TIỂU LUẬN KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU Chủ đề Chiết xuất Ajmalicin. Trong những năm gần đây ngành Dược của Việt Nam đang trên đà phát triển cũng đã tìm kiếm, nghiên cứu và đưa vào sản xuất một số loại thuốc y học dân tộc để góp phần vào việc điều trị. Cùng với sự áp dụng những kỹ thuật trong chiết xuất, những quy trình công nghệ sản xuất nhiều sản phẩm có nhiều công đoạn sấy khô để bảo quản dài ngày. Đặc biệt rất quan trọng trong ngành Dược nói chung và bảo quản dược liệu nói riêng. Trên thực tế, trên thị trường lưu hành các mặt hàng dược phẩm có thành phần chính từ các dược liệu hoặc các hoạt chất từ thiên nhiên, qua các quá trình chiết xuất phức tạp. Chẳng hạn quá trình sấy là quá trình tách nước ra khỏi dược liệu nhờ vào nhiệt hoặc làm mất một số hoạt chất độc không mong muốn ra khỏi dược liệu. Sau đó sử dụng những kỹ thuật tiên tiến cho ra nhưng sản phẩm tốt và chất lượng đưa đến người dùng.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐẠI NAM KHOA DƯỢC TIỂU LUẬN : KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU Chủ đề: Chiết xuất Ajmalicin Giảng viên hướng dẫn: Thầy Phùng Thanh Long Lớp: Dược 12-07 Nhóm: 12 Thành viên: Nguyễn Thị Tâm 1257200387 Tạ Thị Uyên 1257200337 Lò Quang Vũ 1157200310 Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2022 MỤC LỤC I Tổng quan 1.Cây Dừa cạn alcaloid Dừa cạn .7 1.1.Cây Dừa cạn 1.2.Một số công thức: II CHIẾT XUẤT AJIMALICIN 10 Cây dừa cạn 10 Tác dung 10 Công thức 11 3.1 Tính chất 11 3.2 Định tính 13 3.3 Định lượng .13 III QUI TRÌNHCHIẾT XUẤT AJIMALICIN 13 1.Sơ đồ chiết xuất alcaloid từ dừa cạn qui mô pilot 13 2.Hydrogen-hóa alcaloid tồn phần 15 3.Chiết xuất Ajimalicin từ alcaloid khử hóa 16 4.Mơ tả qui trình .17 5.Tối ưu hóa chiết xuất ajimalicin 18 IV.Về tiêu chuẩn chiết xuất Ajmalicin 18 1.Về phương pháp phân lập ajmalicine 18 2.Về tiêu chuẩn nguyên liệu ajmalicine 19 3.Về độ ổn định ajmalicine 19 V KẾT LUẬN 20 Lời phê Thầy Cô ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần ngành Dược Việt Nam đà phát triển tìm kiếm, nghiên cứu đưa vào sản xuất số loại thuốc y học dân tộc để góp phần vào việc điều trị Cùng với áp dụng kỹ thuật chiết xuất, quy trình cơng nghệ sản xuất nhiều sản phẩm có nhiều cơng đoạn sấy khơ để bảo quản dài ngày Đặc biệt quan trọng ngành Dược nói chung bảo quản dược liệu nói riêng Trên thực tế, thị trường lưu hành mặt hàng dược phẩm có thành phần từ dược liệu hoạt chất từ thiên nhiên, qua trình chiết xuất phức tạp Chẳng hạn trình sấy trình tách nước khỏi dược liệu nhờ vào nhiệt làm số hoạt chất độc không mong muốn khỏi dược liệu Sau sử dụng kỹ thuật tiên tiến cho sản phẩm tốt chất lượng đưa đến người dùng Hiện ngành Dược Việt Nam nghiên