Phân lập và khảo sát hoạt tính sinh học của nấm cộng sinh Địa y graphis handelii

Các chất chuyển hoá thứ cấp của địa y đa số là do mycobiont sản xuất, chúng cổ nhiều hoạt tính sinh học đã được nghiền cứu như cấp trong quá trình sống, địa y là nguồn được liệu tiềm nă

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHO HO CHi MINH

SUYEN THI HONG TRINH

PHAN LAP VA KHAO SAT HOAT TINH SINH HQC CUA

NAM CONG SINH DIA Y Graphis handelii

KHOA LUAN TOT NGHIEP NGANH SU’ PHAM SINH HOC

THANH PHO HO CHi MINH - 2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

SUYEN THI HONG TRINH

PHAN LAP VA KHAO SAT HOAT TINH SINH HQC CUA

NAM CONG SINH DIA Y Graphis handelii

KHOA LUAN TOT NGHIEP NGANH SU’ PHAM SINH HOC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HOC

TS Trần Thị Minh Định

THÀNH PHÓ HỖ CHÍ MINH - 2024

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô TS Trằn Thị Minh Định - người đã tận

tinh giúp đỡ, hướng dẫn em trong suốt quá trinh học tập, nghiên cứu và hoàn thiện Khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn Trường, Phòng Đào tạo, các thầy cô trong Khoa Sinh học - Trường Đại học Sư phạm Thành ph Hỗ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận

lợi cho em thực hiện khóa luận này

Bên cạnh đó, em cũng xin chân thành cảm ơn các thÌy cô ở phòng Hóa học

phân tích ~ Khoa Hóa học — Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh, các

thầy cô ở Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học Trường Đại học Khoa học hự thực hiện khỏa luận tốt nghiệp,

Qua đây, em cũng xin bảy tỏ lòng cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè

2 Mục tiêu nghiên cứu

3 Đối tượng nghiên cứu

4, Nhiệm vụ nghiên cứu

1.2 Các phương pháp phân lập nắm cộng sinh dia y

1.3 Ảnh hưởng của quá trình oxy hỏa đến con người 1.4, Ảnh hưởng của bệnh đái tháo đường

1.5 Vikhuin Staphylococeus aureus

1.5.1, Phin logi sinh học và lch sử phát hiện

1.5.2 Mỗi trường sống và đặc điểm chung;

1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu

2.2 Vat ligu nghiên cứu

2.8 Thiết bị và hoá chất

2.4.1, Thiết bị

2.3.2, Ho’ chit

2.4, Phuong pháp nghiên cứu,

2.4.1 Phương pháp phân lập nấm cộng sinh địa y

2.4.2 Phương pháp nuôi nắm cộng sinh địa y

2.4.3, Phương pháp tạo cao thô ethyl acetate và methanol

2.4.4, Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học

CHƯƠNG 3: KẾT QUÁ NGHIÊN CỬU 3,1 Kết quả phân lập và nuôi nắm G handel 3.2 Tạo cao ethyl aeetate và methanol từ sinh khối nắm 3.3 Khio sit hoat tinh sinh hoe

3.3.1 Hoạt tính kháng oxy hos

ai thio đường thai kì Reactive Oxygen Species Dimethyl sulfoxide

ĐANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái địa y G- handelii 6

Hình L.2 Dia y G acharii ¢6 mau tring xám (trai) va G, caribica 0 mau xanh 6 liu

Hình 3.3 Khuân lạc nắm sau 4 tuần môi cấy rên môi tường MY10 21 Hình 3⁄4 Khuẩn lạc nắm sau 6 tuần môi cấy trên môi trường MỸ 10 21

Hình 3.5, Khuẩn lạc nắm sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MY 10 2

Hình 3.6 Khuẩn lạc nắm sau 10 tuần nuôi cấy trên môi trường MY10 2 Hình 37 KẾt quả khảo sit khả năng bất gốc tự do DPPH của các cao chiết

