Nhân giống và xây dựng mô hình trồng nhằm thu nhận nguồn nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị ung thư từ cây bìm bịp clinacanthus nutans

ỦY BAN NHÂN DÂN VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NHÂN GIỐNG VÀ XÂY DỰNG MƠ HÌNH TRỒNG NHẰM THU NHẬN NGUỒN NGUYÊN LIỆU ĐỂ SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ TỪ CÂY BÌM BỊP (Clinacanthus nutans) Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Viện Sinh học nhiệt đới Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS Bùi Đình Thạch Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 i TpHCM, 2019 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH xii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xvi MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Bìm bịp 1.1.1 Phân loại thực vật 1.1.2 Đặc điểm thực vật học 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Công dụng 1.2 Nhân giống in vitro 13 1.2.1 Cơ sở khoa học nhân giống in vitro 13 1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 14 1.2.2.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy 14 1.2.2.2 Ảnh hưởng mẫu nuôi cấy 16 1.2.2.3 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy 19 1.2.3 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng 19 1.2.4 Một số kết ghi nhận ứng dựng nuôi cấy mô số loài Clinacanthus nutans 20 1.3 Một số yếu tố tự nhiên ảnh hưởng trồng 21 1.3.1 Yếu tố khí hậu – thời tiết 21 i 1.3.2 Yếu tố đất đai 23 1.4 Tổng quan cao dược liệu 25 1.4.1 Định nghĩa 25 1.4.2 Phương pháp điều chế 26 1.4.3 Tiêu chuẩn chất lượng cao dược liệu 27 1.4.4 Bảo quản 33 1.5 Tiêu chuẩn chất lượng viên nén 33 1.5.1 Tiêu chuẩn chất lượng viên nén theo DĐVN V 33 1.5.2 Tiêu chuẩn nhà sản xuất 35 1.5.3 Bảo quản 35 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 Mục tiêu 36 2.2 Nội dung nghiên cứu 36 2.3 Vật liệu nghiên cứu 36 2.4 Phương pháp nghiên cứu 36 2.4.1 Nội dung 1: Khảo sát thực vật học sơ thành phần hóa thực vật Bìm bịp 36 2.4.1.1 Khảo sát thực vật học Cây Bìm bịp 36 2.4.1.2 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật 37 2.4.2 Nội dung 2: Nhân nhanh Bìm bịp phương pháp ni cấy mơ tế bào thực vật 2.4.2.1 40 Khảo nghiệm ảnh hưởng thời gian khử trùng lên khả tạo mẫu vô trùng in vitro 40 ii 2.4.2.2 Khảo nghiệm ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên khả tạo chồi từ mẫu cấy 41 2.4.2.3 Khảo nghiệm ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên khả phát triển từ chồi 43 2.4.2.4 Khảo nghiệm ảnh hưởng chất tỉ lệ chất lên khả thích nghi in vitro đưa vườn ươm 44 2.4.3 Nội dung 3: Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng tích lũy hoạt chất từ Bìm bịp 2.4.3.1 45 Khảo nghiệm ảnh hưởng kỹ thuật nhân giống đến phát triển Bìm bịp 46 2.4.3.2 Khảo nghiệm ảnh hưởng lượng phân bón, kiểu trồng đến khả sinh trưởng tích lũy hoạt chất Bìm bịp 47 2.4.3.3 Khảo nghiệm ảnh hưởng mật độ trồng đến phát triển Bìm bịp 48 49 2.4.4 Nội dung 4: Trồng mô hình Bìm bịp 2.4.5 Nội dung 5: Chiết cao, tiêu chuẩn hóa cao chiết Bìm bịp 50 2.4.5.1 Chiết cao 50 2.4.5.2 Tiêu chuẩn hố cao