Nghiên cứu khả năng kích thích hệ miễn dịch chống ung thư của các alcaloid và flavonoid được chiết xuất từ cây trinh nữ hoàng cung crinum latifolium l để sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thuốc hỗ trợ điều trị ung thư

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ GIỮA VIỆT NAM VÀ BUNGARI NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH HỆ MIỄN DỊCH CHỐNG UNG THƯ CỦA CÁC ALCALOID VÀ FLAVONOID ĐƯỢC CHIẾT XUẤT TỪ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (Crinum latifolium L.) ĐỂ SỬ DỤNG LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THUỐC HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Cơng ty CP Dược Liệu TW2 Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS Nguyễn Thị Ngọc Trâm 7588 08/01/2010 Hà Nội - 2009 BỘ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ BỘ Y TẾ CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ GIỮA VIỆT NAM VÀ BUNGARI NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH HỆ MIỄN DỊCH CHỐNG UNG THƯ CỦA CÁC ALCALOID VÀ FLAVONOID ĐƯỢC CHIẾT XUẤT TỪ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (Crinum latifolium L.) ĐỂ SỬ DỤNG LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THUỐC HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS Nguyễn Thị Ngọc Trâm Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: DS Phan Thành Lây Bộ Khoa học Công nghệ Hà Nội - 2009 CÔNG TY CP DƯỢC LIỆU TW2 CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc TP.HCM, ngày 01 tháng 07 năm 2009 DANH SÁCH TÁC GIẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ (Danh sách cá nhân đóng góp sáng tạo chủ yếu cho nhiệm vụ xếp theo thứ tự thoả thuận) Tên nhiệm vụ: Nghiên cứu khả kích thích hệ miễn dịch chống ung thư alcaloid flavonoid chiết xuất từ Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) để sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thuốc hỗ trợ điều trị ung thư Thời gian thực hiện: 24 tháng từ tháng 06/ 2007 đến tháng 06/2009 Tổ chức chủ trì: Cơng ty CP Dược Liệu TW2 Cơ quan chủ quản: Bộ Y Tế Tác giả thực dự án gồm người có tên danh sách sau: Số Chức danh khoa học, học TT vị, họ tên TS Nguyễn Thị Ngọc Trâm Tổ chức công tác Trung tâm NCPTSX Dược Phẩm Crina - Công ty CP Dược Liệu TW2 GS-TSKH Phan Thị Phi Phi Bộ Môn Miễn Dịch Học Trường Đại Học Y Hà Nội Trung tâm Kiểm nghiệm Ths Nguyễn Nhật Thành Dược phẩm, Mỹ phẩm TP Hồ Chí Minh Chữ ký TS Hà Hồi DS Phan Thành Lây Viện Kiểm Nghiệm TP Hồ Chí Minh Cơng ty CP Dược Liệu TW2 Viện Hóa Học Các Hợp PGS-TS Lê Mai Hương Chất Thiên Nhiên thuộc Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam Viện Cơng Nghệ Hố Học PGS.TS Nguyễn Ngọc Hạnh thuộc Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Chủ nhiệm nhiệm vụ TS Nguyễn Thị Ngọc Trâm Thủ trưởng tổ chức chủ trì nhiệm vụ DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Trong báo cáo chúng tơi có sử dụng số từ viết tắt ký hiệu sau: HPLC: High Performance Liquid Chromatography – sắc ký lỏng hiệu cao IR Infrared spectroscopy – phổ hồng ngoại UV Ultraviolet spectroscopy – phổ tử ngoại Proton Nuclear Magnetic Resonance – cộng hưởng từ hạt nhân H1 H - NMR 13 C - NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance – cộng hưởng từ hạt nhân bon 13 GC/MS Gas Chromatography – Mass Spectroscopy – sắc ký khí / khối phổ GAP Good Agricultural Practice TNHC Trinh Nữ Hoàng Cung TT Thuốc Thử EIMS Electron Impact Mass Spectroscopy – Phổ điện tử PBMN Peripherial Blood Mononuclear Cells FCS Foetal Calf Serum Con - A Concanavalin A PHA Phytohemagglutinin CSF Colony stimulative Facters DPPH 1,1 – diphenyl – – picrylhydrazyl SC Scaverging