Chiết xuất và so sánh hoạt tính sinh học của loài bảy lá một hoa ở kon tum paris polyphylla var yunanensis và bảy lá một hoa phía bắc paris polyphylla var chinensis

BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU BÁO CÁO TỔNG KẾT NHIỆM VỤ THƯỜNG XUYÊN CHIẾT XUẤT VÀ SO SÁNH HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LỒI BẢY LÁ MỘT HOA Ở KON TUM (PARIS POLYPHYLLA VAR YUNANENSIS) VÀ BẢY LÁ MỘT HOA PHÍA BẮC (PARIS POLYPHYLLA VAR CHINENSIS) Chủ nhiệm nhiệm vụ Đơn vị Thời gian thực CN LÂM BÍCH THẢO Trung tâm Sâm Dược liệu Tp Hồ Chí Minh 12/2016 đến 11/2017 Tp Hồ Chí Minh – 12/2017 BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU BÁO CÁO TỔNG KẾT NHIỆM VỤ THƯỜNG XUYÊN CHIẾT XUẤT VÀ SO SÁNH HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LỒI BẢY LÁ MỘT HOA Ở KON TUM (PARIS POLYPHYLLA VAR YUNANENSIS) VÀ BẢY LÁ MỘT HOA PHÍA BẮC (PARIS POLYPHYLLA VAR CHINENSIS) CHỦ NHIỆM NHIỆM VỤ TRƯỞNG ĐƠN VỊ VIỆN DƯỢC LIỆU Tp Hồ Chí Minh – 12/2017 MỤC LỤC Trang PHẦN A: CÁC THÔNG TIN CHUNG I.TĨM TẮT NỘI DUNG, CƠNG VIỆC CHỦ YẾU Đà ĐẠT ĐƯỢC II.CÁC SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI III.TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ PHẦN B: NỘI DUNG BÁO CÁO TỔNG KẾT I MỞ ĐẦU II – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ THỰC VẬT HỌC 2.1.1 Đặc điểm thực vật họ Trọng Lâu (Trilliaceae) 2.1.2 Đặc điểm thực vật học loài Paris yunnanensis Franch 2.1.3 Đặc điểm thực vật học loài Paris chinensis Franch 2.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 2.2.1 Saponin steroid 2.2.1.FLavon 12 2.2.2.Phytoecdyson 12 2.2.3.Phenylpropanoid 13 2.2.4.Các hợp chất khác 13 2.3.Tác dụng dược lý 13 2.3.1.Tính kháng ung thư 13 2.3.2.Tác động điều hòa miễn dịch 15 2.3.3 Tác dụng đông chống đông 15 2.3.4 Tác dụng kháng nấm, kháng virus, trừ giun sán 15 2.3.5 Tác dụng thu hẹp ung thư tử cung, tim mạch, tiêu hóa 16 2.3.6 Tác dụng giảm đau an thần 16 2.3.7 Tác dụng điều hòa sinh trưởng thực vật 16 III.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Vật liệu 17 3.1.1 Nguyên liệu 17 3.1.2 Các chủng vi khuẩn sử dụng để xác định tính kháng khuẩn: 17 3.1.3 Các dòng tế bào ung thư 17 3.1.4 Thiết bị - dụng cụ 17 3.1.5 Hoá chất chất chuẩn 18 3.2 Phương pháp nghiên cứu 18 3.2.1 Chiết xuất cao tổng cao phân đoạn 18 3.2.2 Phương pháp kiểm tra khả kháng khuẩn cách xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC với phương pháp pha lỗng mơi trường rắn (Sử dụng cho cao chiết xuất từ loại dược liệu) 18 3.2.3 Thử hoạt tính sinh học cao tổng cao phân đoạn 19 3.2.4 Xác định hàm lượng saponin toàn phần cao toàn phần 22 3.2.4.1 Độ ẩm 22 3.2.4.2 Định tính xác định diện hợp chất saponin 22 3.2.4.3 Xác định hàm lượng saponin toàn phần 23 IV KẾT QUẢ 24 4.1 Chiết xuất cao tổng cao phân đoạn 24 4.2.Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao tổng cao phân đoạn 25 4.2.1.Hoạt tính kháng khuẩn cao tổng cao phân đoạn chiết từ dược liệu Bảy hoa Kon Tum 25 4.2.2 Hoạt tính kháng khuẩn cao tổng cao phân đoạn chiết từ dược liệu Bảy hoa phía Bắc 28 4.3.Thử hoạt tính sinh học cao tổng cao phân đoạn 31 4.3.1 Thử nghiệm sơ hoạt tính cao chiết 31 4.3.1.1 Cao tổng cao phân đoạn chiết từ Bảy hoa Kon Tum 31 4.3.1.2 Cao tổng cao phân đoạn chiết từ Bảy hoa phía Bắc 32 4.3.2 Kết thử nghiệm xác định IC50 cao phân đoạn ethyl acetat 35 4.3.2.1 Kết IC50 cao ethyl acetat chiết từ Bảy hoa Kon Tum 35 4.3.2.2 Kết IC50 cao ethyl acetat chiết từ Bảy hoa phía Bắc 36 4.4 Xác định hàm lượng saponin toàn phần cao toàn phần 37 4.4.1 Độ ẩm 37 4.4.2 Định tính xác định diện hợp chất saponin cao tổng 38 4.4.3 Xác định hàm lượng saponin toàn phần theo chuẩn Gracillin 39 V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 