Bìm bịp 50 2.4.5.3 Thẩm định quy trình định lượng shaftoside, orientin, vitexin isovitexin cao Bìm bịp 54 2.4.6 Nội dung 6: Khảo sát hoạt tính cao chiết Bìm bịp 56 2.4.6.1 Xác định hoạt tính kháng oxi hóa cao chiết từ Bìm bịp 56 iii Xác định hoạt tính apoptosis cao chiết mơ hình tế 2.4.6.2 bào ung thư vú 58 2.4.7 Nội dung Thử nghiệm độc tính cao chiết Bìm bịp 62 Kiểm tra độc tính cấp cao chiết Bìm bịp mơ hình 2.4.7.1 động vật 2.4.7.2 62 Kiểm tra độc tính bán trường diễn cao chiết Bìm bịp mơ hình động vật 2.4.8 63 Nội dung Thử nghiệm điều chế viên nén chứa cao chiết Bìm bịp 64 2.4.8.1 Điều chế viên nén 64 2.4.8.2 Nâng cấp cỡ lô điều chế xác định thơng số quy trình 70 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 74 3.1 Nội dung 1: Khảo sát thực vật học sơ thành phần hóa thực vật Bìm bịp 74 3.1.1 Khảo sát thực vật học Cây Bìm bịp 74 3.1.2 Phân tích sơ thành phần hoá học 84 3.1.2.1 Thử tinh khiết 84 3.1.2.2 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật 84 3.2 Nội dung Nhân nhanh Bìm Bịp phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 86 3.2.1 Khảo nghiệm ảnh hưởng chất khử trùng lên khả tạo mẫu vô trùng in vitro 86 iv 3.2.2 Khảo nghiệm ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên khả tạo chồi từ mẫu cấy 89 3.2.3 Khảo nghiệm ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên khả tái sinh từ chồi 92 3.2.4 Khảo nghiệm ảnh hưởng chất tỉ lệ chất lên khả thích nghi in vitro đưa vườn ươm 95 3.2.5 Quy trình ni cấy mơ Bìm bịp 99 3.3 Nội dung Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng tích lũy hoạt chất từ Bìm bịp 3.3.1 100 Khảo nghiệm ảnh hưởng nguồn giống (kỹ thuật nhân giống) đến phát triển Bìm bịp 100 3.3.2 Khảo nghiệm ảnh hưởng lượng phân bón, kiểu trồng đến khả sinh trưởng tích lũy hoạt chất Bìm bịp 104 3.3.3 Khảo nghiệm ảnh hưởng mật độ trồng đến phát triển Bìm bịp 115 3.4 Nội dung Trồng mơ hình Bìm bịp 119 3.5 Nội dung Chiết cao, tiêu chuẩn hóa cao chiết Bìm bịp 122 3.5.1 Tối ưu hố quy trình ly trích thu nhận cao chiết Bìm bịp 122 3.5.2 Tiêu chuẩn hố cao Bìm bịp 126 3.5.2.1 Mô tả 126 3.5.2.2 Mất khối lượng làm khô 126 3.5.2.3 Tỉ lệ tro 126 3.5.2.4 Giới hạn nhiễm khuẩn 127 3.5.2.5 Hàm lượng kim loại nặng 128 v 3.5.2.6 Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật 128 3.5.2.7 Định tính thành phần cao chiết Bìm bịp TLC 130 3.5.2.8 Định lượng thành phần cao chiết Bìm bịp phương pháp HPLC 131 3.5.3 Thẩm định quy trình định lượng shaftoside, orientin isovitexin cao chiết Bìm bịp 134 3.5.3.1 Tính phù hợp hệ thống 134 3.5.3.2 Tính chọn lọc 136 3.5.3.3 Tính tuyến tính miền giá trị 137 3.5.3.4 Độ xác 138 3.5.3.5 Thẩm định độ 138 3.6 Nội dung Xác định hoạt tính cao chiết Bìm bịp 140 3.6.1 Xác định hoạt tính kháng oxy hóa cao chiết từ Bìm bịp 140 3.6.2 Kiểm tra độc tế bào 141 3.6.3 Đánh giá phân mảnh nhân tế bào 143 3.6.4 Xác định khả ức chế tế bào ung thư vú thông qua biểu gen bax bcl-2 146 3.7 Nội dung Thử nghiệm độc tính cao chiết Bìm bịp 149 3.7.1 Kiểm tra độc tính cấp cao chiết Bìm bịp mơ hình động vật 149 3.7.2 Kiểm tra độc tính bán