Chiết xuất cao chiết có tác dụng tăng sinh tế bào tạo xương người mg 63 từ lá cây trâu cổ ficus pumila l

SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH TP HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ * BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu ngày 03 tháng 01 năm 2018) CHIẾT XUẤT CAO CHIẾT CÓ TÁC DỤNG TĂNG SINH TẾ BÀO TẠO XƯƠNG NGƯỜI MG-63 TỪ LÁ CÂY TRÂU CỔ (Ficus pumila L.) CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: NGUYỄN HỮU AN CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ 01-2018 SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH TP HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ * BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu ngày 03 tháng 01 năm 2018) CHIẾT XUẤT CAO CHIẾT CÓ TÁC DỤNG TĂNG SINH TẾ BÀO TẠO XƯƠNG NGƯỜI MG-63 TỪ LÁ CÂY TRÂU CỔ (Ficus pumila L.) Thủ trưởng Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì đề tài (Họ tên chữ ký) (Họ tên, chữ ký, đóng dấu) Giám đốc Sở Khoa học Cơng nghệ Chủ tịch Hội đồng xét duyệt MỤC LỤC Tóm tắt Abstract Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ Danh mục sơ đồ Mở đầu Chương 1: Tổng quan 1.1 Giới thiệu trâu cổ 1.1.1 Đặc điểm trâu cổ 1.1.2 Các nghiên cứu thành phần hóa học trâu cổ 1.1.2.1 Các hợp chất furanocoumarin coumarin 1.1.2.2 Các hợp chất triterpenoid 1.1.2.3 Các hợp chất steroid 12 1.1.2.4 Các hợp chất sesquiterpenoid 13 1.1.2.5 Các hợp chất flavonoid 14 1.1.2.6 Các hợp chất khác 17 1.1.3 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học 17 1.2 Giới thiệu loãng xương 20 1.2.1 Cấu tạo mơ xương, chu trình chuyển hóa xương đỉnh khối xương 20 1.2.1.1 Cấu tạo mô xương 20 1.2.1.2 Chu trình chuyển hóa xương 21 1.2.1.3 Đỉnh khối xương 22 1.2.2 Giới thiệu loãng xương 23 1.2.2.1 Định nghĩa loãng xương 23 1.2.2.2 Phân loại loãng xương 24 1.2.2.3 Các thuốc dùng điều trị loãng xương 25 1.2.3 Các nghiên cứu tăng sinh tế bào tạo xương in vitro từ thực vật 26 Chương 2: Thực nghiệm 27 2.1 Hóa chất thiết bị 27 2.1.1 Hóa chất 27 2.1.2 Dụng cụ 27 2.1.3 Thiết bị phân tích 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Nguyên liệu 28 2.2.2 Khảo sát chất lượng trâu cổ 28 2.2.3 Phương pháp tiến hành phân lập hợp chất 30 2.2.4 Khảo sát chất lượng cao ethanol 30 2.2.5 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 30 2.2.6 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính tăng sinh tế bào tạo xương người30 2.3 Điều chế loại cao 32 2.3.1 Điều chế cao ethanol 32 2.3.2 Điều chế loại cao từ cao ethanol 32 2.4 Quá trình phân lập 32 Chương 3: Kết biện luận 36 3.1 Khảo sát chất lượng trâu cổ 36 3.2 Khảo sát chất lượng cao ethanol 37 3.3 Phân lập hợp chất từ trâu cổ 38 3.4 Kết thử nghiệm hoạt tính sinh học 40 3.5 Xác định cấu trúc hoá học hợp chất 42 3.5.1 Hợp chất FP1 42 3.5.2 Hợp chất FP2 44 3.5.3 Hợp chất FP3 49 3.5.4 Hợp chất FP4 53 Kết luận kiến nghị 59 Tài liệu tham khảo 60 Phụ lục TÓM TẮT Trong phạm vi đề tài, chúng tơi thử nghiệm hoạt tính tăng sinh tế bào tạo xương người MG-63 cao ethanol, hexane, chloroform, ethyl acetate methanol điều chế từ trâu cổ (Ficus pumila L.) nồng độ 100, 10, 1, 0,1 0,01 µg/ml Kết thu cho thấy tế bào MG-63 có khả sống sót thêm cao hexane, ethyl acetate methanol nồng độ 0,1 0,01 µg/ml Riêng thêm cao ethanol, tế bào có khả sống sót nồng độ 0,01 µg/ml Ở nồng độ 0,01 μg/ml, cao ethyl acetate cho khả sống sót tế bào cao mức 11,79% so với nhóm đối chứng Ngược lại, cao chloroform ức chế khả sống sót tế bào nồng độ nghiên cứu Mặt khác, từ cao ethyl acetate của, phân lập hợp chất Bằng phương pháp phổ nghiệm, cấu trúc hóa học hợp chất xác định bergapten (FP1), acid oleanolic (FP2), (+)-catechin (FP3), rutin (FP4) Trong hợp chất trên, hai hợp chất FP2 FP3 lần tìm thấy trâu cổ ABSTRACT In this study, we investigated the proliferation activity of ethanol, n-hexane, chloroform, ethyl acetate and methanol extracts from Ficus pumila L leaves on MG63 human osteoblast-like cell by MTT assay The result indicated that all extracts had the ability to proliferate MG-63 cells except chloroform extract at the concentration varying from 0.1 to 0.01 µg/ml In particular, at the concentration of 0.01 µg/ml, ethyl acetate and ethanol extracts illustrated the highest proliferation ratio with percentage of 11.79% and 11.54%, respectively Moreover, four compounds as bergapten (FP1), oleanolic acid (FP2), (+)-catechin (FP3), rutin (FP4) were purified and identified from ethyl acetate of F pumilla leaves This is the first report of two compounds FP2 and FP3 from Ficus pumila This potentially obtained result could pave a way for further study to investigate the chemical constituents of Ficus pumila L as well as the proliferation activity of these three compounds on MG-63 human osteoblast-like cell DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt Carbon (13C) nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân resonance spectroscopy carbon (13C) Proton (1H) nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân resonance spectroscopy proton (1H)  Delta Thang delta ALP Alkaline phosphatase br Broad Mũi rộng COSY Correlation spectroscopy Phổ tương quan proton- 13 C-NMR H-NMR proton COX-2 Cyclooxygenase-2 d Deuterium/Doublet Proton deuterium hóa/Mũi đơi DEPT Distortionless enhancement by Phổ DEPT polarization transfer DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium DMSO Dimethylsulfoxide DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl EA Ethyl acetate EtOH Ethanol FBS Fetal bovine serum (k)(m)()g (Kilo)(milli)(micro)gam Glc Glucose GPx Glutathione peroxidase GRd Glutathione reductase HMBC Heteronuclear correlation multiple Huyết bào thai bò bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu nâng cao chromatography HR-ESI-MS HSQC High resolution – Electronspray Phổ khối lượng phân giải cao ionization – Mass spectrum phun mù điện tử Heteronuclear Phổ tương tác dị hạt nhân single-quantum correlation (M)Hz (Mega)hertz IL-1 Interleukin-1 qua liên kết J Hằng số ghép KH Kí hiệu (m)(µ)l (Milli)(micro)liter LD50 Lethal dose 50% Liều gây chết 50% số cá thể thử nghiệm M m Phân tử khối/nồng độ mol/l Multiplet m/z Mũi đa Khối lượng/điện tích MeOH Methanol MDA Malondialdehyde (c)(m)nm (Centi)(milli)(nano)metre OD Optical density NO Nitric oxide p value Probability value pp Mật độ quang học Giá trị xác suất Trang ppm Part per million Một phần triệu PTH Parathyroid hormone q Quartet Rha Rhamnose Rp Reserve phase Pha đảo s Singlet Mũi đơn SC50 Scavenging capacity 50% Khả bẫy 50% gốc tự SD Standard deviation Độ lệch chuẩn Mũi bốn SKC Sắc ký cột SKLM Sắc ký lớp mỏng SOD Superoxide dismutase t Triplet TGF- Transforming growth factor- TLC Thin layer chromatography TLTK TNF- Mũi ba Sắc ký lớp mỏng Tài liệu tham khảo Tumor necrosis factor- tr Trang UV Ultra violet WST-1 Water-soluble tetrazolium salt-1 Tia tử ngoại DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Các hợp chất furanocoumarin coumarin phân lập từ trâu cổ Bảng 1.2: Các hợp chất triterpenoid phân lập từ trâu cổ Bảng 1.3: Các hợp chất steroid phân lập từ trâu cổ 12 Bảng 1.4: Các hợp chất sesquiterpenoid phân lập từ trâu cổ 13 Bảng 1.5: Các hợp chất flavonoid phân lập từ trâu cổ 14 Bảng 1.6: Các hợp chất khác phân lập từ trâu cổ 17 Bảng 2.1: Kết SKC cao ethyl acetate 33 