5.1 Kết luận 42 5.2 Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 DANH MỤC CÁC CỤM TỪ – KÝ HIỆU VIẾT TẮT Kí hiệu chữ viết tắt Viết đầy đủ BLMH Bảy hoa KT Kon Tum MeOH Methanol n-BuOH n-butanol PB Phía Bắc Rf ratio of flow SKLM sắc ký lớp mỏng UV ultraviolet - visible DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1: Các nồng độ pha loãng thử nghiệm MIC 19 Bảng 2: Khối lượng cao tổng thu từ vùng dược liệu 24 Bảng 3: Khối lượng cao phân đoạn thu từ cao tổng 24 Bảng Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao tổng 25 Bảng Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao diethyl ether 26 Bảng Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao ethyl acetat 26 Bảng Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao n – Butanol 26 Bảng Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao nước 26 Bảng Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao tổng 28 Bảng 10 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao diethyl ether 28 Bảng 11 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao ethyl acetat 28 Bảng 12 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao n – Butanol 28 Bảng 13 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao phân đoạn nước 29 Bảng 14 Bảng so sánh kết xác định MIC cao toàn phần cao phân đoạn vùng dược liệu khảo sát 30 Bảng 15: Tỷ lệ (%) gây độc tế bào dòng tế bào ung thư vú MCF-7 nồng độ 100 µg/ml 31 Bảng 16: Tỷ lệ (%) gây độc tế bào dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa nồng độ 100 µg/ml 32 Bảng 17: Tỷ lệ (%) gây độc tế bào dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 nồng độ 100 µg/ml 32 Bảng 18: Tỷ lệ (%) gây độc tế bào dòng tế bào ung thư gan HepG2 nồng độ 100 µg/ml 32 Bảng 19: Tỷ lệ (%) gây độc tế bào dòng tế bào ung thư vú MCF-7 nồng độ 100 µg/ml 32 Bảng 20: Tỷ lệ (%) gây độc tế bào dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa nồng độ 100 µg/ml 33 Bảng 21: Tỷ lệ (%) gây độc tế bào dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 nồng độ 100 µg/ml 33 Bảng 22: Tỷ lệ (%) gây độc tế bào dòng tế bào ung thư gan HepG2 nồng độ 100 µg/ml 33 Bảng 23: Tỷ lệ % gây độc tế bào chứng dương Camptothecin đối chiếu 34 Bảng 24:Tổng hợp tỷ lệ (%) gây độc tế bào dòng tế bào ung thư nồng độ 100 µg/ml 34 Bảng 25: Kết xác định IC50 dòng tế bào ung thư vú MCF-7 35 Bảng 26: Kết xác định IC50 dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela 35 Bảng 27: Kết xác định IC50 dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 35 Bảng 28: Kết xác định IC50 dòng tế bào ung thư gan HepG2 35 Bảng 29: Kết xác định IC50 dòng tế bào ung thư vú MCF-7 36 Bảng 30: Kết xác định IC50 dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela 36 Bảng 31: Kết xác định IC50 dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 36 Bảng 32: Kết xác định IC50 dòng tế bào ung thư gan HepG2 36 Bảng 33: IC50 (µg/ml) cao ethyl acetat chiết xuất từ dược liệu dòng tế bào ung thư 37 Bảng 34: Độ ẩm cao tổng chiết xuất từ dược liệu Bảy hoa Kon Tum 37 Bảng 35: Độ ẩm cao tổng chiết xuất từ dược liệu Bảy hoa phía Bắc 38 Bảng 36: Bảng hàm lượng mật độ quang chất chuẩn Gracillin 39 Bảng 37: Kết xác định hàm lượng hợp chất saponin theo chuẩn Gracillin có cao Bảy hoa Kon Tum 40 Bảng 38: Kết xác định hàm lượng hợp chất saponin theo chuẩn Gracillin có cao Bảy hoa Phía Bắc 41 DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỜ Trang Hình 1: Hình thái thực vật học lồi Paris yunnanensis Franch Hình 2: Hình thái thực vật học loài Paris chinensis Franch Hình 3: Cấu trúc Gracillin 12 Hình 4: Bảy hoa Kon Tum 17 Hình 5: Bảy hoa phía Bắc 17 Sơ đồ 1: Sơ đồ điều chế cao tổng 24 Hình 6: Sắc kí