trường diễn cao chiết Bìm bịp mơ hình động vật 151 vi 3.8 Nội dung Thử nghiệm điều chế viên nén chứa cao chiết Bìm bịp 158 3.8.1 Điều chế viên nén 158 3.8.1.1 Sàng lọc công thức 158 3.8.1.2 Tối ưu hóa cơng thức 163 3.8.2 Nâng cỡ lô điều chế xác định thông số quy trình 170 3.8.2.1 Thiết lập thời gian sấy cốm ướt 172 3.8.2.2 Xác định cỡ lưới xát hạt lưới sửa hạt 173 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 180 4.1 Kết luận 180 4.2 Kiến nghị 182 TÀI LIỆU THAM KHẢO 183 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các hoạt chất xác định Bìm bịp Bảng 1.2 Giới hạn hoá chất bảo vệ thực vật theo DĐVN V 30 Bảng 1.3 Yêu cầu độ lặp lại độ tái lặp phương pháp phân tích 33 Bảng 1.4 Độ lệch cho phép dạng bào chế 34 Bảng 2.1 Phân tích sơ thành phần hoá học 39 Bảng 2.2 Mồi xuôi mồi ngược sử dụng phản ứng Real time PCR 62 Bảng 3.1 Độ ẩm mẫu thử dược liệu 84 Bảng 3.2 Tro toàn phần mẫu thử dược liệu 84 Bảng 3.3 Chất chiết mẫu thử dược liệu phương pháp chiết nóng với EtOH 96% 84 Bảng 3.4 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật 85 Bảng 3.5 Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến hiệu tạo mẫu Bìm bịp vơ trùng 88 Bảng 3.6 Ảnh hưởng BA NAA đến khả tạo chồi Bìm bịp sau tuần nuôi cấy 91 Bảng 3.7 Ảnh hưởng NAA lên phát triển hoàn chỉnh từ chồi 94 Bảng 3.8 Ảnh hưởng chất đến khả thích nghi phát triển Bìm bịp 98 Bảng 3.9 Chỉ tiêu sinh trưởng phát triển Bìm bịp sau tháng trồng100 Bảng 3.10 Hàm lượng hoạt chất tính theo tổng trọng lượng khơ sau tháng trồng 101 Bảng 3.11 Chỉ tiêu sinh trưởng phát triển Bìm bịp sau tháng trồng 103 viii Bảng 3.12 Hàm lượng hoạt chất tính theo tổng trọng lượng khô sau tháng trồng 103 Bảng 3.13 Chỉ tiêu sinh trưởng phát triển Bìm bịp sau tháng trồng 105 Bảng 3.14 Hàm lượng hoạt chất tính theo tổng trọng lượng khơ sau tháng trồng 107 Bảng 3.15 Chỉ tiêu sinh trưởng phát triển Bìm bịp sau tháng trồng 111 Bảng 3.16 Hàm lượng hoạt chất tính theo tổng trọng lượng khô sau tháng trồng 112 Bảng 3.17 Chỉ tiêu sinh trưởng phát triển Bìm bịp sau tháng trồng 115 Bảng 3.18 Hàm lượng hoạt chất tính theo tổng trọng lượng khơ sau tháng trồng 116 Bảng 3.19 Chỉ tiêu sinh trưởng phát triển Bìm bịp sau tháng trồng 117 Bảng 3.20 Hàm lượng hoạt chất tính theo tổng trọng lượng khô sau tháng trồng 118 Bảng 3.21 Chỉ tiêu sinh trưởng phát triển Bìm bịp trồng mơ hình 120 Bảng 3.22 Khảo sát dung mơi ly trích 122 Bảng 3.23 Khảo sát tỉ lệ mẫu/dung môi 123 Bảng 3.24 Khảo sát thời gian ly trích 123 Bảng 3.25 Khảo sát số lần ly trích 123 Bảng 3.26 Tối ưu hóa điều kiện ly trích thu nhận cao chiết Bìm bịp 124 Bảng 3.27 Hiệu suất thu hồi cao chiết nước Bìm bịp 124 Bảng 3.28 Kết khối lượng làm khơ cao bìm bịp 126 Bảng 3.29 Kết tro toàn phần cao Bìm bịp 127 ix lệ lớn, khối lượng viên q trình nén dập không đồng Ở mẻ 4, hạt có kích thước lớn 1,2 mm hạt sau sấy sửa qua rây 1,2 mm Tuy nhiên, kích thước hạt mẻ có xu hướng phân tán, khơng phù hợp cho q trình dập viên quy mơ cơng nghiệp Bảng 3.60 Phần trăm phân đoạn kích thước hạt (%) Lớn 1,2 mm Từ 1,0 đến 1,2 mm Từ 0,85 đến 1,0 mm