quan v i tín hiệu carbon δC 78,2 (C-3 aglycone ; 82,5 (C-4’ glucose bị vị trí 2, 77,8 (C-2’ glucose bị vị trí 2, Từ việc so sánh liệu phổ 1H-NMR 13 C-NMR, hợp chất SG2 xác định (25R)-spirost-5-en-3β-ol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2 -O-[β-D-glucopyranosyl(1→3 ]-β-D-glucopyranoside (gracillin) Bảng 4.13: Dữ liệu phổ 1H and 13C NMR SG2 so với (25R)-spirost-5-en-3β-ol 3-O-α-Lrhamnopyranosyl-(1→2)-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranoside Gracillin Hợp chất SG2 (pyridine-d5) STT (pyridine-d5) HMBC δH (J/Hz) δC DEPT 1,77 (eq);1,08 (ax); 2H 37,98 CH2 37,8 1,79 (eq); 1,55 (ax); 2H 30,58 CH2 30,4 3,52; 1H 78,35 CH C1’ 78,3 1,89; 1,79; 2H 39,22 CH2 C2, C3, C5, C6, C10 39,0 141,3 C H→C δC 141,1 5,35; 1H (d, J = 5,0) 122,32 CH 1,98; 1,56; 2H 32,82 CH2 32,7 1,68; 1H 32,2 CH 32,1 0,85; 1H 50,78 CH 50,6 37,65 C 37,5 10 C7, C10 122,1 11 1,60; 1,48; 1H 21,59 CH2 21,4 12 1,84; 1,17; 2H 40,37 CH2 40,2 29 13 40,96 C 40,8 14 1,15; 1H 57,15 CH 57,0 15 1,70; 1,46; 2H 32,71 CH2 32,6 16 4,06; 1H 81,6 CH 81,4 17 1,34; 1H 63,4 CH 63,2 18 0,85; 3H (s) 16,81 CH3 C12, C13, C14, C17 16,7 19 1,10; 3H (s) 19,88 CH3 C1, C9, C10 19,7 20 1,83; 1H 21 1,17; 3H (d, J = 6,95) 22 CH 42,47 C13, C17, C21, C22, C23 42,3 C17, C20, C22 15,4 15,49 CH3 109,74 C 109,6 23 1,68; 2H 32,33 CH2 32,0 24 1,61; 2H 29,76 CH2 29,6 25 1,60; 1H 31,09 CH 30,9 26 4,05; 2H 67,36 CH2 C22 67,2 27 0,72; 3H (d, J = 5,65) 17,78 CH3 C24, C25, C26 17,7 1’ 4,98; 1H (d, J = 7,35) 100,51 CH 100,3 2’ 4,96; 1H 78,24 CH 78,0 3’ 4,60; 1H 89,92 CH 89,9 4’ 4,59; 1H 70,02 CH 69,9 5’ 4,58; 1H 77,54 CH 77,3 6’a 4,57; 1H 62,96 6’b 4,56; 1H 3-O-Glc CH2 62,7 Rha (1 > 2) 1” 5,36; 1H (d, J = 7,8) 102,69 CH 102,6 2” 4,33; 1H 72,95 CH 72,8 3” 4,32; 1H 73,27 CH 73,1 30 4” 3,24; 1H 74,62 CH 74,4 5” 3,28; 1H 70,1 CH 69,9 6” 1,77; 3H (d, J = 7,35) 19,16 CH3 18,9 Glc (1→3) 1”’ 5,91; 1H (br, s) 105,01 CH 104,9 2”’ 4,22; 1H 75,48 CH 75,3 3”’ 4,26; 1H 78,99 CH 79,0 4”’ 4,14; 1H 72,02 CH 71,8 5”’ 4,19; 1H 79,18 CH 78,9 6”’ 4,06; 4,05; 2H 62,96 CH2 62,7 4.4 Thử hoạt tính sinh học hợp chất saponin steroid phân lập Hợp chất SG1 phân lập 5mg dùng để giải phổ nên hơng đủ để thử hoạt tính dòng tế bào ung thư lựa chọn MCF-7, Hela, HepG-2 NCI-H460 nên có hợp chất SG2 thử hoạt tính Tuy nhiên, hợp chất SG2 phân lập 13mg sau giải phổ hông đủ để thử hoạt tính dịng ung thư lựa chọn nên thử dòng tế bào MCF-7, HepG-2 NCI-H460 Khảo sát tỷ lệ (% gây độc tế bào dòng tế bào ung thư lựa chọn nồng độ hác thực đối chiếu v i chứng dương Camptothecin nhận thấy hợp chất SG2 cho 50% tế bào ung thư chết Chính vậy, tiếp tục làm thí nghiệm để xác định số IC50 Bảng 4.14: Kết xác định IC50 hợp chất SG2 dòng tế bào ung thư v MCF-7 Mẫu Hợp chất SG2 Nồng độ (µg/ml) 40 30 20 10 Phần trăm gây độc tế bào (%) Lần Lần Lần TB ± ĐLC 92.29 97.41 97.53 95.74 ± 2.99 79.24 90.64 97.01 88.96 ± 9.00 60.31 66.53 63.42 63.42 ± 4.40 39.00 30.08 47.92 39.00 ± 12.62 5.23 7.37 2.20 4.93 ± 2.60 IC50 = 15.57 ± 1.57 31 Bảng 4.15: Kết xác định IC50 hợp chất SG2 dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 Mẫu Hợp chất SG2 Nồng độ (µg/ml) Lần 71.02 51.29 30.28 4.01 Phần trăm gây độc tế bào (%) Lần Lần TB ± ĐLC 70.67 71.59 71.09 ± 0.46 55.09 51.81 52.73 ± 2.06 27.73 34.64 30.88 ± 3.49 0 1.34 ± 5.50 0 IC50 = 3.88 ± 0.06 Bảng 4.16: Kết xác định IC50 hợp chất SG2 dòng tế bào ung thư gan HepG2 Mẫu Hợp chất SG2 Nồng độ (µg/ml) 40 20 10 05 2.5 Lần 96.32 98.47 94.33 73.35 43.80 Phần trăm gây độc tế bào (%) Lần Lần TB ± ĐLC 95.47 97.03 96.27 ± 0.78 97.73 96.18 97.46 ± 1.17 93.48 93.49 93.77 ± 0.49 74.22 71.15 72.91 ± 1.59 43.48 37.91 41.73 ± 3.31 IC50 = 2.97 ± 0.12 Bảng 4.17: IC50 (µg/ml mẫu dịng tế bào ung thư STT Tên Cao Hợp chất SG2 Dòng tế bào MCF-7 NCI-H460 HepG2 15.57 ± 1.57 3.88 ± 0.06 2.97 ± 0.12 → Nhận xét: Qua kết khảo sát IC50 hợp chất SG2 dòng tế bào ung thư lựa chọn MCF-7, HepG-2 NCI-H460, nhận thấy hợp chất SG2 cho kết độc tế bào ung thư cao v i dòng tế bào gan Hep G2, kế dịng ung thư phổi NCI – H460 cuối dòng tế bào ung thư v MCF-7 Kết khảo sát tương ứng v i kết cao ethyl acetate cho thử nghiệm dòng tế bào tương tự 32 V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Qua trình nghiên cứu Khảo sát hoạt tính sinh học tách chiết hợp chất saponin steroid loài Bảy hoa (Paris yunanensis Franch, Trilliaceae) Kon Tum, thu số ết sau: - Từ 2,5 g nguyên liệu hô phương pháp chiết ngấm iệt v i dung môi EtOH 70% chiết xuất 300 g cao tổng - Từ 300 g cao tổng phương pháp chiết l ng - l ng v i dung môi diethyl ether, ethyl acetate, n-butanol nư c thu cao phân đoạn - Thử hoạt tính sinh học cao tổng cao phân đoạn dòng tế bào ung thư lựa chọn (MCF-7, HepG2, Hela NCI-H 460 Kết cho thấy, cao phân đoạn ethyl acetate cho hoạt tính chống ung thư dòng tế bào lựa chọn v i số IC50 (µg/ml là:  Cao hoạt tính tế bào ung thư gan HepG2: IC50 = 38.40 ± 0.50  Kế đến hoạt tính tế bào ung thư phổi NCI-H460: IC50 = 41.72 ± 1.42  Tiếp theo hoạt tính tế bào ung thư cổ tử cung Hela: IC50 = 41.72 ± 1.42  Cuối hoạt tính tế bào ung thư v MCF-7: IC50 = 58.45 ± 4.20 - Từ 50 g cao phân đoạn ethyl acetate có hoạt tính phân lập hợp chất saponin steroid SG1 SG2 Xác định cấu tr c hợp chất phân lập được, đối chiếu v i tài liệu tham hảo xác định hợp chất phân lập tương ứng là: SG1 (Diosgenin) SG2 (Gracillin) - Thử hoạt tính sinh học hợp chất Gracillin dòng tế bào ung thư lựa chọn (MCF-7, HepG-2 NCI-H460 Kết hợp chất Gracillin cho hoạt tính chống ung thư dịng tế bào lựa chọn tương ứng v i hoạt tính dòng cao ethyl acetate, v i số IC50 (µg/ml là:  Cao hoạt tính tế bào ung thư gan HepG2: IC50 = 2.97 ± 0.12  Kế đến hoạt tính tế bào ung thư phổi NCI-H460: IC50 = 3.88 ± 0.06  Cuối hoạt tính tế bào ung thư v MCF-7: IC50 = 15.57 ± 1.57 33 5.2 Kiến nghị Tiếp tục hảo sát phân đoạn lại để phân lập hợp chất tinh hác góp phần xác định hợp chất hóa học Tiến hành xây dựng quy trình định tính định lượng dược liệu từ hợp chất tách chiết phương pháp HPLC góp phần cho cơng tác tiêu chuẩn hóa sau Thử hoạt tính sinh học tác dụng háng huẩn, háng nấm hợp chất phân lập 