+ Lập sắc ký đồ: Lập sắc ký đồ trong các điều kiện sau: Quan sát dƣới ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng ngắn (= 254 nm) và bƣớc sóng dài (366 nm). Sau đó nhúng bản mỏng vào dung dịch thuốc thử Ce(SO4)2, tiếp theo sấy nhẹ bản mỏng, quan sát dƣới ánh sáng thƣờng. Đem bản mỏng nƣớng trên bếp điện đôi để thấy rõ vệt chất hơn:
Hình 3.10: Bản mỏng đang nướng trên bếp điện đôi Gali
Ta thấy, mỗi vết tách trên bản mỏng có các giá trị Rf là khác nhau. Qua phân tích sơ bộ cho thấy : Số lƣợng chất có trong cặn chiết quả cây Trâu cổ, đánh giá sơ bộ đƣợc khả năng phân tách chất của dung môi trên silicagel.
+ Kết quả sắc ký đồ:
Hệ các dung môi đƣợc triển khai gồm:
(I): EA/Hx(10%)
(II): EA/Hx(20%)
(III): EA/Hx(30%)
(IV): Ac/ CH2Cl2 (10%)
(V): EA/ CH2Cl2 (10%)
Các bản mỏng sau khi đƣợc triển khai sắc ký, hiện màu bằng đèn tử ngoại sau đó nhúng vào dung dịch thuốc thử Ce(SO4)2 thu đƣợc kết quả tƣơng ứng nhƣ sau:
(I) (II) (III)
(IV) (V)
Hình 3.11: Kết quả khảo sát TLC cặn chiết n-hexne quả cây Trâu cổ
Sau khi khảo sát TLC, ta thấy các cất đƣợc triển khai tốt ở các hệ:
thuốc thử Ce(SO4)2 có các vệt chất hiện rõ rệt ở bƣớc sóng =366 nm, có các vệt chất hiện màu ngay ở bƣớc sóng 254nm
UV-366 Ce(SO4)2
Hình 3.12: TLC cặn n-hexane quả cây Trâu cổ với hệ dung môi (II)
Dựa vào bản mỏng khảo sát các vệt chất với các hệ dung môi trên cho ta các giá trị Rf của các vệt chất với hệ dung môi EtOAc/Hexane đƣợc trình bày cụ thể nhƣ sau:
Bảng 3.1. Giá trị Rf và màu sắc các vệt chất trên bản mỏng
STT Rf Ce(SO4)2
UV
254 nm 366 nm
1 0,100 Xanh đen Nâu Hồng
2 0,325 Xanh đen Nâu (-)
3 0,613 Xanh đen (-) Trắng xanh
4 0,844 Xanh đen Nâu (-)
5 0,969 Xanh đen Nâu Vàng
(-): không hiện
Rf = a/b
b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đƣờng đi của vết(cm) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
0 < Rf < 1
Từ kết quả khảo sát bản mỏng và sự hiện màu các vệt chất, ta lựa chọn hệ dung môi EtOAc /Hexane với độ phân cực tăng dần làm dung môi rửa giải cho cột tổng cặn n-Hexane quả cây Trâu cổ.
3.2.2 Quá trình phân lập các chất
Giai đoạn 1: Chuẩn bị cột
Chọn cột 10 rửa sạch, tráng cột bằng acetone, sấy khô, lót dƣới đáy một lƣợng bông nhỏ. Chuẩn bị cột silica gel theo phƣơng pháp nhồi cột ƣớt:
Sau đó cân 320 gam silica gel, ngâm trƣơng nở ngập trong n-hexane khoảng 30 phút, trong quá trình ngâm dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để bọt khí bay hết đi.
Tráng qua cột một lớp axetone để dựng cột, sau khi cột khô thì nhồi bông vào cột.
Rót từ từ hỗn hợp silica gel đã trƣơng nở vào cột, vừa rót vừa vỗ nhẹ cột để bay hết bọt khí, để cột ổn định trong thời gian 3h.
Hình 3.13 : Cột tổng silica gel trước khi đưa chất lên
Lấy 137,13 gam cặn chiết n-Hexane (kí hiệu FPFH) đƣợc hòa tan với CH2Cl2 vừa đủ cho tan hết, rồi đem trộn với 136g gam silica gel, làm bay hơi hết dung môi trên máy cất quay chân không đến khi thu đƣợc hỗn hợp bột tơi màu xanh đen
Cho từ từ silica gel đã đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố đều vào cột. Đặt một lớp bông lên trên cùng trƣớ khi bắt đầu chạy cột để chất không bị xáo trộn khi rót dung môi.