Từ 0,50 đến 0,85 mm Nhỏ 0,5 mm Mẻ Mẻ Mẻ Mẻ 49,7 0,0 9,0 0,0 6,0 9,0 11 16,7 22,9 32,9 32,9 36,0 11,6 24,5 28,4 22,1 9,8 33,6 18,6 25,3 Đối với mẻ 3, dù phần lớn hạt có kích thước nhỏ 1,0 mm phân bố kích thước hẹp tập trung phân đoạn 0,5 - 1,0 mm Do vậy, điều kiện xát hạt ướt với lưới 1,5 mm sửa hạt khô qua lưới 1,5 mm phù hợp cho quy trình sản xuất viên nén chứa cao bìm bịp nghiên cứu 174 (a) (b) Hình 3.51 (a) Biểu đồ biểu diễn phần trăm phân đoạn kích thước hạt; (b) biểu đồ phần trăm tích lũy phân đoạn kích thước hạt mẻ khảo sát 3.8.2.3 Sản xuất lặp lại kiểm nghiệm viên nén chứa cao bìm bịp Trên sở kết nghiên cứu, tiến hành sản xuất lô 8000 viên với thành phần công thức tối ưu thông số quy trình điều chế xây dựng Cụ thể sau: Cơng thức điều chế trình bày bảng 3.61 Bảng 3.61 Thành phần công thức điều chế 8000 viên nén chứa cao Bìm bịp NC01 Thành phần Lượng viên (mg) Tỷ lệ (%) Lượng cho lô (g) Cao mềm 300 Tương đương cao khô 240 43,6 1920 Lactose monohydrate 87,1 15,8 696,8 Cellulose vi tinh thể 152,9 27,8 1223,2 Sodium croscarmellose (rã 30 5,5 240 2400 nội) 175 Crospovidon (rã ngoại) 15 2,7 120 Silica dioxyd thể keo 20 3,6 160 Magnesi stearate 0,9 40 Tổng 550 100 4400 Mơ tả quy trình điều chế:  Cân 696,8 g lactose monohydrate, 1223,2 cellulose vi tinh thể, 160 g silica dioxyd thể keo, 240 g sodium croscarmellose, 120 g crospovidon rây nguyên liệu cân thiết bị rây rung (lưới 0,5 mm)  Trộn khô lactose monohydrate, cellulose vi tinh thể với silica dioxyd thể keo máy trộn siêu tốc thời gian phút, tốc độ cánh trộn 240 rpm  Phối hợp sodium croscarmellose, trộn máy trộn siêu tốc thời gian phút, tốc độ cánh trộn 240 rpm  Phối hợp 2400 g cao mềm bìm bịp định chuẩn vào hỗn hợp bột khơ, nhồi trộn ướt tạo hạt máy trộn siêu tốc thời gian phút, tốc độ cánh trộn 240 rpm, tốc độ cánh chém 1500 rpm  Sửa hạt ướt thiết bị xát sửa hạt trục đứng, tốc độ cánh xát hạt 2000 rpm, cỡ lưới 1,5 mm  Sấy tủ sấy nhiệt độ 55oC 180 phút (độ ẩm cốm sau sấy đạt 4%)  Cốm khô sửa hạt máy xát hạt trục ngang, cỡ lưới 1,5 mm  Trộn hỗn hợp thu với crospovidon máy trộn chữ V phút, tốc độ 24 rpm 176  Trộn hoàn tất hỗn hợp thu với magnesi stearate (đã rây qua rây 0,3 mm) máy trộn chữ V phút, tốc độ 24 rpm  Viên dập mức khối lượng 550 mg chày caplet, độ cứng trì khoảng 120 - 140 N 177 Lưu đồ sản xuất: Hình 3.52 Lưu đồ sản xuất viên nén chứa cao định chuẩn bìm bịp (cỡ lô 8000 g) 178 Đánh giá chất lượng viên nén Viên nén tạo thành đánh giá tiêu theo hướng dẫn DĐVN V Kết trình bày bảng 3.62 Bảng 3.62 Kết đánh giá chất lượng viên nén chứa cao định chuẩn Bìm bịp STT Chỉ tiêu Cảm quan Định tính Độ đồng khối lượng Mức chất lượng Viên nén caplet, màu nâu, hai mặt khum lồi có khắc vạch Theo DĐVN V: có vết chất shaftoside, orientin, isovitexin KLTB ± 5% (từ 522,5 – 577,5 mg) Kết Đạt Đúng Đạt Thời gian rã Không 15 phút Đạt Độ mài mịn Khơng q 1% Đạt Hàm lượng hợp chất không nhỏ Định lượng 0,806 mg/viên (shaftoside), 0,027 mg/viên (orientin) 0,058 mg/viên (isovitexin) 179 Đạt CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đã mơ tả đặc