Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết n hexane cây thạch vĩ (pyrrhosia lingua (thunb ) farwell) họ dương xỉ (polypodiaceae) trên địa bàn tỉnh phú thọ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ SANG BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC DỊCH CHIẾT n- HEXANE CÂY THẠCH VĨ (PYRRHOSIA LINGUA (THUNB.) FARWELL) HỌ DƢƠNG XỈ (POLYPODIACEAE) TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH PHÚ THỌ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành Sƣ phạm Hóa học Phú Thọ, 2016 TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ SANG BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC DỊCH CHIẾT n- HEXANE CÂY THẠCH VĨ (PYRRHOSIA LINGUA (THUNB.) FARWELL) HỌ DƢƠNG XỈ (POLYPODIACEAE) TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH PHÚ THỌ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Sƣ phạm Hóa học NGƢỜI HƢỚNG DẪN: TS Triệu Quý Hùng Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng Phú Thọ, 2016 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài này, em nhận đƣợc hƣớng dẫn trực tiếp TS Triệu Quý Hùng – giảng viên chuyên ngành Hóa học Hữu cơ, giúp đỡ tận tình thầy giáo mơn Hóa học, khoa Khoa học Tự nhiên Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng nhƣ ý kiến đóng góp từ bạn lớp Nhờ vậy, việc kết hợp với lí thuyết học tiến hành thực nghiệm thuận lợi Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc chân thành đến thầy hƣớng dẫn khoa học TS Triệu Quý Hùng hƣớng nghiên cứu tận tình hƣớng dẫn em suốt trình xây dựng, thực hồn thiện khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn q thầy mơn Hóa học, thầy cô Khoa Khoa học Tự nhiên Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi thời gian vấn đề tìm tịi tài liệu có liên quan suốt q trình nghiên cứu giúp em hồn thành đề tài nhanh sớm Nhân dịp em xin bày tỏ cảm ơn sâu sắc đến Ban Lãnh đạo Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng, Khoa Khoa học Tự nhiên - Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng tạo cho em môi trƣờng học tập khoa học, nghiêm túc Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, ngƣời thân bạn sinh viên lớp K10 ĐHSP Hóa học - Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng hỗ trợ, động viên em suốt trình học tập thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu này! Phú Thọ, ngày 18 tháng năm 2016 Sinh viên Nguyễn Thị Sang iii MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC HÌNH vi DANH MỤC CÁC BẢNG viii MỞ ĐẦU Lí lựa chọn đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chi Pyrrhosia 1.2 Đặc điểm thực vật Thạch vĩ 1.3 Các nghiên cứu hóa thực vật chi Thạch vĩ CHƢƠNG Đ ỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀPHƢƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 10 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 10 2.2 Vật liệu nghiên cứu 10 2.2.1 Mẫu nghiên cứu 10 2.2.2 Hóa chất 12 2.2.3 