Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết ethylacetate cây thạch vĩ ( pyrrhosia lingua (thunb ) farwell ) họ dương xỉ (polypodiaceae) trên địa bàn tỉnh phú thọ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÙI THỊ THU GIANG BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC DỊCH CHIẾT ETHYL ACETATE CÂY THẠCH VĨ (PYRRHOSIA LINGUA (THUNB.) FARWELL) HỌ DƢƠNG XỈ (POLYPODIACEAE) TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH PHÚ THỌ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Sƣ phạm Hóa học Phú Thọ, 2016 TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÙI THỊ THU GIANG BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC DỊCH CHIẾT ETHYL ACETATE CÂY THẠCH VĨ (PYRRHOSIA LINGUA (THUNB.) FARWELL)HỌ DƢƠNG XỈ (POLYPODIACEAE) TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH PHÚ THỌ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Sƣ phạm Hóa học NGƢỜI HƢỚNG DẪN: ThS Nguyễn Thị Bình Yên Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng Phú Thọ, 2016 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn Thầy hƣớng dẫn khoa học: ThS Nguyễn Thị Bình Yên -Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng hƣớng nghiên cứu tận tình hƣớng dẫn em suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô, nhà khoa học Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng giảng dạy hƣớng dẫn em thực thực nghiệm hóa học Nhân dịp em xin bày tỏ cảm ơn sâu sắc đến Ban Lãnh đạo Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng, Khoa Khoa học Tự nhiên - Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng tạo cho em môi trƣờng học tập khoa học, nghiêm túc Em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình, ngƣời thân bạn sinh viên K10 ĐHSP Hóa học-Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng hỗ trợ, động viên em suốt trình học tập thực Đề tài Phú Thọ, ngày 18 tháng năm 2016 Sinh viên Bùi Thị Thu Giang - i- MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv DANH MỤC CÁC BẢNG vi MỞ ĐẦU Lý lựa chọn đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chi Pyrrhosia 1.2 Đặc điểm thực vật loài Thạch vĩ 1.3 Các nghiên cứu hóa thực vật chi Pyrrhosia 1.4 Sơ lƣợc lớp chất steroid CHƢƠNG Đ ỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.2 Nguyên vật liệu thiết bị 2.2.1 Nguyên vật liệu 2.2.1.1 Mẫu nghiên cứu 2.2.1.2 Hóa chất 2.2.2 Thiết bị nghiên cứu 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 12 2.3.1 Phƣơng pháp ngâm chiết 12 2.3.2 Phƣơng pháp sắc ký 13 2.3.2.1 Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng 13 2.3.2.2 Phƣơng pháp sắc ký cột 13 2.3.3 Phƣơng pháp kết tinh 14 2.3.4 Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân(NMR) 15 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 18 - ii- 3.1 Quá trình điều chế cặn