Bình triển khai sắc kí bản mỏng

Còn dung môi đƣợc chƣng cất trƣớc khi sử dụng bằng bộ chƣng cất dung môi của hãng IKA.

Sau khi soi xong UV, đem bản mỏng đi thử với dung dịch thuốc thử Ceri sunfate và thực hiện trên bếp điện đôi Gali.

Hình 2.6: Bếp điện đôi Gali

Các bƣớc sóng UV 254, 366 nm đƣợc thực hiện trên hệ thống đèn UV CAMAG sẽ giúp soi rõ các vệt chất trên bản mỏng.

Hình 2.7: Máy soi UV

2.3 Các phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp ngâm chiết

Kỹ thuật ngâm chiết không đòi hỏi thiết bị phức tạp, vì thế có thể dễ dàng thao tác với một lƣợng lớn mẫu cây.

Mẫu cây sau khi phơi khô cần đƣợc say nghiền thành bột. Quá trình nghiền làm phá vỡ màng tế bào thực vật, giúp dung môi dễ tẩm thấu vào bột cây để dễ dàng chiết tách hết các hợp chất ra khỏi cây.

Hình 2.8 : Máy nghiền

Sau khi nghiền nhỏ, mẫu đƣợc ngâm lần lƣợt với các dung môi: n- hexane;CH2Cl2 EtOAc; MeOH. Mỗi dung môi ngâm 5 lần, mỗi lần ngâm 5L trong 24h, sau đó ta đem lọc. Lọc qua hai lần, lần thứ nhất là lọc vải lần thứ hai đem phần mẫu đã qua lọc vải để lọc giấy. Phần bã cây hoặc sinh khối còn lại đƣợc lọc bỏ.

Do ở nhiệt độ cao có thể làm phân hủy một số hợp chất kém bền nên dung môi lọc đƣợc sẽ đem cất quay ở nhiệt độ thấp từ 30-45oC và áp suất giảm.

Trong phƣơng pháp nghiên cứu hợp chất thiên nhiên thƣờng sử dụng các loại dung môi nhƣ: MeOH, CH2Cl2, EtOAc, n-hexane để ngâm chiết các mẫu thực vật. Do các dung môi có độ phân cực khác nhau nên sẽ chiết tách đƣợc các nhóm chất thứ cấp có độ phân cực khác nhau. Chẳng hạn, n-hexane thƣờng chiết các nhóm chất phân cực thấp nhƣ acid béo, terpene, ...

2.3.2 Phương pháp sắc kí

2.3.2.1 Phương pháp sắc kí lớp mỏng

Sắc kí lớp mỏng là một kĩ thuật sắc kí đƣợc dùng để tách chất trong hỗn hợp. Phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ, thƣờng là silica gel, aluminium oxit hoặc cellulose đƣợc phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích đƣợc hòa tan trong một dung môi thích hợp và đƣợc hút lên bản sắc kí bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch [6], [13].

Hình 2.10 : Minh họa sắc kí lớp mỏng

n-Hexane CH2Cl2 EtOAc MeOH

Với Rf là độ linh động của mỗi chất, ta có:

Tƣơng tự nhƣ vậy với hợp chất B hay với những hợp chất khác. Độ linh động của mỗi chất là khác nhau nên mỗi Rf sẽ cho kết quả khác nhau.

Bản mỏng đế nhôm tráng sẵn Silica gel 60 F254 của hãng Merck có độ dày 0,25 mm đƣợc dùng để sắc kí với các hệ dung môi khác nhau tùy thuộc vào độ phân cực của mỗi hợp chất. Một số hệ dung môi thông dụng nhƣ : CH2Cl2/n-Hexane, EtOAc/ n-Hexane,….

Ceri sulfate Ce(SO4)2, vanilin đƣợc dùng làm thuốc thử.