Hình 3.8 Đồ thị tương quan giữa tỉ lệ bẫy gốc DPPH và logo nồng độ của

Hinh 3.9 Để thị tương quan giữa tỉ lệ bẫy gốc DPPH và logio nồng độ

Hình 310 ĐỒ thị tương quan giữa tỉ lệ bẩy gốc DPPH và logo nồng độ

Hinh 3.11 Két qui khảo sát hoạt tính khing Staphylococcus aureus cia cée

cao chiết 6 ndng 46 10 mg/mL 31

Bang 1.2 Phan logi Staphylococcus aureus 10

Bảng 22 Thành phân mỗi trường MỸ 10 để phân lập và nuôi cấy nắm "6 Bảng 3.1 Khối lượng sinh khối nắm khô và cao chết từng loại 2 Bảng 3.2 Tỉ lệ bẩy gốc DPPII của các nghiệm thức cao chiết ở nồng độ 200 g/ml

25 Bảng 3.3, Tỉ lệ bẫy gốc DPPH của vitamin C ở các nồng độ khác nhau 2s

Bang 3.4 Ti lệ bẩy gốc DPPH của cao ethyl acetate từ sinh khối nấm 8 tuân nuôi

enzyme œ - glueosidase của cao ethyl acetate và methanol

của nấm ở các tuần nuôi 32

liên quan đến nguyên nhân gây ung thư, chứng xơ vữa động mạch, viêm mãn tính vì

chúng có thể phản ứng làm thay đổi cấu trúc base purine và pirymidine [2] Các gốc

oxy hoá tự do có th liên quan đến hơn 100 căn bệnh ở người như Alzheimer, gout, 4-methoxyphenol (BHA) vi 2, 6

thấy tác dụng phụ như gây đột biển cầu trúc DNA [4]

i-ert-butyl-4-methoxyphenol (BHT) cũng cho

'Cùng với đó, tình trạng kháng kháng sinh đang là một thách thức đổi với con

người, đặc biệt là sự xuất hiện các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc [5] Dù đã có

những bước phát triển trong liệu pháp kháng sinh nhưng các bệnh nhiễm trùng vẫn

là nguyên nhân gây bệnh và ừ vong hàng đầu Việ sử dụng các loại thuốc tổng hợp lâu ngày sẽ dẫn đến các tác dụng phụ không mong muốn Vì thể để giải quyết vấn

trong máu cao hơn bình thường Theo nghiên cứu của Li và cộng sự vào năm 2005,

ước tính đến 2025, số người mắc bệnh tiễu đường trên toàn cầu là 300 triệu người hip tha glucose bằng

hop chat có hoạt tính sinh học [10] Các chất chuyển hoá thứ cấp của địa y đa số là

do mycobiont sản xuất, chúng cổ nhiều hoạt tính sinh học đã được nghiền cứu như

cấp trong quá trình sống, địa y là nguồn được liệu tiềm năng để chúng ta tiếp tục

khai thác và nghiên cứu

Cho đến hiện nay, nắm cộng sinh véi dia y Graphis handel vẫn chưa được nghiên cứu nhiều về các hoạt tính sinh học của chúng Chính vì vậy, đ ti: "Phân thực hiện

3 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài thực hiện nhằm phân lập và khảo sắt một số hoạt tính sinh học của nắm

công sinh địa y G handelii

3 Đối tượng nghiên cứu

Nắm cộng sinh địa y G handelii được phân lập từ mẫu địa y được thu từ Thị

xã Kiến Tường Tình Long An (I0/766858, 105,940441) vio thing 05 năm 2023,

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

~ Phân lập nắm cộng sinh dia y G handelii

~ Khảo sắt ảnh hưởng của thời gian mui cấy đến hot tỉnh kháng khuẩn, kháng oxy hoá, ức chế cnzyme œ « glueosidase

~ Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiét (methanol va ethyl acetate) dén hoạt

tính kháng khuẩn, kháng oxy hoá, ức chế enzyme ứ - glucosidase

5, Phạm vi nghiên cứu

"Để tải phân lập và Khảo sắt hoạt tinh kháng oxy hoá bằng phương pháp bẫy gốc DPPH, hoạt tính kháng khuẫn đổi với 3iqplylococcus aureus, dre ché enzyme

20 g, sucrose 100 g, nước cất 1 L) Để tải sử dụng hai loại dung môi để chiết cao là