dịch chiết EtOAc Thạch vĩ 18 3.2 Quá trình phân lập chất từ dịch chiết EtOAc Thạch vĩ 19 3.1.1 Khảo sát thành phần định tính lựa chọn dung mơi 19 3.2.1 Quá trình phân lập chất 21 3.3 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 Kết luận 37 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 - iii- DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Các phƣơng pháp sắc ký TLC Thin Layer Chromatography: Sắc ký lớp mỏng CC Column Chromatography: Sắc ký cột Các phƣơng pháp phổ H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton s: singlet d: doublet m: multiplet  Các chữ viết tắt khác TMS Tetramethyl silan Tên hợp chất đƣợc viết theo nguyên Tiếng Anh - iv- DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh Thạch vĩ Hình 1.2 Cấu tạo khung steroid Hình 1.3 Cấu trúc khung steroid Hình 1.4 Cấu dạng steroid Hình 2.1 Cây Thạch vĩ (tại Lâm Thao) Hình 2.2.Máy cất quay chân khơng 10 Hình 2.3 Cột sắc ký với kích thƣớc khác 10 Hình 2.4 Bộ chƣng cất dung mơi 11 Hình 2.5 Máy soi UV 11 Hình 2.6 Sơ đồ chung phƣơng pháp ngâm chiết 12 Hình 2.7 Minh họa sắc ký lớp mỏng 13 Hình 2.8 Minh họa sắc ký cột 14 Hình 2.9 Độ chuyển dịch hóa học proton 15 Hình 2.10 Sự tách vạch phổ 16 Hình 2.11 Ví dụ minh họa tách vạch phổ 16 Hình 2.12 Một số ví dụ 2J, 3J 17 Hình 3.1 Quá trình lọc dung dịch 18 Hình 3.2 Cặn EtOAc Thạch vĩ 19 Hình 3.3 Kết khảo sát TLC cặn chiết EtOAc Thạch vĩ 20 Hình 3.4 TLC cặn EtOAc Thạch vĩ với hệ dung môi (III) 21 Hình 3.5 Cột tổng silica gel cặn EtOAc 22 Hình 3.6 Hình ảnh TLC lọ từ 55 – 81 phân đoạn F4 23 Hình 3.7 Hình ảnh TLC phân đoạn F1÷F7 26 Hình 3.8 Cột phân đoạn F4 27 Hình 3.9 Hình ảnh TLC lọ từ 228 – 251 phân đoạn F4.6 30 Hình 3.10 Sơ đồ phân lập dịch chiết EtOAc câyThạch vĩ 31 Hình 3.11 Hình ảnh chất PLEA2 sắc ký đồ TLC 32 - v- Hình 3.12 TLC so sánh PLEA2 với hỗn hợp -Sitosterol+Stigmasterol 32 Hình 3.13 Phổ 1H-NMR hợp chất PLEA2 33 Hình 3.14 Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất PLEA2 34 Hình 3.15 Phổ 1H-NMR giãn rộng PLEA2 35 Hình 3.16 Cấu trúc hợp chất PLEA2 36 - vi- DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Giá trị Rf màu sắc vệt chất mỏng 21 Bảng 3.2 Kết phân đoạn thu đƣợc từ cột tổng EtOAc 24 Bảng 3.3 Kết phân đoạn thu đƣợc từ phân đoạn F4 27 -1- MỞ ĐẦU Lý lựa chọn đề tài: Sức khỏe tài sản quý giá ngƣời, sức sống, niềm tin sức mạnh mà không so sánh Con ngƣời có nhiều mơ ƣớc nhƣng ốm đau, bệnh tật cịn điều ƣớc có sức khỏe Nhận thức đƣợc tầm quan trọng sức khỏe, từ xa xƣa cổ đại, ông cha ta nghĩ đến việc chăm lo bảo vệ sức khỏe, sử dụng loại có sẵn tự nhiên để bồi bổ nhƣ chữa trị bệnh, làm mỹ phẩm, sử dụng sản xuất nông nghiệp,… Ngày nay, việc dùng lồi thuốc có nguồn gốc tự nhiên ngày đƣợc ƣa chuộng cơng trình nghiên cứu chúng ngày phát triển để khám phá, tiếp cận