Capacity FBS Fetal Bovine Serum ( Huyết Thanh Bê) PBS Psychedelic Benzodiazepin Solution GTBHS Graffi Tumors Bearing Hamster TLC Sắc ký lớp mỏng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Máy móc thiết bị Bảng 2: Kết nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn C1 GC-MS Bảng 3: Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC HCB01 Bảng 4: Suy giảm số lượng bạch cầu công thức bạch cầu chuột chiếu tia (nhận dạng hình thái học) tác dụng phục hồi Crila dòng Bảng 5: Các nhóm tế bào lympho máu ngoại vi (xác định miễn dịch huỳnh quang trực tiếp) chuột bị chiếu tia điều trị Crila Bảng 6: Tỉ lệ % nhóm tế bào lympho lách (xác định miễn dịch huỳnh quang trực tiếp) Bảng 7: Khả chế tiết TNFα IL-2 tế bào lách chuột chiếu tia điều trị với Crila Bảng 8: Hoạt tính chống ôxy hóa Crila phân đoạn Bảng 9: Sơ đồ pha mẫu theo thang nồng độ chất thử 10 Bảng 10: Kết - dòng Hep-G2 11 Bảng 11: % tế bào sống sót 12 Bảng 12: Kết thực nghiệm hoạt tính gây độc tế bào dòng ung thư nghiên cứu 13 Bảng 13: Giá trị IC50 dòng ung thư nghiên cứu DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Ảnh 1: Crila, 24 h Ảnh 2: Crila, 48h Ảnh 3: Crila, 48h Ảnh 4: H1, 24h Ảnh 5: C1, 24h Ảnh 6: ConA 24h Ảnh 7: Cụm tế bào Tuỷ xương chuột nhắt nuôi cấy môi trường lỏng Ảnh 8: Cụm tế bào Tuỷ xương chuột nhắt nuôi cấy môi trường thạch Ảnh 9: hoạt tính chống khối u, gây độc tế bào thuốc viên CRILA in vitro 10 Ảnh 10: hoạt tính chống khối u, gây độc tế bào thuốc viên CRILA in vitro 11 Ảnh 11: hoạt tính chống khối u, gây độc tế bào thuốc viên CRILA in vitro 12 Ảnh 12: hoạt tính chống khối u, gây độc tế bào thuốc viên CRILA in vitro 13 Ảnh 13: Hoạt tính chống khối u (gây độc tế bào) Crinum latifolium L phân đoạn H1 14 Ảnh 14: Hoạt tính chống khối u (gây độc tế bào) Crinum latifolium L phân đoạn H1 15 Ảnh 15: Hoạt tính chống khối u (gây độc tế bào) Crinum latifolium L phân đoạn H1 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 1: Tỷ số Kyn/trp (% tế bào kích thích PHA) Biểu đồ 2: Tỷ số Kyn/trp (% tế bào kích thích PHA) Biểu đồ 3: Sự tạo thành neopterin % tế bào kích thích Biểu đồ 4: Sự tạo thành neopterin % tế bào kích thích Biểu đồ 5: Đồ thị tính giá trị IC50 mẫu Biểu đồ 6: Mẫu C3- Dòng Hep-G2 Biểu đồ 7: Mẫu C2- Dòng Hep-G2 Biểu đồ 8: Hiệu in vivo Crila phân đoạn tăng trưởng khối u chuột cống dùng thí nghiệm với methylcholanthrene Biểu đồ 9: Thời gian sống trung bình (MST) chuột cống mang khối u chữa trị với Crila phân đoạn 10 Biểu đồ 10: Tỉ lệ chết (%) chuột cống mang khối u, chữa trị với Crila phân đoạn 11 Biểu đồ 11: Kích thước khối u (mm) chuột Hamster, chữa trị với CRILA 12 Biểu đồ 12: Thời gian sống trung bình chuột Hamster mang khối u Graffi chữa trị với Crila 13 Biểu đồ 13: Khả cấy ghép (%) chuột Hamster, chữa trị với Crila 14 Biểu đồ 14: Tỉ lệ chết (%) chuột Hamster mang khối u Graffi, chữa trị với Crila 15 Biểu đồ 15: Khả cấy ghép (%) khối u tế bào tủy Graffi chuột Hamster, chữa với thuốc viên Crila 16 Biểu đồ 16: Tỉ lệ chết (%) chuột Hamster mang khối u tế bào tuỷ, chữa trị với thuốc viên Crila 17 Biểu đồ 17: Thời gian sống trung bình GTBH, chữa trị với thuốc viên Crila 18 Biểu đồ 18: Kích thước (mm) khối u chuột Hamster mang khối u điều trị với Crila MỤC LỤC Nội dung trang ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC VỀ Crinum latifolium L…………………………………………… 1.1 Tình hình nghiên cứu nớc 1.2 Tình hình nghiên cøu ngoµi n−íc 1.3 Các thuốc kích thích hệ miễn dịch 11 TÍNH CẤP THIẾT VÀ KHẢ THI CỦA NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ 13 MỤC TIÊU CỦA NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ 13 NỘI DUNG