Các chất có độ phân cựa khác nhau sẽ cho kết quả khá nhau. Chất có độ phân cựa kém hơn sẽ đi xuống dƣới cột trƣớc. Cứ tiếp tục tăng dần hệ dung môi rửa rải để các chất có độ phân cực cao hơn tiếp tục xuống.
Có nhiều kích cỡ cột sắc kí nên tùy thuộc vào lƣợng chất ít hay nhiều mà lựa chọn cột phù hợp.
2.3.3 Phương pháp kết tinh
Đây là phƣơng pháp quan trọng để tinh chế chất rắn. Cơ sở của phƣơng pháp này là dựa trên sự khác nha về độ tan của các chất trong dung môi (hay hỗn hợp các dung môi) ở các nhiệt độ khác nhau. Hay có sự khác nhau về độ tan các chất, giữa chất chính và tạp chất ở cùng nhiệt độ [6].
Ta chọn dung môi hay hệ dung môi phù hợp để hòa tan chất cần kết tinh khi đun nóng và ít hòa tan khi làm lạnh. Sau khi làm lạnh bằng dung dịch bão hòa, chất cần kết tinh sẽ lắng xuống ở dạng tinh thể, tạp chất ở lại trong dung dịch. Trƣờng hợp tạp chất không tan khi đun nóng thì cần lọc bỏ sau đó làm lạnh dung dịch bão hòa.
2.3.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân(NMR)
Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân dựa trên tƣơng tác của hạt nhân từ (1H, 13C, …) với từ trƣờng ngoài [5], [7].
Phổ cộng hƣởng từ nhân proton (1
H-NMR):
- Số lƣợng tín hiệu (vạch phổ), vị trí vạch phổ (độ chuyển dịch hóa học, H) xác nhận các loại proton khác nhau và môi trƣờng bao quanh mỗi proton trong phân tử.
- Vị trí của tín hiệu cho biết proton thuộc loại proton nào: thơm, béo, bậc một, bậc hai, bậc ba,… Các proton khác nhau này có các môi trƣờng electron bao quanh khác nhau, và chính môi trƣờng electron bao quanh xác định proton hấp thụ ở đâu trong miền phổ.
Trên phổ 1
H-NMR tín hiệu các proton đƣợc ghi nhận thông qua độ chuyển dịch hóa học ( = /0= Hz/MHz = 106 ppm), trong đó chất nội chuẩn TMS đƣợc gán = 0 ppm.
Hình 2.13: Độ chuyển dịch hóa học của proton
- Cƣờng độ tín hiệu cho biết số proton cùng loại.
- Sự tƣơng tác (tách vạch phổ) và hằng số tƣơng tác spin – spin (J) cho biết proton nào tƣơng tác với proton nào.
+ Sự tách vạch phổ gây nên bởi sự tƣơng tác tƣơng tác J. Sự tách vạch phản ánh môi trƣờng bao quanh của các proton đang hấp thụ không phải đối với các electron mà đối với các proton khác ở gần bên cạnh. Số vạch phổ đƣợc tách theo qui tắc n+1 với n là số proton có tƣơng tác. Cƣờng độ các vạch phổ đƣợc tách tỉ lệ theo qui tắc tam giá Pascal.
+ Hằng số tƣơng tác J cho biết một cách chính xác loại thông tin về cấu trúc phân tử. Hằng số J không phụ thuộc vào từ trƣờng cảm ứng. Giá trị hằng số J đƣợc đo bằng Hz luôn bằng nhau dù từ trƣờng ngoài thế nào. Độ lớn của hằng số tƣơng tác phụ thuộc vào mối liên quan cấu trúc giữa các proton có tƣơng tác.
Hình 2.14: Ví dụ minh họa về sự tách vạch phổ
Tƣơng tự nhƣ proton, một trong các đồng vị của carbon, 13C là hạt nhân cho phổ NMR. Phổ 13
C-NMR đƣợc sinh ra theo cách giống nhƣ phổ 1H-NMR [5], [7].
Đồng vị 13C chỉ chiếm 1,1% hàm lƣợng carbon thiên nhiên, nhƣng độ nhạy của phổ kế hiện đại đủ để đo phổ 13
C-NMR. Phổ 13
C-NMR cho nhiều loại thông tin nhƣ 1H-NMR những thông tin trực tiếp là về khung carbon mà không có proton gắn với nó.