tìm nhiều công dụng loại y học cách nghiêm túc, chi tiết rõ ràng.Cùng với phát triển công nghệ tổng hợp hóa dƣợc tạo biệt dƣợc, nhà khoa học cố gắng tìm hiểu, khám phá hoạt tính sinh học khác hợp chất có nguồn gốc từ nhiều lồi thực vật khác Việt Nam đƣờng giao lƣu hai chiều thực vật chúng phong phú miền Nam Trung Quốc, Malaysia, Inđônêxia Nƣớc ta nằm vùng nhiệt đới, khơng có sa mạc, khơng chìm ngập dƣới biển không bị giá băng phủ xua đuổi lồi nên thuận lợi cho sinh sơi, nảy nở cỏ [2] Với đặc thù khí hậu thiên nhiên nhƣ vậy, Việt Nam có hệ thực vật phong phú đa dạng với 12.000 lồi, có 3.200 lồi thực vật đƣợc sử dụng làm thuốc Y học dân gian; mở tiềm nghiên cứu hợp chất tự nhiên từ loài thực vật Việt Nam [3] Chi Pyrrhosia Việt Nam có 17 lồi loài đƣợc sử dụng y học cổ truyền [1] mở tiềm nghiên cứu hóa thực vật lồi -25- STT Bình gộp Dung mơi rửa giải Phân đoạn Khối lƣợng (gam) 400 mL EtOAc/CH2Cl2 10% 400 mL EtOAc/CH2Cl2 11% 400 mL EtOAc/CH2Cl2 12% 360 mL EtOAc/CH2Cl2 13% 115÷122 Dội cột 680 mL EtOAc 100% EtOAc 123÷133 40 mL EtOAc/CH2Cl2 13% Dội cột 990 mL EtOAc 100% F6 2,58 F7 1,49 EtOAc Các phân đoạn F1-F7 đƣợc khảo sát lại TLC với hệ dung môi CH2Cl2 /n-Hexane EtOAc/CH2Cl2 cho kết nhƣ Hình 3.7 (I) (II) (III) (IV) -26- (V) (VI) (VII) (VIII) Hình 3.7 Hình ảnh TLC phân đoạn F1÷F7 Giai đoạn 4: Phân lập chất từ phân đoạn nhỏ F4 (2,6g) Bước 1: Chuẩn bị cột Cột có đƣờng kính 2,5cm; chiều dài 50 cm đƣợc rửa sạch, tráng cột acetone, sấy khơ, lót dƣới đáy bơng Chuẩn bị cột silica gel theo phƣơng pháp nhồi cột ƣớt: Cân 70 gam silica gel, ngâm trƣơng nở ngập n-hexane khoảng 30 phút, trình ngâm dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi hết bọt khí Rót từ từ hỗn hợp silica gel trƣơng nở vào cột, vừa rót vừa vỗ nhẹ cột để đuổi hết bọt khí, để cột ổn định thời gian 1h Bước : Đưa chất lên cột 2,6 gam cặn chiết EtOAc (kí hiệu F4) đƣợc hịa với CH2Cl2 vừa đủ cho tan hết, đem trộn với khoảng 2,6 gam silica gel, làm bay hết dung môi đến thu đƣợc hỗn hợp bột tơi màu nâu đen Cho từ từ silica gel đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố vào cột -27- Hình 3.8 Cột phân đoạn F4 Bước 3: Chạy cột Tiến hành rửa giải hệ dung môi CH2Cl2/n-Hexane (0% - 100%) Hứng dung dịch rửa giải khoảng 10ml vào lọ có dung tích khoảng 15÷20ml Kiểm tra sắc ký lớp mỏng, tiến hành gộp lọ có vết chất tƣơng đƣơng mỏng Dội cột dung môi EtOAc Kết thu đƣợc phân đoạn có kí hiệu từ F4.1 ÷ F4.9 (Bảng 3.3) Bảng 3.3 Kết phân đoạn thu từ phân đoạn F4 STT Bình gộp Dung mơi rửa giải Phân Khối lƣợng đoạn (mg) F4.1 7,5 200 mL CH2Cl2 /n-Hexane 0% 1÷80 100 mL CH2Cl2 /n-Hexane 2% 100 mL CH2Cl2 /n-Hexane 4% -28- STT Bình gộp Dung mơi rửa giải Phân Khối lƣợng đoạn (mg) F4.2 21,3 F4.3 108,0 F4.4 67,8 100 mL CH2Cl2 /n-Hexane 6% 100 mL CH2Cl2 /n-Hexane 8% 100 mL CH2Cl2 /n-Hexane 10% 100 mL CH2Cl2 /n-Hexane 12% 100 mL CH2Cl2 /n-Hexane 14% 100 mL CH2Cl2 /n-Hexane 16% 100 mL CH2Cl2 /n-Hexane 81÷139 18% 100 mL CH2Cl2 /n-Hexane 20% 100 mL CH2Cl2 /n-Hexane 22% 90 mL CH2Cl2 /n-Hexane 24% 10 mL CH2Cl2 /n-Hexane 26% 100 mL CH2Cl2 /n-Hexane 28% 140÷175 100 mL CH2Cl2 /n-Hexane 30% 100 mL CH2Cl2 /n-Hexane 32% 50 mL CH2Cl2 /n-Hexane 34% 50 mL CH2Cl2 /n-Hexane 34% 176÷211 100 mL CH2Cl2 /n-Hexane 36% -29- STT Bình gộp Dung mơi rửa giải Phân Khối lƣợng đoạn (mg) F4.5 147,0 F4.6 45,2 F4.7 135,2 F4.8 342,0 100 mL CH2Cl2 /n-Hexane 38% 100 mL CH2Cl2 /n-Hexane 40% 10 mL CH2Cl2 /n-Hexane 45% 212÷227 90 mL CH2Cl2 /n-Hexane 45% 70 mL CH2Cl2 /n-Hexane 50% 30 mL CH2Cl2 /n-Hexane 50% 100 mL CH2Cl2 /n-Hexane 228÷251 55% 100 mL CH2Cl2 /n-Hexane 60% 10 mL CH2Cl2 /n-Hexane 65% 90 mL CH2Cl2 /n-Hexane 65% 100 mL CH2Cl2 /n-Hexane 70% 252÷293 100 mL CH2Cl2 /n-Hexane 75% 100 mL CH2Cl2 /n-Hexane 80% 30 mL CH2Cl2 /n-Hexane 85% 70 mL CH2Cl2 /n-Hexane 85% 100 mL CH2Cl2 /n-Hexane 90% 294÷376 100 mL CH2Cl2 /n-Hexane 95% 560 mL CH2Cl2 /n-Hexane 100% -30- STT Bình gộp 377÷ hết Dung mơi rửa giải 540 mL CH2Cl2 /n-Hexane 100% Phân Khối lƣợng đoạn (mg) F4.9 51,1 Hình 3.9 Hình ảnh TLC lọ từ 228 – 251 phân đoạn F4.6 Bước 4: Phân lập chất từ phân đoạn nhỏ Tiến hành kết tinh phân đoạn nhỏ F4.6 hệ dung môi CH 2Cl2/nHexane 1:1 thu đƣợc 32 mg chất PLEA2 dƣới dạng tinh thể hình kim màu trắng Quá trình phân lập hợp chất PLEA2 từ cặn EtOAc Thạch vĩ đƣợc trình bày qua Hình 3.10 -31- Hình 3.10 Sơ đồ phân lập dịch chiết EtOAc câyThạch vĩ -32- Hợp chất PLEA2 không màu dƣới đèn tử ngoại hai bƣớc sóng 254 nm, 366 nm màu xanh tím với thuốc thử Ce(SO4)2 (Hình 3.11) Hình 3.11 Hình ảnh chất PLEA2 sắc ký đồ TLC Trên sắc ký lớp mỏng PLEA2 xác định đƣợc giá trị Rf = 0,41 (CH2Cl2/n-Hexane 80:20) 3.3 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc Hợp chất PLEA2 đƣợc so sánh TLC với hỗn hợp - Sitosterol+Stigmasterol chuẩn Phịng Tổng hợp hữu cơ-Viện Hóa sinh biển-Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam cung cấp; kết thu đƣợc cho thấy PLEA2 có Rf = 0,41 (CH2Cl2/n-Hexane 80:20) trùng với Rf hỗn hợp -Sitosterol+Stigmasterol (Hình 3.12) Hình 3.12 TLC so sánh PLEA2 với hỗn hợp -Sitosterol+Stigmasterol -33- Hình 3.13 Phổ 1H-NMR hợp chất PLEA2 -34- Hình 3.14 Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất PLEA2 -35- Hình 3.15 Phổ 1H-NMR giãn rộng PLEA2 -36- Trên phổ 1H-NMR PLEA2(Hình 3.13, 3.14, 3.15.) có tín hiệu proton olefinic H 5,35 ppm (1H, m, H-6), proton nhóm CH liên kết với oxygen H 3,52 ppm (1H, m, H-3) Tín hiệu nhóm methyl đƣợc quan sát thấy phổ 1H-NMR PLEA2 H 0,70 (3H, 18-CH3); 0,80 (3H, 26-CH3); 0,83 (3H, 27-CH3); 0,86 (3H, 29-CH3); 0,90 (3H, 21-CH3); 1,00 (3H, 19-CH3) Trên phổ 1H-NMR cịn quan sát đƣợc tín hiệu hai proton