đồ cao tổng cao phân đoạn Bảy hoa Kon Tum 25 Hình 7: Sắc kí đồ cao tổng cao phân đoạn Bảy hoa phía Bắc 25 Hình 8: Kết thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn cao tổng cao phân đoạn chiết từ dược liệu Bảy hoa Kon Tum 27 Hình 9: Kết thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn cao tổng cao phân đoạn chiết từ dược liệu Bảy hoa phía Bắc 30 Hình 10: Kết phản ứng hóa học xác định diện hợp chất saponin cao tổng chiết xuất từ dược liệu khảo sát 38 Hình 11: Kết sắc kí lớp mỏng xác định diện chuẩn Gracillin hợp chất saponin cao tổng chiết xuất từ dược liệu khảo sát 39 Hình 12: Đồ thị chuẩn Gracillin đo bước sóng hấp thu cực đại  = 460 nm 40 PHẦN A: CÁC THƠNG TIN CHUNG I TĨM TẮT NỘI DUNG, CƠNG VIỆC CHỦ YẾU Đà ĐẠT ĐƯỢC STT Sảm phẩm phải đạt theo Sảm NỘI DUNG đạt kế hoạch 01 02 03 04 phẩm Đánh giá Thu thập xử lý nguyên Nguyên liệu đủ đạt yêu Nguyên liệu liệu cầu nghiên cứu đủ cho nghiên cứu Chiết xuất cao tổng Cao tổng cao phân 10 loại cao cao phân đoạn đoạn (20-30g/loại) So sánh hàm lượng saponin toàn phần cao tổng lồi Bảy hoa khảo sát Thử hoạt tính kháng khuẩn Hàm lượng saponin toàn Báo cáo phần cao tổng loài Bảy hoa khảo sát Hoạt tính kháng khuẩn Báo cáo cao tổng cao phân cao tổng cao phân đoạn loài Bảy đoạn loài Bảy hoa khảo sát 05 hoa khảo sát Thử hoạt tính sinh học Hoạt tính sinh học cao Báo cáo cao tổng cao phân tổng cao phân đoạn đoạn dòng tế bào ung dòng tế bào ung thư lựa thư lựa chọn (MCF-7, chọn (MCF-7, HepG-2, HepG-2, Hela, NCIH 460) Hela, NCIH 460) 06 Báo cáo tổng kết Bảng, số liệu báo cáo chi Báo cáo tiết II CÁC SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI TT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học hoặc/và tiêu kinh tế - kỹ thuật Đăng ký 01 Đạt Cao tổng cao phân 20-30g/ loại 20-30g/ loại đoạn cao cao Cao ethyl acetate 88.79 85.37 81.46 85.21 ± 3.67 Cao n – butanol 37.81 30.77 31.32 33.30 ± 3.92 Cao nước -3.45 -0.79 -4.09 -2.78 ± 1.75 Bảng 23: Tỷ lệ % gây độc tế bào chứng dương Camptothecin đối chiếu % gây độc tế bào Dịng tế bào Nồng độ CPT (µg/ml) Lần Lần Lần TB ±ĐLC HeLa 64,33 58,83 59,33 60,83 ± 3,04 Hep G2 0,07 60,23 57,88 59,03 59,04 ± 1,18 MCF-7 0,01 61,56 63,99 66,08 63,88 ± 2,26 NCI-H460 0,01 82,57 78,65 81,02 80,75 ± 1,97 Bảng 24:Tổng hợp tỷ lệ (%) gây độc tế bào dòng tế bào ung thư nồng độ 100 µg/ml Cao chiết Tên dược liệu Nồng độ Phần trăm (%) gây độc tế bào (µg/ml) ( Trung bình ± Độ lệch chuẩn) Cao tổng BLMH KT 100 3.97 ± 0.55 2.98 ± 1.34 BLMH PB 100 6.66 ± 0.50 12.94 ± 1.52 Diethyl ether BLMH KT 100 15.63 ± 1.29 6.92 ± 2.44 19.99 ± 1.60 -5.46 ± 2.65 BLMH PB 100 8.36 ± 3.65 -1.09 ± 3.55 7.60 ± 2.88 -2.78 ± 1.75 Ethyl acetat BLMH KT 100 88.61 ± 4.72 83.32 ± 2.54 92.14 ± 0.54 71.55 ± 2.75 BLMH PB 100 92.89 ± 1.49 88.91 ± 2.58 92.34 ± 2.79 85.21 ± 3.67 n-butanol BLMH KT 100 4.79 ± 2.15 3.85 ± 4.00 11.22 ± 1.12 -3.64 ± 5.22 BLMH PB 100 34.80 ± 2.97 15.46 ± 5.24 28.37 ± 2.93 33.30 ± 3.92 BLMH KT 100 2.70 ± 1.94 2.77 ± 2.12 2.57 ± 3.49 0.13 ± 2.39 BLMH PB 100 3.97 ± 0.55 2.98 ± 1.34 5.06 ± 1.52 -2.78 ± 1.75 Cao nước 5.06 ± 1.52 14.77 ± 3.74 7.42 ± 1.70 13.63 ± 2.31 → Nhận xét: Qua kết thử nghiệm tỷ lệ (%) gây độc tế bào dòng tế bào ung thư khảo sát nồng độ 100 µg/ml thực đối chiếu với chứng dương Camptothecin nhận thấy có cao phân đoạn ethyl acetate vùng dược liệu khảo sát làm cho 50% tế bào ung thư chết Vì vậy, cao phân đoạn ethyl acetate tiếp tục thí nghiệm để xác định IC50 34 4.3.2 Kết thử nghiệm xác định IC50 cao phân đoạn ethyl acetat dòng tế bào ung thư vùng dược liệu khảo sát 4.3.2.1 Kết IC50 cao phân đoạn ethyl acetat chiết từ Bảy hoa Kon Tum Bảng 25: Kết xác định IC50 dòng tế bào ung thư vú MCF-7 Mẫu Nồng độ Phần