Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết và hợp chất cô lập từ lá cây dó bầu aquilaria crassna pierre

SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ * BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA CÁC CAO CHIẾT VÀ HỢP CHẤT CƠ LẬP TỪ LÁ CÂY DĨ BẦU AQUILARIA CRASSNA PIERRE Chủ nhiệm đề tài: ĐẶNG UY NHÂN Cơ quan chủ trì: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TRẺ TP Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2010 LỜI CẢM ƠN Nhóm nghiên cứu chúng tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành thầy cô, em sinh viên, người bạn, anh chị thuộc Khoa Hóa-trường Đại học khoa học tự nhiên TP.HCM, Phịng thí nghiệm Tế bào gốc, Phịng thí nghiệm Phân tích Trung tâm ĐH KHTN, Viện Cơng nghệ hóa học hết lịng giúp đỡ, hỗ trợ chúng tơi q trình thực đề tài Xin cảm ơn GS Poul Erik Hansen cộng thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em thời gian làm việc đại học Roskilde Đan Mạch Xin gừi lời cảm ơn đến quý thầy cô hội đồng xét duyệt ý kiến đóng góp q báu thiết thực giúp đề tài hoàn thiện Cảm ơn cơng ty TNHH Trầm Hương Việt, Viện nghiên cứu Hóa sinh Ứng dụng hỗ trợ nguyên liệu để chúng tơi hồn thành nghiên cứu Rất mong tiếp tục hợp tác nghiên cứu với vị Cuối xin cảm ơn sở Khoa học Công nghệ TPHCM, Trung tâm Phát triển khoa học-cơng nghệ trẻ, chương trình Vườn ươm KHCN hỗ trợ kinh phí giúp chúng tơi thực ý tưởng LỜI GIỚI THIỆU Cây dó bầu tên khoa học Aquilaria crassna Pierre họ Trầm Hương (Thymelacaceae) loại có khả hình thành phần lõi thân sản phẩm quí trầm hương có giá trị kinh tế cao Tuy nhiên, thời gian từ lúc trồng đến lúc thu trầm dài khoảng từ đến 10 năm nên vấn đề tìm nguồn thu nhanh, ổn định nhiều doanh nghiệp quan tâm Trong đề tài tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính chống oxy hóa cao chiết hợp chất tinh khiết cô lập từ dó bầu Aquilaria crassna Pierre, để từ góp phần mở rộng thêm hiểu biết dó bầu Việt Nam, đánh giá khả sử dụng dó bầu nguồn nguyên liệu sản xuất trà thảo dược tạo nguồn thu cho người dân trồng dó bầu thời gian chờ cho trầm INTRODUCTION Aquilaria crassna Pierre (Thymelaeceae) is one of the precious trees in Viet Nam because it is the principal source of agarwood (named tram huong in Vietnamese ), a highly valuable natural products all over the world However, it takes a long time to get agarwood in Aquilaria tree so “how to get the profit in the beginning time? “ is the problem that many people are interested In this research, we study on chemical constituents, antioxidant activities of the extracts and isolated compounds from Aquilaria crassna leaves The result contribute to improve the knowledge of this tree in Viet Nam and review an ability to make the herbal tea from this leaves to help the farmer have the new profit in the early time MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN LỜI GIỚI THIỆU MỤC LỤC Danh mục chữ viết tắt Danh mục hình ảnh, bảng biểu TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu dó bầu 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Phân loại 1.1.4 Đặc tính sinh học 1.2 NGHIÊN CỨU VỀ CÂY DÓ BẦU 11 1.2.1 Nghiên cứu trầm hương 11 1.2.2 Nghiên cứu thân dó bầu 15 1.2.3 Nghiên cứu dó bầu 16 1.3 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 17 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18 2.1 Điều kiện thực nghiệm 18 2.2 Chuẩn bị nguyên liệu 20 2.3 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa 20 2.3.1 Quy trình thử nghiệm hoạt tính 20 2.4 Khảo sát thành phần hóa học 22 2.4.1 Khảo sát cao ethyl acetate 22 2.4.2 Khảo sát cao butanol 22 2.5 Xác định hàm lượng chất dó bầu 24 2.5.1 Xử lý mẫu 24 2.5.2 Điều kiện phân tích 24 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Hoạt tính chống oxy hóa cao chiết từ dó bầu 26 3.2 Thành phần hóa học dó bầu A crassna 27 3.2.1 Hợp chất DB1 27 3.2.2 Hợp chất DB2 28 3.2.3 Hợp chất DB3 30 3.2.4 Hợp chất DB4 31 3.2.5 Hợp chất DB5 34 3.2.6 Hợp chất DB6 35 3.2.7 Hợp chất DB7 38 3.3 Hoạt tính chống oxy hóa chất cô lập 40 3.4 Hàm lượng chất dó bầu 41 KẾT LUẬN 42 ĐỀ NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AC : acetone COSY : Correlation Spectroscopy d : doublet, mũi đôi dd : mũi đôi đôi DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer DMSO : dimethyl sulfoxide DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EA : ethyl acetate GC-MS : sắc ký khí ghép khối phổ HE : hexane HMBC : Heteronuclear Multiple Quantum Correlation HPLC : sắc ký lỏng hiệu cao HR-MS : khối phổ phân giải cao HSQC : Heteronuclear Single Quantum Coherence J : số ghép spin m : multiplet, mũi đa NMR : cộng hưởng từ hạt nhân PHPLC : sắc ký lỏng hiệu cao điều chế q : quartet, mũi bốn s : singlet, mũi đơn SKC : sắc ký cột t : triplet, mũi ba DANH SÁCH HÌNH ẢNH-BẢNG BIỂU DANH SÁCH HÌNH ẢNH Số 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 2.10 2.11 2.12 2.13 TÊN HÌNH ẢNH Cây dó bầu Lá dó bầu Hoa dó bầu Quả dó bầu Lõi dó bầu sau cấy tạo trầm ba tháng Trầm hương Hình ảnh số thiết bị sử dụng đề tài Sắc ký đồ chuẩn DB1 Sắc ký đồ phân tích DB1 dó bầu Sắc ký đồ chuẩn DB2, DB3 Sắc ký đồ phân tích DB2, DB3 dó bầu Sắc ký đồ chuẩn DB4 Sắc ký đồ phân tích DB4 dó bầu Sắc ký đồ chuẩn DB5 Sắc ký đồ phân tích DB5 dó bầu Sắc ký đồ chuẩn DB6 Sắc ký đồ phân tích DB6 dó bầu Sắc ký đồ chuẩn DB7 Sắc ký đồ phân tích DB7 dó bầu Trang 8 10 10 19 24 24 25 25 25 25 25 25 26 26 26 26 DANH SÁCH BẢNG Số TÊN BẢNG SỐ LIỆU 1.1 2.1 3.1 Kết GC/MS mẫu trầm hương A agallocha Roxb Ấn Độ Bảng pha nồng độ quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH Kết hoạt tính ức chế gốc tự DPPH cao chiết từ dó bầu Hoạt tính ức chế gốc tự DPPH chất đối chứng dương quercetin nồng độ µM nồng độ quy đổi µg mL-1 Số liệu phổ 1H (500 MHz ) 13C-NMR (125 MHz ) DB2 DMSO-d6 so với 7O-methylapigenin Số liệu phổ 1H (500 MHz ) 13C-NMR (125 MHz ) DB3 methanol-d4 so với 7,4'-O-dimethylapigenin Số liệu phổ 1H (500 MHz ) 13C-NMR (125 MHz ) tương quan HMBC DB4 DMSO-d6 Số liệu phổ 1H (500 MHz ) 13C-NMR (125 MHz ) DB5 DMSO-d6 so với mangiferin Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz ) 13C-NMR (125 MHz ) methanol-d4 DB6 so với (6R, 9S)-roseoside 14 21 26 3.8 Số liệu phổ 1H (500 MHz ) 13C-NMR (125 MHz ) DB7 methanol-d4 so với iriflophenon 3,5-C,C-β-diglucopyranoside 39 3.9 Kết hoạt tính ức chế gốc tự DPPH chất DB1-DB7 40 3.10 Hàm lượng chất DB1-DB7 dó bầu Aquilaria crassna Kết nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính chống oxi hóa dó bầu Aquilaria crassna Pierre 41 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 4.1 Trang 27 29 31 33 35 37 43 DANH SÁCH SƠ ĐỒ Số 2.1 2.2 TÊN SƠ ĐỒ Quy trình thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự DPPH Quy trình lập chất dó bầu A crassna Pierre Trang 21 23 TỔNG QUAN TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY DÓ BẦU Tên khoa học: Aquilaria crassna Pierre Tên thơng thường: trầm hương, dó bầu Họ: Trầm hương (Thymelacaceae) Bộ: Mytales Lớp: Magnoliopsida Hình 1.1 Cây dó bầu 1.1.1 Đặc điểm thực vật [2][3] Cây dó bầu loại thân gỗ sống lâu năm, cao đến 30-40 m, đường kính 1-1.5 m, vỏ xám, tán thưa, thân thẳng, có xơ Cây dó bầu phân bố rải rác khu rừng thuộc kiểu ẩm nhiệt đới nguyên sinh thứ sinh, sống thích hợp rừng hỗn giao, rộng Cây dó bầu tái sinh chồi hay hạt, sinh trưởng phát triển điều kiện nhiệt độ ban ngày 15-36 oC, ban đêm 5-25 oC Lá mọc so le, thuôn hay bầu dục giáo, nhọn gốc, thon hẹp đầu, phiến dài 8-10 cm, rộng 3.5-5.5 cm, có mép phồng lên thành vịng, mặt màu lục, sáng bóng, nhẵn, mặt nhạt hơn, có lơng mềm, cuống