‘methanol vi ethyl acetate

(photobiont) Mycobiont nhận nguồn carbon từ quá trình quang hợp của photobiont

và nỗ cung cấp lại nước, chất định dưỡng cho photobiont 6 da số các loài diay myeobiont chiếm phần lớn trong cầu tạo và photobioat nằm ở lớp vỏ trên và dưới

của địa y Myeobiont có thể sống cộng sinh với một photobiont nhất định hoặc đôi

Khi có thể hợp tác với một số phytobiont khác nhau, làm địa y có hình thi rất đa còn li đa số công sinh với một loài ảo (chiếm khoảng 85%) hoặc một loài vi khuẩn kiện khắc nghiệt như gi rét, khô hạn Tên khoa học của nắm cộng sinh với địa y

cỏ khoảng 19.400 loài thuộc 115 chỉ, trong đồ hơn 98% thuộc ngành Ascomsta, cin lại thuộc ngành Basidiomycota [19], [20] Dựa vào hình thái, địa y được chía thành

3 dạng: hình cảnh, bình lä với nhiều thuỷ, bình vày và phần lớn các loài đa y có dạng hình váy (hay côn goi là địa y dạng khám) [21]

Nhờ cách sống cộng sinh, địa y sản xuất ra các sản phẩm thứ cắp và các hợp chất có hoạt tỉnh sinh học [22] Nghiên cứu các hợp chất do đa y sinh ra sẽ cho chất chuyển hoá thứ cắp của đa y lần đều được phát hiện bởi Burkholder va cng

sự vào năm 1944, Kế từ đó, ắt nhiều nghiên cứu được tiến hành để khảo sắt hoạt 50% loài địa y có khả năng kháng khuẩn [23] Photebiont trong địa y có thể là ảo chlorobionts la rbitol, erthrtol va sorbitol trong khi đó, eyancbiont sản xuất ra dưới dạng mannitl [17] Myeobiont sinh sản bằng bảo tử, sau đồ chúng liên kết với

lớn các chất chuyển hố thứ cắp trong địa y cĩ nguồn gốc từ mycobiont Con đường,

chuyển hố polyketide sinh ra hầu hết các chất chuyển hố thứ cấp của dia y amthrequinone), một số chất cịn lại tạo ra bằng con đường shidmat (‘erphenylquinone, pulvinie acid) va mevalonate (diterpene, triterpene, steroid) (25]

Các chất chuyển hố thứ cắp của địa y được nghiên cứu cho thấy chúng cĩ các hoạt

liệu chữa bệnh ở người, chẳng hạn như Ramalina bourgeana được dùng như một vị

thuốc lợi tiêu ở Tây Ban Nha, Pseudevernia furfuracea ding d& chữa bệnh đường

hơ hấp [50]

1.1.2 Bia y thuộc chỉ Graphis

“Theo Robert Lucking và cộng sự (2009), chỉ Gruplis cĩ tổng cộng 330 lội, là

chỉ cĩ số lồi nhiều nhất trong họ Graphidaceae Màu của địa y thuộc chỉ Graphis

hầu hết cĩ màu trắng xám do cĩ một lớp tỉnh thể calcium oxalate nim trén lop

xanh ơ liu (hinh 1.2) Một số lồi cĩ màu vàng nhạt do chứa norstietie và stictic acid

ở nơng độ cao Quả thể của địa y thay đổi phụ thuộc vào độ tuổi, nhìn chung cĩ

inh 6 bao te

hình dạng các vết nứt trên bể mặt, Các lồi thuộc chỉ Graphis di

mẫu trong suốt, kích thước dao động tir rit nho (15 ~ 25 yum), nhỏ (25 ~ 45 um), chất chiết xuất từ địa y thuộc chi Graphis duge xác định là cĩ các hoạt tính như kháng khuẩn, chống oxy hố, ức ché enzyme tyrosinase va xanthine oxidase [32], 3.134]

1.1.3 Địa ý G handelii

Địa y G handelii thuge dang địa y khám, tản địa y cĩ màu trắng Các quả thể nắm màu đen nằm rải ắc và cĩ hình đạng như các vết nứ [35]

1.2 Các phương pháp phân lập nắm cộng sinh dja y

“Có nhiễu phương pháp phân lập nắm cộng sinh địa y và các phương pháp cải biên khác nhau Tuỷ vào từng loại địa y mà chúng ta lựa chọn phương pháp phân lập nắm thích hợp,