cứu đưa vào sản xuất rộng thuốc y học dân tộc để góp phần đièu trị bệnh thiểu tuần hồn não, tìm tịi viện dược học chất chiết xuất ajmalicine để điều trị tuần hoàn não Được biết thiểu tuần hoàn não bệnh phổ biến người có tuổi người lao động trí óc, tình trạng bệnh lý có biểu lâm sàng khác có chung chơ chế bệnh sinh, thiếu máu ni não Theo Tổ chức Y tế giới, 12 nước phát triển tỷ lệ người mắc thiểu tuần hoàn não chiếm từ 0,2-2,5% dân số Ở Việt Nam tỷ lệ người thiểu tuần hoàn não chiếm tới 50% tổng số bệnh nhân điều trị khoa thần kinh Thiểu tuần hoàn não ảnh hưởng tới nhiều sức khoẻ khả lao động sinh hoạt người bệnh Việc phát cungx điều trị kịp thời tránh tái biến não, số bệnh nguy hại đến tính mạng để nhiều hậu di chứng nặng nề cho người bệnh Vì có cầu có cung, miệt mài nghiên cứu sử dụng nguồn dược liệu sẵn có nước làm thuốc điều trị thiểu tuần hoàn não cần thiết Dừa cạn ( Catharanthus roseus G.Don) dược liệu quý có giá trị cao y học kinh tế Ngoài alkaloid quan trọng chữa ung thư máu bệnh tim mạch như: vinblastin, reserpine, …Dừa cạn chứa ajmalicine (hay gọi vinccin, vincain, raubasin, ô- yohimbim), alkaloid chủ yếu rễ có tác dụng điều trị rối loạn tuần hoàn não ngoại vi Hiện nay, hàng năm giới nhu cầu rễ Dừa cạn để chiết xuất ajmalicine lên tới hàng Ở nước ta dừa cạn mọc rải rác khắp tỉnh thành ven biển trồng với quy mô lớn Phú Yên Vào thập kỉ 70-90 củ kỉ XX, nước có nhiều cơng trình nghiên cứu trồng trọt, thu hía Dừa cạn để xuất chiết vinblastine ajmalicine từ Dừa cạn Tuy nhiên quy trình chiết ajmalicine chưa hoàn chỉnh, hiệu suất chiết chưa cao, cịn sử dụng dung mơi độc hại benzene nên khó triển khai quy mơ lớn Vì vậy, để góp phần tạo nguồn nguyên liệu làm thuốc điều trị thiểu tuần hoàn não từ nguồn nguyên liệu sẵn nước, chọn chủ đề chiết xuất ajmalicine từ rễ Dừa cạn - Xây dựng quy trình chiết xuất tinh chế ajmalicin với mục tiêu cụ thể tìm biện pháp ky thuật để nâng cao hiệu xuất tính an tồn quy trình - Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng, xác định độc tính cấp độc tính trường diễn nguyên liệu ajmalcin I Tổng quan 1.Cây Dừa cạn alcaloid Dừa cạn. 1.1.Cây Dừa cạn Dừa cạn (Catharanthus roseus G Don) Thuộc họ Trúc đào (Apocynaceae) Cây thảo cao 50-90 cm, phân nhiều cành Lá mọc đối, hình trái xoan, dài 3-8cm, rộng 12,5cm Hoa mọc đơn độc kẽ phía trên, màu hồng hay trắng Đài 5, hợp thành ống ngắn Tràng 5, hình đinh Nhị đỉnh vào họng ống tràng, nhị ngắn, nhuỵ ống nỗn dính với vịi, rời bầu Quả gồm đại, dài 2,5-3cm, có từ 12-20 hạt nhỏ hình trứng, màu nâu nhạt nâu đen Mùa hoa quả: tháng 4-5 vào tháng 9- 10 Các nhà khoa học sơm nghiên cứu dừa cạn, đặc biệt tữ năm 1950 tìm nhiều hoạt chất, chủ yếu alkaloid có nhân Indol Dihidroindol chia làm