dài 4-6 mm H Hình 1.2 Lá dó bầu Cây ba tuổi hoa Hoa nhỏ có hình chng màu vàng lục, trắng nhạt vàng xám Hoa mọc thành chùm hay thành tán Cây thường hoa, kết từ tháng đến tháng Hình 1.3 Hoa dó bầu TỔNG QUAN Hạt có phần dạng nón phần kéo dài dưới, vỏ ngồi hố gỗ, bên mềm Quả khơ, loại nang, hình lê có lơng mịn, thơng thường dài cm, rộng cm, dày cm Hình 1.4 Quả dó bầu 1.1.2 Phân bố [2][3] Cây dó bầu thường mọc rải rác vùng rừng dọc miền Trung tỉnh phía Nam, xuống tận An Giang, Kiên Giang đảo Phú Quốc, có nơi có mật độ cao đạt đến 120-150 cây/ha Ba Rền (Quảng Bình), Hương Khê (Hà Tĩnh) Phân bố tập trung nhiều tỉnh Quảng Ninh, Hà Bắc, Hồ Bình, Tun Quang, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Nam, Gia Lai, Kon Tum, Bình Ðịnh, Phú Yên Kiên Giang (đảo Phú Quốc Hà Tiên) 1.1.3 Phân loại [5] Trên giới, có khoảng 25 lồi dó bầu Ở nước ta, dó bầu có tất bốn loài A crassna Pierre ex Lecomte, A baillonii Pierre ex Lecomte, A banaense Pham-Hoang-Ho A rugosa L.C.Kiệt & PJ.A Kessler A rugosa L.C.Kiệt & PJ.A Kessler loài phát gần (2005) GS.TS Lê Công Kiệt (Việt Nam) TS Paul Kessler (Hà Lan) tìm thấy cao nguyên Trung Bộ, xem loài thứ Việt Nam thứ 25 giới 1.1.4 Đặc tính sinh học [5] Cây dó bầu có khả hình thành phần lõi thân loại sản phẩm đặc biệt có giá trị kinh tế cao gọi trầm hương hay kỳ nam Những nghiên cứu trước cho thấy, thân dó bầu có trầm hương kỳ nam Chỉ có số có bệnh chứa trầm phần lõi thân trình xảy dó bầu cịn sống Sản phẩm trầm hương hay kỳ nam kết trình chuyển hóa bệnh lý nơi bị bệnh, bị thương, bị tác động yếu tố bên tạo nên vết thương Ngày nay, người ta cịn sử dụng lồi vi sinh để TỔNG QUAN tạo nên vết thương cho nhằm tăng khả hình thành trầm hương Tùy thuộc vào tạo trầm hương mà thu sản phẩm khác : Tóc: biến đổi phần chất gỗ hình thành đường đen sợi tóc lượng tinh dầu nên dùng làm nhang đốt Trầm hương: gỗ trầm hương nhẹ, có vị cay, đắng, mùi thơm nhẹ, có màu nâu hay sọc đen, ngấm tinh dầu trầm nhiều tóc Trầm hương tốt dễ chìm nước Khi đốt cháy trầm hương bốc khói lên hình vịng tan biến nhanh khơng khí Kỳ nam: loại tốt có biến đổi hoàn toàn phần gỗ, thấm nhiều tinh dầu trầm, sản phẩm có màu nâu đậm, đen, xanh, vàng hay trắng Kỳ nam nặng nhuyễn, chìm nước, có đủ vị đắng, cay, chua, thơm, thường hình thành phần lõi trầm hương Kỳ nam chứa nhiều tinh dầu trầm nên cháy tạo lửa màu xanh, khói lên thẳng cao, bay lơ lửng khơng khí lâu Người ta thường gói kỳ nam chuối thật kín đem phơi nắng, đến tối đem vào có nhiều chất dầu chảy tốt Muốn giữ kỳ nam tốt lâu nên bọc vào giấy thiếc, bỏ vào hộp có nắp đậy kín để tinh dầu khỏi bay chảy Hình 1.5 Lõi dó bầu sau cấy tạo trầm ba tháng Hình 1.6 Trầm hương 10 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.2.5 Hợp chất DB5 Hợp chất DB5 thu dạng tinh thể màu vàng nhạt Sắc ký lớp mỏng cho vết hấp thu UV λ 254 nm Phổ 1H-NMR hợp chất DB5 (phụ lục 16) cho thấy tín hiệu nhóm – OH kiềm nối vùng trường thấp δ 13.82 (1H, s), diện ba proton vòng benzen δ 7.36 (1H, s), 6.82 (1H, s ) 6.37 (1H, s ) Nhóm tín hiệu vùng từ 3-5 ppm cho thấy diện phân tử đường với proton anomer nằm vùng trường cao δ 4.58 (1H, d, J = 10), giá trị số ghép lên đến 10 Hz, cho phép dự đoán hợp chất C-glucoside Khối phổ HR-ESI-MS DB5 (phụ lục 15) cho mũi [M+H]+ m/z 423.0922 (lý thuyết 423.0921) tương ứng với cơng thức phân tử C19H18O11 Độ bất bão hịa DB5 11 cho thấy hợp chất xanthone liên kết với đơn vị đường Phổ 13C DEPT-NMR hợp chất DB5 (phụ lục 17-18) cho thấy tín hiệu cộng hưởng tương ứng với 19 carbon có tám nhóm -CH-, nhóm -CH2- 10 carbon tứ cấp Ở vùng trường thấp có diện nhóm carbonyl tham gia liên hợp δC 178.9, sáu carbon vòng benzen liên kết với oxygen δC 163.7 (C-3), 161.7 (C-1), 156.1 (C-4a), 150.9 (C-4b), 143.9 (C-7) Nhóm tín hiệu vùng δC 60 – 95 ppm cho