Bảng 2.2: Kết SKC phân đoạn E2 33 Bảng 2.3: Kết SKC phân đoạn E5 34 Bảng 3.1: Kết xác định độ ẩm trâu cổ 36 Bảng 3.2: Kết xác định tro toàn phần trâu cổ 36 Bảng 3.3: Kết xác định tro không tan acid trâu cổ 36 Bảng 3.4: Kết xác định độ ẩm cao ethanol 37 Bảng 3.5: Kết xác định tro toàn phần cao ethanol 38 Bảng 3.7: Kết hoạt tính tăng sinh tế bào MG-63 cao chiết 40 Bảng 3.8: Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR FP1 với số liệu phổ 1HNMR 13C-NMR bergapten 43 Bảng 3.9: Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR FP2 với số liệu phổ 1HNMR 13C-NMR acid oleanolic 47 Bảng 3.10: Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR C-NMR FP3 với số liệu phổ H-NMR 13C-NMR (+)-catechin 52 Bảng 3.11: Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR 13 13 C-NMR FP4 với số liệu phổ H-NMR 13C-NMR rutin 56 [2] Bộ Y tế, Vụ Khoa học Đào tạo (2011), Giải phẩu – Sinh lý, sách dùng cho trường trung học y tế, Nhà xuất Y học, Hà Nội [3] Trần Đức Thọ (1998), Bệnh loãng xương người cao tuổi, Nhà xuất Y học, Hà Nội [4] Gyu-Won Huh, Dae-Young Lee, Suh-Ji In, Don-Gil Lee, Sang Yong Park, Tae-Hoo Yi, Hee Cheol Kang, Woo-Duck Seo, Nam-In Baek (2012), “Fucosterols from Hizikia fusiformis and their proliferation activities on osteosarcoma-derived cell MG63”, Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry, 55 (4), pp 551-555 [5] Zhen-Ping Shang, Jing-Jing Meng, Qing-Chun Zhao, Ming-Zhi Su, Zhou Luo, Lin Yang, Jing-Jing Tan (2013), “Two new chromone glycosides from Drynaria fortunei”, Fitoterapia, 84, pp 130–134 [6] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập 2, Nhà xuất Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội, tr 1005-1007 [7] Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, tập 2, Nhà xuất Trẻ, Thành phố Hồ Chí Minh, tr 274 [8] Erlinda A Juan, John A Rideout, Consolacion Y Ragasa (1997), “Bioactive furanocoumarin derivatives from Ficus pumila (Moraceae)”, Philipp J Sci., 126 (2), pp 143-154 [9] Junichi Kitajima, Kaoru Kimizuka, Masanobu Arai, Yasuko Tanaka (1998), “Constituents of Ficus pumila leaves”, Chem Pharm Bull., 46 (10), pp 1647-1649 [10] Junichi Kitajima, Kaoru Kimizuka, Yasuko Tanaka (1998), “New sterols and triterpenoids of Ficus pumila fruit”, Chem Pharm Bull., 46 (9), pp 1408-1411 [11] Junichi Kitajima, Kaoru Kimizuka, Yasuko Tanaka (1999), “New dammarane-type acetylated triterpenoids and their related compounds of Ficus pumila fruit”, Chem Pharm Bull., 47 (8), pp 1138-1140 [12] Consolacion Y Ragasa, Erlinda Juan, John A Rideout (1999), “A Triterpene from Ficus pumila”, Journal of Asian Natural Products Research, (4), pp 269-275 [13] Junichi Kitajima, Kaoru Kimizuka, Yasuko Tanaka (2000), “Three new sesquiterpenoid glucosides of Ficus pumila fruit”, Chem Pharm Bull., 48 (1), pp 77-80 [14] Luisa Pistelli, Elisabetta E Chiellini, Ivano Morelli (2000), “Flavonoids from Ficus pumila”, Biochemical Systematics and Ecology, 28, pp 287-289 [15] Leong Cheng Ning Abraham, Tako Masakuni, Hanashiro Isao, Tamaki Hajime (2008), “Antioxidant flavonoid glycosides from the leaves of Ficus pumila L.”, Food Chemistry, 109, pp 415–420 [16] Chi-Ren Liao, Chun-Pin Kao, Wen-Huang Peng, Yuan-Shiun Chang, Shang-Chih Lai, Yu-Ling Ho (2012), “Analgesic and anti-inflammatory activities of methanol extract of Ficus pumila L in mice”, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine [17] Phạm Thị Hóa, Nguyễn Ngọc Chương, Trần Thị Thanh Tú (2012), “Khảo sát tác dụng kháng viêm dịch chiết trâu cổ (Ficus pumila L Moraceae) thực nghiệm”, Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh, 16 (1), tr 140-149 13 Mục tiêu