hai nhóm: - Nhóm Monomer: Gồm chất có tác dụng hạ huyết áp chữa hạ huyết áp, hạ dường huyết, lợi tiểu như: Ajmalicin, Serpentin, Vindolin… - Nhóm Dimer: Gồm chất có tác dụng chữa ung thư như: Vinblastin, Vincristin, Vinrosidin… Ở nước ta nhiều cơng trình Viện dược liệu, Đại học Dược, BỘ môn dược lý Đại học Y bệnh viện C Hà nội nghiên cứu Dừa cạn Tất nhiên ccuws phải đưa thị trường sản phẩm đưa vào sản xuất có tính nhiệm cao nhân dân y bác sĩ Sử dụng điều trị số bệnh ung thư máu… 1.2.Một số công thức: Ajmalicin Serpentin Reserpin Yohimbin Alstonin Vindolin II CHIẾT XUẤT AJIMALICIN Cây dừa cạn -Tên khoa học: Catharanthus Roseus (L.) G – Don Apocynaceae -Bộ phận dùng: rễ -Hàm lượng ajimalicin dừa cạn: Tác dung - Ajimalicin alcaloid có tác dụng hạ huyết áp tuần hồn não dùng chữa suy giảm trí nhớ người già, phịng điều trị rối loạn tuần hồn não 10 Công thức AJIMALICIN -Ajimalicin indol alcaloid có cơng thức phân tử C21H24N2O3 Có phân tử lượng 352,42 -Tên hóa học đầy đủ: Methyl este acid 16,17-didehydro-19-methyloxa yohimban-16-carboxylic 3.1 Tính chất * Tính chất vật lý: - Ajimalicin kết tinh methanol dạng tinh thể mịn bột kết tinh không màu hay ngà vàng, không mùi vị, điểm chảy: 257 độ C (phân hủy) - Dạng muối hydroclorid ajmalicin C12H25ClN2O3 kết tinh dạng vảy từ ethanol, điểm chảy: 290 độ C (phân hủy) Dung dịch 0,5% methanol) - Khó tan dung dịch acid hydrochloric loãng - Ajimalicin hydroclorid ajmalicine kết tinh methanol dạng hình cầu nhỏ, điểm chảy 295-296ᵒ (chân khơng) - Ajmalicin hydroclorid kết tinh methanol lỗng dạng hình tứ diện, điểm chảy 291-293ᵒ (chân khơng) - Ajmalicin picrat kết tinh ethanol tuyệt đối, tinh thể hình kim, điểm chảy 212-213ᵒ * Tính chất hóa học: - Là base yếu số alcaloid Aponynaceae Rubinaceae - Ajmalicin bị loại hydro chì acetat acid maleic có xúc tác để tạo serpeatin 11 Pb(OAc) acid maleic+ Pb H2(Pt) NaBH4 -Ngược lại, serpeatin bị khử hố hydro có xúc tác platin với natri borohydride để tạo thành chất ban đầu -Khi hydro hoá ajmalicine có xúc tác selen tạo alstyrin Phản úng cho thấy ajmalicine đồng phân lập thể tetrahydroalstonin [H} Se Ajmalicin alstyrin -Giống trahydroalstonin, ajmalicine bị khử hoá lithi alumin hydrid tạo tetrahydroserpentiol, connf tác dụng với natri mơi trường butanol tạo heaxaydroserpentinol Tetrahydroserpentinol Hẽahydroserpentinol -Ajmalicin bị loại hydro thuỷ ngân acetat tạo thành ∆3- dehydroajmalicin Chất bị khử hố với natri borohydride hydro có xúc tác platin lại chuyển thành chất ban đầu 12 3.2 Định tính - Phản ứng với TT chung alcaloid như: mayer (tủa trắng), TT bouchardat (tủa đỏ nâu), dung dịch acid picric bão hòa (tủa vàng) - Tác dụng với dung dịch natri molypdat 1% acid sulfuric đậm dặc cho