thấy diện đơn vị đường C-glucoside với carbon anomer δC 73.0 ppm Từ liệu cho thấy DB5 xanthone C-glycoside, kết hợp so sánh với số liệu công bố nghiên cứu trước đây[14] kết luận DB5 mangiferin \ DB5 (mangiferin ) 34 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Bảng 3.6 Số liệu phổ 1H (500 MHz ) 13C-NMR (125 MHz ) DB5 DMSO-d6 so với mangiferin DB5 Carbon Mangiferin δH δC δC - 161.7 161.8 - 107.5 107.6 - 163.7 163.9 6.37, s 93.2 93.3 4a - 156.1 156.2 6.82, s 102.4 102.6 - 154.7 154.3 - 143.9 143.3 7.36, s 107.6 108.0 8a - 111.2 111.6 - 179.0 179.1 9a - 101.2 101.3 10a - 150.9 150.9 1' 4.58, d, J = 10 73.0 73.1 2' 4.05, t, J = 9.5 70.6 70.7 3' 3.20, m 79.0 79.0 4' 3.14, m 70.2 70.2 5' 3.16, m 81.6 81.6 61.5 61.5 - - 6' 3.68, d, J = 10.5 1-OH 3.47, m 13.81, s 3.2.6 Hợp chất DB6 Hợp chất DB6 thu dạng dầu không màu, sắc ký lớp mỏng cho vết hấp thu UV λ254 nm Giá trị góc quay cực [α]D25 -148.5 (c = 0.017, CH3OH) Phổ 1H-NMR hợp chất DB6 (phụ lục 20) , vùng từ trường thấp có tín hiệu ba proton olefin δH 5.89 (1H, s, H-4), 5.98 (1H, d, J = 15.5, H-7), 5.73 (1H, dd, J = 15.5;7.5, H-8), hai proton H-7, H-8 ghép trans với Ở vùng từ 3-5 ppm 35 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN có diện nhóm tín hiệu, tương ứng với đơn vị đường β-Dglucose với proton anomer δH 4.28 (1H, d, J = 8, H-1’), proton carbon liên kết với oxygen δH 4.54 (1H, quint, J = 6.5, H-9) Cặp tín hiệu δH 2.61 (1H, d, J = 16.5, H-2a) δH 2.18 (1H, d, J = 16.5, H-2b) cho thấy diện hai proton metylen vị trí α so với nhóm carbonyl Ở vùng từ trường cao có bốn tín hiệu bốn nhóm methyl δH 1.04 (3H, s, H-11), δH 1.06 (3H, s, H-12), δH 1.30 (3H, d, J = 6.5, H-10), δH 1.96 (3H, s, H13) H-12 H-11 hai proton hai carbon gắn carbon tứ cấp Khối phổ HR-ESI-MS DB6 (phụ lục 19) cho mũi [M+Na]+ m/z 409.1872 (lý thuyết 409.1832) tương ứng với công thức phân tử C19H30O8 Phổ 13C-NMR DEPT (phụ lục 21-22) cho thấy tín hiệu tương ứng với 19 carbon có bốn carbon tứ cấp, hai nhóm -CH2- , bốn nhóm CH3, chín nhóm CH Tín hiệu nhóm carbonyl liên hợp vịng δC 201.2 (C-3) hai liên kết đôi C=C δC 133.8 (C-7), 133.8 (C-8), 127.1 (C-4), 167.1 (C-5) Ở vùng 60-80 pmm cho thấy diện đơn vị đường glucose với carbon anomer δC 101.3 ppm Dựa vào phổ COSY HSQC (phụ lục 23-24) ta xác định proton carbon mang proton phần aglycone phần đường hợp chất DB6 Phổ HMBC (phụ lục 25) cho thấy tương tác proton anomer với C-9 nên nhóm đường β-D-glucopyranosyl liên kết với C-9 Tín hiệu tương tác H-8 với C-6, H-7 với C-6 C5 giúp xác định vị trí liên kết đôi C=C với C-6 Mặt khác, ta thấy có tương quan H-13 với C-6, C-4, C-5 nên nhóm CH3-13 gắn vị trí C-5 Tương quan H-11, H-12 với C-2, C-6, C-1 hai nhóm CH3-11 CH3-12 gắn với C-1 C-1 gắn với C-2 C-6 Kết hợp liệu phổ cho thấy hợp chất DB6 có cấu trúc tương tự với hợp chất (6R,9S)- roseoside, so sánh số liệu phổ cơng bố thấy có tương hợp[32] , đề nghị cấu trúc hợp chất DB6 (6R,9S)- roseoside 36 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN OH 6' 4' HO HO 12 1' 2' 3' 11 O 5' O OH H H H OH H 13 O 10 DB6 [ (6R,9S)- roseoside ] Bảng 3.7 Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz ) 13 C-NMR (125 MHz ) methanol-d4 DB6 so với (6R, 9S)-roseoside Carbon 10 11 12 13 1' 2' 3' 4' 5' 6' DB6 δH 2.18 ( 1H, d, J = 16.5 ) 2.61( 1H, d, J = 16.5 ) 5.89 ( 1H, s ) 5.98 ( 1H, d, J = 15.5 ) 5.73 ( 1H, dd, J = 15.5; 7.5 ) 4.54 ( 1H, quint, J = 6.5 ) 1.30 ( 3H, d, J = 6.5 ) 1.04 ( 3H, s ) 1.06 ( 3H, s ) 1.96 ( 3H, s ) 4.28 ( 1H, d, J = 8.0 ) 3.19 ( 1H, m ) 3.37 ( 1H, m ) 3.28 ( 1H, m ) 3.17 ( 1H, m ) 3.63 ( 1H, dd, J = 6.0; 11.5) 3.85 ( 1H, dd, J = 2.5; 11.5) 37 δC 42.4 (6R, 9S)-Roseoside δC 42.3 50.8 50.6 201.3 127.2 167.1 80.0 133.8 133.7 74.7 22.3 23.5 24.7 19.6 101.3 75.0 78.4 71.7 78.2 201.1 127.2 166.9 80.0 134.1 