- Số lƣợng tín hiệu cho ta biết có bao nhiêu nhóm carbon khác nhau hay nhóm carbon tƣơng đƣơng khác nhau có ở trong phân tử.
- Sự tách vạch tín hiệu cho ta biết có bao nhiêu hiđro gắn với mỗi carbon. Phân biệt tín hiệu của carbon các bậc, nhóm CH là một vân đôi (d), ở nhóm CH2 là vân ba (t), ở nhóm CH3 là vân bốn (q), còn carbon không đính với hiđro là vân đơn (s). Trong kỹ thuật đo phổ hiện nay thƣờng khử tƣơng tác giữa C và H nên các carbon tƣơng đƣơng chỉ xuất hiện tín hiệu và 1 vạch đơn.
- Độ chuyển dịch hóa học (C) cho biết trạng thái lai hóa (sp3
, sp2,sp) của mỗi carbon, cho biết môi trƣờng electron bao quanh mỗi carbon đối với nhau, carbon gần bên cạnh hay các nhóm chức.
Hình 2.15: Độ chuyển dịch hóa học carbon C-13
DEPT
Đây là kỹ thuật ghi phổ hỗ trợ cho phổ 13
C-NMR.
Phân biệt tín hiệu của carbon các bậc, nhóm CH là một vân đôi (d), ở nhóm CH2 là vân ba (t), ở nhóm CH3 là vân bốn (q), còn carbon không đính với hidro là vân đơn (s). Thông thƣờng các máy đo phổ 13
C-NMR sử dụng kỹ thuật xóa tƣơng tác nên mỗi tín hiệu của C chỉ còn 1 vạch; trong kỹ thuật ghi phổ DEPT-90; các nhóm CH ở phía trên; trong DEPT-135 các nhóm CH, CH3 ở phía trên, CH2 ở phía dƣới, C bậc 4 không xuất hiện tín hiệu trên phổ [5], [7].
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1 Quá trình điều chế cặn dịch chiết n-Hexane quả cây Trâu cổ
Thu hái mẫu tại Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng, cơ sở Thị xã Phú Thọ.
Hình 3.1: Mẫu khi mới thu hái.
Sau đó, đem mẫu về rửa sạch, loại bỏ lá và đem cân.
Hình 3.2: Mẫu quả cây Trâu cổ
Sau khi có khối lƣợng của mâu tƣơi, ta đem thái nhỏ và phơi trong bóng râm.
Hình 3.3 : Mẫu quả sau khi phơi khô
Tiến hành cho mẫu trên vào máy nghiền nghiền nhỏ bớt quả rồi cho vào các bình thủy tinh dung tích 5 lít để ngâm. Các bình thủy tinh phải có nắp đậy kín để không cho dung môi bay hơi ra ngoài. Không sử dụng bình nhựa hay bình thép gỉ để không bị nhầm lân các chất khác.
Đầu tiên là ngâm mẫu quả cây Trâu cổ trong dung môi kém phân cực nhất là n–Hexane.
Hình 3.4 : Hình ảnh ngâm quả Trâu cổ trong dung môi n–Hexane.
Ngâm lần đầu tiên trong 24h sau đó đem lọc. Bƣớc đầu tiên là lọc qua vải, sau đó lấy phần dung dịch đã lọc đƣợc để lọc bằng giấy (kí hiệu là
Hình 3.5 : Dung dịch qua lọc vải và lọc giấy.
Sau khi thu đƣợc dung dịch đã qua lọc giấy, ta tiến hành cô đặc lại mẫu bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ thấp và áp suất giảm (44°C, tốc độ quay trung bình 205 vòng/phút) để thu đƣợc cặn dịch chiết n-hexane quả cây Trâu cổ.
Tận dụng nguồn dung môi thu hồi đƣợc tiếp tục ngâm mẫu lần hai. Làm tƣơng tự nhƣ lần đầu với lần hai, ba, bốn và năm (ngâm trong 24h). Ngâm đến khi dung dịch nhạt màu dần thì dừng lại. Sau năm lần ngâm, lọc, quay ta thu đƣợc 137,13 gam cặn dịch chiết n-hexane quả cây Trâu cổ.