màu xanh da trời - Tác dụng với p-dimethylaminobenzaldehyd acid acetic bang acid sulfuric đậm đặc cho phản ứng màu xanh cây, chuyển thành đỏ them acid acetic băng - Tác dụng với dung dịch anilin 1% acid hydroclorid đậm đặc (mới pha ) cho màu hồng tím (phản ứng nhân đơi) - Tác dụng với TT ceric amoni sulfat (dung dịch 1% acid photphoric đậm đặc) cho màu vàng chanh 3.3 Định lượng - Định lượng phương pháp: tách khỏi alcaloid sắc ký giấy, SKLM hay di điện sau xác định hàm lượng phương pháp so màu, quang phổ tử ngoại huỳnh quang - Đo quang phổ tử ngoại bước song 282nm Trong phương pháp HPLC, hỗn hợp Alc.TP dễ dừa cạn tiêm lên cột sắc ký Dựa vào diện tích pic dung dịch chuẩn tính hàm lượng ajmalicin III QUI TRÌNHCHIẾT XUẤT AJIMALICIN - Để chiết xuất ajimalicin từ rễ Dừa cạn, thực chiết xuất phân lập Ajimalicin theo qui trình sau: - Chiết xuất alcaloid từ Dừa cạn khử hóa alc.tp Naborohydrua chiết xuất Ajimalicin 1.Sơ đồ chiết xuất alcaloid từ dừa cạn qui mô pilot 13 Rễ dừa cạn Cồn acid Tartric 2% Dịch chiết cồn acid Bã dược liệu NH4OH 12,5% Dịch chiết cồn acid pH =7 Dịch đặc H2SO4, 2% Dịch acid CHCl4 Dịch acid loại tạp NH4OH 12.5% Dịch lọc pH9 Tủa Alc.tp CHCl3 Sấy 50ᵒC Dịch chiết CHCl4 Cất Sấy 50ᵒC Cắn chứa Alc.tp Cắn chưa Alc.tp 14 Sơ đồ chiết xuất alcaloid từ dừa cạn qui mơ pilo 2.Hydrogen-hóa alcaloid tồn phần - Alc.tp chiết xuất chứa trung bình 20% Ajimalicin Đem hydrogen-hóa chuyển serpentin có rễ thành tetrahydro serpentin (Ajimalicin) tăng hàm lượng Ajimalicin lên gấp đơi - Tác nhân hydrogen-hóa tốt dùng Naborohydrua (NaBH4) Alc.tp Methanol Dung dịch NaBH4 Hỗn hợp phản ứng Dịch lọc Cất Cắn Ethyl acetat Dịch chiết ethyl acetat Rửa kiềm Làm khan Dịch chiết ethyl acetat khan Cất Alc.H 15 Sơ đồ khử hóa alc.tp rễ Dừa cạn natri borohydrid 3.Chiết xuất Ajimalicin từ alcaloid khử hóa Alc.tp khử hóa ethanol Ajimalicin thô Dịch lọc Acid tatric Dịch chiết acid Cắn n-hexan : ethyl acetat (6:4) Dịch chiết ethyl acetat Dịch acid loại tạp kết tinh Nh4OH Dịch lọc Tủa ajimalicin thô n-hexan : ethyl acetat kết tinh Ajimalicin tinh khiết Ajimalicin thô Dịch chiết ajimalicin thô 16 sơ đồ chiết xuất ajimalicin từ alcaloid tồn phần khử hóa -Sau khử hóa alc.tp NaBH4, tăng gấp đơi từ 20% lên 40% hàm lượng ajimalicin -Giai đoạn chiết xuất ajimalicin thực qui trình đơn giản, khơng dùng dung mơi độc hại 4.Mơ tả qui trình * Giai đoạn Chiết xuất alcaloid toàn phần -Cất dung mơi acid hóa: Dịch chiết đem trung hịa NH4OH 12.5% đem cô, đem trộn với H2SO4 2%, khuấy kỹ lọc -Loại tạp kiềm hóa: Dồn dịch chiết acid lại, khuấy với CHCl4, để lắng, gạn bỏ lớp CHCl4, kiềm hóa pha nước acid với NH4OH 12.5% tới pH=10 -Lọc chiết alc.tp: Để lắng tủa lọc alc.tp tủa hòa tan CHCl3, dịch lọc chiết