~ Phương pháp đùng bảo tử sinh sẵn hữu tính: mẫu địa y được rửa sạch để loại

bỏ đất và các mảnh vụn còn sốt li Dũng dao mé v6 tring để cắt mẫu địa y nhỏ có

ố định trên nắp của đĩa Petri úp ngược có sẵn môi chứa quả thể, sau đó mẫu được

trường nuôi chy nắm Đĩa Peti có chứa mẫu địa y sẽ được bảo quản rong tối ở nhiệt độ 18°C + 2°, Bảo tử của nắm sẽ phóng thích và nảy mắm trên bề mặt môi trường môi cấy, cằn kiểm tra đĩa 2 ~ 3 ngày lẫn

~ Phương pháp dùng bảo từ sinh sản vô tính: rửa sạch miu dia y bing nước khử trùng (3 ~ 5 phút) để các si nắm trở nên mềm và dễ ấy su đồ dùng kim mũi nhọn vô trằng lấy khi bào từ cho vào mỗi trường nuôi cấy lỏng [39]

~ Phương pháp của Yamamoto: mẫu địa y cất nhỏ rửa hai ng nước cất

khử trùng trong vòng 1Š phút, Ể tiếp rửa 10 giây với 70% ethanol, 10 gidy voi 2%

NaOCl, 500 uL dung dịch Tween 80 pha loãng 10 lần trong 30 phút và cudi cing

nữa lại mẫu Š phút bằng nước cất vô trùng hai lần Dũng chảy và cối để rộn các aqua tim lưới nylon 500 jm và 150 ym, cling kinh hin vi soi nỗi để kiểm tr tắm

khả năng phản ứng cao Trong cơ thể, hẳu hết các gốc oxy tự do được tạo ra trong

26 lượng oxy tiêu thụ chuyển thành O;” thay vĩ bị khử thành nước, Tuy nhiền, khỉ

cơ thể trong điều kiện tăng hoặc giảm hấp thụ oxy, tăng nồng độ glucose như bệnh

tiểu đường thì tốc độ hình thành gốc Oz“ cũng tăng theo [42] Các gốc oxy hoá phản

do (H202, ROOH, Ở trạng thai bình thường, cơ thể có các cơ chế cân bằng việc

hình thành các ROS, nếu các ROS hình thành quả mức mà các cơ ch trong cơ thể không kiêm soát được sẽ gây nên tình trạng stress oxy hoá (Qui tri oxy hoá làm ảnh hướng đến sự ôn định cầu trúc DNA, gây đột biến base guanine thành 8 - øxoguanine bắt cặp với adenine thay vÌ cyfogine Ngoài ra,

sự tích luỹ base 8 - oxoguanine còn làm rồi loạn chức năng của ty thể và liên quan

n bệnh ung thư [43] Bên cạnh đồ stress oxy hoá còn được cho là liên quan đến sự:

tiến triển của bệnh Hungtinton [44] Quá trình oxy hoá do ROS có thẻ làm đứt gãy

các liên kết pepdde, bình thành các iên kết cộng hoá trị giữa protein này với protein khớp th hàm lượng protein bj oxy hoổ trong mô cao hơn so với người bình thường điều đó cho thấy quá trình oxy hoá có thể à nguyên nhân hoặc kết quả trong sự tiến

triển của bệnh [45],

Trong cơ thể có các hệ thống duy t sự cân bằng giữa các gốc tự do và chất

chong oxy hod nhw hé thing cée enzyme gim: superoxide dismutase, catalase,

elutathione peroxidase và peroxiredoxin Ngoài ra còn có các chất chống oxy hoá oxoearotenoid Bên cạnh đồ, con người côn sử đụng các chất chống oxy hóa tổng

3(2)-tert-butyl-4-hydroxyanisol (BHA); 3,5-di-tert-butyl-4-hydroxytoluen (BHT);

4-hydroxy-metyl-2,6 diter-butyiphenol (lonox-100); mono-tertbutylhyroquinone

(TBHQ), 3,3" thiodipropionic acid (TDPA); 2,4.5-trihydroxybutyrophenone

(THBP); dilaury! thiodipropionate (DLTDP); propyl gulate (PG); và orlihydroguaiarei acid (NDGA) [46],

1-4 Ảnh hưỡng của bệnh đái tháo đường

Bệnh đái tháo đường được chỉa thành 4 dạng cơ bản [17]

~ Đái tháo đường tuýp 1: đo tế bào beta tuyến tuy bị hư hỏng chức năng dẫn đến không sản xuất được insullin

chiếm hon 90% số người mắc bệnh tiểu đường ở tuổi trưởng thành [48]