nhiệm vụ a Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu hoạt tính tăng sinh tế bào tạo xương người MG-63 cao chiết từ trâu cổ phân lập hợp chất từ trâu cổ b Mục tiêu cụ thể - Thử nghiệm hoạt tính tăng sinh tế bào tạo xương người MG-63 cao chiết từ trâu cổ - Phân lập xác định cấu trúc 1-3 hợp chất từ trâu cổ 14 Tình trạng nhiệm vụ Mới Kế tiếp hướng nghiên cứu nhóm tác giả Kế tiếp nghiên cứu người khác 15 Nội dung nghiên cứu khoa học TT Các nội dung, công việc Kết chủ yếu cần thực cần đạt Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu Nguyên liệu đạt tiêu chuẩn sở Điều chế cao tổng cao phân đoạn, kiểm nghiệm tiêu chuẩn sở cao tổng Cao tổng đạt tiêu chuẩn sở cao phân đoạn đủ khối lượng cho nghiên cứu Thử nghiệm hoạt tính tăng sinh tế bào tạo xương Kết thử nghiệm hoạt tính người MG-63 cao tổng cao phân đoạn cao chiết Phân lập xác định cấu trúc 1-3 hợp chất Cấu trúc hóa học 1-3 hợp chất Viết báo cáo nghiệm thu Báo cáo nghiệm thu 16 Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng 16.1 Nội dung 1: Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu  Phương pháp thu hái xử lý mẫu Mẫu thực vật thu hái tươi Lá tươi sau thu hái, loại bỏ sâu bệnh, vàng úa, rửa sạch, để ráo, sấy khô, nghiền nhuyễn thành bột, sử dụng cho phần nghiên cứu Nguyên liệu TS Lưu Hồng Trường, Viện Sinh thái học Miền Nam, giám định tên khoa học Thời gian, vị trí lưu giữ mẫu tiêu  Xác định độ khối lượng làm khô mẫu Phương pháp: Dược điển Việt Nam IV, Phụ lục 9.6 - Tiến hành: cân xác khoảng g dược liệu vào chén cân (đã sấy 105 oC đến khối lượng không đổi cân bì), đem sấy 105 oC tủ sấy áp suất thường đến khối lượng không đổi (nghĩa chênh lệch lần cân khơng q 0,5 mg) - Tính tốn: H %  ab  100 a Trong đó: a: khối lượng bột dược liệu trước sấy (g) b: khối lượng bột dược liệu sau sấy (g) H%: độ ẩm (kl/kl)  Tro toàn phần Phương pháp: Dược điển Việt Nam IV, Phụ lục 9.8 - Nung chén nung sứ khối lượng không đổi, để nguội bình hút ẩm cân khối lượng chén khơng (b) - Cân xác khoảng g dược liệu cho vào chén nung Trải dược liệu đáy chén đốt cẩn thận bếp điện dược liệu cháy hồn tồn chén khơng cịn bốc khói - Dùng kẹp sắt dài đưa chén vào lị nung 500-600 oC vơ hóa hồn tồn (tro khơng cịn màu đen) Dùng kẹp sắt lấy chén nung ra, để nguội khoảng 30 phút bình hút ẩm Cân ghi lại lượng cân - Đặt chén đựng tro vào lò nung lại tiếp tục nung nhiệt độ Lấy chén ra, để nguội khoảng 30 phút bình hút ẩm Cân tính khối lượng - Tiếp tục làm đến kết lần cân liên tiếp, khối lượng chén có tro (a) chênh lệch khơng q 0,5 mg - Tro tồn phần tính dược liệu khô kiệt theo công thức: A  a  b  100 % c  c  h  - Trong đó: A% : tro tồn phần (%) dược liệu a: khối lượng chén có tro b: khối lượng chén không c: khối lượng dược liệu dùng h: độ ẩm (%) dược liệu  Tro không tan acid Phương pháp: Dược điển Việt Nam IV, Phụ lục 9.7 Tiến hành: Cho 25 ml HCl 2M vào tro tồn phần, đun sơi phút, lọc ðể tập trung chất không tan vào phễu thuỷ tinh xốp cân bì, vào giấy lọc khơng tro, rửa nước nóng đem nung 500 oC đến khối lượng khơng đổi Tính tỷ lệ phần trãm tro không tan acid so với dựợc liệu làm khơ khơng khí  Định tính flavonoid phản ứng hóa học Dung dịch thử: Lấy 0,5 g bột dược liệu, thêm 10 ml ethanol Đun sôi phút, để nguội, lọc Dịch lọc (dung dịch A) dùng làm phản ứng sau dịch chấm sắc ký lớp mỏng Định tính: Lấy ml dung dịch A pha loãng với 10 ml ethanol 90% chia vào ống nghiệm: - Ống 1: Thêm giọt acid hydrocloric bột magnesi, dung dịch chuyển dần từ màu vàng nhạt sang màu hồng tím đỏ - Ống 2: Thêm giọt dung dịch natri hydroxyd 20%, xuất tủa vàng cam - Ống 3: Thêm giọt dung dịch sắt (III) clorid 5%, dung dịch có màu xanh rêu  