trăm gây độc tế bào (%) (µg/ml) Lần Lần Lần TB ± ĐLC 100 93.64 84.29 87.90 88.61 ± 4.72 80 78.20 66.70 70.29 71.73 ± 5.88 Cao ethyl 60 52.18 49.21 43.79 48.39 ± 4.25 acetate 40 36.01 24.72 25.35 28.69 ± 6.34 20 -2.65 -6.86 -3.66 -4.39 ± 2.20 IC50 = 58.45 ± 4.20 Bảng 26: Kết xác định IC50 dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela Mẫu Nồng độ Phần trăm gây độc tế bào (%) (µg/ml) Lần Lần Lần TB ± ĐLC 75 84.31 74.23 81.00 79.84 ± 5.14 50 68.62 57.96 56.52 61.03 ± 6.61 Cao ethyl 40 34.15 28.64 27.53 30.11 ± 3.55 acetate 20 0.62 -8.25 -2.68 -3.44 ± 4.48 10 1.08 -2.52 -3.41 -1.62 ± 2.38 IC50 = 46.54 ± 1.70 Bảng 27: Kết xác định IC50 dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 Mẫu Nồng độ Phần trăm gây độc tế bào (%) (µg/ml) Lần Lần Lần TB ± ĐLC 100 91.62 92.69 92.11 92.14 ± 0.54 75 84.13 80.06 88.32 84.17 ± 4.13 Cao ethyl 50 69.76 62.46 68.32 66.85 ± 3.86 acetate 25 17.96 16.28 14.87 16.37 ± 1.55 10 4.79 -5.72 5.49 1.52 ± 6.28 IC50 = 41.72 ± 1.42 Bảng 28: Kết xác định IC50 dòng tế bào ung thư gan HepG2 Mẫu Nồng độ Phần trăm gây độc tế bào (%) (µg/ml) Lần Lần Lần TB ± ĐLC 50 63.46 62.40 63.90 63.26 ± 0.77 40 52.60 58.71 58.23 56.51 ± 3.40 35 30.61 30.43 23.75 18.71 15.96 15.02 IC50 = 38.40 ± 0.50 4.3.2.2 Kết IC50 cao phân đoạn ethyl acetat chiết từ Bảy Cao ethyl acetate 30 20 10 34.65 18.11 9.76 31.90 ± 2.38 20.19 ± 3.10 13.58 ± 3.34 hoa phía Bắc Bảng 29: Kết xác định IC50 dòng tế bào ung thư vú MCF-7 Mẫu Nồng độ Phần trăm gây độc tế bào (%) (µg/ml) Lần Lần Lần TB ± ĐLC Cao ethyl acetate 100 80 60 50 40 20 88.79 78.77 74.40 33.56 20.49 3.28 85.37 75.56 62.42 36.79 20.81 0.66 81.46 75.84 66.67 46.53 19.72 0.15 85.21 ± 3.67 76.73 ± 1.78 67.83 ± 6.07 38.96 ± 6.75 20.34 ± 0.56 1.37 ± 1.68 IC50 = 55.10 ± 2.30 Bảng 30: Kết xác định IC50 dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela Mẫu Cao ethyl acetate Nồng độ (µg/ml) 75 50 40 30 20 Lần Phần trăm gây độc tế bào (%) Lần Lần TB ± ĐLC 66.24 43.63 20.56 10.18 2.00 65.28 48.34 18.35 12.05 2.52 63.35 40.96 16.22 11.24 6.40 64.95 ± 1.47 44.31 ± 3.74 18.37 ± 2.17 11.16 ± 0.94 3.64 ± 2.41 IC50 = 56.53 ± 3.85 Bảng 31: Kết xác định IC50 dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 Mẫu Nồng độ Phần trăm gây độc tế bào (%) (µg/ml) Lần Lần Lần TB ± ĐLC Cao ethyl acetate 100 75 50 95.50 90.32 69.82 90.20 82.56 62.11 91.31 80.25 59.05 92.34 ± 2.79 84.38 ± 5.27 63.66 ± 5.55 25 10 25.41 13.51 29.82 8.40 28.65 6.62 27.96 ± 2.28 9.51 ± 3.58 IC50 = 37.40 ± 2.24 Bảng 32: Kết xác định IC50 dòng tế bào ung thư gan HepG2 Mẫu Nồng độ Phần trăm gây độc tế bào (%) (µg/ml) Lần Lần Lần TB ± ĐLC 50 40 74.90 66.83 73.87 69.33 36 74.30 67.67 74.35 ± 0.52 67.94 ± 1.27 Cao ethyl acetate 30 20 10 41.53 6.99 -0.40 49.69 6.65 1.26 41.16 6.40 1.14 44.13 ± 4.82 6.68 ± 0.29 0.67 ± 0.92 IC50 = 32.28 ± 1.84 Bảng 33: IC50 (µg/ml) cao ethyl acetat chiết xuất từ dược liệu dòng tế bào ung thư Dòng tế bào Tên dược Tên Cao liệu MCF-7 HeLa NCI-H460 HepG2 BLMH KT Cao ethyl 58.45 ± 4.20 46.54 ± 1.70 41.72 ± 1.42 38.40 ± 0.50 BLMH PB acetate 55.10 ± 2.30 56.53 ± 3.85 37.40 ± 2.24 32.28 ± 1.84  Nhận xét: Qua kết khảo sát IC50 cao ethyl acetat chiết xuất từ dược liệu dòng tế bào ung thư cho thấy - Cao ethyl acetate dược liệu cho kết độc tế bào ung thư cao với dòng tế bào gan Hep G2, kế dịng ung thư phổi NCI – H460, dòng tế bào cổ tử cung HeLa cuối dòng tế bào ung thư vú MCF-7 - Cao ethyl acetate chiết xuất từ dược liệu Bảy hoa Kon Tum kết độc tế bào ung thư với dòng tế bào HeLa cao so với cao ethyl acetate chiết xuất từ dược liệu Bảy hoa phía Bắc, riêng dịng tế bào cịn lại cho kết ngược lại 4.4 Xác định hàm lượng saponin toàn phần cao toàn phần chiết xuất