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Chương cộng (2004 , Cây Thuốc động vật làm thuốc Việt Nam (Tập , NXB hoa học ĩ thuật, tr.182 – 184 [2] GS TSKH Nguyễn Tiến Bân, GS TSKH Trần Đình Lý, TS Nguyễn Tập cộng (2007 , Sách đ Việt Nam (Phần II- Thực Vật , Nhà xuất Khoa Học Tự Nhiên Công Nghệ, tr 495 [3] Phạm Hoàng Hộ (2001 , Cây c Việt Nam, NXB trẻ, III, tr 474-475 [4] V Văn Chi (2007 , Sách tra cứu tên c Việt Nam, NXB Giáo dục, tr.59, 400 [5] V Văn Chi, Từ điển thuốc Việt Nam (Tập 2), NXB y học, tr 775 TIẾNG ANH [6] A Monks, D.Scudiero, P.Skehan, R Shoemake, K.Paull, D.Vistica, C.Hose, J.Langley, P Cronise, H.Campbell, J.Mayo, M.Boyd (1991), Feasibility of a highflux anticancer drug screen using a diverse panel of cultured human tumor cell lines, Journal of National Cancer Institute, Vol 11 (83): 757-766 [7] Cai, J.; Liu, M.; Wang, Z.; Ju, Y., Apoptosis induced by dioscin in Hela cells Biological & Pharmaceutical Bulletin 2002, 25 (2), 193-196 [8] Chibber, R.; Hagan, R Core glcnac-t inhibitors 2012 [9] Dawei D., Denis R L., Janine M C., Dwayne J J., Kirstin V W., Jenine E U., Richard D C., Ming Z W., Ming Z L., ANTIFUNGAL SAPONINS FROM PARIS POLYPHYLLA SMITH, PlantaMed,Vol 74 (2008), pp 1397–1402 [10] Jing S., Bao R L., Wen J H., Li X Y Xiao P Q., SHORT COMMUNICATION: IN VITRO ANTICANCER ACTIVITY OF AQUEOUS EXTRACTS AND ETHANOL EXTRACTS OF FIFTEEN TRADITIONAL CHINESE MEDICINES ON HUMAN DIGESTIVE TUMOR CELL LINES, Phytotherapy research, Vol 21 (2007), pp 1102-1104 [11] Li P K., YiX L., Tolga E., Else D., He S Y., Yang Z.,Cheng Q X., Chao L., 35 Thomas E., Bai P M., POLYHYDROXYLATED STEROIDAL GLYCOSIDES FROM PARIS POLYPHYLLA, Journal of Natural Products, Vol 75 (2012), pp 1201-1205 [12] M C Alley, D A Scudiero, A Monks, M L Hursey, M J Czerwinski, D L Fine, B J Abbot, J G Mayo, R H Shoemaker and M R Boyd (1988), Feasibility of Drug Screening with Panels of Human Tumor Cell Lines Using a Microculture Tetrazolium Assay, Cancer Research, Vol 48 ( 3): 589-601 [13] Mei S L., Judy C Y W., Siu K K.,Biao Y.,Vincent O E C., Henry W N C., Thomas M C W., Kwok P F., RESEARCH PAPER: EFFECTS OF POLYPHYLLIN D, A STEROIDAL SAPONIN IN PARIS POLYPHYLLA, IN GROWTH INHIBITION OF HUMAN BREAST CANCER CELLS AND IN XENOGRAFT, Cancer Biology & Therapy, Vol (2005), pp 1248-1254 [14] Sheo B S, Raghunath S R Hans R S., SPIROSTANOL SAPONINS FROM PARIS POLYPHYLLA, STRUCTURES OF POLYPHYLLIN C, D, E AND F, Phytochemistry, Vol 21 (1982), pp 2925-2929 [15] Sheo B S, Raghunath S R Hans R S., FUROSTANOL
PARIS POLYPHYLLA: STRUCTURES SAPONINS FROM OF POLYPHYLLIN G AND H, Phytochemistry, Vol.21 (1982), pp 2079-2082 [16] Tal, B.; Tamir, I.; Rokem, J S.; Goldberg, I., Isolation and characterization of an intermediate steroid metabolite in diosgenin biosynthesis in suspension cultures of Dioscorea deltoidea cells Biochem J 1984, 219 (2), 619-24 [17] Xia W.,Lei W., Hui W., Yi D., Wen C Y., Yao L L., STEROIDAL SAPONINS FROM PARIS POLYPHYLLA VAR YUNNANENSIS, Phytochemistry, Vol 81 (2012), pp 133-143 36