Nghiên cứu thành phần hóa học cặn chiết n hexane quả cây trâu cổ (ficus pumila l)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THÙY LINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CẶN CHIẾT n-HEXANE QUẢ CÂY TRÂU CỔ (Ficus pumila L.) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Sƣ phạm Hóa học Phú Thọ, 2019 TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THÙY LINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CẶN CHIẾT n-HEXANE QUẢ CÂY TRÂU CỔ (Ficus pumila L.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Sƣ phạm Hóa học NGƢỜI HƢỚNG DẪN: ThS Nguyễn Thị Bình Yên TS Triệu Quý Hùng Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng Phú Thọ, 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan khóa luận cơng trình nghiên cứu khoa học riêng tôi, nỗ lực nghiên cứu q trình học tập làm thí nghiệm trƣờng dƣới hƣớng dẫn nhiệt tình Ths Nguyễn Thị Bình Yên TS Triệu Quý Hùng Trong q trình viết, tơi tham khảo số tài liệu đƣợc trích dẫn đầy đủ khóa luận Sinh viên Nguyễn Thị Thùy Linh LỜI CẢM ƠN Trong trình viết, em nhận đƣợc nhiều giúp đỡ để hồn thành tốt khóa luận Trƣớc tiên em xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới ThS Nguyễn Thị Bình Yên TS Triệu Quý Hùng ngƣời cơ, ngƣời thầy ln nhiệt tình hƣớng dẫn, bảo, truyền đạt kinh nghiệm cho em suốt trình thực khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng, quý thầy cô Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng tạo điều kiện giúp đỡ em suốt thời gian qua Em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, bạn sinh viên K13ĐHSP Hóa học Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng động viên, hỗ trợ em suốt q trình học tập hồn thành khóa luận Sinh viên Nguyễn Thị Thùy Linh -i- DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT  Các phƣơng pháp sắc ký TLC Thin Layer Chromatography: Sắc ký lớp mỏng CC Column Chromatography: Sắc ký cột  Các phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13 DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer: Phổ DEPT s: singlet (vạch đơn) t: triplet (vạch ba)  Tên hợp chất đƣợc viết theo nguyên Tiếng Anh -ii- DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Giá trị Rf màu sắc vệt chất mỏng 33 Bảng 3.2 : Kết phân đoạn thu đƣợc từ cột tổng n-Hexane 35 Bảng 3.3 : Kết phân đoạn thu đƣợc từ phân đoạn F2 39 -iii- DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Cây Trâu cổ 12 Hình 2.2: Các dung môi thông dụng đƣợc dùng để phân lập hợp chất thiên nhiên 13 Hình 2.3: Máy cất quay dung môi IKA-RV10 Anh 14 Hình2.4 : Bình triển khai sắc kí mỏng 15 Hình 2.5: Bộ chƣng cất dung mơi 15 Hình 2.6: Bếp điện đôi Gali 16 Hình 2.7: Máy soi UV 16 Hình 2.8 : Máy nghiền 17 Hình 2.9: Ngâm mẫu mẫu chất sau lọc 17 Hình 2.10 : Minh họa sắc kí lớp mỏng 18 Hình 2.11: Minh họa sắc kí cột 20 Hình 2.12 : Minh họa phƣơng pháp kết tinh 20 Hình 2.13: Độ chuyển dịch hóa học proton 22 Hình 2.14: Ví dụ minh họa tách vạch phổ 23 Hình 2.15: Độ chuyển dịch hóa học carbon C-13 24 Hình 2.16: Phổ DEPT ethylbenzene 25 Hình 3.1: Mẫu thu