CỦA NHIỆM VỤ 13 4.1 Chiết xuất phân đoạn alcaloid flavonoid từ Trinh nữ hoàng cung Crinum latifolium L 13 4.2 Đánh giá tác dụng sinh học in vitro in vivo phân đoạn alcaloid flavonoid chiết xuất từ TNHC (Crinum latifolium L.) 14 CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 15 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 17 3.1 Chiết xuất phân đoạn alcaloid flavonoid từ Trinh nữ hoàng cung Crinum latifolium L 17 3.1.1 Chiết xuất phân đoạn alcaloid từ TNHC (Crinum latifolium L.) 17 3.1.2 Chiết xuất phân đoạn flavonoid từ trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) 20 3.1.3 Máy móc thiết bị 22 3.1.4 Xác định thành phần hóa học phân đoạn alcaloid C1 phân đoạn flavonoid H1 22 3.1.5 Tiêu chuẩn hóa sản phẩm 26 3.2 Đánh giá tác dụng sinh học phân đoạn Alcaloid Flavonoid chiết xuất từ Trinh Nữ Hoàng Cung 38 3.2.1 Chứng minh tác dụng tăng cường miễn dịch in vivo in vitro phân đoạn alcaloid, flavonoid viên nang Crila 38 3.2.1.1 Thí nghiệm in vivo 39 3.2.1.2 Tác dụng gây phân bào (mitogenic activity) in vitro Crila phân đoạn H1 (Flavonoid), C1(Alcaloid) 44 3.2.1.3 Nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch in vitro viên nang Crila phân đoạn C1, C2, C3 (alcaloid), H1 (flavonoid) bạch cầu đơn nhân người từ máu ngoại vi 47 3.2.1.4 Tác dụng viên nang Crila tủy xương chuột nhắt nuôi cấy in vitro 49 3.2.2 Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hố viên nang Crila thơng qua phản ứng bao vây gốc tự 1,1 – diphenyl – – picrylhydrazyl (DPPH) 51 3.2.3 Thử gây độc tế bào với dịng ung thư ni cấy in vitro 53 3.2.3.1 Với dòng ung thư phổi, gan, màng tim in vitro 53 3.2.3.2 Thử độc tế bào in vitro viên nang Crila phân đoạn H1 tế bào ung thư tuỷ Graffi nuôi cấy 59 3.2.4 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vivo chứng minh chuột Wistar chuột Hamster 65 3.2.4.1 Nghiên cứu tác dụng viên nang Crila phân đoạn C1, H1 chuột Wistar gây ung thư hoá chất 20 – methylcholanthrene 65 3.2.4.2 Đánh giá hoạt tính gây độc in vivo viên Crila Việt Nam sử dụng chỗ khối u tế bào tuỷ Graffi chuột Hamster 70 3.2.4.3 Nghiên cứu khả kích thích miễn dịch chống khối u viên nang Crila chuột Hamster cấy ghép khối u tế bào tủy Graffi 75 CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 80 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 82 Tài liệu tham khảo 86 Phụ lục 3” 4” 5” 6” 78.42 71.41 78.08 62.68 H3”→ C4”,2”,5” >CH–O– 3.48, m >CH–O– >CH–O– 3.21-2.24, m −CH2– O– 2' HO O 10 3' 1' 4' 5' 6' OH OH OH O O O 1" HO 6" 5" 2" 4" 3" H OH OH Kaempferol-3-O-β-glucopyranoside (HCB01) Các liệu phổ xem mục phần phụ lục báo cáo tổng hợp Việc xác định chất phân đoạn H1 kaempferol sở để có chất điểm tinh khiết sử dụng định tính, định lượng phân đoạn H1 flavonoid Chất kaempferol chất đánh giá có tác dụng sinh học gây độc tế bào ung thư Tác dụng sinh học phân đoạn H1 đánh giá hàm lượng kaempferol có phân đoạn H1 3.1.5 Tiêu chuẩn hóa sản phẩm Để đánh giá chất lượng sản phẩm phân đoạn C1, C2, C3 tiến hành xây dựng tiêu chuẩn sở phân đoạn C1, C2, C3 dựa kết nghiên cứu dự án KC.10.DA17 phần nâng cấp tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu, bán thành phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Viện Kiểm Nghiệm TW thực hiện, xây dựng tiêu chuẩn sở phân đoạn H1 14 3.2 Đánh giá tác dụng sinh học phân đoạn Alcaloid Flavonoid chiết xuất từ Trinh Nữ Hoàng Cung: 3.2.1 Chứng minh tác dụng tăng cường miễn dịch in vivo in vitro phân đoạn alcaloid flavonoid viên nang Crila Mục đích cơng trình nghiên cứu đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch, gây độc với tế bào ung thư, tác dụng chống oxy