tính thực vật học sơ thành phần hóa thực vật Bìm bịp Cây Bìm bịp nhân nhanh phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, với thông số: khử trùng mẫu với hypochloride natri 50%(v/v), thời gian khử trùng 25 phút; tạo chồi môi trường MS bổ sung mg/L BA o,4 mg/L NAA; phát triển môi trường MS bổ sung 0,4 mg/L IBA; đưa vườn ươm với tỷ chất: mụn dừa: tro trấu: cát theo tỷ lệ: 1:1:1 Xác định số yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng tích lũy hoạt chất từ Bìm bịp: - Cây nhân giống phương pháp giâm hom nuôi cấy mô khác biệt tiêu sinh trưởng tích lũy hoạt chất sau tháng trồng - Có ảnh hưởng lượng phân bón kiểu trồng lên khả sinh trưởng tích lũy hoạt chất Bìm bịp Theo kết ghi nhận, nghiệm thức (bón phân 20 tấn/ha, điều kiện tủ rơm) phù hợp cho khả sinh trưởng tích lũy hoạt chất Bìm bịp sau tháng trồng: tỷ lệ sống: 80,00%; chiều cao 63,23 cm; số lá/cây: 51,33; diện tích 33,61; số rễ: 33,00; chiều dài rễ 50,49 (cm); trọng lượng tươi: 1471,19 (g/cây); trọng lượng khô: 141,90 (g/cây); hàm lượng phenolic: 1929,67 (mg/Tổng TLK); hàm lượng flavonoid: 878,84 (mg/tổng TLK) - Khơng có khác biệt ảnh hưởng khoảng cách trồng (30, 40, 50, 60 cm) lên khả sinh trưởng phát triển bìm bịp sau tháng trồng 180 Trồng mơ hình Bìm bịp: Cây Bìm bịp trồng mơ hình với điều kiện: lượng phân hữu bón lót: 20 tấn/ha, tủ rơm, khoảng cách trồng 50 cm có kết ghi nhận phù hợp với điều kiện khảo sát Chiết cao, tiêu chuẩn hóa cao chiết Bìm bịp: - Chiết cao phương pháp ngâm dầm điều kiện tối ưu: dung môi nước; tỷ lệ mẫu /dung môi: 1/40; thời gian ly trích 24 h; số lần ly trích: Hiệu suất thu hồi cao: 33,34% (w/wTLK) - Cao chiết kiểm tra đạt tiêu theo quy định cao chiết DĐVN V, có hàm lượng shaftoside: 3,16 mg/g cao; orientin: 0,104 mg/g cao, isovitexin: 0,229 mg/g cao Khảo sát hoạt tính cao chiết Bìm bịp: - Hoạt tính kháng oxy hóa, IC50=96,85 (µg/ml) - Cao chiết có hoạt tính ức chế tế bào ung thư vú MCF-7 thông qua biểu ức chế tăng sinh tế bào, phân mảnh nhân, biểu gen (bcl-2 bax) Thử nghiệm độc tính cao chiết Bìm bịp: - Độc tính cấp: cao Bìm bịp có giá trị LD50 > 5000 mg/kg trọng lượng chuột (khơng độc) - Độc tính bán trường diễn: cao chiết Bìm bịp khơng ảnh hưởng đến trạng thái, thể trọng, trọng lượng quan, chức tạo máu, chức gan thận động vật nghiên cứu liều thử nghiệm Thử nghiệm điều chế viên nén từ cao chiết Bìm bịp: - Tỷ lệ thành phần công thức tối ưu đề xuất cho viên nén trọng lượng 550 mg: cao mềm Bìm bịp: 300 mg; lactose monohydrate: 87,1 mg; cellulose vi tinh thể: 152,9 mg; sodium croscarmellose (rã nội): 30 mg; 181 crospovidon (rã ngoại): 15 mg; Silica dioxyd thể keo: 20 mg; Magnesi stearate: mg - Nâng cỡ lô điều chế xác định thơng số quy trình: cỡ lưới xát cốm: 1,5 mm, cỡ lưới sửa cốm: 1,5 mm; thời gian sấy cốm: 180 phút 4.2 Kiến nghị : - Đánh giá hiệu kinh tế mô hình trồng Bìm bịp để có sở nhân rộng mơ hình - Thử nghiệm độc tính viên nén hoạt tính hỗ trợ điều trị ung thư mơ hình thực nghiệm - Theo dõi đánh giá độ ổn định viên nén chứa cao chiết Bìm bịp theo thời gian 182 TÀI LIỆU THAM KHẢO