Thiết bị nghiên cứu 12 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 13 2.3.1 Phƣơng pháp ngâm chiết 13 2.3.2 Phƣơng pháp sắc ký 15 2.3.3 Phƣơng pháp xác định cấu trúc 25 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Quá trình phân lập chất từ dịch chiết n-hexane từ Thạch vĩ 33 iv 3.1.1 Khảo sát thành phần định tính lựa chọn dung môi 33 3.1.2 Quá trình phân lập chất 35 3.2 Xác định cấu trúc chất phân lập đƣợc 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 Kết luận 49 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT  Các phƣơng pháp sắc ký TLC Thin Layer Chromatography: Sắc ký lớp mỏng CC Column Chromatography: Sắc ký cột  Các phƣơng pháp phổ H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13 DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer: Phổ DEPT COSY Correlation Spectroscopy: Phổ tƣơng tác chiều đồng hạt nhân HSQC H-1H Heteronuclear Single Quantum Correlation: Phổ tƣơng tác hai chiều trực tiếp dị hạt nhân HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation: Phổ tƣơng tác đa liên kết hai chiều dị hạt nhân s: singlet d: doublet t: triplet m: multiplet dd: double doublet ddt: double double triplet  Các chữ viết tắt khác CTPT Công thức phân tử  Tên hợp chất đƣợc viết theo nguyên Tiếng Anh vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây Thạch vĩ Hình 2.1 Cây Thạch vĩ đƣợc thái nhỏ, phơi bóng mát 10 Hình 2.2 Quá trình ngâm chiết Thạch vĩ với n-hexane (I), lọc (II), cất loại dung môi dƣới áp suất thấp (III) cặn dịch chiết n-hexane Thạch vĩ (IV) 11 Hình 2.3 Các dung môi thông dụng đƣợc sử dụng phân lập hợp chất thiên nhiên 12 Hình 2.4 Một số dụng cụ thơng dụng đƣợc sử dụng trình phân lập hợp chất thiên nhiên 13 Hình 2.5 Kĩ thuật chiết ngâm dầm (Maceration) 14 Hình 2.6 Minh họa sắc kí lớp mỏng 16 Hình 2.7 Bản mỏng Silica gel F254 hãng Merck 16 Hình 2.8 Minh họa sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khác 19 Hình 2.9 Một số cột sắc kí (1) Silica gel 60 hãng Merck (2) 21 Hình 2.10 Minh họa sắc kí cột 22 Hình 2.11 So sánh chiều cao chất hấp thu cột với đƣờng kính cột23 Hình 2.12 Cách theo dõi q trình sắc kí cột sắc kí lớp mỏng Các lọ có sắc kí lớp mỏng giống đƣợc gom lại chung với thành phân đoạn 24 Hình 2.13 Độ chuyển dịch hóa học proton 27 Hình 2.14 Sự tách vạch phổ 28 Hình 2.15 Ví dụ minh họa tách vạch phổ 28 Hình 2.16 Độ chuyển dịch hóa học carbon C-13 29 Hình 2.17 Minh họa phổ DEPT 30 Hình 2.18 Minh họa phổ COSY 31 Hình 3.1 Kết khảo sát TLC cặn chiết n-hexane Thạch vĩ 34 Hình 3.2 TLC cặn n-hexane Thạch vĩ với hệ dung môi (II) (III) 35 Hình 3.3 Cột tổng silica gel cặn n-hexane 36 Hình 3.4 Quá trình sắc ký cột tổng n-hexane 37 Hình 3.5 Hình ảnh TLC phân đoạn F1÷F6 38 vii Hình 3.6 Hình ảnh sắc ký đồ TLC chất PLH3 39 Hình 3.7 Sơ đồ phân lập dịch chiết n-hexane Thạch vĩ 40 Hình 3.8 Cấu trúc hợp chất PLH3 41 Hình 3.9 Phổ 13C-NMR PLH3 42 Hình 3.10 Phổ DEPT PLH3 43 Hình 