Hình 3.7 : Cặn dịch chiết n-hexane quả cây Trâu cổ.
Sau khi ngâm n–Hexane, tiếp tục ngâm mẫu với lần lƣợt dung môi CH2Cl2, EtOAc, MeOH thu đƣợc các cặn dịch chiết sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.8: Sơ đồ ngâm chiết quả cây Trâu cổ
3.2 Quá trình phân lập các chất từ dịch chiết n-hexane cây Trâu cổ
3.2.1 Khảo sát thành phần định tính và lựa chọn dung môi
+ Triển khai sắc ký lớp mỏng: Tiến hành khảo sát một lƣợng nhỏ cặn dịch chiết n-hexane quả cây Trâu cổ hòa tan trong hỗn hợp n-hexane. Đổ vào bình triển khai sắc ký hệ dung môi đã đƣợc pha sẵn (5 mL). Đƣa chất lên lớp mỏng bằng ống mao quản, cách đáy bản mỏng 6 mm và cách đều hai bên mép bản, để dung môi bay hết rồi đƣa vào bình triển khai. Dung môi khi đã chạy lên cách mép trên của bản khoảng 3 mm thì lấy bản mỏng ra, sấy nhẹ bản mỏng để dung môi bay hết.
Quả cây Trâu cổ khô (FPFH; 3,6 kg)
n-Hexane, (6L, 24h)x5
Dịch chiết n-Hexane Mẫu cây
Cặn dịch chiết n-Hexane
(FPFH; 137,13 g)
Chƣng cất
dƣới áp suất giảm
Ngâm tiếp
với CH2Cl2, EtOAc,
Hình 3.9: Sắc kí lớp mỏng
+ Lập sắc ký đồ: Lập sắc ký đồ trong các điều kiện sau: Quan sát dƣới ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng ngắn (= 254 nm) và bƣớc sóng dài (366 nm). Sau đó nhúng bản mỏng vào dung dịch thuốc thử Ce(SO4)2, tiếp theo sấy nhẹ bản mỏng, quan sát dƣới ánh sáng thƣờng. Đem bản mỏng nƣớng trên bếp điện đôi để thấy rõ vệt chất hơn:
Hình 3.10: Bản mỏng đang nướng trên bếp điện đôi Gali
Ta thấy, mỗi vết tách trên bản mỏng có các giá trị Rf là khác nhau. Qua phân tích sơ bộ cho thấy : Số lƣợng chất có trong cặn chiết quả cây Trâu cổ, đánh giá sơ bộ đƣợc khả năng phân tách chất của dung môi trên silicagel.
+ Kết quả sắc ký đồ:
Hệ các dung môi đƣợc triển khai gồm:
(I): EA/Hx(10%)
(II): EA/Hx(20%)
(III): EA/Hx(30%)
(IV): Ac/ CH2Cl2 (10%)
(V): EA/ CH2Cl2 (10%)
Các bản mỏng sau khi đƣợc triển khai sắc ký, hiện màu bằng đèn tử ngoại sau đó nhúng vào dung dịch thuốc thử Ce(SO4)2 thu đƣợc kết quả tƣơng ứng nhƣ sau:
(I) (II) (III)
(IV) (V)
Hình 3.11: Kết quả khảo sát TLC cặn chiết n-hexne quả cây Trâu cổ
Sau khi khảo sát TLC, ta thấy các cất đƣợc triển khai tốt ở các hệ:
thuốc thử Ce(SO4)2 có các vệt chất hiện rõ rệt ở bƣớc sóng =366 nm, có các vệt chất hiện màu ngay ở bƣớc sóng 254nm
UV-366 Ce(SO4)2
Hình 3.12: TLC cặn n-hexane quả cây Trâu cổ với hệ dung môi (II)
Dựa vào bản mỏng khảo sát các vệt chất với các hệ dung môi trên cho ta các giá trị Rf của các vệt chất với hệ dung môi EtOAc/Hexane đƣợc trình bày cụ thể nhƣ sau:
Bảng 3.1. Giá trị Rf và màu sắc các vệt chất trên bản mỏng
STT Rf Ce(SO4)2
UV
254 nm 366 nm
1 0,100 Xanh đen Nâu Hồng
2 0,325 Xanh đen Nâu (-)
3 0,613 Xanh đen (-) Trắng xanh
4 0,844 Xanh đen Nâu (-)
5 0,969 Xanh đen Nâu Vàng
(-): không hiện
Rf = a/b
b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đƣờng đi của vết(cm)
0 < Rf < 1
Từ kết quả khảo sát bản mỏng và sự hiện màu các vệt chất, ta lựa chọn hệ dung môi EtOAc /Hexane với độ phân cực tăng dần làm dung môi rửa giải cho cột tổng cặn n-Hexane quả cây Trâu cổ.