hái 26 Hình 3.2: Mẫu Trâu cổ 26 Hình 3.3 : Mẫu sau phơi khô 27 Hình 3.4 : Hình ảnh ngâm Trâu cổ dung môi n–Hexane 27 -iv- Hình 3.5 : Dung dịch qua lọc vải lọc giấy 28 Hình 3.6 : Cất quay mẫu máy cất quay chân khơng 28 Hình 3.7 : Cặn dịch chiết n-hexane Trâu cổ 29 Hình 3.8: Sơ đồ ngâm chiết Trâu cổ 30 Hình 3.9: Sắc kí lớp mỏng 31 Hình 3.10: Bản mỏng nƣớng bếp điện đôi Gali 31 Hình 3.11: Kết khảo sát TLC cặn chiết n-hexne Trâu cổ 32 Hình 3.12: TLC cặn n-hexane Trâu cổ với hệ dung mơi (II) 33 Hình 3.13 : Cột tổng silica gel trƣớc đƣa chất lên 34 Hình 3.14 : Cột tổng silica gel cặn n-Hexane 35 Hình 3.15: Hình ảnh TLC phân đoạn F1÷F5 36 Hình 3.16 : Cột chạy silica gel 37 Hình 3.17 : Chất tẩm silica gel tơi 38 Hình 3.18 : Cột phân đoạn F2 38 Hình 3.19: Sơ đồ phân lập chất FPFHC1 40 Hình 3.20 : Hình ảnh chất FPFHC1 40 Hình 3.21 : Sắc kí đồ TLC FPFHC1 41 Hình 3.22: Cấu trúc hợp chất FPFHC1 41 Hình 3.23: Phổ ESI-MS FPFHC1 42 Hình 3.24: Phổ IR FPFHC1 43 Hình 3.25: Phổ 1H-NMR hợp chất FPFHC1 44 Hình 3.26: Phổ 13C-NMR FPFHC1 45 -v- MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC CÁC HÌNH iii MỞ ĐẦU 1.Lí lựa chọn đề tài Mục tiêu đề tài 3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chi F.pumila L 1.2 Đặc điểm thực vật Trâu cổ 1.3 Các nghiên cứu hóa thực vật chi Ficus CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 12 2.2 Hóa chất thiết bị 12 2.2.1 Các hóa chất sử dụng 12 2.2.2 Các thiết bị nghiên cứu 13 2.3 Các phƣơng pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Phƣơng pháp ngâm chiết 16 2.3.2 Phƣơng pháp sắc kí 18 2.3.3 Phƣơng pháp kết tinh 20 2.3.4 Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân(NMR) 21 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Quá trình điều chế cặn dịch chiết n-Hexane Trâu cổ 26 3.2 Quá trình phân lập chất từ dịch chiết n-hexane Trâu cổ 30 3.2.1 Khảo sát thành phần định tính lựa chọn dung mơi 30 -vi- 3.2.2 Quá trình phân lập chất 34 3.3 Xác định cấu trúc hợp chất FPFHC1 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 Kết luận 46 Kiến nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 -35- Lấy 137,13 gam cặn chiết n-Hexane (kí hiệu FPFH) đƣợc hịa tan với CH2Cl2 vừa đủ cho tan hết, đem trộn với 136g gam silica gel, làm bay hết dung môi máy cất quay chân không đến thu đƣợc hỗn hợp bột tơi màu xanh đen Cho từ từ silica gel đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố vào cột Đặt lớp lên trƣớ bắt đầu chạy cột để chất không bị xáo trộn rót dung mơi Hình 3.14 : Cột tổng silica gel cặn n-Hexane Giai đoạn 3: Chạy cột tổng Tiến hành chạy hệ dung mơi EtOAc/n-Hexane Sử dụng bình nón để hứng dung dịch rửa giải (80-100mL) Tiến hành triển khai sắc kí lớp mỏng, gộp bình có vệt chất giống tƣơng đƣơng mỏng Khi vệt chất mỏng mờ dần, ta dội cọt dung môi EtOAc Sau chạy cột tổng ta thu đƣợc phân đoạn, kí hiệu từ F1-F5: Bảng 3.2 : Kết phân đoạn thu từ cột tổng n-Hexane -36- STT Bình gộp 1÷14 Dung môi rửa giải Phân đoạn 1400 mL EtOAc /n-Hexane 2% Khối lƣợng (gam) F1 69,76 F2 28,39 F3 10,57 F4 19,39 F5 5,32 2600 mL