từ hai dược liệu (Sử dụng cho cao toàn phần chiết xuất từ loại dược liệu) 4.4.1 Độ ẩm Bảng 34: Độ ẩm cao tổng chiết xuất từ dược liệu Bảy hoa Kon Tum STT Khối lượng dược liệu trước sấy(g) Độ ẩm dược liệu (%) 1,0005 g 10,29 % 1,0006 g 10,13 % 1,0008 g 10,75 % 37 Độ ẩm trung bình (%) 10,39 Bảng 35: Độ ẩm cao tổng chiết xuất từ dược liệu Bảy hoa phía Bắc STT Khối lượng dược liệu trước sấy (g) Độ ẩm dược liệu (%) 1,0027 g 10,99 % 1,0031 g 10,25 % 1,0014 g 10,53 % Độ ẩm trung bình (%) 10,59% 4.4.2 Định tính xác định diện hợp chất saponin cao tổng chiết xuất từ dược liệu khảo sát  Bằng phương pháp hóa học: A B A B A A Ống chứng A Ống chứng B Dịch chiết B Dịch chiết từ B từ cao phía Bắc A B Ống chứng A Ống chứng A Dịch chiết B Dịch chiết từ tổng cao tổng BLMH từ BLMH Kon Tum B cao tổng cao tổng BLMH BLMH Kon Tum phía Bắc Phản ứng tạo bọt Phản ứng Lieberman -Buchard Hình 10: Kết phản ứng hóa học xác định diện hợp chất saponin cao tổng chiết xuất từ dược liệu khảo sát Nhận xét: Dịch chiết từ cao tổng cho kết dương tính với phản ứng hợp chất saponin: phản ứng tạo bọt (lớp bọt bền 30 phút) phản ứng Lieberman – Buchard (cho vịng ngăn cách lớp dung dịch có màu đỏ tím)  Bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng: 38 Sắc kí đồ n-butanol : acid acetic : nước (7 : : 2) Chloroform : methanol (8 : 2) 3 Chuẩn Gracillin Chuẩn Gracillin Cao BLMH Kon Tum Cao BLMH Kon Tum Cao BLMH phía Bắc Cao BLMH phía Bắc Hình 11: Kết sắc kí lớp mỏng xác định diện chuẩn Gracillin hợp chất saponin cao tổng chiết xuất từ dược liệu khảo sát  Nhận xét: Trên sắc kí đồ, cao khảo sát có diện chuẩn Gracillin Ngồi ra, sắc kí đồ cao khảo sát cịn có vết có màu sắc giá trị Rf tương đồng với 4.4.3 Xác định hàm lượng saponin toàn phần theo chuẩn Gracillin cao tổng chiết xuất từ dược liệu khảo sát Bảng 36: Bảng hàm lượng mật độ quang chất chuẩn Gracillin STT Dung dịch chuẩn (ml) 1,0 1,25 1,5 1,75 2,0 Hàm lượng ( g) 100 125 150 175 200 0,370 0,478 0,552 0,657 0,733 OD 39 0.8 y = 0.0036x + 0.015 R² = 0.9963 Mật độ quang (Abs) 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 50 100 150 200 250 Hàm lượng Gracillin (g) Hình 12: Đồ thị chuẩn Gracillin đo bước sóng hấp thu cực đại  = 460 nm Phương trình đường chuẩn Gracillin: Y = 0,0036X + 0,0015 với hệ số tương quan R2 = 0,9963 Trong đó: Y mật độ quang dung dịch chuẩn, X hàm lượng Gracillin Hàm lượng saponin tồn phần cao tính dựa vào phương trình đường tuyến tính chuẩn Gracillin: Y = 0.0036X + 0.0015 Cơng thức xác định hàm lượng saponin tồn phần cao dựa vào đường tuyến tính chất chuẩn Gracillin: x x 100 Trong đó: A t: Độ hấp thu mẫu thử b: Độ pha loãng mẫu thử p: Khối lượng nguyên liệu đem thử trừ độ ẩm (g) Kết hàm lượng saponin toàn phần thu dựa vào đường tuyến tính chất chuẩn Gracillin Bảng 37: Kết xác định hàm lượng hợp chất saponin theo chuẩn Gracillin có cao Bảy hoa Kon Tum 40 LLL Khối lượng Mật độ quang Hàm lượng saponin Hàm lượng cao (g) (Abs) cao trừ ẩm saponin trung (%) bình (%) 0,5009 0,522 32,65 0,5020 0,569 32,17 0,5008 0,540 33,36 32,73  0,60 Hàm lượng saponin trung bình có cao Bảy hoa Kon Tum 32,73% với SD = 0,60 RSD = 0,02 Bảng 38: Kết xác định hàm lượng hợp chất saponin theo chuẩn Gracillin có cao Bảy hoa Phía Bắc LLL Khối lượng Mật độ quang Hàm lượng saponin Hàm lượng cao (g) (Abs) cao trừ ẩm saponin trung (%) bình (%) 0,5005 0,552 34,17 0,5010 0,538 33,27 0,5004 0,542 33,56 33,67  0,46 Hàm lượng saponin trung bình có cao Bảy hoa Phía Bắc 33,67% với SD = 0,46 RSD = 0,01  Nhận xét: Hàm lượng saponin tồn phần cao Bảy hoa Phía Bắc cao không đáng kể so với hàm lượng cao Bảy hoa Kon Tum 41 V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Qua trình nghiên cứu