Hình 3.14 : Cột tổng silica gel cặn n-Hexane
Giai đoạn 3: Chạy cột tổng
Tiến hành chạy hệ dung môi EtOAc/n-Hexane. Sử dụng bình nón để hứng dung dịch rửa giải (80-100mL).
Tiến hành triển khai sắc kí lớp mỏng, gộp các bình có vệt chất giống hoặc tƣơng đƣơng nhau trên bản mỏng. Khi các vệt chất trên bản mỏng mờ dần, ta dội cọt bằng dung môi EtOAc. Sau khi chạy cột tổng ta thu đƣợc 5 phân đoạn, kí hiệu từ F1-F5:
STT Bình gộp Dung môi rửa giải Phân đoạn Khối lƣợng (gam) 1 1÷14 1400 mL EtOAc /n-Hexane 2% F1 69,76 2 15÷54 2600 mL EtOAc /n-Hexane 2% 1000 mL EtOAc/n-Hexane 5% 200 mL EtOAc/n-Hexane 10% F2 28,39 3 55÷73 1800 mL EtOAc/n-Hexane 10% F3 10,57 4 74÷100 2000 mL EtOAc/n-Hexane 20% 1200 mL EtOAc/n-Hexane 50% F4 19,39 5 101÷108 900 mL EtOAc/n-Hexane 50% F5 5,32
Khảo sát lại TLC của các phân đoạn với một số hệ dung môi khác cho kết quả nhƣ sau:
(I) (II)
Hình 3.15: Hình ảnh TLC các phân đoạn F1÷F5
Giai đoạn 4: Phân lập các chất từ phân đoạn nhỏ F2 (28,39g) Bước 1: Chuẩn bị cột
Sử dụng cột có đƣờng kính 5cm; chiều dài 50 cm đƣợc rửa sạch, tráng cột bằng acetone, sấy khô, nhồi dƣới đáy cột một ít bông. Chuẩn bị cột silica gel theo phƣơng pháp nhồi cột ƣớt:
Trong thời giam chờ cột khô cân khảng 300 gam silica gel, ngâm trƣơng nở ngập trong dung môi n-hexane khoảng 30 phút, vừa ngâm silica gel vừa dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi hết bọt khí. Sau đó rót từ từ hỗn hợp silica gel đã trƣơng nở vào cột, vừa rót hỗn hợp lên cột vừa vỗ nhẹ cột để bọt khí bay đi hết, để cột ổn định trong khoảng thời gian 2h.
Hình 3.16 : Cột chạy silica gel
Bước 2: Đưa chất lên cột
Lấy 28,39g cặn gam cặn chiết n-Hexane (kí hiệu F2) hòa tan với CH2Cl2 vừa đủ cho tan hết, rồi đem hỗn hợp trộn với 32g silica gel. Làm bay hết dung môi đên khi thu đƣợc hỗn hợp bột tơi có màu xanh nhạt.
Hình 3.17 : Chất tẩm silica gel đã tơi
Vừa hỗn hợp trên lên cột vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố đều vào cột.
Hình 3.18 : Cột phân đoạn F2
Bước 3: Chạy cột
Sử dụng hệ dung môi EA/n-Hexane cho cột phân đoạn F2. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cho một lớp bông mỏng lên trên mặt chất tránh khi cho dung môi lên làm xáo trộn bề mặt chất sẽ làm cho chất đi xuống không đều.
Các bình tam giác có dung tích 80-100 mL đƣợc sử dụng để hứng dung dịch rửa giải. Sau khi hứng tiến hành sắc kí lớp mỏng và gộp các vệt tƣơng tự nhau. Sau đó dội cột bằng dung môi MeOH để chất xuống hết. Kết quả thu đƣợc 7 phân đoạn nhƣ sau:
Bảng 3.3 : Kết quả các phân đoạn thu được từ phân đoạn F2
STT Bình gộp Dung môi rửa giải Phân
đoạn Khối lƣợng (gam) 1 1÷38 1400 mL EtOAc /n-Hexane 0% 1000 mL EtOAc /n-Hexane 0,5% 1000 mL EtOAc /n-Hexane 1% 600mL EtOAc /n-Hexane 1,5% F2.1 0,82 2 39÷64 400mL EtOAc /n-Hexane 1,5% 2300 mL EtOAc/n-Hexane 2% F2.2 3,64 3 65÷70 1800 mL EtOAc/n-Hexane 2% F2.3 1.36 4 71÷78 800 mL EtOAc/n-Hexane 2% F2.4 1,06 5 79÷106 2800 mL EtOAc/n-Hexane 2% F2.5 3.7 6 107÷136 2700 mL EtOAc/n-Hexane 2% F2.6 3,31 7 137÷148 400 mL EtOAc/n-Hexane 2% 750 mL MeOH F2.7 15,91
Bước 4: Phân lập chất từ phân đoạn nhỏ:
Sau khi hoàn thành chạy cột phân đoạn F2, tiến hành xử lí phân đoạn F2.2 (lọ 40). Thu đƣợc kết tủa hình kim, trắng, tan trong CH2Cl2 và không xuất hiện màu khi soi UV. Sau khi kết tinh trong hệ dung môi CH2Cl2/n-
Hexane 50:50 thu đƣợc 20mg chất FPFHC1.
