Định danh tên khoa học và phân lập hợp chất saporin steroid của loài bảy lá một hoa paris sp trilliaceae ở kontum

BÁO CÁO NGHIỆM THU Tên đề tài: “Định danh tên khoa học phân lập hợp chất saponin steroid loài Bảy hoa Kon Tum (Paris.sp, Trilliaceae)” Chủ nhiệm đề tài: CN Lâm Bích Thảo Cơ quan chủ trì: Trung tâm phát triển khoa học cơng nghệ trẻ Thời gian thực đề tài: 12/2012 đến 12/2013 Kinh phí thực đề tài: 80.000.000đ (Tám mươi triệu đồng) Kinh phí cấp: 72.000.000đ (Bảy mươi hai triệu đồng) theo TB số: TB-SKHCN ngày Mục tiêu: Định danh xác định tên khoa học loài Bảy hoa Kon Tum Định tính định lượng saponin toàn phần loài Bảy hoa Kon Tum Phân lập tinh chế hợp chất saponin steroid loài Bảy hoa Kon Tum Nội dung: Công việc dự kiến Công việc thực Khảo sát mặt thực vật học Xác định tên khoa học khảo sát vi học loài Bảy hoa Kon Tum Thu hái, xử lý mẫu (Thân rễ loài Bảy Thu hái xử lý 2,5kg nguyên liệu hoa Kon Tum) chiết xuất khơ; chiết xuất 300g cao tồn phần; loại cao phân đoạn 8,8182g cao ether ethylic; 51,2075g cao ethyl acetate 46,5387g cao n-butanol Định tính định lượng saponin Hàm lượng saponin toàn phần toàn phần Bảy hoa Kon Tum đạt: 14,89% Phân lập tinh chế hợp chất Tách chiết hỗn hợp gồm chất là: stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranoside β- saponin steroid sitosterol -3-O-β-D-glucopyranoside spirostanol saponin gracillin LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đề tài nhận nhiều giúp đỡ, động viên hướng dẫn tận tình Thầy, Cô hỗ trợ bạn nghiệp Với lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến với: PGS.TS Trần Công Luận ThS Dương Thị Mộng Ngọc, Thầy Cơ tận tình hướng dẫn khoa học dành thời gian q báu giúp đỡ tơi hồn thành đề tài Ban lãnh đạo Trung tâm Sâm Dược liệu TPHCM tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực đề tài thực đề tài Các bạn đồng nghiệp Phòng – Hóa Chế Phẩm có ý kiến đóng góp để đề tài tơi hồn thiện Em Châu Thị Nhã Trúc người đồng hành suốt trình thực đề tài TP.HCM, ngày 13 tháng 06 năm 2014 CN Lâm Bích Thảo TĨM TẮT ĐỀ TÀI TIẾNG VIỆT ĐỊNH DANH TÊN KHOA HỌC VÀ PHÂN LẬP HỢP CHẤT SAPONIN STEROID CỦA LOÀI BẢY LÁ MỘT HOA (PARIS SP, TRILLIACEAE) Vật liệu phương pháp nghiên cứu Vật liệu: Thân rễ Bảy hoa thu hái Kon Tum Phương pháp nghiên cứu: Định danh dựa vào hình thái bên ngồi mẫu tươi, đồng thời vào tài liệu mơ tả hình thái TV & phân bố loài để xác định loài khảo sát Hàm lượng saponin toàn phần thân rễ Bảy hoa xác định phương pháp Namba Sử dụng phương pháp chiết lỏng - lỏng, sắc kí cột để phân lập hợp chất, sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều hai chiều để xác định cấu trúc hợp chất phân lập Kết quả: Tên khoa học loài Bảy hoa khảo sát: Paris yunanensis Franch Hàm lượng saponin toàn phần thân rễ 14,89% tính theo trọng lượng khơ tuyệt đối Phân lập hai hợp chất gồm: gracillin hỗn hợp stigmasterol 3-O- β-Dglucopyranoside β -sitosterol-3-O- β-D-glucopyranoside Kết luận: Đây nghiên cứu hình thái học thành phần hóa học Paris yunanensis thu thập miền Nam Việt Nam TIẾNG ANH DETERMINATION SCIENTIFIC NAME AND ISOLATION SAPONIN STEROID COMPOUNDS IN PARIS SP., TRILLIACEAE IN KON TUM, VIET NAM Materials and methods Material: Roof of Paris sp Trilliacea collected in Kon Tum province Method:  Determination scientific name: Base on superficial morphology and distribution of tree, and scientific documents of Paris sp  The saponin composition of the root of Paris sp was quantitatively determined by NAMBA’s weight methol  Compounds were purified and isolated by column chromatographic Their chemical structures were elucidated on the basis of spectroscopic analyses and compared with those of liturature references Results  Specie of this plant growing in Kon Tum was determine as Paris yunanensis Franch  The result revealed that the total saponin content was 14,89 %, on absolutely dry basis  Two compounds were identified as gracillin (1), and a mixture included stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranoside (2) and β-sitosterol-3-O-β-D- glucopyranoside (3) Conclusion This is the first study on morphology and chemical constituents of Paris yunanensis collected in Southern Vietnam MỤC LỤC Trang Phần mở đầu Lời cảm ơn Giới thiệu đề tài tiếng Việt Giới thiệu đề tài tiếng Anh Mục lục 5-7 Danh sách chữ viết tắt Danh sách hình Danh sách bảng 10 Bảng tốn kinh phí chi 11 I- Tổng quan 12 Đại cương thực vật học 12 1.1 Vị trí phân loại thực vật học 12 1.2 Đặc điểm thực vật họ Trọng Lâu (Trilliaceae) 12 1.2.1 Đặc điểm thực vật học Bảy hoa 13 1.2.2 Phân bố, sinh thái 13 1.2.3 Thành phần hóa học 14 1.2.4 Tác dụng dược lý 18 II- Nội dung phương pháp 21 Thực vật học Bảy hoa Kon Tum 21 1.1 Mô tả 21 1.2 Phương pháp nghiên cứu 21 1.3 Sản phẩm nội dung cần đạt 21 Xác định hàm lượng saponin toàn phần Bảy hoa Kon Tum 21 2.1 Mất khối lượng làm khơ 21 2.2 Định tính hợp chất saponin có dược liệu 22 2.2.1 Phương pháp hóa học 22 2.2.2 Sắc kí lớp mỏng 22 2.3 Định lượng saponin toàn phần phương pháp Namba 24 2.4 Sản phẩm nội dung cần đạt 24 Chiết xuất 24 3.1 Đối tượng 24 3.2 Phương pháp 24 3.3 Sản phẩm nội dung cần đạt 25 Tách chiết hợp chất saponin steroid 25 4.1 Đối tượng 25 4.2 Phương pháp 25 4.3 Sản phẩm nội dung cần đạt 26 III- Kết 27 Thực vật học loài Bảy hoa Kon Tum 27 1.1 Tên khoa học Bảy hoa Kon Tum 27 1.2 Mơ tả hình thái 27 1.3 Sinh học sinh thái 28 1.4 Phân bố 28 1.5 Giá trị sử dụng 28 1.6 Khảo sát vi học 28 1.6.1.Vi phẩu 28 1.6.2 Soi bột 35 Xác định hàm lượng saponin toàn phần Bảy hoa Kon Tum 36 2.1 Độ ẩm 36 2.2 Định tính hợp chất saponin 36 2.2.1 Bằng phương pháp hóa học 36 2.2.2 Bằng sắc kí lớp mỏng 37 2.3 Định lượng saponin tồn phần phương