3.11 Phổ HSQC PLH3 44 Hình 3.12 Phổ COSY PLH3 46 Hình 3.13 Phổ HMBC PLH3 47 Hình 3.14 Tƣơng tác phổ HMBC PLH3 48 viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Giá trị Rf màu sắc vệt chất mỏng 35 Bảng 3.2 Kết phân đoạn thu đƣợc từ cột tổng n-hexane 37 Bảng 3.3 So sánh liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR PLH3 (A) với 22hydroxyhopane (B) 45 -1- MỞ ĐẦU Lí lựa chọn đề tài Hóa học mơn khoa học thực nghiệm Hóa học nói chung hóa học hữu nói riêng có vai trị quan trọng đời sống ngƣời Tầm quan trọng hợp chất hữu không số lƣợng áp đảo chúng mà vai trò to lớn chúng đời sống nhân loại Các hợp chất hữu tạo thức ăn, đồ mặc, thuốc chữa bệnh, nhiều vật dụng thiết yếu khác Chúng có mặt tất ngành kinh tế lĩnh vực khoa học, kĩ thuật Từ thời cổ xƣa loài ngƣời biết điều chế sử dụng sản phẩm hữu dạng không tinh khiết dạng hỗn hợp nhƣ: đƣờng mía, rƣợu, giấm, phẩm chàm, tinh dầu thơm, thuốc chữa bệnh,…Ở kỉ XX, hóa học hữu đóng góp cho nhân loại phát minh có ý nghĩa thực tiễn quan trọng Chẳng hạn, thành tựu nghiên cứu lĩnh vực polime sinh ngành công nghiệp chất dẻo, cao su nhân tạo tơ sợi hóa học; nghiên cứu phản ứng crackinh refoming đặt tảng cho cơng nghiệp hóa dầu – xƣơng sống ngành cơng nghiệp nhiên liệu hóa chất; việc tổng hợp loại thuốc làm nảy sinh ngành cơng nghiệp hóa dƣợc,…Ngày hóa học hữu đạt tới phát triển cao có vai trị quan trọng ngành kinh tế quốc dân Các chất hữu có mặt khắp nơi Không kể chất hữu tạo nên thể sống, ta gặp thành hóa hữu lĩnh vực Cùng với phát triển xã hội, ngƣời phải đối mặt với nhiều loại nguy cơ, bệnh tật khác Nhƣ biết, đấu tranh với bệnh tật ngƣời đƣợc lâu Những thuốc chữa bệnh ngƣời sử dụng có nguồn gốc từ thiên nhiên: thực vật, động vật khống chất Trong khoảng thời gian hàng nghìn năm, Trung Quốc Ấn Độ áp dụng thành cơng thuốc dân gian, thành phần hồn toàn từ nguồn gốc thiên nhiên Hiện nay, hƣớng chữa bệnh khác với y học -37- Giai đoạn 3: Chạy cột tổng Tiến hành rửa giải hệ dung môi EtOAc /n-hexane gradient (0-60%) Hứng dung dịch rửa giải khoảng 80÷100 mL vào bình nón (Hình 3.4) Hình 3.4 Quá trình sắc ký cột tổng n-hexane Kiểm tra sắc ký lớp mỏng, tiến hành gộp bình có vết chất tƣơng đƣơng mỏng Dội cột dung môi n-hexane Kết thu đƣợc phân đoạn có kí hiệu từ F1÷F6 (Bảng 3.2) Bảng 3.2 Kết phân đoạn thu từ cột tổng n-hexane STT Bình gộp 1÷17 Dung môi rửa giải 2400 mL EtOAc /n-Hexane 0% Phân Khối lƣợng đoạn (gam) F1 123mg F2 11,7g F3 0,6g 500 mL EtOAc /n-Hexane 1% 18÷46 1000 mL EtOAc /n-Hexane 2% 1000 mL EtOAc /n-Hexane 3% 47÷59 1500 mL EtOAc /n-Hexane 4% -38- STT Bình gộp 60÷75 76÷95 Dung mơi rửa giải 2000 mL EtOAc /n-Hexane 5% 500 mL EtOAc /n-Hexane 6% 500 mL EtOAc /n-Hexane 8% Phân Khối lƣợng đoạn (gam) F4 1,6g F5 1,9g F6 2,1g 500 mL EtOAc /n-Hexane 12% 800 mL EtOAc /n-Hexane 14% 96÷142 Mỗi lần 500 mL tƣơng ứng với Dội cột hệ dung môi EtOAc /n- n-hexane Hexane 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28%, 