Phƣơng pháp sắc ký silica gel có cơ sở chung là dựa trên khả năng hấp phụ khác nhau của các chất trên silica gel (pha tĩnh) sau đó sẽ đƣợc dung môi rửa giải (pha động) kéo lên theo lực mao quản sẽ phân tách (giải hấp) ở các vị trí khác nhau trên đƣờng đi của dung môi. Do mỗi chất có độ phân cực là khác nhau nhƣ đã nói ở trên nên chất nào có độ phân cực kém hơn sẽ đi lên nhanh hơn (cao hơn) chất có độ phân cực cao hơn (thấp hơn).

Dựa vào khảo sát TLC để lựa chọn hệ dung môi cho sắc ký cột silica gel.

2.3.2.2 Phương pháp sắc kí cột

Đây là một phƣơng pháp phổ thông nhất trong các phòng thí nghiệm. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp này là dựa vào khả năng hấp thụ khác nhau của các chất và sự tƣơng tác giữa pha động và pha tĩnh. Trong đó, pha tĩnh là chất hấp thụ rắn thƣờng là silica gel (SiO2) 60, cỡ hạt 0,040-0,063 mm (230-400 mesh astm) của hãng Merck. Pha động – dạng lỏng thƣờng là mốt số hệ dung môi nhƣ : n-hexane/CH2Cl2, n-hexane/EtOAc, n-hexane/acetone,.... đƣợc rót từ trên đỉnh cột và chảy xuống nhờ trọng lực hoặc áp suất ngoài [6].

R

f

của A=

Quãng đƣờng di chuyển của hợp chất A Quãng đƣờng di chuyển của dung môi Z

Hình 2.11: Minh họa sắc kí cột

Các chất có độ phân cựa khác nhau sẽ cho kết quả khá nhau. Chất có độ phân cựa kém hơn sẽ đi xuống dƣới cột trƣớc. Cứ tiếp tục tăng dần hệ dung môi rửa rải để các chất có độ phân cực cao hơn tiếp tục xuống.

Có nhiều kích cỡ cột sắc kí nên tùy thuộc vào lƣợng chất ít hay nhiều mà lựa chọn cột phù hợp.

2.3.3 Phương pháp kết tinh

Đây là phƣơng pháp quan trọng để tinh chế chất rắn. Cơ sở của phƣơng pháp này là dựa trên sự khác nha về độ tan của các chất trong dung môi (hay hỗn hợp các dung môi) ở các nhiệt độ khác nhau. Hay có sự khác nhau về độ tan các chất, giữa chất chính và tạp chất ở cùng nhiệt độ [6].

Ta chọn dung môi hay hệ dung môi phù hợp để hòa tan chất cần kết tinh khi đun nóng và ít hòa tan khi làm lạnh. Sau khi làm lạnh bằng dung dịch bão hòa, chất cần kết tinh sẽ lắng xuống ở dạng tinh thể, tạp chất ở lại trong dung dịch. Trƣờng hợp tạp chất không tan khi đun nóng thì cần lọc bỏ sau đó làm lạnh dung dịch bão hòa.

2.3.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân(NMR)

Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân dựa trên tƣơng tác của hạt nhân từ (1H, 13C, …) với từ trƣờng ngoài [5], [7].

Phổ cộng hƣởng từ nhân proton (1

H-NMR):

- Số lƣợng tín hiệu (vạch phổ), vị trí vạch phổ (độ chuyển dịch hóa học, H) xác nhận các loại proton khác nhau và môi trƣờng bao quanh mỗi proton trong phân tử.

- Vị trí của tín hiệu cho biết proton thuộc loại proton nào: thơm, béo, bậc một, bậc hai, bậc ba,… Các proton khác nhau này có các môi trƣờng electron bao quanh khác nhau, và chính môi trƣờng electron bao quanh xác định proton hấp thụ ở đâu trong miền phổ.

Trên phổ 1

H-NMR tín hiệu các proton đƣợc ghi nhận thông qua độ chuyển dịch hóa học  ( = /0= Hz/MHz = 106 ppm), trong đó chất nội chuẩn TMS đƣợc gán  = 0 ppm.

Hình 2.13: Độ chuyển dịch hóa học của proton

- Cƣờng độ tín hiệu cho biết số proton cùng loại.