Arullappan S, Rajamanickam P, Thevar N, Kodimani C.2014 In vitro screening of cytotoxic, antimicrobial and antioxidant activities of Clinacanthus nutans (Acanthaceae) leaf extracts Trop J Pharm Res 13:1455–1461 Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A 2018 Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries CA cancer J Clin 68(6):394-424 Chelyn JL, Omar MH, Mohd Yousof NSA, Ranggasamy R, Wasiman M I, Ismail Z (2014) Analysis of flavone c-glycosides in the leaves of Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau by HPTLC and HPLCUV/DAD Scientific World J 2014: 1-6 Cragg GM, Newman DJ 2005 Plants as source of anticancer agents J Ethnopharmacol 100: 72-79 Creemers GJ, Bolis G, Gore M, Scarfone G, Lacave AJ, Guastalla JP, Despax R, Favalli G, Kreinberg R, VanBelle S, Hudson I, Verweij J, Huinink WWT Topotecan, an active drug in the second-line treatment of epithelial ovarian cancer: results of a large European phase II study J Clin Oncol 1996; 14: 3056-61 Dampawan, P 1976 Studies of the chemical constituents of the Clinacanthus nutans (Acanthaceae) and Zingiber cassumunar Roxb Master thesis, Mahidol University Dampawan, P., Huntrakul, C., Reutrakul, V., Raston, C L & White, A H 1977 Constituents of Clinacanthus nutans and the crystal structure of lup-20 (29)-ene-3-one J Sci Soc Thailand, 3, 14-26 183 Danmin Huang., Wenjie Guo., Jing Gao., Jun Chen and Joshua Opeyemi Olatunji 2015 Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau Ethanol Extract Inhibits Hepatoma in Mice through Upregulation of the Immune Response Dembitsky, V.M.; Takashi, M 2007 Prog Lipid Res 46, 328– 375 10 Devasagayam, T.P.A.; Sainis, K.B 2002 Indian J Exp Biol 40, 639–655 11 Direkbusarakom S, Ruangpan L, Ezura Y, Yoshimizu M 1998 Protective Efficacy of Clinacanthus nutans on yellow- head disease in black tiger shrimp (Penaeus monodon) Fish Pathology; 33(4):401-404 12 Fong, S, Y., Piva, T., Urban, S and Huynh, T 2014 Genetic homogeneity of vegatatively propagated Clincanthus nutans (Acanthaceae) J Med Plants Res., 8, 903-914 13 Ghasemzadeh, A., Nasiri, A., Jaafar, H Z E., Baghdadi, A & Ahmad, I 2014 Changes in phytochemical synthesis, chalcone synthase activity and pharmaceutical qualities of Sabah snake grass (Clinacanthus nutans L.) in relation to plant age Molecules, 19, 17632-17648 14 Globinmed 2015 Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau [Online] Kuala Lumpur, Malaysia: Institute for Medicinal Research Available:http://www.globinmed.com/index.php?option=com_content&vi ew=article&id=79320:clinacanthus-nutans-burmf-lindau [Accessed July 2015] 15 Gu, G.Y.; Jiang, Y 2008 World Phytomed 23, 13–20 16 Hu, J and Daniel, T F 2011 Clinacanthus nutans (N L Burman) Lindau In: WU, Z., Raven, P H & Hong, D (eds.) Flora of China: Cucurbitaceae through Valerianaceae with Annonaceae and 184 Berberidaceae Beijing and Missouri: Science Press and Missouri Botanical Garden Press 17 Huang D, Guo W, Gao J, Chen J, Olatunji J (2015) Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau ethanol