Định tính rutin sắc ký lớp mỏng Bản mỏng: Silica gel F254 Dung môi khai triển: n- butanol- acid acetic- nước (4: 1: 5) Dung dịch thử: Dung dịch A Dung dịch chuẩn: Hoà tan rutin ethanol 90% để dung dịch có chứa mg/ml Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 20 l dung dịch Sau triển khai xong, để khô mỏng nhiệt độ phòng Quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm, sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết phát quang màu nâu giá trị Rf với vết rutin sắc ký đồ dung dịch đối chiếu Hiện màu dung dịch H2SO4 10%, sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết màu vàng có giá trị Rf với vết rutin chuẩn (Rf: 0,5 - 0,54) sắc ký đồ dung dịch đối chiếu  Định lượng rutin Dung dịch chuẩn: Cân xác khoảng 0,2 g rutin chuẩn sấy khô (trong chân không) tới khối lượng không đổi, cho vào bình định mức 100 ml Hồ tan 70 ml methanol cách làm ấm cách thuỷ Để nguội, thêm methanol đủ 100 ml, lắc kỹ Lấy xác 10 ml dung dịch cho vào bình định mức 100 ml khác Thêm nước tới vạch, lắc kỹ (mỗi ml chứa 0,2 mg rutin khan) Xây dựng đường cong chuẩn: Lấy xác 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0 ml dung dịch chuẩn cho vào bình định mức 25 ml riêng biệt, thêm nước ml bình thêm ml dung dịch natri nitrit 5%, trộn kỹ Để yên phút, thêm ml dung dịch nhôm nitrat 10%, trộn kỹ, lại để yên phút Thêm 10 ml dung dịch natri hydroxyd 10%, thêm nước tới vạch, trộn kỹ để yên 15 phút Đo độ hấp thụ bước sóng 500 nm Vẽ đường cong chuẩn, lấy độ hấp thụ trục tung, nồng độ trục hồnh Dung dịch thử: Cân xác khoảng g bột dược liệu thô sấy khô 60 oC cho vào bình Soxhlet Thêm 120 ml ether, chiết tới dịch chiết không màu Để nguội gạn bỏ ether Thêm 90 ml methanol chiết tới dịch chiết khơng cịn màu Chuyển dịch chiết vào bình định mức 100 ml, rửa bình chiết lượng nhỏ methanol cho tiếp vào bình định mức Thêm methanol vạch lắc kỹ Lấy xác 10 ml dung dịch cho vào bình định mức 100 ml, thêm nước tới vạch trộn kỹ Lấy xác ml cho 10 vào bình định mức 25 ml, thêm ml nước thêm ml dung dịch natri nitrit 5%, trộn kỹ Để yên phút, thêm ml dung dịch nhôm nitrat 10%, trộn kỹ, để yên phút Thêm 10 ml dung dịch natri hydroxyd 10%, thêm nước tới vạch, trộn kỹ để yên 15 phút Đo độ hấp thụ bước sóng 500 nm Tính khối lượng rutin (g) dung dịch thử từ nồng độ đọc đường cong chuẩn tính hàm lượng phần trăm rutin dược liệu 16.2 Nội dung 2: Điều chế cao tổng cao phân đoạn, kiểm nghiệm tiêu chuẩn sở cao tổng  Điều chế cao tổng Sử dụng phương pháp ngâm nhiệt độ phịng để điều chế cao tổng Bột khơ trâu cổ ngâm ethanol 96% nhiệt độ phịng 24 Sau lọc lấy dung dịch, cô quay thu hồi dung môi Tiếp tục thực trình nhiều lần lượng cao thu không đáng kể, thu cao ethanol  Điều chế cao phân đoạn Cao ethanol tiến hành trích pha rắn silica gel với dung mơi giải ly nhexane, cô quay thu hồi dung môi, thu cao hexane Kế tiếp giải ly với chloroform, ethyl acetate, methanol, cô quay thu hồi dung môi thu cao chloroform, cao ethyl acetate cao methanol tương ứng  Xác định độ khối lượng làm khô cao tổng: Theo phương pháp ghi Dược điển Việt Nam IV, Phụ lục 9.6 tương tự nguyên liệu  Xác định tro toàn phần cao tổng: Theo phương pháp ghi Dược điển Việt Nam IV, Phụ lục 9.8 tương tự nguyên liệu  Xác định Tro không tan acid cao tổng: Theo phương pháp ghi Dược điển Việt Nam IV, Phụ lục 9.7 tương tự nguyên liệu  Định tính flavonoid cao tổng phản ứng hóa học: Tương tự phương pháp trình bày phần định tính flavonoid ngun liệu phản ứng hóa học  Định tính rutin cao tổng sắc ký lớp mỏng: Tương tự phương pháp trình bày phần định tính rutin nguyên liệu phương pháp sắc ký lớp mỏng  Định lượng rutin cao tổng: Tương tự phương