EtOAc /n-Hexane 2% 15÷54 1000 mL EtOAc/n-Hexane 5% 200 mL EtOAc/n-Hexane 10% 55÷73 1800 mL EtOAc/n-Hexane 10% 74÷100 101÷108 2000 mL EtOAc/n-Hexane 20% 1200 mL EtOAc/n-Hexane 50% 900 mL EtOAc/n-Hexane 50% Khảo sát lại TLC phân đoạn với số hệ dung môi khác cho kết nhƣ sau: (I) (II) Hình 3.15: Hình ảnh TLC phân đoạn F1÷F5 Giai đoạn 4: Phân lập chất từ phân đoạn nhỏ F2 (28,39g) Bước 1: Chuẩn bị cột -37- Sử dụng cột có đƣờng kính 5cm; chiều dài 50 cm đƣợc rửa sạch, tráng cột acetone, sấy khơ, nhồi dƣới đáy cột bơng Chuẩn bị cột silica gel theo phƣơng pháp nhồi cột ƣớt: Trong thời giam chờ cột khô cân khảng 300 gam silica gel, ngâm trƣơng nở ngập dung môi n-hexane khoảng 30 phút, vừa ngâm silica gel vừa dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi hết bọt khí Sau rót từ từ hỗn hợp silica gel trƣơng nở vào cột, vừa rót hỗn hợp lên cột vừa vỗ nhẹ cột để bọt khí bay hết, để cột ổn định khoảng thời gian 2h Hình 3.16 : Cột chạy silica gel Bước 2: Đưa chất lên cột Lấy 28,39g cặn gam cặn chiết n-Hexane (kí hiệu F2) hòa tan với CH2Cl2 vừa đủ cho tan hết, đem hỗn hợp trộn với 32g silica gel Làm bay hết dung môi đên thu đƣợc hỗn hợp bột tơi có màu xanh nhạt -38- Hình 3.17 : Chất tẩm silica gel tơi Vừa hỗn hợp lên cột vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố vào cột Hình 3.18 : Cột phân đoạn F2 Bước 3: Chạy cột Sử dụng hệ dung môi EA/n-Hexane cho cột phân đoạn F2 Cho lớp mỏng lên mặt chất tránh cho dung môi lên làm xáo trộn bề mặt chất làm cho chất xuống khơng -39- Các bình tam giác có dung tích 80-100 mL đƣợc sử dụng để hứng dung dịch rửa giải Sau hứng tiến hành sắc kí lớp mỏng gộp vệt tƣơng tự Sau dội cột dung mơi MeOH để chất xuống hết Kết thu đƣợc phân đoạn nhƣ sau: Bảng 3.3 : Kết phân đoạn thu từ phân đoạn F2 STT Bình gộp Dung môi rửa giải Phân đoạn Khối lƣợng (gam) 1400 mL EtOAc /n-Hexane 0% 1÷38 1000 mL EtOAc /n-Hexane 0,5% 1000 mL EtOAc /n-Hexane 1% F2.1 0,82 F2.2 3,64 600mL EtOAc /n-Hexane 1,5% 400mL EtOAc /n-Hexane 1,5% 39÷64 65÷70 1800 mL EtOAc/n-Hexane 2% F2.3 1.36 71÷78 800 mL EtOAc/n-Hexane 2% F2.4 1,06 79÷106 2800 mL EtOAc/n-Hexane 2% F2.5 3.7 107÷136 2700 mL EtOAc/n-Hexane 2% F2.6 3,31 137÷148 F2.7 15,91 2300 mL EtOAc/n-Hexane 2% 400 mL EtOAc/n-Hexane 2% 750 mL MeOH Bước 4: Phân lập chất từ phân đoạn nhỏ: Sau hoàn thành chạy cột phân đoạn F2, tiến hành xử lí phân đoạn F2.2 (lọ 40) Thu đƣợc kết tủa hình kim, trắng, tan CH2Cl2 không xuất màu soi UV Sau kết tinh hệ dung môi CH2Cl2/nHexane 50:50 thu đƣợc 20mg chất FPFHC1 Chất FPFHC1 từ cặn dịch chiết n-Hexane Trâu cổ đƣợc phân lập qua trình sau: -40- Cặn dịch chiết n-Hexan FPFH (137,13g) CC,silicaget,EtOAc/n-Hexan F2 28,39g F1 69,76g F3 10,57g F4 19,39g F5 5,32g CC,silicaget,EtOAc/n-Hexan F2.1 0,82g F2.2 3,64g F2.3 1,36g F2.4 1,06g F2.5 3,7g F2.6 3,31g Kết tinh F2.7 15,91 g C1 20mg Hình 3.19: Sơ đồ phân lập chất FPFHC1 Hình 3.20 : Hình ảnh chất FPFHC1 Trên hình ảnh sắc ký lớp mỏng chất FPFHC1 xác định đƣợc giá trị Rf = 0,64 (CH2Cl2/n-Hexane 45:55) -41- Hình 3.21 : Sắc kí đồ TLC FPFHC1 3.3 Xác định cấu