- Sự tƣơng tác (tách vạch phổ) và hằng số tƣơng tác spin – spin (J) cho biết proton nào tƣơng tác với proton nào.

+ Sự tách vạch phổ gây nên bởi sự tƣơng tác tƣơng tác J. Sự tách vạch phản ánh môi trƣờng bao quanh của các proton đang hấp thụ không phải đối với các electron mà đối với các proton khác ở gần bên cạnh. Số vạch phổ đƣợc tách theo qui tắc n+1 với n là số proton có tƣơng tác. Cƣờng độ các vạch phổ đƣợc tách tỉ lệ theo qui tắc tam giá Pascal.

+ Hằng số tƣơng tác J cho biết một cách chính xác loại thông tin về cấu trúc phân tử. Hằng số J không phụ thuộc vào từ trƣờng cảm ứng. Giá trị hằng số J đƣợc đo bằng Hz luôn bằng nhau dù từ trƣờng ngoài thế nào. Độ lớn của hằng số tƣơng tác phụ thuộc vào mối liên quan cấu trúc giữa các proton có tƣơng tác.

Hình 2.14: Ví dụ minh họa về sự tách vạch phổ

Tƣơng tự nhƣ proton, một trong các đồng vị của carbon, 13C là hạt nhân cho phổ NMR. Phổ 13

C-NMR đƣợc sinh ra theo cách giống nhƣ phổ 1H-NMR [5], [7].

Đồng vị 13C chỉ chiếm 1,1% hàm lƣợng carbon thiên nhiên, nhƣng độ nhạy của phổ kế hiện đại đủ để đo phổ 13

C-NMR. Phổ 13

C-NMR cho nhiều loại thông tin nhƣ 1H-NMR những thông tin trực tiếp là về khung carbon mà không có proton gắn với nó.

- Số lƣợng tín hiệu cho ta biết có bao nhiêu nhóm carbon khác nhau hay nhóm carbon tƣơng đƣơng khác nhau có ở trong phân tử.

- Sự tách vạch tín hiệu cho ta biết có bao nhiêu hiđro gắn với mỗi carbon. Phân biệt tín hiệu của carbon các bậc, nhóm CH là một vân đôi (d), ở nhóm CH2 là vân ba (t), ở nhóm CH3 là vân bốn (q), còn carbon không đính với hiđro là vân đơn (s). Trong kỹ thuật đo phổ hiện nay thƣờng khử tƣơng tác giữa C và H nên các carbon tƣơng đƣơng chỉ xuất hiện tín hiệu và 1 vạch đơn.

- Độ chuyển dịch hóa học (C) cho biết trạng thái lai hóa (sp3

, sp2,sp) của mỗi carbon, cho biết môi trƣờng electron bao quanh mỗi carbon đối với nhau, carbon gần bên cạnh hay các nhóm chức.

Hình 2.15: Độ chuyển dịch hóa học carbon C-13

 DEPT

Đây là kỹ thuật ghi phổ hỗ trợ cho phổ 13

C-NMR.

Phân biệt tín hiệu của carbon các bậc, nhóm CH là một vân đôi (d), ở nhóm CH2 là vân ba (t), ở nhóm CH3 là vân bốn (q), còn carbon không đính với hidro là vân đơn (s). Thông thƣờng các máy đo phổ 13

C-NMR sử dụng kỹ thuật xóa tƣơng tác nên mỗi tín hiệu của C chỉ còn 1 vạch; trong kỹ thuật ghi phổ DEPT-90; các nhóm CH ở phía trên; trong DEPT-135 các nhóm CH, CH3 ở phía trên, CH2 ở phía dƣới, C bậc 4 không xuất hiện tín hiệu trên phổ [5], [7].

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Quá trình điều chế cặn dịch chiết n-Hexane quả cây Trâu cổ

Thu hái mẫu tại Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng, cơ sở Thị xã Phú Thọ.

Hình 3.1: Mẫu khi mới thu hái.

Sau đó, đem mẫu về rửa sạch, loại bỏ lá và đem cân.