extract inhibits hepatoma in mice through upregulation of the immune response Molecules 20: 1740517428 18 Janwitayanuchit, W., Suwanborirux, K., Patarapanich, C., Pummangura, S., Lipipun, V & Vilaivan, T 2003 Synthesis and antiherpes simplex viral activity of monoglycosyl diglycerides Phytochemistry, 64, 1253-1264 19 Khoo LW, Mediani A, Zolkeflee NKZ, Leong SW, Ismail IS, Khatib A, Shaari K, Abas F.2015 Phytochemical diversity of Clinacanthus nutans extracts and their bioactivity correlations elucidated by NMR based metabolomics Phytochem Lett 14:123–133 20 Kunsorn P, Ruangrungsi N, Lipipun V, Khanboon A, Rungsihirunrat K.2013 The identities and anti-Herpes simplex virus activity of Clinacanthus nutans and Clinacanthus siamensis Asian Pac J Trop Biomed 3:284–290 21 Lin, J., Li, H M & Yu, J G 1983 Studies on the chemical constituents of niu xu hua (Clinacanthus nutans) Zhongcaoyao, 14, 337338 22 Lusia Barek, M., Hasmadi, M., Zaleha, A Z & Mohd Fadzelly, A B 2015 Effect of different drying methods on phytochemicals and antioxidant properties of unfermented and fermented teas from Sabah snake grass (Clinacanthus nutans Lind.) leaves Int Food Res J., 22, 661-670 23 Mascarenhas, M 1994 Mushroom Res 3, 77–80 24 Motoo,Y.; Sawabu, N 1994 Cancer Lett 86, 91–95 185 25 Mustapa, A N., Martin, Á., Mato, R B & Cocero, M J 2015 Extraction of phytocompounds from the medicinal plant Clinacanthus nutans Lindau by microwave-assisted extraction and supercritical carbon dioxide extraction Ind Crops Prod., 74, 83-94 26 Newman, D.J.; Cragg, G.M J Nat Prod 2007, 70, 461‒477 27 P’ng XW, Akowuah GA (2012) Acute oral toxicity study of Clinacanthus nutans in mice Int J Pharma Sci Res 3(11): 4202-4205 28 Pannangpetch P, Laupattarakasem P, Kukongviriyapan V, Kukongviriyapan U, Kongyingyoes B, Aromdee C.2007 Antioxidant activity and protective effect against oxidative hemolysis of Clinacanthus nutans (Burm f) Lindau Songklanakarin J Sci Technol 29:1–9 29 Pannangpetch, P., Laupattarakasem, P., Kukongviriyapan, V., Kukongviriyapan, U., Kongyngyoes, B & Aromdee, C 2007 Antioxidant activity and protective effect against oxidative hemolysis of Clinacanthus nutans (Burm F.) Lindau Songklanakarin J Sci Technol., 29, 1-9 30 Putwatana, P., Sanmannowong, P., Oonprasertpong, L., Junda, T., Pitiporn, S & Narkwong, L 2009 Relief of radiation-induced oral mucositis in head and neck cancer Cancer Nurs 32, 82-87 31 Sakdarat, S., Shuyprom, A., Na Ayudhya, T D., Waterman, P G & Karagianis, G 2008 Chemical composition investigation of the Clinacanthus nutans Lindau leaves Thai J Phytopharm., 15, 13-24 32 Sakdarat, S., Shuyprom, A., Pientong, C., Ekalaksananan, T & Thongchai, S 2009 Bioactive constituents from the leaves of Clinacanthus nutans Lindau Bioorg Med Chem., 17, 1857-1860 33 Sangkitporn, S., Polchan, K., Thawatsupa, P., Bunchob, M & Chawalitthumrong, P 1993 Treatment of recurrent genital herpes simplex virus infection with Clinacanthus nutans extract Bull Dept Med Serv., 18, 226-231 186 34 Satayavivad J, Bunyaoraphatsara