với cấu hình trans H 5,16 (1H, dd, J = 15,0; 8,5 Hz; H-22); 5,02 (1H, dd, J = 15,0; 8,5 Hz; H-23) đặc trƣng cho liên kết đôi C-22 C-23 phân tử Stigmasterol Đây điểm khác biệt cấu trúc Stigmasterol -Sitosterol Kết hợp tài liệu tham khảo [10] cho phép khẳng định PLEA2 hỗn hợp -Sitosterol+Stigmasterol 29 21 18 19 10 HO 11 H H 14 22 20 17 16 24 29 21 26 18 25 19 27 10 H HO -Sitosterol 11 H H 14 22 24 20 17 26 25 27 16 H Stigmasterol Hình 3.16 Cấu trúc hợp chất PLEA2 Căn đƣờng cong tích phân proton olefinic cho thấy tỉ lệ hai hợp chất -Sitosterol : Stigmasterol = 1,3:1 -37- KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Trong trình thực đề tài thu đƣợc kết nhƣ sau: - Đã điều chế đƣợc cặn dịch chiết EtOAc (ethyl acetate) Thạch vĩ - Khảo sát thành phần hóa học định tính cặn dịch chiết EtOAc Thạch vĩ sắc ký lớp mỏng lựa chọn hệ dung môi CH 2Cl2/nHexaneEtOAc/CH2Cl2 để phân tách cặn dịch chiết EtOAc thành phân đoạn nhỏ F1-F7 - Từ phân đoạn nhỏ F4 phân tách thành phân đoạn nhỏ F4.1-F4.9 Từ phân đoạn F4.6 phân lập đƣợc hợp chất (-Sitosterol+Stigmasterol) (PLEA2) - Cấu trúc hợp chất PLEA2 đƣợc xác định phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton 1H-NMR so sánh TLC với chất chuẩn Kiến nghị - Tiếp tục phân lập chất phân đoạn lại dịch chiết EtOAc Thạch vĩ - Khảo sát hoạt tính sinh học hợp chất phân lập đƣợc từ Thạch vĩ - Bán tổng hợp số hợp chất từ Thạch vĩ khảo sát hoạt tính sinh học chúng -38- TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng-Tập 2,NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [2] Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam-Quyển 1, NXB Trẻ [3] Nguyễn Văn Hùng (2011), Họ Na (Annonaceae)-Hóa học hoạt tính sinh học loài Desmos rostrata, Goniothalamus tamirensis, Fissistigma villosissium -Quyển 1, NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ-Hà Nội [4] Đỗ Tất Lợi (2011), Những cây thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Thời Đại [5] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh [6] Trần Quốc Sơn, Đặng Văn Liếu (2013), Giáo tình sở hóa học hữu cơ, Tập 1, NXB Đai học sƣ phạm [7] Đặng Nhƣ Tại, Ngơ Thị Thuận (2010), Hóa học hữu cơ-Tập 1, NXB Giáo dục Việt Nam Tài liệu Tiếng Anh [8] S Furniss, A.J Hannaford, P.W.G Smith, A.R Tatchell (1989),Text book of practical organic chemistry, Longman Scientific Technical [9] T.W.G Solomons, C.B Fryhle (2011), Organic chemistry-10th edition, John Wiley  Sons, INC [10] Vu Minh Trang, Phan Minh Giang, Phan Tong Son (2010), “Phytosterols, taraxerane triterpenoids, and flavonol glycosides from the leaves of Mallotus macrostachyus (Miq.) Muell.-Arg (Euphorbiaceae)”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 48(6A), pp11-16 Giảng viên hƣớng dẫn Sinh viên thực ThS Nguyễn Thị Bình Yên Bùi Thị Thu Giang