Hình 3.2: Mẫu quả cây Trâu cổ

Sau khi có khối lƣợng của mâu tƣơi, ta đem thái nhỏ và phơi trong bóng râm.

Hình 3.3 : Mẫu quả sau khi phơi khô

Tiến hành cho mẫu trên vào máy nghiền nghiền nhỏ bớt quả rồi cho vào các bình thủy tinh dung tích 5 lít để ngâm. Các bình thủy tinh phải có nắp đậy kín để không cho dung môi bay hơi ra ngoài. Không sử dụng bình nhựa hay bình thép gỉ để không bị nhầm lân các chất khác.

Đầu tiên là ngâm mẫu quả cây Trâu cổ trong dung môi kém phân cực nhất là n–Hexane.

Hình 3.4 : Hình ảnh ngâm quả Trâu cổ trong dung môi n–Hexane.

Ngâm lần đầu tiên trong 24h sau đó đem lọc. Bƣớc đầu tiên là lọc qua vải, sau đó lấy phần dung dịch đã lọc đƣợc để lọc bằng giấy (kí hiệu là

Hình 3.5 : Dung dịch qua lọc vải và lọc giấy.

Sau khi thu đƣợc dung dịch đã qua lọc giấy, ta tiến hành cô đặc lại mẫu bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ thấp và áp suất giảm (44°C, tốc độ quay trung bình 205 vòng/phút) để thu đƣợc cặn dịch chiết n-hexane quả cây Trâu cổ.

Tận dụng nguồn dung môi thu hồi đƣợc tiếp tục ngâm mẫu lần hai. Làm tƣơng tự nhƣ lần đầu với lần hai, ba, bốn và năm (ngâm trong 24h). Ngâm đến khi dung dịch nhạt màu dần thì dừng lại. Sau năm lần ngâm, lọc, quay ta thu đƣợc 137,13 gam cặn dịch chiết n-hexane quả cây Trâu cổ.

Hình 3.7 : Cặn dịch chiết n-hexane quả cây Trâu cổ.

Sau khi ngâm n–Hexane, tiếp tục ngâm mẫu với lần lƣợt dung môi CH2Cl2, EtOAc, MeOH thu đƣợc các cặn dịch chiết sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

Hình 3.8: Sơ đồ ngâm chiết quả cây Trâu cổ

3.2 Quá trình phân lập các chất từ dịch chiết n-hexane cây Trâu cổ

3.2.1 Khảo sát thành phần định tính và lựa chọn dung môi

+ Triển khai sắc ký lớp mỏng: Tiến hành khảo sát một lƣợng nhỏ cặn dịch chiết n-hexane quả cây Trâu cổ hòa tan trong hỗn hợp n-hexane. Đổ vào bình triển khai sắc ký hệ dung môi đã đƣợc pha sẵn (5 mL). Đƣa chất lên lớp mỏng bằng ống mao quản, cách đáy bản mỏng 6 mm và cách đều hai bên mép bản, để dung môi bay hết rồi đƣa vào bình triển khai. Dung môi khi đã chạy lên cách mép trên của bản khoảng 3 mm thì lấy bản mỏng ra, sấy nhẹ bản mỏng để dung môi bay hết.

Quả cây Trâu cổ khô (FPFH; 3,6 kg)

n-Hexane, (6L, 24h)x5

Dịch chiết n-Hexane Mẫu cây

Cặn dịch chiết n-Hexane

(FPFH; 137,13 g)

Chƣng cất

dƣới áp suất giảm

Ngâm tiếp

với CH2Cl2, EtOAc,

Hình 3.9: Sắc kí lớp mỏng

+ Lập sắc ký đồ: Lập sắc ký đồ trong các điều kiện sau: Quan sát dƣới ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng ngắn (= 254 nm) và bƣớc sóng dài (366 nm). Sau đó nhúng bản mỏng vào dung dịch thuốc thử Ce(SO4)2, tiếp theo sấy nhẹ bản mỏng, quan sát dƣới ánh sáng thƣờng. Đem bản mỏng nƣớng trên bếp điện đôi để thấy rõ vệt chất hơn:

Hình 3.10: Bản mỏng đang nướng trên bếp điện đôi Gali

Ta thấy, mỗi vết tách trên bản mỏng có các giá trị Rf là khác nhau. Qua phân tích sơ bộ cho thấy : Số lƣợng chất có trong cặn chiết quả cây Trâu cổ, đánh giá sơ bộ đƣợc khả năng phân tách chất của dung môi trên silicagel.