Chất FPFHC1 từ cặn dịch chiết n-Hexane quả cây Trâu cổ đƣợc phân lập qua các quá trình sau:
CC,silicaget,EtOAc/n-Hexan CC,silicaget,EtOAc/n-Hexan Kết tinh Hình 3.19: Sơ đồ phân lập chất FPFHC1 Hình 3.20 : Hình ảnh chất FPFHC1
Trên hình ảnh sắc ký lớp mỏng của chất FPFHC1 xác định đƣợc giá trị Rf = 0,64 (CH2Cl2/n-Hexane 45:55). Cặn dịch chiết n-Hexan FPFH (137,13g) F1 69,76g F2 28,39g F3 10,57g F4 19,39g F5 5,32g F2.1 0,82g 3,64g F2.2 1,36g F2.3 1,06g F2.4 F2.5 3,7g 3,31g F2.6 F2.7 15,91 g C1 20mg
Hình 3.21 : Sắc kí đồ TLC của FPFHC1
3.3 Xác định cấu trúc hợp chất FPFHC1
Hình 3.22: Cấu trúc của hợp chất FPFHC1
Phổ khối phun mù điện tử ESI-MS cho pic ion giả phân tử [M+H]+
= 457, [M-CH3COOH+H]+ = 397 phù hợp với CTPT C31H52O2, M=456.
Phổ hồng ngoại của FPFHC1 có đỉnh hấp thụ ở 1729 cm1 đặc trƣng cho nhóm C=O trong phân tử. Tín hiệu của các dao động C-H sp3
đƣợc quan sát ở vùng 2935, 2866 cm1. Các đỉnh hấp thụ ở 1371, 1242 đặc trƣng cho liên kết C-O.
Hình 3.25: Phổ 1
H-NMR của hợp chất FPFHC1
Trên phổ 13
C-NMR cho thấy phân tử FPFHC1 chứa 1 nhóm CO ở C
1 CH-sp2 ở 122,7 (C-6); 6 nhóm CH3-sp3 ở 19,8 (C-26); 19,3 (C-19); 19,1 (C- 21); 18,8 (C-27); 12,0 (C-29); 11,9 (C-18), 1 nhóm CH3 liên kết với CO ở 27,8 (CH3-CO).
Hình 3.26: Phổ 13
C-NMR của FPFHC1
Kết hợp tài liệu tham khảo [8], [17] cho phép khẳng định FPFHC1 là - Sitosterol acetate.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Sau quá trình nghiên cứu, đề tài thu đƣợc một số kết quả nhƣ sau:
- Điều chế đƣợc 137,13 gam cặn dịch chiết n-Hexane của quả cây Trâu cổ (FPFH). Sau khi khảo sát TLC cặn dịch chiết n-Hexane của quả cây Trâu cổ và đã quyết định chọn hệ dung môi EtOAc/n-Hexane để phân tách cặn dịch chiết n-Hexane. Kết quả thu đƣợc 5 phân đoạn nhỏ F1-F5. Qua khảo sát lực chọn phân đoạn nhỏ F2, phân tách thành 7 phân đoạn nhỏ F2.1- F2.7. Từ phân đoạn F2.2 đem kết tinh thu đƣợc 20 mg hợp chất -Sitosterol acetate (FPFHC1). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Cấu trúc hợp chất FPFHC1 đƣợc xác định bằng phƣơng pháp phổ hồng ngoại, phổ khối lƣợng, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1
H-NMR, 13C- NMR.
2. Kiến nghị
- Tiếp tục phân lập các phân đoạn còn lại của dịch chiết n-hexane quả cây Trâu cổ và các cặn dịch chiết khác của cây Trâu cổ.
- Khảo sát hoạt tính sinh học các hợp chất phân lập đƣợc từ cây Trâu cổ. - Bán tổng hợp một số hợp chất nghiên cứu tách ra từ cây Trâu cổ và khảo sát các hoạt tính sinh học của chúng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
[1]. Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, Tập 2, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tr.1155- 1173.