133.8 74.7 22.2 23.4 24.8 19.4 100.9 75.0 78.2 71.7 78.1 62.9 62.9 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.2.7 Hợp chất DB7 Hợp chất DB7 thu dạng dầu màu vàng nâu Sắc ký lớp mỏng cho vết hấp thu UV λ 254 nm Phổ 1H-NMR hợp chất DB7 (phụ lục 27), vùng từ trường thấp xuất tín hiệu vịng benzen mang hai nhóm vị trí 1,4, hai cặp proton lại ghép ortho với [ δH 7.68 (1H, d, J = 8.5, H-2',6') 6.81 (1H, d, J = 8.5, H3',5') ] Vùng từ 3-5 ppm cho thấy nhóm tín hiệu tương ứng với đơn vị đường β-D-glucose với proton anomer δH 4.95 (1H, d, J = 10), số ghép lên đến 10 Hz cho phép dự đoán hợp chất C-glucoside Khối phổ HR-ESI-MS DB7 (phụ lục 26) cho mũi [M+H]+ m/z 571.1723 (lý thuyết 571.1657) tương ứng với công thức phân tử C25H30O15 phổ 13C-NMR DB7 cho thấy 15 tín hiệu, điều cho thấy DB7 có cấu trúc đối xứng Phổ 13C-DEPT NMR (phụ lục 28-29), vùng trường thấp cho thấy tín hiệu nhóm carbonyl δC 198.7 (C-7), bốn carbon vịng benzen liên kết với oxygen δC 163.1 (C-4'), 160.2 (C-4 ), 159.0 (C-2,6 ) Ở vùng từ 60-90 ppm, tín hiệu cho thấy diện đơn vị đường β-D-glucopyranosyl với carbon anomer δC 77.0, điều cho thấy DB7 hợp chất C-glucoside Phổ 2D-NMR, tín hiệu COSY HSQC (phụ lục 30-31) cho phép xác định proton carbon mang proton phần aglycone phần đường Phổ HMBC (phụ lục 32) cho thấy có tương tác tín hiệu proton H2’,6’ nhóm carbonyl (C-7); H-2', 6' C-3',5'; tương quan proton anomer với carbon tứ cấp vị trí δC 105.4 (C-3), δC 159.0 (C-2), δC 160.3 (C-4), tín hiệu tương tác giúp xác định liên kết phân tử có hai nhóm đường glucoside đối xứng liên kết với vịng benzen thứ hai carbon C-3, C-5 Từ liệu cho thấy hợp chất DB7 hợp chất có khung sườn iriflophenone liên kết với hai đường vị trí 3,5 vịng benzen So sánh số liệu phổ 13 C-NMR với hợp chất iriflophenon 3,5-C,C-β38 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN diglucopyranoside trình bày bảng cho thấy có tương hợp[13] , đề nghị cấu trúc hợp chất DB7 iriflophenon 3,5-C,C-β-diglucopyranoside OH HO 4''' 3''' 6''' 2''' 5''' OH HO O HO 1''' OH OH 6'' 4'' OH 4' O 5'' 1'' HO HO 5' 6' 2" 3'' OH OH 1' 3' 2' O DB7 ( Iriflophenon 3,5-C,C-β-diglucoside) Bảng 3.8 Số liệu phổ 1H (500 MHz ) 13C-NMR (125 MHz ) DB7 methanol-d4 so với iriflophenon 3,5-C,C-β-diglucopyranoside Carbon Iriflophenon 3,5-C-βdiglucopyranoside DB7 δH δC δC - 132.9 132.7 2, - 159.0 158.9 3, - 105.4 105.3 - 160.2 160.1 3', 5' 6.81 (2H, d, J = 8.5) 115.7 115.6 - 198.7 198.6 1' - 108.6 108.7 2', 6' 7.68 (2H, d, J = 8.5) 133.1 133.0 1'', 1''' 4.95 (2H, d, J = 10) 77.0 76.9 2'', 2''' 3.71 (2H, m ) 74.3 74.1 3'', 3''' 3.53 (2H, m ) 79.4 79.1 4'', 4''' 3.52 (2H, m ) 71.1 70.9 5'', 5''' 3.44 ( 2H, m ) 82.7 82.5 62.1 61.9 6'', 6''' 3.80 (2H, m ) 3.85 (2H, m ) 39 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.3 Hoạt tính chống oxy hóa chất lập từ dó bầu A crassna Pierre Khả chống oxy hóa chất DB1-DB7 lập từ dó bầu A crassna Pierre xác định phương pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự DPPH Kết thu trình bày bảng 3.9 Bảng 3.9 Kết hoạt tính ức chế gốc tự DPPH chất DB1-DB7  ỨC CHẾ STT MẪU DB5 IC50 µM 50 µM 25 µM 12.5 µM µM 99.53 94.80 87.94 48.94 100 µM 50 µM 25 µM 10 µM 5.14 DB1 7.24 6.15 5.58 2.51 >100 DB2 19.85 18.91 16.31 16.07 >100 DB3 16.23 14.58 10.16 4.84 >100 DB4 38.18 22.69 16.31 10.95 >100 DB6 4.43 4.21 3.35 2.50 >100 DB7 41.60 35.78 34.99 30.26 >100 Nhận xét Kết thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự DPPH bảy hợp chất lập từ dó bầu A crassna cho thấy hợp chất DB5 ( mangiferin ) có hoạt tính mạnh với IC50 5.14 µM so với chất đối chứng dương quercetin IC50 6.52 µM 40 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.4 Hàm lượng chất dó bầu Aquilaria crassna Hàm lượng hợp chất lập từ dó bầu DB1-DB7 xác định phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC-UV Kết phân tích trình bày bảng 3.10 Bảng 3.10 Hàm lượng chất DB1-DB7 dó bầu Aquilaria crassna Hàm lượng ( mg/g) MẪU Lá dó bầu khơ DB1 DB2 DB3 DB4 DB5 DB6 DB7 0.09 5.49 4.34 2.56 17.16 0.04 5.74 Nhận xét Kết hàm lượng hợp chất dó bầu cho thấy hàm lượng DB5 (mangiferin) dó bầu cao lên đến 17.16 mg/g (tương đương 1.7% khô) chứng minh hợp chất Điều hứa hẹn khả sử dụng dó bầu nguồn nguyên liệu chiết xuất mangiferin cung cấp cho ngành công nghiệp dược nước 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Trong đề tài này, bước đầu khảo sát thành phần hóa học dó bầu Aquilaria crassna Pierre thu hái Lộc Ninh – Bình Phước, từ cao ethyl acetate cao butanol cô lập bảy hợp chất DB1-DB7 Bằng phương pháp phổ nghiệm đại 1D-NMR, 2D-NMR, khối phổ phân giải cao HR-MS… cấu trúc bảy hợp chất xác định DB1 methyl 4-hydroxybenzoate, DB2 7-Omethylapigenin, DB3 7,4'-O-dimethylapigenin, DB4 7-O-methylapigenin 5-O-[β – D-xylopyranosyl-(1→6)- β-D-glucopyranoside], DB5 mangiferin, DB6 (6R,9S)roseoside, DB7 iriflophenon 3,5-C,C-β-diglucoside Trong đó, DB6 hợp chất lần tìm thấy thuộc chi Aquilaria Kết thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa phương pháp ức chế gốc tự DPPH cao chiết chất lập từ dó bầu cho thấy cao ethyl acetate cao butanol có hoạt tính mạnh với IC50 7.96 µg mL-1 10.24 µg mL-1 Trong chất tinh khiết, DB5 (mangiferin ) cho thấy hoạt tính chống oxy hóa mạnh (IC50 5.14 µM ) tương đương với chất chứng dương quercetin (IC50 6.52 µM) Ngồi ra, cao nước cao ethanol chiết trực tiếp từ dó bầu thể khả chống oxy hóa tương với IC50 42.29 µg mL-1 36.31 µg mL-1 điều cho thấy khả ứng dụng thực phẩm sản phẩm chức giúp chống oxy hóa Kết hàm lượng hợp chất dó bầu cho thấy hàm lượng DB5 ( mangiferin ) dó bầu cao lên đến 17.16 mg/g (1.7% khô), hoạt chất có giá trị thử nghiệm hoạt tính phịng thí nghiệm lâm sàng với khả tiêu diệt trực tiếp virus Herpes simplex ,virus Sitommegalo, kích thích sản sinh inteferon giúp thể tăng khả chống lại bệnh có nguồn gốc virus[14] Điều hứa hẹn khả sử dụng dó bầu nguồn nguyên liệu chiết xuất mangiferin cung cấp cho ngành công nghiệp dược nước 42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Bảng 4.1 Kết nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính chống oxi hóa dó bầu Aquilaria crassna Pierre Mẫu Cao Cao Cao ethyl Cao Cao Cao Cao methanol hexane acetate butanol nước A ethanol nước B 24.21 >100 7.96 10.24 79.99 36.31 42.29 Hoạt tính ức chế gốc tự DPPH IC50  Cao nước A : cao nước cịn lại sau trích với dung môi  Cao nước B : cao nước thu đun trực tiếp khô với nước Hoạt tính ức chế gốc tự Hàm lượng dó bầu DPPH IC50 (mg/g ) DB1 >100 0.09 DB2 >100 5.49 DB3 >100 4.34 DB4 >100 2.56 5.14 17.16 DB6 >100 0.04 DB7 >100 5.74 Hợp chất Cấu trúc HO DB5 HO HO HO O OH O OH OH OH O 43 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ BẢNG ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Tên sản phẩm Thành phần hóa học hàm lượng hợp chất lập dó bầu Aquilaria crassna Pierre Sản phẩm khoa học Sản phẩm khoa học Đánh đăng ký thực giá - Cô lập hợp chất tinh khiết, xác định cấu trúc hợp chất thu - Hàm lượng hợp chất cô lập dó bầu - Cơ lập xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết từ dó bầu - Xác định hàm lượng  Hoàn thành hợp chất dó bầu - Kết hoạt tính chống - Kết hoạt tính chống Hoạt tính chống oxy hóa loại oxy hóa loại cao oxy hóa cao chiết (đặc biệt cao chiết(trong có cao cao chiết chiết nước cao chiết nước cao ethanol) hợp chất tinh khiết ethanol) hợp chất hợp chất tinh khiết cô cô lập tinh khiết cô lập từ lập từ dó dó bầu bầu  Hoàn thành - Một báo cáo hội nghị khoa học trường đại học Khoa học tự nhiên Bài báo báo cáo hội nghị - Một báo báo cáo lần năm 2010 khoa học hội nghị - Một báo gửi chuyên ngành