- Các loại bệnh tiểu đường cụ thể khác do các nguyên nhân khác, ví dụ như khiểm khuyết di truyền ở tế bào beta tuyển tuy, khiếm khuyết di truyền trong hoạt

Một trong những cách kiểm soát lượng đường trong máu là sử dụng các chất

ức chế enzyme ơ = glueosidase giúp ngân chăn sự phân huỷ catbohydrate thành

tháo đường tuýp 2 Aearbose, voglibose va miglitol la thuốc được sử dụng hiện nay

trong điều trị bệnh tiểu đường, có tác dụng ức chế cạnh tranh với enzyme œ-

glueosidise, trong độ ncarbose được đánh giá là hiệu quả nhất [49] Bệnh đái tháo đường gây nhiễu biển chứng cho sức khoẻ con người, một số nghiên cứu cho thấy tần số đột quy ở các bệnh nhân mắc bệnh đái thảo đường cao

hơn so với bình thường do thiểu máu cục bộ và tiểu đường tuýp 2 lảm tăng đáng kế:

nguy cơ đột quy Theo nghiên cứu của Seppo Lehto và cộng sự khảo sát nguy cơ

tim mach được thực hiện trong vòng 7 năm trên 1059 bệnh nhân tiểu đường tuýp 2 (681 nam, 79 n) và B73 người không núc bệnh tu đường (638 nam, 735m,

từ 45 đến 64 ti, ởn Ên đông và miễn tây Phần Lan Kết quả cho thấy phụ nữ mắc

bệnh tiểu đường tuýp 2 có nguy cơ bị đột quy cao gấp 5 lần so với phụ nữ không

mắc bệnh tễu dường Nguy cơ đột quy ở nam giới mắc bệnh tiễu đường cao gắp

2 - 3 lần so với nam giới không mắc bệnh tiếu đường Nghiên cứu cũng phát hiện

1.5.1 Phân loại sinh học và lịch sử phát hiện

S aureus được phát hiện bởi nhà khoa học Koch vào năm 1878 Năm 1880,

Alexander Ogston ta phát hiện ra khi ông tiêm mú từ người có chứa tụ cầu vào

chuột, nd to ra áp xe, Tuy nhiên, khi mũ được đun nóng hoặc xử lý bằng phenol,

nó không tạo ra áp xe, Năm 1882, Ogston đặt tên cho sinh vật này là tụ cầu khuẩn Sau đó, vào năm 1884, Rosenbach đã phân biệt được các loài tụ cầu trên cơ sở sắc

Vi Khun thude chi Staphylococcus li mim bệnh của con người và các động vật có vú khác Chúng được chia thành hai nhóm dựa trên phản ứng dương tính hay Jodi gây bệnh mạnh nhất S aureus gây nên các bệnh nhiễm trừng ở người như mụn

nhọt, viêm phổi, áp xe, viêm tủy xương, viêm nội tâm mạc, viêm tĩnh mạch, viêm

vũ và viêm mảng não, đặc biệt ở những người bị suy nhược do bệnh mãn tính chắn mảng hồng cầu, (an mầu [52]

người khoẻ mạnh S awreus thường không gây bệnh Tuy nhiên khi có điều kiện phủ

hợp như các vết thương hở tạo điều kiện cho tụ cầu vàng xâm nhập vào các mô vì

những người mắc bệnh tiểu đường nhiễm bệnh do tụ cầu vàng nhiều hơn so với

người không mắc bệnh [54]

Staphylococcus la chi vi khuẩn Gram đương, các tễ bào hình cầu thường tập, trung lại như chủm nho, kích thước tế bio tir 0,5 ~ 1,0 wm, Vi khuẩn tụ cầu có thể phút Š awzews có thể chuyển hỏa glucose, xylose, lactose, sucrose, maltose vả

chịu được nồng độ NaCI từ

tại trên môi trường có hảm lượng muối cao và có thị

7,5 — 10% nên có thể chịu được hàm lượng muối trong mỗ hôi trên da người [54], (551

bề mặt tế bảo tụ cầu vàng có một loại protein Á giúp cản trở phản ứng mỉ

kháng thể bằng cách liên kết với kháng thể G Lớp chất nhờn cũng tạo điều kiện cho

ví Khun thuge chi Staphylococcus bim vào các bỂ mặt nhân to, chẳng hạn như

ống thông, van tim và các hớp nhân tạo Bên cạnh đó, bề mặt hẳu hết các chủng quanh vi khuẩn để không bị các tẾ bào thực bào tiêu hoá [56]

