Nghiên cứu quy trình điều chế cao chứa alcaloid và flavonoid có tác dụng sinh học chống oxy hóa kháng acetylcholinesterase in vitro chống suy giảm trí nhớ từ lá cây trinh nữ hoàng cung

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM (ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HCM) SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ (TTKH CN DƯỢC SÀI GÒN) BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH ĐIỀU CHẾ CAO CHỨA ALCALOID VÀ FLAVONOID CĨ TÁC DỤNG SINH HỌC – CHỐNG OXY HÓA, KHÁNG ACETYLCHOLINESTERASE (IN VITRO), CHỐNG SUY GIẢM TRÍ NHỚ TỪ LÁ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (CRINUM LATIFOLIUM L AMARYLLIDACEAE) (PGS TS Võ thị Bạch Huệ Th.S Nguyễn Hữu Lạc Thủy) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 04/ 2015 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH ĐIỀU CHẾ CAO CHỨA ALCALOID VÀ FLAVONOID CÓ TÁC DỤNG SINH HỌC – CHỐNG OXY HĨA, KHÁNG ACETYLCHOLINESTERASE (IN VITRO), CHỐNG SUY GIẢM TRÍ NHỚ TỪ LÁ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (CRINUM LATIFOLIUM L AMARYLLIDACEAE) CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI PGS TS Võ thị Bạch Huệ Th.S Nguyễn Hữu Lạc Thủy CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 04/ 2015 TÓM TẮT Đề tài thực với mục tiêu: - Tiêu chuẩn hóa quy trình điều chế cao chứa alcaloid flavonoid tồn phần (bằng phương pháp chiết siêu tới hạn phương pháp ngấm kiệt) -Tối ưu hóa điều kiện áp suất, nhiệt độ thời gian để chiết cao flavonoid alcaloid từ Trinh nữ hoàng cung (TNHC) phương pháp chiết siêu tới hạn chiết ngấm kiệt - Chiết cao flavonoid toàn phần cao alcaloid toàn phần từ TNHC từ cao toàn phần - Tách phân đoạn flavonoid phân đoạn alcaloid từ cao flavonoid cao alcaloid toàn phần - Phân lập xác định cấu trúc số hợp chất tinh khiết flavonoid alcaloid từ TNHC - Thử nghiệm tác dụng sinh học -Thử tác dụng chống oxy hóa in vitro cao flavonoid hợp chất flavonoid tinh khiết - Thử tác dụng kháng AChE in vitro cao alcaloid hợp chất alcaloid tinh khiết - Thử nghiệm tác dụng chống suy giảm trí nhớ chuột từ cao phân đoạn alcaloid Đề tài đạt số kết sau: Trong lĩnh vực chiết xuất : xây dựng hai quy trình chiết xuất cao alkaloid toàn phần flavonoid toàn phần từ Crinum latifolium làm nguyên liệu cho sản xuất dược phẩm, thực phẩm chức - - hydroxycrinamidin , crinamidin , astragalin isoquercitrin phân lập từ cao alkaloid tồn phần Trong lĩnh vực hóa học: sắc ký cột chân không sắc ký cột cổ điển với chất hấp phụ thích hợp sử dụng Từ kỹ thuật này: - 16 hợp chất phân lập từ TNHC , alkaloid phân lập từ thiên nhiên - Thiết lập chất đối chiếu : alkaloids (crinamidin - hydroxycrinamidin ) flavonoid (astragalin isoquercitrin) Lần đầu tiên, bốn chất tham khảo hóa học thiết lập theo hướng dẫn WHO việc thành lập, phân phối lưu giữ Trong lĩnh vực sinh học Cao toàn phần alkaloid sử dung để thử nghiệm chất ức chế AChE động vật TMT sử dụng chất tham khảo galanthamin chứng dương sử dụng Các phân đoạn alkaloid chiết xuất từ TNHC cho thấy khả bảo vệ tế bào thần kinh , chống suy giảm trí nhớ thể điều kiện thí nghiệm in vivo Summary This subject was realized with the following objectives: - Standardize the procedures for preparating the total alkaloids and flavonoids (by supercritical fluid extraction method and percolation method) - Optimize the conditions