3.2.2 Quá trình phân lập các chất
Giai đoạn 1: Chuẩn bị cột
Chọn cột 10 rửa sạch, tráng cột bằng acetone, sấy khô, lót dƣới đáy một lƣợng bông nhỏ. Chuẩn bị cột silica gel theo phƣơng pháp nhồi cột ƣớt:
Sau đó cân 320 gam silica gel, ngâm trƣơng nở ngập trong n-hexane khoảng 30 phút, trong quá trình ngâm dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để bọt khí bay hết đi.
Tráng qua cột một lớp axetone để dựng cột, sau khi cột khô thì nhồi bông vào cột.
Rót từ từ hỗn hợp silica gel đã trƣơng nở vào cột, vừa rót vừa vỗ nhẹ cột để bay hết bọt khí, để cột ổn định trong thời gian 3h.
Hình 3.13 : Cột tổng silica gel trước khi đưa chất lên
Lấy 137,13 gam cặn chiết n-Hexane (kí hiệu FPFH) đƣợc hòa tan với CH2Cl2 vừa đủ cho tan hết, rồi đem trộn với 136g gam silica gel, làm bay hơi hết dung môi trên máy cất quay chân không đến khi thu đƣợc hỗn hợp bột tơi màu xanh đen
Cho từ từ silica gel đã đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố đều vào cột. Đặt một lớp bông lên trên cùng trƣớ khi bắt đầu chạy cột để chất không bị xáo trộn khi rót dung môi.
Hình 3.14 : Cột tổng silica gel cặn n-Hexane
Giai đoạn 3: Chạy cột tổng
Tiến hành chạy hệ dung môi EtOAc/n-Hexane. Sử dụng bình nón để hứng dung dịch rửa giải (80-100mL).
Tiến hành triển khai sắc kí lớp mỏng, gộp các bình có vệt chất giống hoặc tƣơng đƣơng nhau trên bản mỏng. Khi các vệt chất trên bản mỏng mờ dần, ta dội cọt bằng dung môi EtOAc. Sau khi chạy cột tổng ta thu đƣợc 5 phân đoạn, kí hiệu từ F1-F5:
STT Bình gộp Dung môi rửa giải Phân đoạn Khối lƣợng (gam) 1 1÷14 1400 mL EtOAc /n-Hexane 2% F1 69,76 2 15÷54 2600 mL EtOAc /n-Hexane 2% 1000 mL EtOAc/n-Hexane 5% 200 mL EtOAc/n-Hexane 10% F2 28,39 3 55÷73 1800 mL EtOAc/n-Hexane 10% F3 10,57 4 74÷100 2000 mL EtOAc/n-Hexane 20% 1200 mL EtOAc/n-Hexane 50% F4 19,39 5 101÷108 900 mL EtOAc/n-Hexane 50% F5 5,32
Khảo sát lại TLC của các phân đoạn với một số hệ dung môi khác cho kết quả nhƣ sau:
(I) (II)
Hình 3.15: Hình ảnh TLC các phân đoạn F1÷F5
Giai đoạn 4: Phân lập các chất từ phân đoạn nhỏ F2 (28,39g) Bước 1: Chuẩn bị cột
Sử dụng cột có đƣờng kính 5cm; chiều dài 50 cm đƣợc rửa sạch, tráng cột bằng acetone, sấy khô, nhồi dƣới đáy cột một ít bông. Chuẩn bị cột silica gel theo phƣơng pháp nhồi cột ƣớt:
Trong thời giam chờ cột khô cân khảng 300 gam silica gel, ngâm trƣơng nở ngập trong dung môi n-hexane khoảng 30 phút, vừa ngâm silica gel vừa dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi hết bọt khí. Sau đó rót từ từ hỗn hợp silica gel đã trƣơng nở vào cột, vừa rót hỗn hợp lên cột vừa vỗ nhẹ cột để bọt khí bay đi hết, để cột ổn định trong khoảng thời gian 2h.