pháp NamBa 38 Chiết xuất 38 3.1 Chiết xuất cao tổng 38 3.2 Chiết xuất cao phân đoạn 39 Phân lập tinh chế hợp chất saponin steroid 40 4.1 Phân lập hợp chất saponin steroid từ phân đoạn cao ethyl acetate 40 4.2 Biện giải cấu trúc hai hợp chất cô lập 43 4.2.1 Hợp chất EA3.2 43 4.2.2 Hợp chất EA5.3 47 IV- Kết luận kiến nghị 51 Kết luận 51 Kiến nghị 52 Mục lục 1: Các phổ hợp chất EA3.2 53 Mục lục 1: Các phổ hợp chất EA5.3 54 Tài liệu tham khảo 55 DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT Cosy d dd COrrelation SpectroscopY Doublet (mũi đôi) Doublet-doublet (mũi đôi-đôi) DEPT EtOH EtOAc Glc HMBC HR-ESI-MS HPLC HSQC H2SO4 Hz/MHz IR J m KOH MeOH NMR PĐ Rf s STT SKLM t Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Ethanol Ethyl acetat Glucopyranosyl Heteronuclear Multiple Bond Coherence High Resolution ElectroSpray Ionization Mass Spectroscopy High Performance Liquid Chromatography Heteronuclear Single Quantum Correlation Acid sulfuric Hertz / MegaHertz (đơn vị tần số) Infra red (quang phổ hồng ngoại) Hằng số ghép cặp (coupling constant, phổ 1H-NMR) Multiplet (mũi đa) Kali hydroxyd Methanol Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy Phân đoạn Retardation factors Singlet (mũi đơn) Sớ thứ tự Sắc kí lớp mỏng Triplet (mũi ba) TT TLTK UV Thuốc thử Tài liệu tham khảo Ultraviolet, tử ngoại DANH SÁCH SƠ ĐỒ VÀ HÌNH SỐ TÊN SƠ ĐỒ Quy trình chiết dịch chấm sắc kí hợp chất saponin lồi Bảy TRANG 23 hoa Kon Tum Sơ đồ điều chế cao tổng 38 Sơ đồ điều chế cao phân đoạn 39 Quá trình cô lập hợp chất EA3.2 EA5.3 41 SỐ TÊN HÌNH ẢNH TRANG Cây Bảy hoa thu hái Kon Tum 27 Các thành phần loài Paris yunanensis Franch 28 Đặc điểm vi phẩu thân rễ Bảy hoa 30 Đặc điểm vi phẩu thân Bảy hoa 32 Đặc điểm vi phẩu Bảy hoa 34 Các cấu tử bột thân rễ Bảy hoa 35 Sắc kí đồ SKLM định tính saponin lồi Bảy hoa 37 Sắc kí đồ SKLM cao phân đoạn 40 Sắc kí đồ SKLM phân đoạn tách từ cao ethyl acetate 42 10 Sắc kí đồ SKLM hợp chất EA3.2 lập từ phân đoạn cao ethyl 42 acetate 11 Sắc kí đồ SKLM hợp chất EA5.3 lập từ phân đoạn cao ethyl acetate 43 DANH SÁCH BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG Các phân đoạn tách từ cao ethyl acetate 26 Độ ẩm thân rễ Bảy hoa 36 Kết định tính saponin phản ứng hóa học 36 Kết định lượng saponin tồn phần có dược liệu 38 So sánh phổ 13C –NMR EA3.2 với Sc2, stigmasterol 3-O- βD-glucopyranoside β -sitosterol-3-O- β-D-glucopyranoside 45 10 EA3.2-IR EA3.2- Phổ IR 56 EA3.2- Phổ 1H 57 EA3.2- Phổ 13C 58 EA3.2- Phổ DEPT 59 PHỤ LỤC – CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT EA5.3 60 EA5.3- Phổ 1H 61 EA5.3- Phổ 13C 62 EA5.3- Phổ DEPT 63 EA5.3- Phổ COSY 64 EA5.3- Phổ HSQC 65 EA5.3- Phổ HMBC 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nước [1] Dawei D., Denis R L., Janine M C., Dwayne J J., Kirstin V W., Jenine E U., Richard D