hóa phân đoạn alcaloid flavonoid – in vivo in vitro, để sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thuốc hỗ trợ điều trị bệnh ung thư Từ kết cơng trình nghiên cứu trước, sản xuất viên nang Crila thử nghiệm lâm sàng theo quy chế 371 Bộ Y Tế Căn vào hiệu điều trị đánh giá Hội đồng Khoa Học – Bộ Y Tế, Cục Quản Lý Dược cho phép viên nang Crila lưu hành toàn quốc điều trị bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt u xơ tử cung với số đăng ký VNB-3391-05 Viên nang Crila có hàm lượng alcaloid tồn phần 1,25mg Từ cao alcaloid tách phân đoạn C1, C2, C3 Ở cơng trình nghiên cứu chúng tơi muốn tìm hiểu khả hỗ trợ điều trị ung thư Crila bào chế từ alcaloid toàn phần tác dụng sinh học hỗ trợ điều trị ung thư có mạnh phân đoạn C1, C2, C3 Nếu tác dụng tăng cường miễn dịch gây độc tế bào ung thư, chống oxy hóa tương đương với phân đoạn C1, C2, C3 bào chế viên thuốc chứa đựng C1, C2, C3 để làm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư Nếu Crila có tác dụng mạnh ba phân đoạn C1, C2, C3 sử dụng Crila alcaloid toàn phần phối hợp với phân đoạn flavonoid H1 để bào chế viên thuốc có tên Crila – T Như giá thành sản phẩm thấp bào chế từ cao alcaloid tồn phần Cũng mục tiêu mà sử dụng viên thuốc Crila lưu hành thị trường vật liệu nghiên cứu cơng trình 15 3.2.1.1 Thí nghiệm in vivo: Đánh giá khả phục hồi, tăng cường dòng tế bào lympho T dòng tủy viên nang Crila chuột nhắt trắng random bị chiếu tia gamma: (thực Bộ môn miễn dịch-sinh lý bệnh, Đại Học Y Hà Nội) Sự giảm sút tế bào bạch cầu tủy lympho đặc trưng sinh vật bị chiếu tia cấp, bán cấp Khi nhận dạng tế bào hình thái học, chủ yếu dựa vào kích thước bắt màu nhân, bào tương khơng phát thay đổi bạch cầu toan bạch cầu NK Nhưng nhận dạng dấu ấn miễn dịch (CD16+/56+) NK tia gamma làm NK giảm sút nặng nề (so với đối chứng sinh học) máu ngoại vi lách với P < 0.001 NK từ năm 1980 thức xem quần thể miễn dịch bẩm sinh gây độc với tế bào nhiễm vi rút với tế bào ung thư, tác dụng Th, Tc thông qua cytokin quan trọng IL-2 TNFα làm tăng miễn dịch chống tế bào nhiễm vi rút tế bào ung thư (tác dụng gián tiếp) hay trực tiếp gây dung giải tế bào ung thư tế bào nhiễm vi rút Tế bào TCD8 tế bào gây độc đặc hiệu chủ yếu với tế bào ung thư (nhất quần thể CD8b) bị tia gamma phá hủy, làm giảm số lượng chức chế tiết IL-2 (P< 0.01) Do TNFα có nhiều nguồn gốc (cả tế bào khơng miễn dịch) nên hàm lượng trì chuột bị chiếu tia.TNFα có tác dụng chống viêm chống ung thư Chuột chiếu tia điều trị với Crila hồi phục hoàn toàn số lượng dòng tế bào miễn dịch chức chế tiết IL-2 Ngồi ra, Crila cịn hồi phục số lượng tế bào bạch cầu dòng tủy (bạch cầu hạt trung tính, ưa acid) trị số sinh học, cho ta hy vọng mở rộng việc sử 16 dụng Crila nhiều bệnh lý suy giảm miễn dịch hỗ trợ điều trị ung thư Có thể cho ta sở điều trị bệnh lý phóng xạ với Crila 3.2.1.2 Tác dụng gây phân bào (mitogenic activity) in vitro Crila phân đoạn H1 (flavonoid), C1(alcaloid) (Thực phòng miễn dịch – Viện hàn lâm khoa học Bungari) Tác dụng kích thích miễn dịch Trinh Nữ Hoàng Cung Việt Nam có mặt Alcaloid Ambelline epoxyambelline dịch chiết viên nang Crila Kottke.T cộng cho tác dụng tăng cường miễn dịch sử dụng điều trị di ung thư tuyến tiền liệt 3.2.1.3 Nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch in vitro viên nang Crila phân đoạn C1,C2,C3 (Alcaloid), H1 (Flavonoid) bạch cầu đơn nhân người từ máu ngoại vi (peripheral blood mononuclear cells – PBMN) (thực Bộ môn hóa sinh, khoa y, ĐH tổng hợp Insbrusck - Áo) Các kết thu chứng minh rằng- phân đoạn nghiên cứu có tác dụng tăng cường miễn dịch làm tăng khả chống ung thư dùng làm nguyên