trúc hợp chất FPFHC1 Hình 3.22: Cấu trúc hợp chất FPFHC1 Phổ khối phun mù điện tử ESI-MS cho pic ion giả phân tử [M+H]+ = 457, [M-CH3COOH+H]+ = 397 phù hợp với CTPT C31H52O2, M=456 Phổ hồng ngoại FPFHC1 có đỉnh hấp thụ 1729 cm1 đặc trƣng cho nhóm C=O phân tử Tín hiệu dao động C-H sp3 đƣợc quan sát vùng 2935, 2866 cm1 Các đỉnh hấp thụ 1371, 1242 đặc trƣng cho liên kết C-O -42- Hình 3.23: Phổ ESI-MS FPFHC1 -43- Hình 3.24: Phổ IR FPFHC1 -44- Hình 3.25: Phổ 1H-NMR hợp chất FPFHC1 Trên phổ 13 C-NMR cho thấy phân tử FPFHC1 chứa nhóm CO C 170,5 ppm, 1CH liên kết với oxy C 74,0 (C-3), 1C-sp2 bậc 139,7 (C-5), -45- CH-sp2 122,7 (C-6); nhóm CH3-sp3 19,8 (C-26); 19,3 (C-19); 19,1 (C21); 18,8 (C-27); 12,0 (C-29); 11,9 (C-18), nhóm CH3 liên kết với CO 27,8 (CH3-CO) Hình 3.26: Phổ 13C-NMR FPFHC1 Kết hợp tài liệu tham khảo [8], [17] cho phép khẳng định FPFHC1 Sitosterol acetate -46- KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau trình nghiên cứu, đề tài thu đƣợc số kết nhƣ sau: - Điều chế đƣợc 137,13 gam cặn dịch chiết n-Hexane Trâu cổ (FPFH) Sau khảo sát TLC cặn dịch chiết n-Hexane Trâu cổ định chọn hệ dung môi EtOAc/n-Hexane để phân tách cặn dịch chiết n-Hexane Kết thu đƣợc phân đoạn nhỏ F1-F5 Qua khảo sát lực chọn phân đoạn nhỏ F2, phân tách thành phân đoạn nhỏ F2.1- F2.7 Từ phân đoạn F2.2 đem kết tinh thu đƣợc 20 mg hợp chất -Sitosterol acetate (FPFHC1) - Cấu trúc hợp chất FPFHC1 đƣợc xác định phƣơng pháp phổ hồng ngoại, phổ khối lƣợng, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13 C- NMR Kiến nghị - Tiếp tục phân lập phân đoạn lại dịch chiết n-hexane Trâu cổ cặn dịch chiết khác Trâu cổ - Khảo sát hoạt tính sinh học hợp chất phân lập đƣợc từ Trâu cổ - Bán tổng hợp số hợp chất nghiên cứu tách từ Trâu cổ khảo sát hoạt tính sinh học chúng -47- TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, Tập 2, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr.1155- 1173 [2] Nguyễn Văn Hùng (2011), Họ Na (Annonaceae)-Hóa học hoạt tính sinh học lồi Desmos rostrata, Goniothalamus tamirensis, Fissistigma villosissium -Quyển NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Hà Nội [3] Đỗ Tất Lợi (2011) Những cây thuốc vị thuốc Việt Nam NXB Thời Đại, tr.75-77 [4] Hoàng Hƣơng Ly (2018), Phân lập xác định cấu trúc hợp chất Triterpenoid từ Trâu cổ (Ficus pumila L.) họ dâu tằm ( Moraceace), Khóa luận tốt nghiệp ngành sƣ phạm hóa học, Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng, Phú Thọ [5] Đặng Nhƣ Tại, Ngô Thị Thuận (2010) Hóa học hữu cơ, Tập NXB Giáo dục Việt Nam, tr.478 [6] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh [7] Trần Quốc Sơn, Đặng Văn Liếu (2013), Giáo tình sở hóa học hữu cơ, Tập 1, NXB Đai học sƣ phạm [8] Vu Minh Trang, Phan Minh Giang, Phan Tong Son (2010), “Phytosterols, taraxerane triterpenoids, and flavonol glycosides from the leaves of Mallotus macrostachyus (Miq.) Muell.