C., Ming Z W., Ming Z L., ANTIFUNGAL SAPONINS FROM PARIS POLYPHYLLA SMITH, PlantaMed,Vol 74 (2008), pp 1397–1402 [2] Jing S., Bao R L., Wen J H., Li X Y Xiao P Q., SHORT COMMUNICATION: IN VITRO ANTICANCER ACTIVITY OF AQUEOUS EXTRACTS AND ETHANOL EXTRACTS OF FIFTEEN TRADITIONAL CHINESE MEDICINES ON HUMAN DIGESTIVE TUMOR CELL LINES, Phytotherapy research, Vol 21 (2007), pp 1102-1104 [3] Li P K., YiX L., Tolga E., Else D., He S Y., Yang Z.,Cheng Q X., Chao L., Thomas E., Bai P M., POLYHYDROXYLATED STEROIDAL GLYCOSIDES FROM PARIS POLYPHYLLA, Journal of Natural Products, Vol 75 (2012), pp 12011205 [4] Mei S L., Judy C Y W., Siu K K.,Biao Y.,Vincent O E C., Henry W N C., Thomas M C W., Kwok P F., RESEARCH PAPER: EFFECTS OF POLYPHYLLIN D, A STEROIDAL SAPONIN IN PARIS POLYPHYLLA, IN GROWTH INHIBITION OF HUMAN BREAST CANCER CELLS AND IN XENOGRAFT, Cancer Biology & Therapy, Vol (2005), pp 1248-1254 [5] Sheo B S, Raghunath S R Hans R S., SPIROSTANOL SAPONINS FROM PARIS POLYPHYLLA, STRUCTURES OF POLYPHYLLIN C, D, E AND F, Phytochemistry, Vol 21 (1982), pp 2925-2929 [6] Sheo B S, Raghunath S R Hans R S., FUROSTANOL 
 PARIS POLYPHYLLA: STRUCTURES SAPONINS FROM OF POLYPHYLLIN G AND H, Phytochemistry, Vol.21 (1982), pp 2079-2082 67 [7] Xia W.,Lei W., Hui W., Yi D., Wen C Y., Yao L L., STEROIDAL SAPONINS FROM PARIS POLYPHYLLA VAR YUNNANENSIS, Phytochemistry, Vol 81 (2012), pp 133-143 [18] N.P.Rai1, B.B.Adhikari1 and Arjun Paudel1, K.Masuda2, R.D.Mckelvey3 anh M.D.Manandhar1*, Phytochemical constituents of the flowers of Sarcococca coriaceae of Nepalese origin, J Nepal Chem.Soc., Vol.21, 2006 [19] Chuan Li, Biao Yu *, Meizheng Liu, Yongzheng Hui*, Synthesis of diosgenyl αL- rhamnopyranosyl –(1→2)-[β-D-glucopyranosyl–(1→3)]-β-D-glucopyranoside (Gracillin)1 and related saponin, Carbohydrate Research 306 (1998), pp 189-195 Trong nước [8] Trần Cơng Khánh, 1981 Thực tập hình thái giải phẫu thực vật NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp Hà Nội [9] Viện Dược liệu, 1982 Kiểm nghiệm dược liệu (tập 3) NXB Y học [10] Bộ Y tế, 2010 Dược điển Việt Nam IV, Hà Nội [11] Bộ môn Dược liệu, Đại học Y – Dược Tp.HCM, 2007 Giáo trình thực tập Dược liệu [12] Bộ Khoa học Cơng nghệ,Thực vật chí Việt Nam - tập 8, NXB khoa học kĩ thuật, tr.317-318 [13] Võ Văn Chi (2007), Sách tra cứu tên cỏ Việt Nam, NXB Giáo dục, tr.59, 400 [14] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Chương cộng (2004), Cây Thuốc động vật làm thuốc Việt Nam (Tập 1), NXB khoa học kĩ thuật, tr.182 – 184 [15] GS TSKH Nguyễn Tiến Bân, GS TSKH Trần Đình Lý, TS Nguyễn Tập cộng (2007), Sách đỏ Việt Nam (Phần II- Thực Vật), Nhà xuất Khoa Học Tự Nhiên Công Nghệ, tr 495 [16] Phạm Hoàng Hộ (2001), Cây cỏ Việt Nam, NXB trẻ, III, tr 474-475 [17] Võ Văn Chi, Từ điển thuốc Việt Nam (Tập 2), NXB y học, tr 775 68 69 70