30%, 40%, 50%, 56% 60% Các phân đoạn F1÷F6 đƣợc khảo sát lại TLC với hệ dung môi EtOAc /n-Hexane (5%(I), 6%(II), 10%(V)), phân đoạn F1÷F2 với hệ dung mơi EtOAc /n-Hexane (1%(III)), phân đoạn F4÷F6 với hệ dung mơi EtOAc /n-Hexane (8%(IV)) cho kết nhƣ Hình 3.5 (I) (III) (II) (IV) (V) Hình 3.5 Hình ảnh TLC phân đoạn F1÷F6 -39- Giai đoạn 4: Phân lập chất từ phân đoạn nhỏ Phân đoạn F3 đƣợc tinh chế sắc kí cột silica gel, rửa giải hệ dung mơi CH2Cl2/n-hexane gradient (0%÷100%) thu đƣợc phân đoạn nhỏ, kí hiệu từ F3.1÷F3.8 Phân đoạn F3.6 đƣợc tinh chế sắc kí cột silica gel với hệ dung mơi rửa giải CH2Cl2/n-hexane gradient (0%÷55%) thu đƣợc 19mg chất PLH3 (Hình 3.6) Hình 3.6 Hình ảnh sắc ký đồ TLC chất PLH3 Sơ đồ phân lập dịch chiết n-hexane Thạch vĩ đƣợc trình bày nhƣ Hình 3.7 -40- Hình 3.7 Sơ đồ phân lập dịch chiết n-hexane Thạch vĩ -41- 3.2 Xác định cấu trúc chất phân lập đƣợc Hợp chất PLH3 đƣợc đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân chiều, chiều Viện Hóa học-Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Từ kiện phổ thu đƣợc cho phép xác định cấu trúc hợp chất PLH3 Hình 3.8 Cấu trúc hợp chất PLH3 Phân tích phổ 13C-NMR (Hình 3.9) kết hợp với phổ DEPT (Hình 3.10) phổ HSQC (Hình 3.11) cho thấy phân tử PLH3 chứa C bậc liên kết với oxy C 73,9 (C-22), nhóm methyl C 33,4 (C-23); 30,8 (C-30); 28,8 (C-29); 21,6 (C-24); 17,0 (C-27); 16,7 (C-26); 16,1 (C-28); 15,8(C-25); nhóm CH sp3 C 56,1 (C-5); 53,9 (C-17); 51,1 (C-21); 50,4 (C-9); 49,9 (C13); carbon bậc sp3 C 44,1 (C-18); 41,9 (C-8, C-14); 37,4 (C-10); 33,3 (C-4) với 11 nhóm CH2 sp3 C 42,1 (C-3); 41,3 (C-19); 40,3 (C-1); 34,4 (C-15); 33,3 (C-7); 26,6 (C-20); 24,2 (C-12); 22,0 (C-16); 20,9 (C-11); 18,7 (C-2, C-6) Các số liệu hoàn toàn phù hợp với liệu phổ 22hydroxyhopane (Bảng 3.3) -42- Hình 3.9 Phổ 13C-NMR PLH3 -43- Hình 3.10 Phổ DEPT PLH3 -44- Hình 3.11 Phổ HSQC PLH3 -45- Bảng 3.3 So sánh liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR PLH3 (A) với 22hydroxyhopane (B) Vị trí 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 H-NMR (H, ppm) A B 0,76; 1,64 0,76; 1,64 1,38; 1,56 1,38; 1,56 1,12; 1,34 1,12; 1,34 0,70 0,70 1,50; 1,35 1,50; 1,35 1,20; 1,45 1,20; 1,45 1,22 1,23 1,53; 1,32 1,53; 1,32 1,45; 1,37 1,45; 1,37 1,39 1,40 1,24; 1,38 1,24; 1,38 1,57; 1,93 1,57; 1,93 1,46 1,45 1,53; 0,93 1,53; 0,93 1,49; 1,74 1,49; 1,74 2,22 2,22 1,60 1,60 0,85 0,848 0,79 0,790 0,81 0,812 0,96 0,954 0,96 0,954 0,76 0,759 1,18 1,179 1,21 1,207 13 C-NMR (C, ppm) A B 40,3 40,29 18,7 18,69 42,1 42,10 33,3 33,25 56,1 56,08 18,7 18,69 33,3 33,21 41,9 41,90 50,4 50,34 37,4 37,38 20,9 20,89 24,2 24,13 49,9 49,83 41,9 41,84 34,4 34,37 22,0 21,95 53,9 53,91 44,1 44,09 41,3 41,23 26,6 26,60 51,1 51,11 73,9 73,96 33,4 33,41 21,6 21,60 15,8 15,83 16,7 16,71 17,0 17,03 16,1 16,14 28,8 28,72 30,8 30,85 -46- Trên phổ COSY (Hình 3.12) PLH3 cho thấy số tƣơng tác