liệu sản xuất thuốc hỗ trợ điều trị ung thư 3.2.1.4 Tác dụng viên nang Crila tủy xương chuột nhắt nuôi cấy in vitro (trong môi trường lỏng thạch) Trước chưa có tác giả thử tác dụng Alcaloid hoạt chất sinh học khác thực vật mẫu cấy tủy xương Mục tiêu nghiên cứu để đánh giá hoạt tính tạo máu (hematoporietic) viên Crila Việt Nam tế bào tủy xương chuột nhắt môi trường nuôi cấy lỏng thạch theo tác giả E.zvetkova (chương trình nghiên cứu thực phịng thí nghiệm miễn dịch Viện hàn lâm KH Bungari) Viên nang Crila Việt Nam với liều lượng 25µg/ml mơi trường ni cấy kích thích tạo tế bào non (blast) khu trú phân tán môi trường lỏng môi trường thạch Các kỹ thuật đơn giản để nhận dạng in situ tế bào riêng biệt hay cụm tế bào (quần bào cụm tế bào) cho ta chẩn đốn 17 xác trường hợp tạo máu bình thường hay bệnh lý tủy xương Đáng ý dòng tủy hồng cầu tạo thành quần bào (colonies) cụm tế bào (chesters) Khi bị kích thích in vitro với Crila tương đương CSF (các yếu tố tạo máu): clơn (dịng) tế bào tiền thân lympho chung sớm nhận dạng đặc điểm hình thái blast rải rác môi trường nuôi cấy Cần nghiên cứu thêm để xác định phát Có thể điều trị ung thư người ta tạo quần thể tế bào T (CD8+, NK gây độc tế bào ) tuỷ xương (nghĩa kích thích tự tạo lympho tuỷ xương) đặc biệt phát triển tế bào tiền thân lympho chung, sớm, tác dụng chất kích thích sinh lympho Có thể xem Crila yếu tố có nguồn gốc thực vật kích thích sinh lympho tuỷ xương, viên Crila Việt Nam có tác dụng chất điều biến miễn dịch (yếu tố gây tăng sinh lympho) tuỷ xương để tạo tế bào tiền thân lympho mới, chung, sớm cần quan tâm miễn dịch trị liệu ung thư 3.2.2 Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hố viên nang Crila thông qua phản ứng bao vây gốc tự (DPPH): Nhận xét: + Ba mẫu C1, C2, C3 phân đoạn alcaloid khơng biểu hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH + Mẫu thử C có hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH với giá trị SC50 = 199,6 Từ kết nghiên cứu cho nhận xét phân đoạn Alcaloid khơng biểu hoạt tính chống oxy hóa kết hợp ba phân đoạn C1 + C2 + C3 = C (phân đoạn tổng) C nguyên liệu sản xuất viên nang Crila Viên nang Crila có hoạt tính chống oxy hóa (bao vây gốc tự do) gốc xuất phong phú ung thư Ở nghiên cứu đưa đến cho thông tin Crila thuốc hỗ trợ điều trị ung thư, cần tiếp tục thử nghiệm lâm sàng để khẳng định cách chắn tác dụng viên nang Crila điều trị ung thư 18 3.2.3 Thử gây độc tế bào với dòng ung thư ni cấy in vitro 3.2.3.1 Với dịng ung thư phổi, gan, màng tim in vitro (phòng sinh học thực nghiệm thuộc viện hóa học hợp chất thiên nhiên- Viện KHCN VN) Thử gây độc tế bào (cytotoxicity assay) dòng tế bào ung thư phổi, ung thư gan ung thư màng tim Bảng 3: Kết thực nghiệm hoạt tính gây độc tế bào dịng ung thư nghiên cứu STT Ký hiệu Dòng tế bào Cell survival (%) Kết luận Mẫu Hep-G2 DMSO 100,0±0,0 Chứng 0,8± 0,4 3,2± 0,02 0,5± 0,01 Dương tính Lu RD 100,0± 0,0 100,0± 0,0 (+) C 92,4± 0,5 95,6 ±0,2 85,0± 0,9 Âm tính C1 85,1± 0,6 100,1± 1,2 84,1± 0,2 Âm tính C2 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0± 0,0 Dương tính dịng C3 0,0 ±0,0 1,4± 0,1 0,0± 0,0 Dương tính dòng 19 Bảng 4: Giá trị IC50 dòng ung thư nghiên cứu Dòng tế bào STT Giá trị IC50 (µg/ml) Ký hiệu Kết luận mẫu Hep-G2 Lu RD Chứng 0,34 0,42 0,23 Dương tính 0,97 0,54 0,66 Dương tính (+) C2 dịng C3 1,23 0,89 1,01 Dương tính dịng Trong thử nghiệm: Chứng (+) - Ellipithine 3.2.3.2 Thử độc tế bào in vitro viên nang Crila phân đoạn H1 tế bào ung thư tuỷ Graffi nuôi cấy Nghiên cứu khả gây độc tế bào in vitro viên nang Crila phân đoạn C1 H1 tế bào tuỷ Graffi *Kết thảo luận: Các kết từ việc sàng