với CHCl3 Dồn dịch chiết alc lại làm khan Na2SO4 Cất lại cloroform sấy 50 độ thu cắn cân định lượng alc.tp cắn chiết *Giai đoạn 2: hydrogen-hóa alc.tp -Khử hóa: Sử dụng dung môi methanol thêm vào alc.tp thu dung dịch, khử hóa NaBH4 dịch lọc đem cất -Cất, thu hồi alc.tp khử hóa: Cắn thu thêm ethyl acetat thu dịch chiết ethyl acetat, rửa dịch chiết ethyl acetat kiềm sau làm khan, dịch chiết ethyl acetat khan thu đem cất, thu alc.tp khử hóa *Giai đoạn 3: chiết xuất ajimalicin khử hóa -Hịa tan Alc.H ethanol -Để yên 2h độ, lọc thu phần Ajimalicin thô Dịch lọc cô đặc -Chiết cắc với dung dịch acid tartric 2% Lọc, loại tạp hỗn hợp n-hexanethyl acetat (6:4) Điều chỉnh dịch chiết đến Ph=9 NH4OH, thu tủa Ajimalicin thô Lọc 17 -Chiết dịch lọc với hệ dung môi n-hexan-ethyl acetat (6:4) Lọc dịch chiết qua Na2SO4 khan sau lọc qua lớp nhôm oxyd Dịch lọc đem cô áp suất giảm 55-60 độ thu ajimalicin thô -Kết tinh ajimalicin methanol 5.Tối ưu hóa chiết xuất ajimalicin *Để tối ưu hóa chiết xuất ajimalicin, người ta tối ưu hóa q trình chiết xuất alc từ rễ Dừa cạn: -Với qui mô 10kg/mẻ: dung môi ethanol 90% có thêm 2% acid tartric, tỷ lệ dịch chiết/dược liệu 8/1, thời gian ngâm lạnh 24h -Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết: độ cồn, kích thước dược liệu tốc độ rút dịch chiết theo nghiên cứu hiệu suất chiết tối đa (92,7%) đạt điều kiện: + dung môi: ethanol 70 độ + 2% acid tartric + kích thước bột rễ: 1mm + tỷ lệ dịch chiết/ dược liệu 8/1 + tốc độ rút dịch chiết 15ml/phút *Qúa trình khử hóa alc.tp thực phản ứng với NaBH4 tiết kiệm chất khử tạo thuận lợi cho việv phân lập ajimalicin sau Ngồi ra, điều kiện thích hợp phản ứng khử hóa alc.tp rễ Dừa cạn với NaBH4 lựa chọn Kết nghiên cứu lượng ajimalicin alc.tp tăng tối đa 74,4% *Qúa trình chiết xuất ajimalicin: hoạt chất chiết từ dược liệu nhiều phương pháp khác Tuy nhiên phương pháp sử dụng dung mơi độc hại cho hiệu suất thấp nên có ý nghĩa qui mơ phịng thí nghiệm phương pháp đề xuất da nguyên tắc dùng dung môi : ethanol hỗn hợp n-hexan-ethyl acetat để hòa tan chiết chọn lọc phương pháp đơn giản, không dùng dung môi độc hại, đỡ tốn thời gian, hiệu suất nên có khả thi qui mơ lớn IV.Về tiêu chuẩn chiết xuất Ajmalicin 1.Về phương pháp phân lập ajmalicine Các hoạt chất dược chiết từ dược liệu nhiều phương pháp khác phương pháp sử dụng môi hữu độc hại cho hiệu suất thấp có ý nghĩa quy mơ phịng thí nghiệm Trong trường hợp ajmalicine chủ yếu phân lập từ Alc.tp rễ Dừa Cạn phương pháp sắc ký cột sử dụng dung môi hữu độc hại benzene chloroform nên khó áp dụng quy mơ lớn Việc khử hoá Alc.tp rễ Dừa cạn với natri horohydrid khơng làm giầu ajmalicine mà cịn tạo điều kiện thuận lợi để tìm phương pháp phân 18 lập ajmalicine, khắc