so sánh hoạt tính sinh học hàm lượng saponin toàn phần loài Bảy hoa Kon Tum (Paris polyphylla var yunnanensis) Bảy hoa phía Bắc (Paris polyphylla var chinensis), thu số kết sau: - Từ 1,0 kg nguyên liệu loài Bảy hoa khảo sát phương pháp chiết ngấm kiệt với dung môi EtOH 80% chiết xuất khoảng 190 g cao tổng - Từ 150g cao tổng phương pháp chiết lỏng – lỏng với dung môi diethyl ether, ethyl acetate, n-butanol nước thu cao phân đoạn - Qua khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao tổng cao phân đoạn chiết xuất từ dược liệu Bảy hoa chủng vi khuẩn thử nghiệm cho thấy hoạt tính kháng khuẩn thể mạnh cao diethyl ether khơng thể hoạt tính cao nước dược liệu Tuy nhiên, cao diethyl ether chiết từ dược liệu bảy hoa Kon Tum thể mạnh so với cao diethyl ether chiết từ dược liệu bảy hoa phía Bắc chủng vi khuẩn S aureus MRSA, cao n-butanol chiết từ dược liệu bảy hoa Kon Tum thể mạnh so với cao n-butanol chiết từ dược liệu bảy hoa phía Bắc chủng vi khuẩn E coli P aeruginosa - Thử hoạt tính sinh học cao tổng cao phân đoạn dòng tế bào ung thư lựa chọn (MCF-7, Hela NCI-H 460, HepG2) Kết cho thấy, cao phân đoạn ethyl acetate từ dược liệu khảo sát cho hoạt tính chống ung thư dòng tế bào lựa chọn với số IC50 (µg/ml) là:  Cao ethyl acetat từ Bảy hoa Kon Tum: MCF-7 (58.45 ± 4.20), Hela (46.54 ± 1.70), NCI-H 460 (41.72 ± 1.42) HepG2 (38.40 ± 0.50)  Cao ethyl acetat từ Bảy hoa phía Bắc: MCF-7 (55.10 ± 2.30), Hela (56.53 ± 3.85), NCI-H 460 (37.40 ± 2.24) HepG2 (32.28 ± 1.84) 42  Cao ethyl acetate dược liệu cho kết độc tế bào ung thư cao với dịng tế bào gan Hep G2, kế dòng ung thư phổi NCI – H460, dòng tế bào cổ tử cung HeLa cuối dòng tế bào ung thư vú MCF-7  Cao ethyl acetate chiết xuất từ dược liệu Bảy hoa Kon Tum kết độc tế bào ung thư với dòng tế bào HeLa cao so với cao ethyl acetate chiết xuất từ dược liệu Bảy hoa phía Bắc, riêng dòng tế bào lại cho kết ngược lại - Hàm lượng saponin toàn phần theo chuẩn Gracillin cao Bảy hoa Phía Bắc (33,67%) cao khơng đáng kể so với hàm lượng cao Bảy hoa Kon Tum (32,73%) 5.2 Kiến nghị Tiếp tục khảo sát hoạt tính sinh học lồi Bảy hoa khác Chi Tiến hành xây dựng quy trình định tính định lượng hợp chất Gracillin cao phương pháp HPLC góp phần cho cơng tác tiêu chuẩn hóa sau Nghiên cứu chiết tách hợp chất từ cao chiết có hoạt tính khảo sát 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bơ mơn Phân Tích - Kiểm Nghiệm, Giáo trình kiểm nhiệm thuốc Đại học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh 2007, 65-91 Bộ mơn Dược Liệu, Phương pháp nghiên cứu dược liệu Đại học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh 2007, 124-126 Đỗ, H B.; Đặng, Q T.; Bùi, X C., Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam NXB Khoa học – Kỹ thuật 2004, 1, 182 – 184 Nguyễn, T Đ., Bộ Hoa Loa kèn, Thực vật chí Việt Nam NXB Khoa học – Kỹ thuật 2007, 8, 317 – 318 TÀI LIỆU TIẾNG ANH Cai, J.; Liu, M.; Wang, Z.; Ju, Y., Apoptosis induced by dioscin in Hela cells Biological & Pharmaceutical Bulletin 2002, 25 (2), 193-196 Chan, J Y.; Koon, J C.; Liu, X.; Detmar, M.; Yu, B.; Kong, S K.; Fung, K P., Polyphyllin D, a steroidal saponin from Paris polyphylla, inhibits endothelial cell functions in vitro and angiogenesis in zebrafish embryos in vivo J Ethnopharmacol 2011, 137 (1), 64-9 Cheung, J Y.; Ong, R C.; Suen, Y K.; Ooi, V.; Wong, H N.; Mak, T C.; Fung, K P.; Yu, B.; Kong, S K., Polyphyllin D is a potent apoptosis inducer in drug-resistant HepG2 cells Cancer Lett 2005, 217 (2), 203-11 Deng, D.; Lauren, D R.; Cooney, J M.; Jensen, D J.; Wurms, K V.; Upritchard, J E.; Cannon, R D.; Wang, M Z.; Li, M Z., Antifungal saponins from Paris polyphylla Smith Planta Med 2008, 74 (11), 1397-402 Hu, K.; Yao, X., The cytotoxicity of methyl protoneogracillin (NSC-698793) and gracillin (NSC-698787), two steroidal saponins from the rhizomes of Dioscorea collettii var hypoglauca, against human cancer cells in vitro Phytother Res 2003, 17 (6), 620-6 10 Huang, X.; Gao, W.; Man, S.; Gao, Y.; Huang, L.; Liu, C., Structure-Activity Relationship Study of Twelve Compounds from Paris polyphylla Smith var pubescens Latin American Journal of Pharmacy 2010, 29 (3), 401-7 44 11 Huang, X.; Gao, W.; Man, S.; Gao, Y.; Huang, L.; Liu, C., Isolation and Identification of Compounds Present in Rhizomes of Paris axialis H Li and Study of Their Cytotoxic Effects Latin American Journal of Pharmacy 2011, 30 (3), 540-5 12 Huang, Y.; Cui, L.; Zhan, W.; Dou, Y.; Wang, Y.; Wang, Q.; Zhao, D., Separation and identification of steroidal compounds with cytotoxic activity against human gastric cancer cell lines in vitro from the rhizomes of Paris polyphylla var chinensis Chemistry of Natural Compounds 2007, 43 (6), 672-677 13 Kang, L P.; Liu, Y X.; Eichhorn, T.; Dapat, E.; Yu, H S.; Zhao, Y.; Xiong, C Q.; Liu, C.; Efferth, T.; Ma, B P., Polyhydroxylated steroidal glycosides from Paris polyphylla J Nat Prod 2012, 75 (6), 1201-5 14 Lee, J C.; Su, C L.; Chen, L L.; Won, S J., Formosanin C-induced apoptosis requires activation of caspase-2 and change of mitochondrial membrane potential Cancer Sci 2009, 100 (3), 503-13 15 Lee, M.-S.; Chan, J Y.-W.; Kong, S.-K.; Yu, B.; Eng-Choon, V O.; Nai-Ching, H W.; Mak Chung-Wai, T.; Fung, K.-P., Effects of polyphyllin D, a steroidal saponin inParis polyphylla, in growth inhibition of human breast cancer cells and in xenograft Cancer Biology & Therapy 2014, (11), 1248-1254 16 LI Hai-tao, LUO Xian-wen, GUAN Yan-hong, ZHANG Li-xia 2014 Comparison between content of saponins of Paris polyphylla var yunnanensis in different areas of Yunnan province China Journal of Chinese Materia Medica 39:803-806 17 Liu, Y.-x.; Kang, L.-p.; Zhao, Y.; Chen, H.-B.; Zou, P.; Xiong, C.-q.; Zhao, Y.; Tan, D.-w.; Ma, B.-p., An NMR Study on Parisaponin I and Parisvietnaside A isolated from Paris polyphylla Smith var yunnanensis Chinese Journal of Magnetic Resonance 2009, 45 (3), 316-326 18 Liu, H.; Yang, J.; Du, Y.; Bai, X.; Du, Y., Synthesis of four oligosaccharides derived from Paris polyphylla var yunnanensis and their tobacco (Nicotiana tabacum L.) growth-regulatory activity Plant Growth Regulation 2009, 60 (1), 69-75 45 19 Liu, M.-J.; Wang, Z.; Ju, Y.; Zhou, J.-b.; Wang, Y.; Wong, R N.-S., The mitoticarresting and apoptosis-inducing effects of diosgenyl saponins on human Leukemia cell lines Biological & Pharmaceutical Bulletin 2004, 27 (7), 1059-1065 20 Man, S.; Gao, W.; Yan, Y.; Liu, Z.; Liu, C., Inhibition of matrix metalloproteinases related to metastasis by diosgenyl and pennogenyl saponins J Ethnopharmacol 2011, 137 (3), 1221-7 21 Man, S.; Gao, W.; Zhang, Y.; Jin, X.; Ma, C.; Huang, X.; Li, Q., Characterization of steroidal saponins in saponin extract from Paris polyphylla by liquid chromatography tandem multi-stage mass spectrometry Anal Bioanal Chem 2009, 395 (2), 495-505 22 Man, S.; Gao, W.; Zhang, Y.; Liu, Z.; Yan, L.; Huang, L.; Liu, C., Formosanin Cinhibited pulmonary metastasis through repression of matrix metalloproteinases on mouse lung adenocarcinoma Cancer Biology & Therapy 2011, 11 (6), 592-598 23 Matsuda, H.; Pongpiriyadacha, Y.; Morikawa, T.; Kishi, A.; Kataoka, S.; Yoshikawa, M., Protective effects of steroid saponins from Paris polyphylla var yunnanensis on ethanol- or indomethacin-induced gastric mucosal lesions in rats: structural requirement for activity and mode