lọc tác dụng gây độc tế bào (chống khối u) in vitro thuốc viên Việt nam phân đoạn Crinum latifolium (L) kiểm tra thể ảnh số báo cáo tổng hợp Tế bào chết mức độ cao tan tế bào khối u (chết hoại tử ) thuốc viên Việt nam CRILA in vitro quan sát thứ 24 chữa trị Như thể thứ 48-72 việc nuôi cấy tế bào với diện thuốc viên CRILA, khối u nghỉ sống, tế bào gốc lớp mơ đệm bám dính (trên đĩa Petri), làm chậm tăng trưởng khối u 20 Như phân đoạn H1 áp dụng để kích thích tế bào mơ đệm (ví dụ trường hợp bị thiếu hụt tế bào tuỷ xương tế bào mô đệm hạch tim) 3.2.4 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vivo chứng minh chuột Wistar chuột Hamster 3.2.4.1 Nghiên cứu tác dụng viên nang Crila phân đoạn C1, H1 chuột Wistar gây ung thư hoá chất 20 – methylcholanthrene (được thực phịng thí nghiệm ung thư thực nghiệm Viện hàn lâm KH Bungari) Kết thảo luận Ảnh hưởng thuốc viên Việt nam CRILA phân đoạn C1,H1 lên tăng trưởng khối u (kích thước tính mm) thể biểu đồ 8: tăng trưởng (kích thước) khối u bị chậm lại đáng kể ngày thứ 45 phát triển khối u, ảnh hưởng thuốc viên CRILA dùng đường uống (P.O) cho chuột cống Ở nhóm đối chứng không chữa trị sống từ 25-45 ngày (tính trung bình 40-45 ngày) Biểu đồ báo cáo tổng hợp, thời gian sống trung bình chuột cống nhóm thí nghiệm đường P.O chữa trị với thuốc viên CRILA lâu (5073 ngày: tính trung bình 60-63 ngày) Hiện tượng cần quan tâm tài liệu nghiên cứu khoa học cho thấy hoạt tính chống khối u trực tiếp tính điều hịa miễn dịch alcaloid thực vật hợp chất có liên quan tác dụng chống ung thư 3.2.4.2 Đánh giá hoạt tính gây độc in vivo viên Crila Việt Nam sử dụng chỗ khối u tế bào tuỷ Graffi chuột Hamster (thực phòng miễn dịch– Viện hàn lâm khoa học Bungari) Kết thảo luận: 21 Nhóm chuột đối chứng cho thấy phát triển khối u nhanh phần lớn điển hình cho thời gian sống tỉ lệ chết khối u tế bào tủy Graffi Nhóm chuột thí nghiệm thể đặc điểm khối u Graffi phát triển chậm Thuốc CRILA làm giảm khối lượng khối u tế bào tủy Graffi Tuổi thọ chuột Hamster thí nghiệm có dùng thuốc viên CRILA gia tăng sống lâu so với nhóm đối chứng Trong năm gần số lượng tài liệu tham khảo ảnh hưởng số hợp chất chiết xuất từ dược thảo có hoạt tính mặt sinh học tăng trưởng khối u Từ Crinum latifolium (L) Việt Nam sản sinh hợp chất đặc hiệu bao gồm đặc tính chống khối u Ghosal mô tả giống kết nhóm nghiên cứu chúng tơi Các nghiên cứu trước chúng tơi nhằm vào hiệu chống khối u, kích thích miễn dịch chất chiết xuất từ Crinum latifolium (L) Việt Nam trích dẫn rộng rãi tài liệu khoa học CRILA xem sản phẩm thuốc phát Việt nam phân đoạn alcaloid, flavonoid Crinum latifolium L Việt Nam, tìm đồng nghiệp người Việt nam nước khác (Crinamine, crinamidine, crinafoline, crinafolidine alcaloid chống ung thư khác thuộc loài Crinum, lectin miễn dịch alcaloid ambelline epoxy-ambelline…) nguồn nguyên liệu tuyệt vời cho phát triển hóa trị liệu hỗ trợ chống ung thư tương lai gần đây, hay chống ung thư thực 3.2.4.3 Nghiên cứu khả kích thích miễn chống khối u viên nang Crila chuột Hamster cấy ghép khối u tế bào tủy Graffi Nhận xét: hợp chất chống khối u (ví dụ loại alcaloid, crinan, crinamine, crinamidine, crinafoline, crinafolidine, ambelline, epoxyambelline) chất kích thích hệ miễn dịch chống khối u Các nhóm chất nhóm chất có TNHC Việt Nam - Crinum latifolium (L) 22 Tiềm chữa trị thuốc CRILA Việt nam, khối u nơng, tình trạng tiền ung thư (ví dụ: u hắc tố, ung thư cột sống, loại ung thư tế bào đáy (baso-cellular), bướu vùng âm đạo, thực quản, mũi hầu,…) áp dụng chỗ in situ Điều giúp cho tiếp tục nghiên cứu tìm hiểu mặt lâm sàng tiếp tục thí nghiệm với nhiều lần