nhƣ proton H-17 (H 1,46) tƣơng tác với H-21 (H 2,22) H-16a (H 1,93); đồng thời H-16a tƣơng tác với H-15a (H 1,38), H-21 tƣơng tác với H-20a (H 1,74), H-20a tƣơng tác với H-19b (H 0,93) Hình 3.12 Phổ COSY PLH3 Phân tích phổ HMBC (Hình 3.13) PLH3 cho thấy H-21 tƣơng tác với C-20, C-22; H-29, H-30 tƣơng tác với C-21, C-22; H-26 tƣơng tác với C8; H-27 tƣơng tác với C-14; H-5 tƣơng tác với C-4, C-10, C-6, C-25, C-23; H-23, H-24, H-25 tƣơng tác với C-5; H-28 tƣơng tác với C-17, C-13 Các tƣơng tác khẳng định vị trí nhóm methyl liên kết với vịng hopane -47- Hình 3.13 Phổ HMBC PLH3 -48- Các tƣơng tác phổ HMBC đƣợc trình bày Hình 3.14 Hình 3.14 Tương tác phổ HMBC PLH3 Kết hợp kiện phổ NMR so sánh với tài liệu tham khảo [7] cho phép kết luận PLH3 triterpenoid 22-Hydroxyhopane -49- KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua trình thực đề tài Khóa luận tốt nghiệp; lần Thạch vĩ đƣợc nghiên cứu thành phần hóa học: - Đã khảo sát định tính thành phần hóa học dịch chiết n-hexane Thạch vĩ (Pyrrhosia lingua (Thunb.) Farwell) họ Dƣơng xỉ (Polypodiaceae) sắc ký mỏng Lựa chọn đƣợc hệ dung môi EtOAc/n-hexane làm dung môi rửa giải sắc ký cột silica gel để phân tách cặn dịch chiết n-hexane thành phân đoạn khác - Đã phân lập đƣợc hợp chất triterpenoid khung hopane 22Hydroxyhopane (PLH3) từ phân đoạn nhỏ F3 dịch chiết n-hexane Thạch vĩ - Cấu trúc hợp chất PLH3 đƣợc xác định phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân chiều chiều Kiến nghị - Tiếp tục tinh chế phân đoạn lại dịch chiết n-hexane Thạch vĩ nhằm tìm kiếm hợp chất thiên nhiên có lồi - Khảo sát hoạt tính sinh học hợp chất phân lập đƣợc -50- TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, Tập 2, Nxb Khoa học kĩ thuật, Hà Nội [2] Nguyễn Văn Hùng (2011), Họ Na (Annonaceae) - Hóa học hoạt tính sinh học lồi Desmos rostrata, Goniothalamus tamirensis, Fissistigma villosissium, Quyển 1, Nxb Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Hà Nội [3] Đỗ Tất Lợi (2011),Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Thời đại [4] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nxb Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh [5] Đặng Nhƣ Tại, Ngơ Thị Thuận (2010), Hóa học hữu cơ, Tập 1, Nxb Giáo dục Việt Nam [6] Đặng Nhƣ Tại, Ngô Thị Thuận (2012), Hóa học hữu cơ, Tập 2, Nxb Giáo dục Việt Nam Tài liệu Tiếng Anh [7] Hiroyuki Ageta, Kenji Shiojima, Hideki Suzuki and Sachiko Nakakuma (1993), “NMR Spectra of Triterpenoids I Conformation of the Side Chain of Hopane and Isohopane, and Their Derivatives”, Chem Pharm Bull., 41(11), pp1939-1943 [8] B.S Furniss, A.J Hannaford, P.W.G Smith, A.R Tatchell (1989), Text book of practical organic chemistry,Longman Scientific Technical [9] Donald L Pavia, Gary L Lampman, George S Kriz, James R Vyvyan (2009), Introduction to Spectrocopy, Brooks Cole Xác nhận giảng viên hƣớng dẫn Sinh viên TS Triệu Quý Hùng Nguyễn Thị Sang