CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.2 Quá trình phân lập các chất từ dịch chiết n-hexane cây Trâu cổ
3.2.2 Quá trình phân lập các chất
Giai đoạn 1: Chuẩn bị cột
Chọn cột 10 rửa sạch, tráng cột bằng acetone, sấy khô, lót dƣới đáy một lƣợng bông nhỏ. Chuẩn bị cột silica gel theo phƣơng pháp nhồi cột ƣớt:
Sau đó cân 320 gam silica gel, ngâm trƣơng nở ngập trong n-hexane khoảng 30 phút, trong quá trình ngâm dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để bọt khí bay hết đi.
Tráng qua cột một lớp axetone để dựng cột, sau khi cột khô thì nhồi bông vào cột.
Rót từ từ hỗn hợp silica gel đã trƣơng nở vào cột, vừa rót vừa vỗ nhẹ cột để bay hết bọt khí, để cột ổn định trong thời gian 3h.
Hình 3.13 : Cột tổng silica gel trước khi đưa chất lên
Lấy 137,13 gam cặn chiết n-Hexane (kí hiệu FPFH) đƣợc hòa tan với CH2Cl2 vừa đủ cho tan hết, rồi đem trộn với 136g gam silica gel, làm bay hơi hết dung môi trên máy cất quay chân không đến khi thu đƣợc hỗn hợp bột tơi màu xanh đen
Cho từ từ silica gel đã đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố đều vào cột. Đặt một lớp bông lên trên cùng trƣớ khi bắt đầu chạy cột để chất không bị xáo trộn khi rót dung môi.
Hình 3.14 : Cột tổng silica gel cặn n-Hexane
Giai đoạn 3: Chạy cột tổng
Tiến hành chạy hệ dung môi EtOAc/n-Hexane. Sử dụng bình nón để hứng dung dịch rửa giải (80-100mL).
Tiến hành triển khai sắc kí lớp mỏng, gộp các bình có vệt chất giống hoặc tƣơng đƣơng nhau trên bản mỏng. Khi các vệt chất trên bản mỏng mờ dần, ta dội cọt bằng dung môi EtOAc. Sau khi chạy cột tổng ta thu đƣợc 5 phân đoạn, kí hiệu từ F1-F5:
STT Bình gộp Dung môi rửa giải Phân đoạn Khối lƣợng (gam) 1 1÷14 1400 mL EtOAc /n-Hexane 2% F1 69,76 2 15÷54 2600 mL EtOAc /n-Hexane 2% 1000 mL EtOAc/n-Hexane 5% 200 mL EtOAc/n-Hexane 10% F2 28,39 3 55÷73 1800 mL EtOAc/n-Hexane 10% F3 10,57 4 74÷100 2000 mL EtOAc/n-Hexane 20% 1200 mL EtOAc/n-Hexane 50% F4 19,39 5 101÷108 900 mL EtOAc/n-Hexane 50% F5 5,32
Khảo sát lại TLC của các phân đoạn với một số hệ dung môi khác cho kết quả nhƣ sau:
(I) (II)
Hình 3.15: Hình ảnh TLC các phân đoạn F1÷F5
Giai đoạn 4: Phân lập các chất từ phân đoạn nhỏ F2 (28,39g) Bước 1: Chuẩn bị cột
Sử dụng cột có đƣờng kính 5cm; chiều dài 50 cm đƣợc rửa sạch, tráng cột bằng acetone, sấy khô, nhồi dƣới đáy cột một ít bông. Chuẩn bị cột silica gel theo phƣơng pháp nhồi cột ƣớt:
Trong thời giam chờ cột khô cân khảng 300 gam silica gel, ngâm trƣơng nở ngập trong dung môi n-hexane khoảng 30 phút, vừa ngâm silica gel vừa dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi hết bọt khí. Sau đó rót từ từ hỗn hợp silica gel đã trƣơng nở vào cột, vừa rót hỗn hợp lên cột vừa vỗ nhẹ cột để bọt khí bay đi hết, để cột ổn định trong khoảng thời gian 2h.