nghiên cứu thí nghiệm CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ ỨNG DỤNG CỦA NHIỆM VỤ Thông qua kết nghiên cứu in vitro in vivo đánh giá tác dụng chống ung thư phân đoạn alcaloid flavonoid chiết xuất từ Trinh Nữ Hoàng Cung (Crinum latifolium L.) Việt Nam cho phép sử dụng phân đoạn C1,C2, C3 H1 để sản xuất thuốc hỗ trợ điều trị ung thư như: ung thư gan, ung thư phổi, ung thư da, ung thư màng tim, sản phẩm sản xuất từ flavonoid có hoạt tính chống oxy hố từ alcaloid có hoạt tính sinh học kích thích miễn dịch Nhưng kết thử độc tính tế bào ung thư in vitro thử tác dụng chống ung thư chuột, muốn sản phẩm nguyên liệu sản xuất thuốc hỗ trợ điều trị ung thư, phải chứng minh qua thử nghiệm lâm sàng chế phẩm thuốc sản xuất từ phân đoạn đây, theo quy chế thử nghiệm lâm sàng Bộ Y Tế Những chế phẩm thuốc sản xuất từ phân đoạn C1, C2, C3 H1 mở hướng hỗ trợ điều trị ung thư từ dược thảo Việt Nam Nếu đất nước Triều Tiên có Nhân Sâm làm cho đất nước họ giàu có sản phẩm họ bán toàn giới, Trinh Nữ Hồng Cung Việt Nam làm điều Bộ Y Tế, Bộ Khoa Học Cơng Nghệ có kinh phí để đầu tư mức cho nghiên cứu để chứng minh chế tác dụng thuốc, thải trừ hấp thu thuốc thể người chất có hoạt tính sinh học điều trị ung thư Vấn đề đặt 23 nhiều, phải tiếp tục nghiên cứu, đòi hỏi nhà khoa học phải tập trung nghiên cứu với thời gian dài, đưa kết luận xác đáng khả hỗ trợ điều trị bệnh ung thư Trinh Nữ Hoàng Cung (Crinum latifolium L.) Việt Nam Các nhà khoa học giới tập trung nghiên cứu thuốc điều trị ung thư từ dược thảo Việt Nam có nhiều thuốc, việc sàng lọc tìm kiếm hoạt chất có hoạt tính sinh học điều trị ung thư cần thiết Để góp phần tìm sản phẩm thuốc mới, chúng tơi Bộ Khoa Học Công Nghệ cho phép thực nhiệm vụ: “Nghiên cứu khả kích thích hệ miễn dịch chống ung thư alcaloid flavonoid chiết xuất từ Trinh Nữ Hoàng Cung (Crinum latifolium L.) để sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thuốc hỗ trợ điều trị ung thư”, nhà khoa học nước nỗ lực để hoàn thành nhiệm vụ giao với kết cao Cơng trình thực Bungari Việt Nam sử dụng phương pháp nghiên cứu đại, để chứng minh khả điều trị ung thư từ phân đoạn alcaloid flavonoid chiết xuất từ Trinh Nữ Hoàng Cung Các flavonoid alcaloid chứng minh có tác dụng chống oxy hố, kích thích miễn dịch ngăn ngừa phát triển tế bào u sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thuốc thuốc hỗ trợ điều trị ung thư 24 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ * KẾT LUẬN Chúng tơi thực hồn thành nhiệm vụ hợp tác Khoa học Công nghệ theo nghị định thư Việt Nam Bungari Đối chiếu với đề cương Bộ Khoa học Cơng nghệ phê duyệt Chúng tơi hồn thành hai mục tiêu sau: + Chiết xuất phân đoạn alcaloid flavonoid từ Trinh Nữ Hoàng Cung (Crinum latifolium L.) + Đánh giá khả kích thích miễn dịch chống ung thư phân đoạn alcaloid (C1, C2, C3) flavonoid (H1) Để thực mục tiêu nghiên cứu mặt hóa học: + Đã chiết xuất alcaloid tồn phần, tách phân đoạn C1, C2, C3 từ alcaloid toàn phần + Tách phân đoạn H1 từ flavonoid toàn phần + Đã xác định thành phần hóa học phân đoạn có hoạt tính sinh học điều trị ung thư C1 (có 16 alcaloid: 9- Octadecenamided, Dihydro-oxodemethoxyhaemanthamine, Augustamine, Oxoassoanine, Crinane-3α-ol, -ol, Buphanidrine, hydroxybuphanidrine, hydroxyundulatine, powelline, Undulatine, 6-hydroxypowelline, 1β,2β-epoxyambelline, Epoxy-3,7-dimethoxycrinane-11-one) H1 Ambeline, Crinamidine, 66- 6-hydroxycrinamidine, có flavonoid: kaempferon Để xác định thành phần hóa học phân đoạn C1, H1 sử dụng phương pháp sắc ký (sắc ký khí/phối phổ, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột phương pháp phổ (IR, EIMS