N, Kitisiripornkul S, Tanasomwang W 1996 Analgesic and anti-inflammatory activities of extract of Clinacanthus nutans Lindau Thai J Phytopharm; 3: 7-17 35 Shan, H.C.; Ma, W.G and Gao, Z.Z 2005 Mod J Integ Trader Chin.West Med 14, 825–827 36 Shim, S Y., Aziana, I & Khoo, B Y 2013 Perspective and insight on Clinacanthus nutans Lindau in traditional medicine Int J Integr Biol., 14, 7-9 37 Shuyprom, A 2004 Chemical composition investigation of the Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau leaves Master thesis, Suranaree University of Technology 38 Sittiso, S., Ekalaksananan, T., Pientong, C., Sakdarat, S., Charoensri, N & Kongyingyoes, B 2010 Effects of compounds from Clinacanthus nutans on dengue virus type infection Srinagarind Med J., 25, 272-275 39 Sriwanthana, B., Chavalittumrong, P & Chompuk, L 1996 Effect of Clinacanthus nutans on human cell-mediated immune response in vitro Thai J Pharm Sci., 20, 261-267 40 Stehelin, D.; Varmus, H.E.; Bishop, J.M.; Voqt, P.K Nature.1976, 260, 170–173 41 Teshima, K I., Kaneko, T., Ohtani, K., Kasai, R., Lhieochaiphant, S., Picheansoonthon, C & Yamasaki, K 1998 Sulfurcontaining glucosides from Clinacanthus nutans Phytochemistry, 48, 831835 42 Teshima, K I., Kaneko, T., Ohtani, K., Kasai, R., Lhieochaiphant, S., Picheansoonthon, C & Yamasaki, K 1997 Cglycosyl flavones from Clinacanthus nutans Nat Med., 51, 557 187 43 Thorngakard V, Tencomnao T 2010, Modulatory effects of Thai medicinal plant extract on proinflammatory cytokines-induced apoptosis in human keratinocyte HaCaT cells Afr J Biotechnol., 9, 4999-5003 44 Tiew, W P., P'ng, X W., Chin, J H & Akowuah, G A 2014 Effect of methanol extract of Clinacanthus nutans on serum biochemical parameters in rats J Appl Pharm., 6, 77-86 45 Tu S-F, Liu R, Cheng Y-B, Hsu Y-M, Du Y-C, El-Shazly M, Wu Y-C, Chang F-R.2014 Chemical constituents and bioactivities of Clinacanthus nutans aerial parts Molecules 19:20382–20390 46 Tuntiwachwuttikul, P., Pootaeng-on, Y., Phansa, P & Taylor, W C 2004 Cerebrosides and a monoacylmonogalactosylglycerol from Clinacanthus nutans Chem Pharma Bull., 52, 27- 32 47 Uawonggul N, Chaveerach A, Thammasirirak S, Arkaravichien T, Chuachan C, Daduang S.2006 Screening of plants acting against Heterometrus laoticus scorpion venom activity on fibroblast cell lysis J Ethnopharmacol 103:201–207 48 Yong, Y K., Tan, J J., Teh, S S., Mah, S H., EE, G C L., Chiong, H S & Ahmad, Z 2013 Clinacanthus nutans extracts are antioxidant with antiproliferative affect on cultured human cancer cell lines Evid Based Complement Alternat Med 1-8 49 Yong, Y K., Tan, J J., Teh, S S., Mah, S H., EE, G C L., Chiong, H S and Ahmad, Z 2013 Clinacanthus nutans extracts are antioxidant with antiproliferative affect on cultured human cancer cell lines Evid Based Complement Alternat Med 1-8 50 Yuann, J M P., Wang, J S., Jian, H L., Lin, C C & Liang, J Y 2012 Effects of Clinacanthus nutans (Burm.f) Lindau leaf extracts on protection of plasmid DNA from riboflavin photoreaction MT-Trans Biotechnol., 4, 45-58 188