Hình 3.16 : Cột chạy silica gel
Bước 2: Đưa chất lên cột
Lấy 28,39g cặn gam cặn chiết n-Hexane (kí hiệu F2) hòa tan với CH2Cl2 vừa đủ cho tan hết, rồi đem hỗn hợp trộn với 32g silica gel. Làm bay hết dung môi đên khi thu đƣợc hỗn hợp bột tơi có màu xanh nhạt.
Hình 3.17 : Chất tẩm silica gel đã tơi
Vừa hỗn hợp trên lên cột vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố đều vào cột.
Hình 3.18 : Cột phân đoạn F2
Bước 3: Chạy cột
Sử dụng hệ dung môi EA/n-Hexane cho cột phân đoạn F2.
Cho một lớp bông mỏng lên trên mặt chất tránh khi cho dung môi lên làm xáo trộn bề mặt chất sẽ làm cho chất đi xuống không đều.
Các bình tam giác có dung tích 80-100 mL đƣợc sử dụng để hứng dung dịch rửa giải. Sau khi hứng tiến hành sắc kí lớp mỏng và gộp các vệt tƣơng tự nhau. Sau đó dội cột bằng dung môi MeOH để chất xuống hết. Kết quả thu đƣợc 7 phân đoạn nhƣ sau:
Bảng 3.3 : Kết quả các phân đoạn thu được từ phân đoạn F2
STT Bình gộp Dung môi rửa giải Phân
đoạn Khối lƣợng (gam) 1 1÷38 1400 mL EtOAc /n-Hexane 0% 1000 mL EtOAc /n-Hexane 0,5% 1000 mL EtOAc /n-Hexane 1% 600mL EtOAc /n-Hexane 1,5% F2.1 0,82 2 39÷64 400mL EtOAc /n-Hexane 1,5% 2300 mL EtOAc/n-Hexane 2% F2.2 3,64 3 65÷70 1800 mL EtOAc/n-Hexane 2% F2.3 1.36 4 71÷78 800 mL EtOAc/n-Hexane 2% F2.4 1,06 5 79÷106 2800 mL EtOAc/n-Hexane 2% F2.5 3.7 6 107÷136 2700 mL EtOAc/n-Hexane 2% F2.6 3,31 7 137÷148 400 mL EtOAc/n-Hexane 2% 750 mL MeOH F2.7 15,91
Bước 4: Phân lập chất từ phân đoạn nhỏ:
Sau khi hoàn thành chạy cột phân đoạn F2, tiến hành xử lí phân đoạn F2.2 (lọ 40). Thu đƣợc kết tủa hình kim, trắng, tan trong CH2Cl2 và không xuất hiện màu khi soi UV. Sau khi kết tinh trong hệ dung môi CH2Cl2/n-
Hexane 50:50 thu đƣợc 20mg chất FPFHC1.
Chất FPFHC1 từ cặn dịch chiết n-Hexane quả cây Trâu cổ đƣợc phân lập qua các quá trình sau:
CC,silicaget,EtOAc/n-Hexan CC,silicaget,EtOAc/n-Hexan Kết tinh Hình 3.19: Sơ đồ phân lập chất FPFHC1 Hình 3.20 : Hình ảnh chất FPFHC1
Trên hình ảnh sắc ký lớp mỏng của chất FPFHC1 xác định đƣợc giá trị Rf = 0,64 (CH2Cl2/n-Hexane 45:55). Cặn dịch chiết n-Hexan FPFH (137,13g) F1 69,76g F2 28,39g F3 10,57g F4 19,39g F5 5,32g F2.1 0,82g 3,64g F2.2 1,36g F2.3 1,06g F2.4 F2.5 3,7g 3,31g F2.6