C13-NMR, 1H-NMR, HSQC, HMBC) - Đã xây dựng tiêu chuẩn sở cho cao phân đoạn alcaloid flavonoid + Cao C1: định lượng alcaloid tồn phần tính theo lycorin định lượng Crinamidine phương pháp HPLC 25 + Cao C2 C3: định lượng alcaloid tồn phần tính theo lycorin Phân đoạn H1 định lượng kaempferol sắc ký lỏng hiệu cao HPLC - Phần nghiên cứu alcaloid hoa Trinh Nữ Hoàng Cung chiết xuất phân đoạn alcaloid flavonoid Sau sàng lọc đưa nghiên cứu tác dụng sinh học kết cho thấy khơng có tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư nên báo cáo không trình bày phân đoạn alcaloid flavonoid chiết xuất từ hoa Chúng đánh giá tác dụng sinh học phân đoạn C1, C2, C3 H1 thông qua nghiên cứu sau: Đã chứng minh tác dụng chống oxy hóa tăng cường miễn dịch chống khối u gián tiếp hay có tác dụng gây độc tế bào ung thư trực tiếp dòng ung thư nghiên cứu in vitro in vivo Kết nghiên cứu biểu mơ hình sau đây: 2.1 Viên nang Crila có tác dụng : + Phục hồi thương tổn tăng cường nhóm tế bào Lympho T máu ngoại vi lách, số lượng chức chế tiết đặc biệt chế tiết IL2 + Tăng bạch cầu tủy (bạch cầu hạt trung tính bạch cầu ưa acid) + Các trị số nghiên cứu trở trị số sinh học (P > 0,05) 2.2 Viên Crila phân đoạn H1 có tác dụng gây phân bào Con – A 2.3 Viên nang Crila phân đoạn C1, C2, C3, H1 có tác dụng tăng hoạt tính miễn dịch thể tăng tỷ số Kynurenine / tryptophan tăng tiết neopterin mẫu nuôi cấy bạch cầu đơn nhân người từ máu ngoại vi 2.4 Crila làm tăng tạo máu, đặc biệt tăng sinh tế bào tiền thân lympho sớm, chung tủy xương 2.5 Tác dụng chống oxy hóa: Alcaloid tồn phần – C ngun liệu sản xuất viên nang Crila có tác dụng bao vây gốc tự do, có hoạt tính chống oxy hóa 26 2.6 Crila gây độc với dịng ung thư ni cấy in vitro (ung thư phổi, gan, màng tim u tủy bào Graffi) 2.7 In vivo, Crila làm chuột cống trắng Wistar có mang ung thư fibrosarcoma 20-methylcholanthrene chậm tăng trưởng khối u (kích thước khối u nhỏ lại), sống lâu nhóm đối chứng khơng điều trị với Crila (50-73 ngày/25-45 ngày); giảm tỉ lệ chết nhóm điều trị Crila 2.8 In vivo, Crila làm chậm phát triển ung thư tế bào tủy Graffi cấy ghép chuột Hamster dòng Golden Syrian KIẾN NGHỊ Cơng trình thực hoàn thành theo đề cương thông qua Bộ Khoa Học Công Nghệ, đánh giá khả gây độc tế bào ung thư kích thích miễn dịch phân đoạn alcaloid flavonoid chiết xuất từ Trinh Nữ Hoàng Cung (Crinum latifolium L.) Việt Nam Là nguyên liệu sử dụng để sản xuất thuốc hỗ trợ điều trị ung thư Kính đề nghị Bộ Khoa Học Công Nghệ, Bộ Y Tế tiếp tục giúp đỡ cấp kinh phí để chúng tơi thực dự án sau: a Nghiên cứu tác dụng sinh học bào chế viên nang cứng CRILA-T từ phân đoạn alcaloid C1, C2, C3 phân đoạn flavonoid H1 chiết xuất từ Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) để làm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư b Thử nghiệm lâm sàng đánh giá tác dụng thuốc hỗ trợ điều trị ung thư CRILA-T c Đánh giá hiệu khả chấp nhận thuốc CRILA-T hỗ trợ điều trị ung thư gan d Đánh giá hiệu khả chấp nhận thuốc CRILA-T hỗ trợ điều trị ung thư phổi 27 e Đánh giá hiệu khả chấp nhận thuốc CRILA-T hỗ trợ điều trị ung thư tử cung f Đánh giá tác dụng điều trị ung thư tuyến tiền liệt viên nang CRILA-T Nhu cầu thuốc hỗ trợ điều trị ung thư thị trường cấp thiết, sau có kết thử nghiệm lâm sàng mong muốn tiếp tục thực dự án sau: g Hồn thiện quy trình cơng nghệ chiết xuất phân đoạn alcaloid flavonoid có hoạt tính sinh học hỗ trợ điều trị ung thư từ Trinh nữ hoàng cung để sản xuất viên nang CRILA-T điều trị ung thư gan, phổi, tuyến tiền liệt Sau hoàn thành dự án này, Việt Nam tự lực phần thuốc hỗ trợ điều trị ung thư từ nguồn dược liệu nước 28