pháp trình bày phần định lượng rutin nguyên liệu 16.3 Nội dung 3: Thử hoạt tính tăng sinh tế bào tạo xương người MG-63 cao tổng cao phân đoạn - Hoạt tính tăng sinh tế bào tạo xương người MG-63 thử nghiệm viện Khoa học Y sinh, Đại học Ajou, Hàn Quốc theo quy trình EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit 11  Nguyên tắc: Bộ EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit có chứa muối tetrazolium (màu vàng nhạt) Trong qua trình hơ hấp tế bào, muối tetrazolium bị enzyme ti thể khử thành dạng formazan (màu vàng đệm) (hình 1) Chỉ có tế bào “sống” khử muối tetrazolium Do đó, lượng formazan tạo thành tỉ lệ với số lượng tế bào “sống” Hình 1: Muối tetrazolium bị enzyme ti thể khử thành dạng formazan  Phương pháp tiến hành - Nuôi cấy tế bào với nồng độ 1x104 tế bào/giếng đĩa 96 giếng với 100 µl mơi trường Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM) bổ sung với 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin G, 100 µg/ml streptomycin Ủ đĩa nuôi cấy 24 37 oC 5% CO2 Thêm 10 µl mẫu cần thử nghiệm vào theo nồng độ thay đổi sau: 100 µg/ml, 10 µg/ml, µg/ml, 0,1 µg/ml, 0,01 µg/ml Tiếp tục ủ đĩa ni cấy 48 Sau đó, thêm 10 µl Kit vào giếng ủ đĩa nuôi cấy Đo OD buớc sóng 450 nm Mỗi thí nghiệm tiến hành lần Đối chứng dương FGF-18 - Cơng thức tính tỷ lệ tăng sinh tế bào: Tỷ lệ tăng sinh tế bào (%) = Với Amau Amau  Acontrol x100 Acontrol : độ hấp thụ quang giếng chứa cao tế bào Acontrol : độ hấp thụ quang giếng chứa tế bào (khơng có cao) 16.4 Nội dung 4: Phân lập xác định cấu trúc 1-3 hợp chất  Phương pháp tiến hành phân lập hợp chất - Sử dụng kỹ thuật sắc ký cột với chất nhồi cột silica gel, silica gel pha đảo Rp-18, gel Sephadex LH-20, kết hợp sắc ký lớp mỏng để phân lập chất tinh khiết - Phát chất đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm 365 nm dùng thuốc thử dung dịch 10% H2SO4/EtOH hay 1% FeCl3/EtOH 12  Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất Việc xác định cấu trúc thực phương pháp phổ nghiệm HNMR, 13 C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC, COSY so sánh với số liệu phổ nghiệm từ tài liệu tham khảo 17 Điều kiện sở vật chất Điều kiện có: - Sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ (HPLC-MS) - Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) - Máy sắc ký khí - Thiết bị đo độ quay cực - Quang phổ kế hồng ngoại (IR) - Quang phổ kế UV-VIS - Lị nung theo chương trình - Kính hiển vi điện tử quét - Sắc ký lỏng điều chế cao áp - Máy cô quay chân không 18 Phương án phối hợp với tổ chức nghiên cứu sở sản xuất nước 19 Phương án hợp tác quốc tế Hoạt tính tăng sinh tế bào tạo xương người MG-63 thử nghiệm viện Khoa học Y sinh, Đại học Ajou, Hàn Quốc 20 Kế hoạch triển khai (Phải thể sơ đồ Gantt) Thời gian (Tháng) TT Công việc 1 Công việc Công việc Công việc Công việc Công việc 5 13 10 11 12 III SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CỦA NHIỆM VỤ 21 Dạng kết nghiên cứu nhiệm vụ a Dạng I: TT Tên sản phẩm Nguyên liệu Cao tổng Cao phân đoạn Hợp chất tinh khiết Số lượng kg 1-3 Chỉ tiêu kinh tế - kỹ Ghi thuật Đã định danh khoa học đạt tiêu chuẩn sở Đạt tiêu chuẩn sở Đủ khối lượng nghiên cứu - Độ tinh khiết > 85% - Khối lượng: Đủ ghi phổ NMR MS (> 3,0 mg) b Dạng II: TT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học cần đạt Ghi Bộ số liệu xác định cấu trúc Có thể xác định cấu trúc hố hóa học hợp chất 1-3 hợp chất học phân lập từ trâu cổ Báo cáo kết thử hoạt Đầy đủ nội dung khoa học tính sinh học Báo cáo tổng hợp (báo cáo tóm tắt, báo cáo chính, đĩa Đầy đủ nội dung khoa học CD) Báo cáo tóm tắt (5 quyển), báo cáo (5 quyển), đĩa CD (5 đĩa) c Dạng III: Bài báo; Sách