phục hạn chế Phải chọn Phuong pháp đơn giản, không dùng dung môi độc hại, đỡ tốn thời gianvaf nâng cao hiệu suất nên khả thi quy mơ lớn 2.Về tiêu chuẩn nguyên liệu ajmalicine Cho đến nay, dược điển nước khơng có chuyện luận ajmalicine Trong nước, trước thực đề tài có tiêu chuẩn sơ ajmalicine nhiên chưa hoàn chỉnh: tiêu chuẩn độ tinh khiết chưa đầy đủ Phương pháp định lượng ajmalicine quang phổ tử ngoại nên không tách tạp chất kiểm nghiệm Để hoàn chỉnh tiêu chuẩn ajmalicine cách bổ sung nội dung như: Định tính ajmalicine sắc ký lớp mỏng Thử độ tinh khiết quy định dược điển Việt nam nguyên liệu alkaloid gồm: khối lượng làm khô, thử kim loại nặng, arsenic, tro sulfat, thử độ tinh khiết sắc ký lớp mỏng,vv Xây dựng phương pháp định lượng ajmalicine sắc ký lỏng hiệu cao Phương pháp có độ tuyến tính cao, độ lập lại tốt có độ đạt yêu cầu 3.Về độ ổn định ajmalicine Qua tài liệu tham khảo chưa tìm thấy liệu nghiên cứu độ ổn định ajmalicine.Vì kết bảo quản ajmalicine số điều kiện khắc nhiệt cho thấy cho ajmalicine tương đối bền vững tác động nhiệt độ lại bền vững điều kiện độ ẩm cao( 90%) Vì nên bảo quản ajmalicine điều kiện độ ẩm (65-70%), tránh ánh sáng Nhiệt độ phòng thay đổi theo thời tiết bên Dự kiến tuổi thọ ajmalicine đạt 42 tháng 4.Về độc tính ajmalicine chiết từ Dừa cạn Độc tính cấp ajmalicine cho thấy cho chuột uống liều cao từ 500mg/24h đến 1600mg/kg/24h (tương đương gấp khoảng 400đến 1300 lần liều dùng cao người (1,2mg/kg/24h) khơng thấy độc tính cấp ajmalicine theo đường uống, theo khơng cần phải tính liều LD50 Khi cho thỏ uống liên tục tháng với liều ajmalicine 4,8mg/kg/24h (gặp khoảng lần liều điều trị người: 0,6mg/kg/24h), không nhận thấy khác đáng kể trọng lượng thỏ, số huyết học sinh học so với kiểm chứng Vậy độc tính ajmalicine rễ dừa cạn thấp súc vật V KẾT LUẬN Qua trình làm việc nhóm nghiên cứu tìm hiểu chiết xuất Ajimalicin từ dừa cạn, thấy qui trình chiết xuất ajimalicin cần qua nhiều giai 19 đoạn, nhiên điều kiện thuận lợi để tìm nhiều phương pháp Đặc biệt ngành Dược cần nhiều nghiên cứu để so sánh hiệu hiệu suất để đưa vào qui mô sản xuất lớn 20 ... Indol Dihidroindol chia làm hai nhóm: - Nhóm Monomer: Gồm chất có tác dụng hạ huyết áp chữa hạ huyết áp, hạ dường huyết, lợi tiểu như: Ajmalicin, Serpentin, Vindolin… - Nhóm Dimer: Gồm chất có tác... Tartric 2% Dịch chiết cồn acid Bã dược liệu NH4OH 12, 5% Dịch chiết cồn acid pH =7 Dịch đặc H2SO4, 2% Dịch acid CHCl4 Dịch acid loại tạp NH4OH 12. 5% Dịch lọc pH9 Tủa Alc.tp CHCl3 Sấy 50ᵒC Dịch... hịa NH4OH 12. 5% đem cơ, đem trộn với H2SO4 2%, khuấy kỹ lọc -Loại tạp kiềm hóa: Dồn dịch chiết acid lại, khuấy với CHCl4, để lắng, gạn bỏ lớp CHCl4, kiềm hóa pha nước acid với NH4OH 12. 5% tới