đăng tạp chí Phát triển Khoa học Cơng Nghệ - NXB ĐH Quốc Gia 44  Hoàn thành KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ĐỀ NGHỊ Kết nghiên cứu cho thấy, dó bầu chứa nhiều hoạt chất có hàm lượng cao hoạt tính thử nghiệm mangiferin (17.16 mg/g) có khả chống oxy hóa hạ đường huyết[6], 7-O-methylapigenin 5-O-[β –Dxylopyranosyl-(1→6)- β-D-glucopyranoside] DB4 (2.56 mg/g) có tính nhuận tràng chống táo bón[7] Điều cho thấy, dó bầu hồn tồn có khả sử dụng để chế biến trà thảo dược mang nhiều dược tính đáng q Vì thế, xin đề nghị hỗ trợ tiếp tục nghiên cứu để sản phẩm đời thời gian nhanh Với mục tiêu tạo nên sản phẩm trà thảo dược từ dó bầu, chúng tơi dự kiến thực hiện:  Xác định liều độc LD50 dó bầu để có sở khoa học bảo đảm an toàn cho người sử dụng  Nghiên cứu quy trình sản xuất trà từ dó bầu quy mơ thí nghiệm, khảo sát dạng chế phẩm phù hợp trà túi lọc, trà hòa tan … cho giữ hương vị đặc trưng dó bầu  Tiếp tục khảo sát thành phần hóa học dó bầu để góp phần mở rộng thêm hiểu biết loài quý Việt Nam hỗ trợ việc phát triển sản phẩm từ dó bầu Những lợi ích nghiên cứu mang lại Kết nghiên cứu hướng đến mục tiêu tạo nguồn thu mới, nhanh ổn định cho người dân trồng dó bầu, đóng góp sản phẩm vào thị trường có nhu cầu sử dụng chế phẩm có nguồn gốc tự nhiên Về mặt đào tạo, nghiên cứu tiến hành liên kết cán trẻ nhiều đơn vị khác Viện hóa học, Đại học Bách Khoa, Đại học Y dược, môn Hóa phân tích – đại học Khoa học tự nhiên, phịng thí nghiệm Tế bào gốc – đại học Khoa học tự nhiên, điều góp phần nâng cao lực nhóm nghiên cứu trẻ mở rộng hiểu biết chuyên ngành khác với 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Trần Thị Hồng Châu (2009), Nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa số hợp chất thuộc họ Lignan Stilbene, Khóa luận tốt nghiệp- mơn Hóa Phân Tích, Trường đại học Khoa học tự nhiên, TP Hồ Chí Minh [2] Võ Văn Chi (1999), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học, TP Hồ Chí Minh [3] Đỗ Tất Lợi (1995), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [4] Lã Đình Mỡi (2001), Tài nguyên thực vật tinh dầu Việt Nam – Tập 1, NXB Nông nghiệp, Hà Nội [5] Nguyễn Thị Thùy Trang (2007), Khảo sát thành phần hóa học thân dó bầu Aquilaria crassna Pierre., Luận văn Thạc sĩ khoa Hóa học, Trường đại học Khoa học tự nhiên, TP Hồ Chí Minh [6] N.T.H.Giang, Đ.V.Phan, P.H.Điển (2004), Nghiên cứu tác dụng hạ glucose máu mangiferin chiết xuất từ tri mẫu (Anemarhena asphodeloides Bunge) chuột nhắt bình thường chuột gây đái tháo đường Streptozotocin, Tạp chí Nghiên cứu Y học, 31(5), 10-15 TIẾNG ANH [7] H Hara, Y Ise, N Morimoto, M Shimazawa, K Ichihashi, M Ohyama, M Iinuma (2008 ), Laxative Effect of Agarwood Leaves and Its Mechanism, Biosci Biotechnol Biochem., 72 (2), 335–345 [8] M Ishihara, T Tsuneya, K Uneyama (1991 ), Three sesquiterpenes from agarwood, Phytochemistry, 30 (2 ), 563-566 [9] M Ishihara, T Tsuneya, K Uneyama (1991 ), Quaiane sesquiterpenes from agarwood, Phytochemistry, 30(10 ), 3343-3347 [10] M Ishihara, T Tsuneya, K Uneyama (1993 ), Fragnant sesquiterpenes from agarwood, Phytochemistry, 33(5 ), 1147-1155 [11] K Iwagoe, T Konishi, S Kiyosama, Y Shimada, K Miyahara, T Kawasaki (1988 ), Studies on the Agalwood ( Jinko ) Structures of phenylethyl chromone Derivaties AH7, AH8 and AH9, Chem Pharm Bull., 36(7), 2417-2422 [12] K Iwagoe, T Kakae, T Konishi, S Kiyosawa, Y Fujiwara, Y Shimada, 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO K Miyahara and T Kawasaki (1989 ), Studies on the agalwood ( Jinko) Structures of Bi-Phenylethylchromone Derivaties, Chem Pharm Bull., 37(1), 124-128 [13] Qi Jin, Lu Jing-Jing, Liu Ji-Hua, Yu Bo-Yang (2009 ), Flavonoid and a rare benzophenone glycoside from the leaves of Aquilaria sinensis., Chem Pharm Bull., 57 (2 ), 134-137 [14] C Y Kim, M J Ahn, J Kim (2006 ), Preparative Isolation of Mangiferin from Anemarrhena asphodeloides Rhizomes by Centrifugal Partition Chromatography, J Liq Chrom Rel Technol., 29, 869-875 [15] T Konishi, K Iwagoe, K Kiyosawa, Y Fujiwara (1989 ), Tri-2-(2phenylethyl)chromones from agalwood, Phytochemistry, 28 (12 ), 3548-3550 [16] T Konishi, S Kiyosama, Y Shimada, K Miyahara, T Kawasaki (1989 ), The structure of AH16, new tetrahydroxy-2-(2-phenylethyl) chromone from agarwood, Chem Pharm Bull., 37(5), 1428-1430 [17] T Konishi, K Iwagoe, A Sugimoto, S Kiyosama, Y Fujiwara, Y Shimada (1991 ), Studies on Agalwood ( Jinko) Structures of 2-(2-phenylethyl) chromone Derivatives, Chem Pharm Bull., 39(1), 207-209 [18] T Konishi, A Sugimoto, S Kiyosawa, Y Fujiwara (1992 ), Studies on the agalwood “ Jinko”, Chem Pharm Bull., 40(3), 778-779 [19] T Konishi, T Konoshima, Y Shimada, S Kiyosawa (2002 ), Six New 2(2-phenylethyl) chromones from Agarwood, Chem Pharm Bull 50(3), 419—422 [20] Y Lu, Y F L (2001 ), Antioxydant activities of polyphenols from sage (Salvia officinalis ), Food Chem., 75(2 ), 197-202 [21] P.B Miniyar, T.S Chitre, H.J Deuskar, S.S Karve, K.S Jain (2008 ), Antioxidant activity of ethyl acetate extract of Aquilaria agallocha on nitriteinduced methaemoglobin formation., Int J Green Pharm, 2, 116-117 [22] Regula Naf, A Velluz, N Busset, J Gaudin (1992 ), New Norsesquiterpenoids with 10-epi-Eudesmane skeleton from Agarwood ( Aquilaria agallocha Roxb.), Flavour and fragrance journal,7, 295-298 [23] Regula Naf, A Velluz, W Thommen, R Brauchli, C Sigwart, J Gaudin (1993 ), New compounds identified in agarwood ( Aquilaria agallocha Roxb.), Flavour and fragrance journal,8 , 307-319 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO [24] T Nakanishi, E Yamagata, K Yoneda, I Miura (1981 ), Jinkohol – a prezizane sesquiterpene alcohol from agarwood, Phytochemistry, 20 (7 ), 15971599 [25] T Nakanishi, E Yamagata, K Yoneda, T Nagashima, I Kawasaki, T Yoshida, H Mori, I Miura (1984 ), Three fragrant sesquiterpenes of agarwood, Phytochemistry, 23(9), 2066-2067 [26] S M Pan, H Y Ding, W L Chang, H C Lin (2006 ), Phenols from the Aerial Parts of Leonurus sibiricus, Chin Pharm J., 58, pp 35-40 [27] B F Rasulev, N D Abdullaev, V N Syrov, J Leszczynski (2005 ), A Quantitative structure-Activity Relationship (QSAR ) Study of the antioxidant activity of flavonoids, QSAR & Combinatorial Science, 24, 1056-1065 [28] Y Shimada, T Tominaga, T Konishi, S Kiyosawa (1982 ), Studies on the Agalwood ( Jinko ) Structures of 2-(2-phenylethyl) chromone Derivaties, Chem Pharm Bull 30(10), 3791-3795 [29] Y Shimada, T Konishi, S Kiyosawa, M Nishi, K Miyahara, T Kawasaki (1986 ), Studies on the Agalwood ( Jinko) Structures of 2-(2Phenylethyl)chromone Derivatives, Agarotetrol and Isoagalrotetrol, Chem Pharm Bull 34(7), 2766-2773 [30] Y Shimada, T Konishi, S Kiyosawa (1986 ), Studies on the Agalwood ( Jinko ) Structures of three 2-(2-phenylethyl)-5,6,7,8-tetrahydrochromone Derivaties AH1a,AH2a and AH2b, Chem Pharm Bull 34(7), 3033-3037 [31] J Ueda, L Imamura, Y Tezuka, Quan L Tran, M Tsuda, S Kadota (2006 ), New sesquiterpene fromVietnamese agarwood and its induction effect on brain-derived neurotrophic factor mRNA expression invitro, Bioorg.Med.Chem., (14), 3571–3574 [32] A Yajima, Y Oono, R Nakagawa, T Nukada, G Yabuta (2009 ), A simple synthesis of four stereo isomers of roseoside and their inhibitory Activity on leukotriene release from mice bone marrow-derived Cultured mast cells, Bioorg.Med.Chem.,17 , 189–194 [33] A Zahir, A Jossang, B Bodo, J Provost, J P Cosson, T Sévenet (1996 ), DNA Topoisomerase I Inhibitors: Cytotoxic Flavones from Lethedon tannaensis, J Nat Prod., 59, 701-703 48