chuyên khảo; sản phẩm khác Số TT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học cần đạt Bài báo khoa học Đạt yêu cầu đăng tạp chí Dự kiến nơi cơng bố (Tạp chí, Nhà xuất bản) Tạp chí Hóa học Số lượng d Dạng IV: Kết tham gia đào tạo sau đại học Số TT Cấp đào tạo Số lượng Chuyên ngành đào tạo Đại học Hóa học Ghi 22 Tài sản sở hữu trí tuệ từ kết thực nhiệm vụ nghiên cứu KH&CN 23 Khả ứng dụng phương thức chuyển giao kết nghiên cứu 23.1 Khả thị trường Hiện nay, số lượng người mắc bệnh lỗng xương khơng ngừng gia tăng, sản phẩm phịng ngừa hỗ trợ điều trị bệnh loãng xương từ nguồn gốc tự nhiên có tiềm vơ lớn 14 23.2 Khả ứng dụng kết nghiên cứu vào sản xuất kinh doanh Kết nghiên cứu tảng ban đầu cho nghiên cứu nhằm tạo sản phẩm phòng ngừa hỗ trợ điều trị bệnh lỗng xương từ trâu cổ nói riêng từ dược liệu nói chung 23.3 Khả liên doanh liên kết với doanh nghiệp trình nghiên cứu 23.4 Mơ tả phương thức chuyển giao 23.5 Phạm vi địa (dự kiến) ứng dụng kết nhiệm vụ 24 Tác động lợi ích mang lại kết nghiên cứu 24.1 Đối với lĩnh vực KH&CN có liên quan Đề tài góp phần tạo sản phẩm hữu ích có tác dụng hỗ trợ chữa bệnh loãng xương từ nguồn dược liệu sẵn có nước ta với chất lượng tốt, giá thành hợp lý, phục vụ việc bảo vệ chăm sóc sức khỏe cộng đồng 24.2 Đối với tổ chức chủ trì sở ứng dụng kết nghiên cứu Đề tài góp phần nâng cao hiểu biết làm sáng tỏ công dụng chữa bệnh loãng xương trâu cổ mọc Việt Nam, làm sở khoa học cho việc sử dụng dược liệu sản xuất sản phẩm chăm sóc sức khoẻ cộng đồng 24.3 Đối với kinh tế - xã hội môi trường Kết đề tài dóp phần phục vụ cho nghiên cứu sâu để phát triển thành sản phẩm phòng ngừa, hỗ trợ điều trị bệnh loãng xương với giá thành rẻ an toàn Với nguồn nguyên liệu từ thiên nhiên phần giảm bước tổng hợp dược chất sử dụng hoá chất độc hại Đồng thời góp phần nâng cao giá trị kiến nghị bảo tồn loài dược liệu quý Việt Nam Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng 11 năm 2016 Thủ trưởng Chủ nhiệm nhiệm vụ Cơ quan chủ trì nhiệm vụ Sở Khoa học Công nghệ Chủ tịch Hội đồng xét duyệt nhiệm vụ 15 IV PHÂN BỔ KINH PHÍ THỰC HIỆN 25 Cơ cấu phân bổ kinh phí (x 1000 đồng) Nguồn kinh phí Tổng số Cơng lao động Ngun, vật liệu Thiết bị, máy móc Xây dựng, sữa chữa nhỏ 80.000 50.820 21.680 7.500 80.000 50.820 21.680 0 7.500 Tổng kinh phí Chi khác Trong đó: Ngân sách nhà nước: Các nguồn vốn khác: - Vốn tự có sở - Khác (vốn huy động) 26 Kế hoạch phân bổ kinh phí (theo năm tài chánh nhiệm vụ phê duyệt) Phân bổ kinh phí Ngân sách nhà nước Năm thứ 40.000.000 Năm thứ hai 40.000.000 Năm thứ ba 0 40.000.000 40.000.000 Nguồn vốn khác Tổng cộng V DỰ TOÁN KINH PHÍ ĐỀ TÀI 27 Bảng tổng hợp kinh phí (ngàn đồng) TT Tổng số Nội dung khoản chi Nguồn vốn Kinh phí NSNN Tự có Khác Khốn chi Ngồi khốn 50.820 50.820 Công lao động (khoa học, phổ thông) Nguyên, vật liệu, lượng 21.680 21.680 Thiết bị, máy móc 0 Xây dựng, sửa chữa nhỏ 0 Chi khác 7.500 7.500 56.800 23.200 80.000 Tổng cộng: 16 28 Giải trình khoản chi A CÁC KHOẢN CHI ĐƯỢC GIAO KHỐN (theo Thơng tư số 58/2011/TT-BTC Thơng tư liên tịch số 55/2015/TTLT-BTC-BKHCN) Khoản Công lao động (khoa học, phổ thông) Số ngày TT Nội dung lao động Đơn vị: Ngàn đồng Số tiền/Hệ số Thành Đơn công/Số tiền cơng theo vị tính lượng ngày (hstcn) = Ghi tiền 70% định mức Tiền công lao động trực tiếp 1.1 50.820 Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu (nội dung 1) ThS Phạm Ngọc Ẩn 1150 Thành 0,175 1.610 Điều chế cao tổng cao phân đoạn, kiểm nghiệm tiêu chuẩn sở (nội dung ngày công* hệ 2) 2.1 tiền = số ThS Phạm Ngọc Ẩn 1150 12 0,175 2.415 số tiền cơng* Thử hoạt tính tăng sinh tế bào tạo xương người MG-63 cao tổng cao