-Arg (Euphorbiaceae)”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 48(6A), pp11-16 [9] http://suckhoe24h-7.blogspot.com/2015/02/cay-trau-co-chua-benh.html [10] http://tracuuduoclieu.vn/trau-co.html [11] Đào Thị Hải Yến (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học số phân đoạn dịch chiết n-Hexane Trâu cổ (Ficus pumila L.) họ dâu tằm ( -48- Moraceace) địa bàn tỉnh Phú Thọ, Khóa luận tốt nghiệp ngành sƣ phạm hóa học, Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng, Phú Thọ Tài liệu Tiếng Anh [12] Anshul Chawla, Ramandeep Kaur, Anil Kumar Sharma (2012) Ficus carica Linn.: A Review on its Pharmacognostic, Phytochemical and Pharmacological Aspects International Journal of Pharmaceutical and Phytopharmacological Research, 1(4): 215-232 [13] B.S Furniss (1989), A.J Hannaford, P.W.G Smith, A.R Tatchell Text book of practical organic chemistry Longman Scientific Technical, pp 197 [14] Shukranul Mawa, Ibrahim Jantan and Khairana Husain (2016), “Isolation of Terpenoids from the Stem of Ficus aurantiaca Griff and their Effects on Reactive Oxygen Species Production and Chemotactic Activity of Neutrophils”, Molecules, 21, 9; doi:10.3390/molecules21010009 [15] Consolacion Y Ragasa, Agnes B Alimboyoguen, and Chien-Chang Shen (2014), “Chemical constituents of Ficus nota”, Der Pharma Chemica, 6(4), 98-101 [16] Pham Thi Nhat Trinh, Nguyen Huu An, Pham Ngoc An, Mai Dinh Tri, Cao Van Du, Nguyen Thi Le Thuy, Nguyen Trong Tuan, Vang Thi Kim Thoa, Nguyen Ngoc Tuan & Le Tien Dung (2017), “A new benzofuran derivative from the leaves of Ficus pumila L.”, Natural Product Research, DOI: 10.1080/14786419.2017.1395427 [17] Jiliang Hang, Patrick Dussault (2010),“A concise synthesis of βsitosterol and other phytosterols”, Steroids, 75(12), pp 879–883; doi: 10.1016/j.steroids.2010.05.016 -49- NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƢỚNG DẪN Sinh viên Nguyễn Thị Thùy Linh thực Khóa luận tốt nghiệp với thái độ cầu thị, tích cực học hỏi chủ động bố trí thời gian thực thực nghiệm nghiên cứu phịng thí nghiệm Đã thực mục tiêu đề tài đặt ra: Đã điều chế đƣợc 137,13 gam cặn dịch chiết n-Hexane Trâu cổ (FPFH) Bằng phƣơng pháp sặc ký cột silica gel kết tinh thu đƣợc 20 mg hợp chất -Sitosterol acetate (FPFHC1) Cấu trúc hợp chất FPFHC1 đƣợc xác định phƣơng pháp phổ hồng ngoại, phổ khối lƣợng, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13CNMR GIẢNG VIÊN HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS Nguyễn Thị Bình Yên Nguyễn Thị Thùy Linh ... góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa học tạo sở khoa học cho việc sử dụng lồi thực vật, tơi lựa chọn nghiên cứu khóa luận ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học cặn chiết n-hexane Trâu cổ (Ficus pumila. .. HỌC HÙNG VƢƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THÙY LINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CẶN CHIẾT n-HEXANE QUẢ CÂY TRÂU CỔ (Ficus pumila L.) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Sƣ phạm Hóa học. .. 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Quá trình điều chế cặn dịch chiết n-Hexane Trâu cổ 26 3.2 Quá trình phân lập chất từ dịch chiết n-hexane Trâu cổ 30 3.2.1 Khảo sát thành phần định