§ aureus tạo ra các loại enzyme như: coagulase, hyaluronidase,

staphylokinase, lipase, Plactamase

~ Coagulase: trong chỉ ụ cầu khuẩn chỉ có S; aureus méi e6 khả năng tổng hợp coagulas c, chuyển hoá fibrinogen than fibrin và hình thành cục máu đông

- Hyaluronidase: có ở 90% dong S aureus gitip phan huỷ hyaluronic acid tir

đó đễ dàng xâm nhập vào tế bào người bệnh

- Staphylokinase: 06 tác dụng ngược lại với coaglase là lâm tan cục mầu

đông

- Lipase: huỷ phân lipi, iúp tụ cầu khuẩn có th tổn tại trên bề mặt da người

~ J-lactamase (penicillinase): phá huỷ cầu trúc kháng sinh penieillin, có ở hơn 90% đồng vi kuin S aureus:

Bên cạnh đó vi khuẩn tụ cầu còn sản xuất ra các độc tổ như

~ Alpha, beta, gamma và delta, leukocidin toxin: là protein có khả năng

phá vỡ màng tẾ bào chất của nhiều loại ế bảo trong đó có tế bảo bạch cầu, giấp tụ cầu vàng chẳng lại thực bào

- Esoliadve toxins (ETS): là loại độc tổ làm bong vay da vì nỗ phá huỷ cầu nối giữa các tế bảo biểu bì

= Toxie-shock syndrome (TSS): protein gây hội chứng sốc nhiễm độc

~ Độc tổ ruột enterotoxin: kích thích sự co bóp của cơ ruột, gây buồn nôn và

nôn mửa khi ngộ độc thực phẩm do tụ c

1.8, Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

"Nghiên cứu của B, C, Behera và cộng sự vào năm 2006 về cao chiết methanol của địa y G guimarana, G nakanishiana và G schizograpta cho thay khả năng tre ché enzyme tyrosinase, xanthine oxidase va ehéng oxy hod [57] Năm 2009, một nghiên cứu trên địa y G: tetralocularis cho thấy có khả năng lie ché vi khuin Mycobacterium tubercnlosis với nằng độ ức chễ tối thiểu (MIC) là

100 — 200 qygimL, phân lập được 3 c

ba chất phân lập được, graphisia Á và B cho giá tri MIC eao hom acremonidin E, lớn hơn 200 ng/mL 58]

Năm 2010, cao chiết methanol của sáu loãi din y Cetraria pinasr, Cladonia

(acremoni in E, graphisin A và B) Trong digata, Cladonia fimbriata, Fulgensia Fulgens, Ochrolechia parella va Parmelia crinia được khảo sắt hoại tinh khing 6 loai vi khuan (trong a 6 S aureus) vi UL loại nắm bằng phương pháp khuếch tin dia thach, Kết quả kháng khuẩn và kháng tính mạnh và có thể lâm nguồn được iệu tự nhiên [59}

hoá bằng phương pháp DPPH của các cao hexane, acelone, methanol và nước

a địa y Ramalina roesleri Két qua cho thiy chiét xuắt hexane cổ hoạt tỉnh khẳng

S aureus va Štreptococeus mufans và khả năng loại gốc tự đo DPPH từ 29,42% đến

790% ở nỗng độ cao 250 ugimL Khảo sát hoạt tính của các chất được phân lập từ

methoxy-6-propyl acid, homosekikaic acid, sekikaic acid, benzoic acid, 2,4-

dinydrony-6-propyl va 2,4-dihydroxy-3,6.dimethyl benzoat) cho thấy sekikaic acid

kháng oxy hoá mạnh nhất với giá trị IC: 11,24 ng/mL tương đương với chứng

dương là galie ad Ca: = 11.41 wgiml) [60]

Ngoài những nghiên cứu về chỉ Gaphix của nước ngoài, nước ta cũng có

những nghiên cứu về hoạt tỉnh của địa y và nắm cộng sinh với địa y chỉ Graplis

Năm 2020, Võ Văn Giậu và cộng sự đã nuôi cấy mycobiont của Graphis sp kết

quả nghiên cứu phân lập được một chất mới và bai chất đã biết Graphene là hợp với giá tị ICp là 87.20 + 0,76 uM [62],