+ Kết quả sắc ký đồ:

Hệ các dung môi đƣợc triển khai gồm:

(I): EA/Hx(10%)

(II): EA/Hx(20%)

(III): EA/Hx(30%)

(IV): Ac/ CH2Cl2 (10%)

(V): EA/ CH2Cl2 (10%)

Các bản mỏng sau khi đƣợc triển khai sắc ký, hiện màu bằng đèn tử ngoại sau đó nhúng vào dung dịch thuốc thử Ce(SO4)2 thu đƣợc kết quả tƣơng ứng nhƣ sau:

(I) (II) (III)

(IV) (V)

Hình 3.11: Kết quả khảo sát TLC cặn chiết n-hexne quả cây Trâu cổ

Sau khi khảo sát TLC, ta thấy các cất đƣợc triển khai tốt ở các hệ:

thuốc thử Ce(SO4)2 có các vệt chất hiện rõ rệt ở bƣớc sóng =366 nm, có các vệt chất hiện màu ngay ở bƣớc sóng 254nm

UV-366 Ce(SO4)2

Hình 3.12: TLC cặn n-hexane quả cây Trâu cổ với hệ dung môi (II)

Dựa vào bản mỏng khảo sát các vệt chất với các hệ dung môi trên cho ta các giá trị Rf của các vệt chất với hệ dung môi EtOAc/Hexane đƣợc trình bày cụ thể nhƣ sau:

Bảng 3.1. Giá trị Rf và màu sắc các vệt chất trên bản mỏng

STT Rf Ce(SO4)2

UV

254 nm 366 nm

1 0,100 Xanh đen Nâu Hồng

2 0,325 Xanh đen Nâu (-)

3 0,613 Xanh đen (-) Trắng xanh

4 0,844 Xanh đen Nâu (-)

5 0,969 Xanh đen Nâu Vàng

(-): không hiện

Rf = a/b

b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đƣờng đi của vết(cm)

0 < Rf < 1

Từ kết quả khảo sát bản mỏng và sự hiện màu các vệt chất, ta lựa chọn hệ dung môi EtOAc /Hexane với độ phân cực tăng dần làm dung môi rửa giải cho cột tổng cặn n-Hexane quả cây Trâu cổ.

3.2.2 Quá trình phân lập các chất

Giai đoạn 1: Chuẩn bị cột

Chọn cột 10 rửa sạch, tráng cột bằng acetone, sấy khô, lót dƣới đáy một lƣợng bông nhỏ. Chuẩn bị cột silica gel theo phƣơng pháp nhồi cột ƣớt:

Sau đó cân 320 gam silica gel, ngâm trƣơng nở ngập trong n-hexane khoảng 30 phút, trong quá trình ngâm dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để bọt khí bay hết đi.

Tráng qua cột một lớp axetone để dựng cột, sau khi cột khô thì nhồi bông vào cột.

Rót từ từ hỗn hợp silica gel đã trƣơng nở vào cột, vừa rót vừa vỗ nhẹ cột để bay hết bọt khí, để cột ổn định trong thời gian 3h.

Hình 3.13 : Cột tổng silica gel trước khi đưa chất lên

Lấy 137,13 gam cặn chiết n-Hexane (kí hiệu FPFH) đƣợc hòa tan với CH2Cl2 vừa đủ cho tan hết, rồi đem trộn với 136g gam silica gel, làm bay hơi hết dung môi trên máy cất quay chân không đến khi thu đƣợc hỗn hợp bột tơi màu xanh đen

Cho từ từ silica gel đã đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố đều vào cột. Đặt một lớp bông lên trên cùng trƣớ khi bắt