phân đoạn (nội dung 3) 3.1 ThS Nguyễn Hữu An 1150 24 0,553 15.262,8 3.2 TS Lê Tiến Dũng 1150 20 0,175 4.025 3.3 ThS Phạm Ngọc Ẩn 1150 28 0,175 5.635 Phân lập xác định cấu trúc 1-3 hợp chất (nội dung 4) 4.1 ThS Nguyễn Hữu An 1150 20 0,553 12.719 4.2 TS Lê Tiến Dũng 1150 18 0,175 3.622,5 4.3 ThS Phạm Ngọc Ẩn 1150 18 0,175 3.622,5 0,553 1.907,9 5.1 Viết báo cáo nghiệm thu (nội dung 5) Nguyễn Hữu An 1150 Cộng 50.820 17 1150 Khoản 2: Nguyên vật liệu Mục chi TT Nội dung Nguyên, vật liệu Dụng cụ, phụ tùng, Đơn Số Đơn vị đo lượng giá tiền NSKH Tự có Khác 0 0 0 0 vật rẻ tiền mau hỏng Đơn vị : Ngàn đồng Nguồn vốn Thành - Mua sách, tài liệu, số liệu Cộng: Đơn vị: ngàn đồng Nguồn vốn Khoản Chi khác TT Nội dung Kinh phí NSKH Tự Khác có Cơng tác nước (địa điểm, thời gian, số lượt 0 0 Kinh phí quản lý 5.500 5.500 Quản lý phí quan quản lý 1.500 1.500 Quản lý phí quan chủ trì 4.000 4.000 Chi khác 2.000 2.000 2.000 2.000 7.500 7.500 người) Hợp tác quốc tế Đoàn vào (số người, số ngày, số lần phải xin phép quan hữu quan) - Hội thảo - Hội nghị - Ấn lốt tài liệu, văn phịng phẩm - Dịch tài liệu - Đăng ký bảo hộ sở hữu trí tuệ - Khác Cộng: Tổng cộng khoản chi khoán (A) = Khoản + Khoản + Khoản = 58.320.000 đồng 18 B CÁC KHOẢN CHI NGỒI KHỐN Khoản 1: Nguyên vật liệu, lượng Mục chi Đơn Số TT Nội dung vị đo lượng 1 1.1 Đơn Đơn vị tính: Ngàn đồng Thành Nguồn vốn giá tiền NSKH Tự có Khác 21.680 21.680 Nguyên, vật liệu Điều chế cao tổng cao phân đoạn, kiểm nghiệm tiêu chuẩn sở (nội dung 2) 1.1.1 Ethanol kỹ thuật Lít 30 30 900 900 1.1.2 n-Hexane kỹ thuật Lít 10 50 500 500 1.1.3 Chloroform kỹ thuật Lít 10 125 1.250 1.250 1.1.4 Ethyl acetate kỹ thuật Lít 30 270 270 1.1.5 Methanol kỹ thuật Lít 10 20 200 200 1.1.6 Silica gel pha thường Kg 1.800 1.800 1.800 1.2 Phân lập xác định cấu trúc 1-3 hợp chất (nội dung 4) 1.2.1 n-Hexane kỹ thuật Lít 44 50 2.200 2.200 1.2.2 Chloroform kỹ thuật Lít 38 125 4.750 4.750 1.2.3 Ethyl acetate kỹ thuật Lít 50 30 1.500 1.500 1.2.4 Methanol kỹ thuật Lít 70 20 1.400 1.400 1.2.5 Silica gel pha thường Kg 1.800 5.400 5.400 Hộp 1.510 1.510 1.510 1.2.6 Bản mỏng TLC phân tích - Xăng, dầu - Nhiên liệu khác - Nước m3 19 Đơn vị: ngàn đồng Nguồn vốn Khoản Thiết bị, máy móc Đơn Số Đơn Thành Nội dung vị đo lượng giá tiền NSKH Tự có Khác I Thiết bị có tham HPLC-MS Cái X GC-MS Cái X Máy sắc ký khí Cái X Thiết bị đo độ quay cực Cái X Quang Cái X Quang phổ kế UV-VIS Cái X Lò nung theo chương Cái X Kính hiển vi điện tử quét Cái X Sắc ký lỏng điều chế cao Cái X Cái 10 X TT gia thực đề tài phổ kế hồng ngoại (IR) trình áp Máy quay chân khơng II Thiết bị mua Mua thiết bị, công nghệ Mua thiết bị thử nghiệm, đo lường Mua sáng chế, quyền Mua phần mềm máy tính III Khấu hao thiết bị (chỉ khai mục quan chủ trì doanh nghiệp) IV Thuê thiết bị (ghi tên thiết bị, thời gian thuê) V Vận chuyển lắp đặt Cộng: 20 Đơn vị: Ngàn đồng Nguồn vốn Khoản Xây dựng, sửa chữa nhỏ TT Nội dung Kinh phí Chi phí xây dựng…m2 nhà xưởng, PTN Chi phí sửa chữa… m2 nhà xưởng, PTN Chi phí lắp đặt hệ thống điện, nước Chi phí khác NSKH Tự có Khác Cộng: Đơn vị: Ngàn đồng Nguồn vốn Khoản Chi khác TT Nội dung Kinh phí NSKH Tự có Khác Hợp tác quốc tế Cộng: Tổng kinh phí thực nhiệm vụ: 80.000.000 đồng, đó: - Ngân sách nhà nước: tám mươi triệu đồng (Bằng chữ) - Nguồn vốn khác: không đồng (Bằng chữ) Ngân sách nhà nước bao gồm: - Kinh phí khốn: 58.320.000 đồng + Cơng lao động: 50.820.000 đồng + Nguyên, vật liệu, lượng: đồng + Chi khác: 7.500.000 đồng - Kinh phí ngồi khốn: 21.680.000 đồng + Ngun, vật liệu, lượng: 21.680.000 đồng Thủ trưởng quan chủ trì nhiệm vụ (Ký tên đóng dấu) Chủ nhiệm nhiệm vụ Sở Khoa học Công nghệ 21