of pressure, temperature and time for obtaining the flavonoid and alkaloid extract from the leaves of Crinum latifolium using supercritical extraction methods and extraction leach out - Extract the total flavonoid and total alkaloid extract from Crinum latifolium leaves - Separate the flavonoid and alkaloid fractions from total flavonoid and total alkaloid extracts - Isolate and determine the chemical structures of flavonoid and alkaloid pure compounds which were separated from Crinum latifolium leaves - Study the biological effects Study the (in vitro) antioxidant effects of flavonoid extract and pure flavonoid substances - Study the (in vitro) acetylcholinesterase inhibitory activities of alkaloid extract and pure alkaloid substances antibacterial effect of high alkaloids and alkaloid compounds purified - Study the effects of dementia in mice from fractions of total alcaloid extract This subject has some results as follows: In the process of extraction: two total alkaloid or total flavonoids extraction processes from Crinum latifolium leaveswere extracted determined as raw materials for production of pharmaceuticals or functional foods - hydroxycrinamidine, crinamidine, astragalin and isoquercitrin were isolated from these total extracts In the field of chemistry: Column chromatography vacuum and classical column chromatography with suitable adsorbent were used: - 16 compounds were isolated from Crinum latifolium leaves, alkaloid first was isolated from nature - Establish Chemical Reference Substances: alkaloids (crinamidin and - hydroxycrinamidin) and two flavonoids (astragalin and isoquercitrin) For the first time, four chemical reference substances have been established in accordance with the WHO guidelines on establishment, distribution and storage of chemical reference substances In the field of biology Total alkaloid extract was tested as AChE inhibition in animals TMT was used as Reference Substances and positive control galanthamin was used Alkaloid fractions were extracted from Crinum latifolium leaves are shown the ability to protect nerve cells, against memory impairment in vivo in experimental conditions MỤC LỤC CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan thực vật học 1.2 Tổng quan hóa học 1.3 Tổng quan tác dụng sinh học chi Crinum TNHC 11 1.4 Chiết cao toàn phần từ dược liệu phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn (SFE) 17 1.5 Các phương pháp sắc ký ứng dụng phân tích hóa học TNHC 18 CHƯƠNG NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20 2.1 Tên nội dung 1: Khảo sát điều kiện để chiết cao toàn phần từ TNHC 20 2.2 Tên nội dung 2: Xây dựng quy trình chiết cao flavonoid cao alcaloid từ TNHC 23 2.3 Tên nội dung 3: Tách phân đoạn flavonoid phân đoạn alcaloid 25 2.4 Tên nội dung 4: Phân lập xác định cấu trúc flavonoid alcaloid .25 2.5 Tên nội dung 5: Thử tác dụng chống oxy hóa in vitro 28 2.6 Tên nội dung 6: Thử tác dụng kháng AChE in vitro 28 2.7 Tên nội dung 7: Thử nghiệm tác dụng chống suy giảm trí nhớ chống thối hóa tế bào thần kinh in vivo mẫu cao alcaloid .29 2.8 Tên nội dung 8: Xây dựng chất đối chiếu alcaloid flavonoid từ cao chiết TNHC 32 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Nội dung 1: Tối ưu hóa điều kiện để chiết cao tồn phần 35 3.2 Nội dung 2: Quy trình