[2]. Nguyễn Văn Hùng (2011), Họ Na (Annonaceae)-Hóa học và hoạt tính sinh học của các loài Desmos rostrata, Goniothalamus tamirensis, Fissistigma villosissium -Quyển 1. NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội.
[3]. Đỗ Tất Lợi (2011). Những cây cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Thời Đại, tr.75-77.
[4]. Hoàng Hƣơng Ly (2018), Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất Triterpenoid từ cây Trâu cổ (Ficus pumila L.) họ dâu tằm ( Moraceace),
Khóa luận tốt nghiệp ngành sƣ phạm hóa học, Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng, Phú Thọ.
[5]. Đặng Nhƣ Tại, Ngô Thị Thuận (2010). Hóa học hữu cơ, Tập 1. NXB Giáo dục Việt Nam, tr.478
[6]. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
[7]. Trần Quốc Sơn, Đặng Văn Liếu (2013), Giáo tình cơ sở hóa học hữu cơ, Tập 1, NXB Đai học sƣ phạm.
[8]. Vu Minh Trang, Phan Minh Giang, Phan Tong Son (2010), “Phytosterols, taraxerane triterpenoids, and flavonol glycosides from the leaves of Mallotus macrostachyus (Miq.) Muell.-Arg. (Euphorbiaceae)”,
Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 48(6A), pp11-16.
[9]. http://suckhoe24h-7.blogspot.com/2015/02/cay-trau-co-chua-benh.html [10]. http://tracuuduoclieu.vn/trau-co.html
[11]. Đào Thị Hải Yến (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học một số phân đoạn dịch chiết n-Hexane lá cây Trâu cổ (Ficus pumila L.) họ dâu tằm (
Moraceace) trên địa bàn tỉnh Phú Thọ, Khóa luận tốt nghiệp ngành sƣ phạm hóa học, Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng, Phú Thọ.
Tài liệu Tiếng Anh
[12]. Anshul Chawla, Ramandeep Kaur, Anil Kumar Sharma (2012). Ficus carica Linn.: A Review on its Pharmacognostic, Phytochemical and Pharmacological Aspects. International Journal of Pharmaceutical and Phytopharmacological Research, 1(4): 215-232
[13]. B.S. Furniss (1989), A.J. Hannaford, P.W.G. Smith, A.R. Tatchell. Text book of practical organic chemistry. Longman Scientific Technical, pp 197.
[14]. Shukranul Mawa, Ibrahim Jantan and Khairana Husain (2016), “Isolation of Terpenoids from the Stem of Ficus aurantiaca Griff and their Effects on Reactive Oxygen Species Production and Chemotactic
Activity of Neutrophils”, Molecules, 21, 9;
doi:10.3390/molecules21010009.
[15]. Consolacion Y. Ragasa, Agnes B. Alimboyoguen, and Chien-Chang Shen (2014), “Chemical constituents of Ficus nota”, Der Pharma Chemica, 6(4), 98-101.
[16]. Pham Thi Nhat Trinh, Nguyen Huu An, Pham Ngoc An, Mai Dinh Tri, Cao Van Du, Nguyen Thi Le Thuy, Nguyen Trong Tuan, Vang Thi Kim Thoa, Nguyen Ngoc Tuan & Le Tien Dung (2017), “A new benzofuran derivative from the leaves of Ficus pumila L.”, Natural Product Research, DOI: 10.1080/14786419.2017.1395427.
[17]. Jiliang Hang, Patrick Dussault (2010),“A concise synthesis of β- sitosterol and other phytosterols”, Steroids, 75(12), pp. 879–883; doi: 10.1016/j.steroids.2010.05.016
NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƢỚNG DẪN (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sinh viên Nguyễn Thị Thùy Linh đã thực hiện Khóa luận tốt nghiệp với thái độ cầu thị, tích cực học hỏi và chủ động bố trí thời gian thực hiện các thực nghiệm nghiên cứu tại phòng thí nghiệm.
Đã thực hiện đúng mục tiêu đề tài đặt ra: Đã điều chế đƣợc 137,13 gam cặn dịch chiết n-Hexane của quả cây Trâu cổ (FPFH). Bằng phƣơng pháp sặc ký cột silica gel và kết tinh thu đƣợc 20 mg hợp chất -Sitosterol acetate (FPFHC1). Cấu trúc hợp chất FPFHC1 đã đƣợc xác định bằng phƣơng pháp phổ hồng ngoại, phổ khối lƣợng, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1
H-NMR, 13C- NMR.
GIẢNG VIÊN HƢỚNG DẪN
ThS. Nguyễn Thị Bình Yên
SINH VIÊN THỰC HIỆN