Hình 3.16 : Cột chạy silica gel
Bước 2: Đưa chất lên cột
Lấy 28,39g cặn gam cặn chiết n-Hexane (kí hiệu F2) hòa tan với CH2Cl2 vừa đủ cho tan hết, rồi đem hỗn hợp trộn với 32g silica gel. Làm bay hết dung môi đên khi thu đƣợc hỗn hợp bột tơi có màu xanh nhạt.
Hình 3.17 : Chất tẩm silica gel đã tơi
Vừa hỗn hợp trên lên cột vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố đều vào cột.
Hình 3.18 : Cột phân đoạn F2
Bước 3: Chạy cột
Sử dụng hệ dung môi EA/n-Hexane cho cột phân đoạn F2.
Cho một lớp bông mỏng lên trên mặt chất tránh khi cho dung môi lên làm xáo trộn bề mặt chất sẽ làm cho chất đi xuống không đều.
Các bình tam giác có dung tích 80-100 mL đƣợc sử dụng để hứng dung dịch rửa giải. Sau khi hứng tiến hành sắc kí lớp mỏng và gộp các vệt tƣơng tự nhau. Sau đó dội cột bằng dung môi MeOH để chất xuống hết. Kết quả thu đƣợc 7 phân đoạn nhƣ sau:
Bảng 3.3 : Kết quả các phân đoạn thu được từ phân đoạn F2
STT Bình gộp Dung môi rửa giải Phân
đoạn Khối lƣợng (gam) 1 1÷38 1400 mL EtOAc /n-Hexane 0% 1000 mL EtOAc /n-Hexane 0,5% 1000 mL EtOAc /n-Hexane 1% 600mL EtOAc /n-Hexane 1,5% F2.1 0,82 2 39÷64 400mL EtOAc /n-Hexane 1,5% 2300 mL EtOAc/n-Hexane 2% F2.2 3,64 3 65÷70 1800 mL EtOAc/n-Hexane 2% F2.3 1.36 4 71÷78 800 mL EtOAc/n-Hexane 2% F2.4 1,06 5 79÷106 2800 mL EtOAc/n-Hexane 2% F2.5 3.7 6 107÷136 2700 mL EtOAc/n-Hexane 2% F2.6 3,31 7 137÷148 400 mL EtOAc/n-Hexane 2% 750 mL MeOH F2.7 15,91
Bước 4: Phân lập chất từ phân đoạn nhỏ:
Sau khi hoàn thành chạy cột phân đoạn F2, tiến hành xử lí phân đoạn F2.2 (lọ 40). Thu đƣợc kết tủa hình kim, trắng, tan trong CH2Cl2 và không xuất hiện màu khi soi UV. Sau khi kết tinh trong hệ dung môi CH2Cl2/n-
Hexane 50:50 thu đƣợc 20mg chất FPFHC1.
Chất FPFHC1 từ cặn dịch chiết n-Hexane quả cây Trâu cổ đƣợc phân lập qua các quá trình sau:
CC,silicaget,EtOAc/n-Hexan CC,silicaget,EtOAc/n-Hexan Kết tinh Hình 3.19: Sơ đồ phân lập chất FPFHC1 Hình 3.20 : Hình ảnh chất FPFHC1
Trên hình ảnh sắc ký lớp mỏng của chất FPFHC1 xác định đƣợc giá trị Rf = 0,64 (CH2Cl2/n-Hexane 45:55). Cặn dịch chiết n-Hexan FPFH (137,13g) F1 69,76g F2 28,39g F3 10,57g F4 19,39g F5 5,32g F2.1 0,82g 3,64g F2.2 1,36g F2.3 1,06g F2.4 F2.5 3,7g 3,31g F2.6 F2.7 15,91 g C1 20mg
Hình 3.21 : Sắc kí đồ TLC của FPFHC1