cơng nghệ chiết cao flavonoid cao alcaloid từ TNHC 43 3.3 Nội dung 3: Tách phân đoạn flavonoid phân đoạn alcaloid 47 3.4 Nội dung 4: Phân lập xác định cấu trúc flavonoid alcaloid 48 3.5 Nội dung 5: Kết thử tác dụng chống oxy hóa in vitro 60 3.6 Nội dung 6: Kết thử nghiệm khả kháng AChE in vitro .61 3.7 Nội dung 7: Thử nghiệm tác dụng chống suy giảm trí nhớ chống thối hóa tế bào thần kinh in vivo mẫu cao alcaloid TNHC 63 3.8 Nội dung 8: Xây dựng chất đối chiếu alcaloid, flavonoid từ TNHC 73 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .93 CHƯƠNG Tài liệu tham khảo i CHƯƠNG Phụ lục xii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AA% Antioxidant activity (% khả chống oxi hóa) ACh Acetylcholin AChE Acetylcholinesterase AChEI Acetylcholinesterase inhibitor (Hoạt tính kháng AChE) ATCI Acetylthiocholin d doublet - đỉnh đôi DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV DTNB Dithionitrobenzen DPPH 2,2-diphenyl-1-picryhydrazyl FC Flash chromatography (Sắc ký cột nhanh) IR Infra red (Hồng ngoại) MS Mass Spectrometry (Khối phổ) NMR Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) PDA Photo Diode Array (Đầu dò dãy diod quang) SF-CO2 Supercritical fluild carbon dioxide (CO2 lỏng siêu tới hạn) SFE Supercritical Fluid Extraction (Chiết lỏng siêu tới hạn) SKLM Sắc ký lớp mỏng TNHC Trinh nữ hoàng cung TMT Trimethyltin chloride TT Thuốc thử UV-Vis Ultraviolet-Visible (Tử ngoại khả kiến) VLC Vacuum Liquid Chromatography (Sắc ký cột chân khơng) DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1: Hình vẽ TNHC phận: Cây với thân hành lá; Cụm hoa; Một phần bao hoa nhị; Bộ nhụy [6] Hình 2.1 Màn hình khởi động JMP 22 Hình 2.2 Màn hình DOE với biến số 22 Hình 2.3 Các thiết kế JMP .22 Hình 2.5 Nhập hàm lượng 6-hydroxycrinamidin, crinamidin 6-hydroxybuphanidrin TN vào ma trận 23 Hình 2.6 Các bước xử lý phần mềm JMP .23 Hình 3.1 Sắc ký đồ kiểm tra thành phần cao A-SFE từ dịch chiết SFE TNHC .35 Hình 3.2 SKĐ CĐC 6-hydroxy crinamidin, crinamidin 6-hydroxy buphanidrin 36 Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu thử A-SFE 36 Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu thử A-SFE thêm chất đối chiếu 36 Hình 3.5: Mơ hình thể tính tương thích yếu tố khảo sát lên hàm lượng alcaloid 40 Hình 3.6 Bảng thể tác động yếu tố đến hàm lượng 6-hydroxycrinamidin 40 Hình 3.7 Bảng thể tác động yếu tố đến hàm lượng crinamidin 40 Hình 3.8 Bảng thể tác động yếu tố đến hàm lượng 6-hydroxybuphanidrin 41 Hình 3.9 Mơ hình bề mặt đáp ứng hàm lượng 6-hydroxycrinamidin (T, áp suất thời gian) 41 Hình 3.10 Mơ hình bề mặt đáp ứng hàm lượng crinamidin (nhiệt độ, áp suất thời gian) 41 Hình 3.11 Mơ hình bề mặt đáp ứng 6-hydroxybuphanidrin (nhiệt độ, áp suất thời gian) 41 Hình 3.12 Sự tương tác yếu tố đến hàm lượng 6-hydroxycrinamidin .42 Hình 3.13 Sự tương tác yếu tố đến hàm lượng crinamidin 42 Hình 3.14 Sự tương tác yếu tố hàm lượng 6-hydroxybuphanidrin 42 Hình 3.15 Tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng 6-hydroxycrinamidin 42 Hình 3.16 Tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng crinamidin 42 Hình 3.17 Tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng 6-hydroxybuphanidrin 42 Hình 3.18: Sự thay đổi thời gian tìm thấy bệ đỡ (giây) TN ẩn bệ đỡ nhóm chứng nhóm TMT có điều trị dự phòng với Gal TNHC(1); (2).***p