of action Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2003, 13 (6), 1101-1106 24 Shuli, M.; Wenyuan, G.; Yanjun, Z.; Chaoyi, M.; Liu, Y.; Yiwen, L., Paridis saponins inhibiting carcinoma growth and metastasis in vitro and in vivo Arch Pharm Res 2011, 34 (1), 43-50 25 Siu, F M.; Ma, D L.; Cheung, Y W.; Lok, C N.; Yan, K.; Yang, Z.; Yang, M.; Xu, S.; Ko, B C.; He, Q Y.; Che, C M., Proteomic and transcriptomic study on the action of a cytotoxic saponin (Polyphyllin D): induction of endoplasmic reticulum stress and mitochondria-mediated apoptotic pathways Proteomics 2008, (15), 3105-17 26 Sun, J.; Liu, B R.; Hu, W J.; Yu, L X.; Qian, X P., In vitro anticancer activity of aqueous extracts and ethanol extracts of fifteen traditional Chinese medicines on human digestive tumor cell lines Phytother Res 2007, 21 (11), 1102-4 46 27 Wang, G X.; Han, J.; Zhao, L W.; Jiang, D X.; Liu, Y T.; Liu, X L., Anthelmintic activity of steroidal saponins from Paris polyphylla Phytomedicine 2010, 17 (14), 11025 28 Wang, Y.; Gao, W.; Liu, X.; Zuo, Y Z.; Chen, H.; Duan, H., Anti-tumor constituents from Paris polyphylla Asian Journal of Traditional Medicines 2006, (1), 7-10 29 Wang, Y.; Gao, W Y.; Zhang, T J.; Guo, Y Q., A novel phenylpropanoid glycosides and a new derivation of phenolic glycoside from Paris polyphylla var yunnanensis Chinese Chemical Letters 2007, 18 (5), 548-550 30 Wang, Y C.; Yi, T Y.; Lin, K H., In vitro activity of Paris polyphylla smith against enterovirus 71 and coxsackievirus B3 and its immune modulation Am J Chin Med 2011, 39 (6), 1219-34 31 Wang, Z.; Zhou, J.; Ju, Y.; Zhang, H.; Liu, M.; Li, X., Effects of two saponins extracted from the Polygonatum Zanlanscianense Pamp on the human Leukemia (HL60) cells Biological & Pharmaceutical Bulletin 2001, 24 (2), 159-162 32 Wei, J C.; Gao, W Y.; Yan, X D.; Wang, Y.; Jing, S S.; Xiao, P G., Chemical constituents of plants from the genus Paris Chem Biodivers 2014, 11 (9), 1277-97 33 WENG Zhou, WANG Li, TANG Rui and WANG Bo 2008 Studies of the morphological variation on Paris polyphylla Smith Journal of Sichuan University (Natural Science Edition) 45: 1228-1234 34 Wu, R T.; Lin, W J.; Chiang, H C.; Horng, L Y.; Chung, Y M., Modulation of experimental autoimmune uveitis with formosanin-C in guinea pigs J Ocul Pharmacol 1990, (4), 301-11 35 Wu, X.; Wang, L.; Wang, H.; Dai, Y.; Ye, W C.; Li, Y L., Steroidal saponins from Paris polyphylla var yunnanensis Phytochemistry 2012, 81, 133-43 36 Yan, L.; Gao, W.; Zhang, Y.; Wang, Y., A new phenylpropanoid glycosides from Paris polyphylla var yunnanensis Fitoterapia 2008, 79 (4), 306-7 37 Yan, L L.; Zhang, Y J.; Gao, W Y.; Man, S L.; Wang, Y., In vitro and in vivo anticancer activity of steroid saponins of Paris polyphylla var yunnanensis Exp Oncol 2009, 31 (1), 27-32 47 38 YUAN Meng-qiu, DING Chun-bang, CHEN Hong-han, CHEN Hui and WU Qi 2012 Cloning and sequence analysis ofcycloartenol synthase gene from Paris polyphylla var yunnanensis Chinese Traditional and Herbal Drugs 43:2250-2256 39 Zhang, X F.; Cui, Y.; Huang, J J.; Zhang, Y Z.; Nie, Z.; Wang, L F.; Yan, B Z.; Tang, Y L.; Liu, Y., Immuno-stimulating properties of diosgenyl saponins isolated from Paris polyphylla Bioorg Med Chem Lett 2007, 17 (9), 2408-13 40 Zhao, Y.; Kang, L P.; Liu, Y X.; Liang, Y G.; Tan, D W.; Yu, Z Y.; Cong, Y W.; Ma, B P., Steroidal saponins from the rhizome of Paris polyphylla and their cytotoxic activities Planta Med 2009, 75 (4), 356-63 41 Zhao, Y.; Kang, L P.; Liu, Y X.; Zhao, Y.; Xiong, C Q.; Ma, B P.; Dong, F T., Three new steroidal saponins from the rhizome of Paris polyphylla Magn Reson Chem 2007, 45 (9), 739-44 48