Nhiều loài địa y đã được nghiên cứu phân lập các chất chuyên hoá thứ cấp để

Khảo sắt hoạt tính ức chế enzyme œ - giueosidase cho kết quả rắt khả quan

Năm 2012, ba loài địa y Ramalina celastri, R nervulosa va Ñ pacifica thuộc:

chỉ Ramatinaceae được nghiên cứu và phân lập ra các chất chuyển hoá như

salazinie aid, sekikaic acid vi usnie acid Các chất chuyển hoá ch thấy khả năng

li ché enzyme a - glucosidase, gia tr ICo của salazinie acid, sekikaic acid va usnic ace Hin lượt à 13,8 đến 18,1; 13,8 dén 14,6 va 17,7 đến I%9 po mL [63] Năm 2020, Dương Thú

dia y Parmotrema tsavoense,

Huy và cộng sự đã phân lập được 5 depsidone méi từ

có hoạt tính tinh ức chế

149 uM) [64] Năm 2022, địa y Usnea sp được đánh giá có tiềm năng là một dược liệu tự

hơn nhiều so với đối chứng đương acarbose (ICs¿

nhiên trong điều trị đái tháo đường vì có khả năng ức chế enzyme œ - glucosidase

Kết quả nghiên cứ phin kip duge hop chit usnic acid ir cao methanol Uisnea sp

có hoạt tính ức chế œ = glucosidase với giá trị ICaa là 106,78 gmL [65]

Năm 2023, các nhà nghiên cứu đã phân lập được 2 loại depsidone mới,

cristfones A và B từ địa y Parmotrema crisjfrum và đánh giá khả năng ức chế

a = glucosidase Hop chất ] và 2 được xác nhận là có khả năng ức chế

+ glueosidase với giá trì IC« lần lượt là 21,5 va 18,4 uM [66]

2.2 Vật liệu nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hảnh trên nắm cộng sinh địa y G- handelit duge phan

lập từ mẫu địa y được thu từ Thị xã Kiến Tường, Tinh Long An (10.766858,

Vo Thi

105.9404441) vio thing 05 năm 2023, Mẫu địa y được định danh bởi Tiền Phi Giao Khoa Sinh học ~ Công nghệ Sinh học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phổ Hồ Chí Minh

4 Tủ cấy võ trùng Việt Nam

6 “Cân phân tích điện từ Sartorius (Di)

" Mãy đo quang phô ‘Thermo Genesys 20 (Mỹ)

14 Máy cô quay chân không | Diab scientific (Trung Quốc)

2.3.2 Hoá chất

Các hoá chất sử dụng tong đề tải bao gồm các hoá chất để tạo môi tường

„ các hoá chất dé tạo cao chiết và các hoá chất để thử các hoạt tính sinh

2.3.2.1 Hoi chit sit dung dé tao môi tường nuôi nắm

Môi trường MYI0 được sử dụng tong đề ti để phân lập và môi cấy nấm

cộng sinh dja y G ñandelii Thành phần môi trường MY10 được trình bày trong

Bảng22

Bang 2.2 Thành phân môi trường MY10 để phân lập và nuôi cấy nắm

2.3.2.2 Hod chit diing để tgo cao chiết

= Ethyl acetate (AR, Trung Quốc)

= Methanol (AR, Trung Quốc)

2.3.2.3 Hoá chất dùng đễ khảo sát hoạt tính sinh học

~ 2,2-diphenyl-1-pierylhydrazyl (DPPH) (TCI, Nhật Bán)

~ Melhanol (Merek, Đức)

«Ascorbic acid (99%, Mj),

~ Enzyme a ~elueosidase

+ pritropheny!-a-D: glucopyranoside (pNPG) (Sigma Aldrich, Anh)

~ Môi trưởng Muller-Himon agar (MHA) (Merck, Đức)

~ Dimethyl sulfoxide (DMSO) (BioBasic, Canada)

- NasPOs, NatlsPOs, NasCOs (Merek, Bite)

3.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp phân lập nắm cộng sinh địa y Mẫu địa y nên được sử dụng trong vòng một tuần sau khi lấy hoặc bảo quản ở

nhiệt độ -25'C trong vòng một năm Cắt mẫu địa y thành những mảnh nhỏ và rửa bằng côn T0 rong vòng 30 giấy và ha lẫn nước cất ệt trồng, mỗi lần 5 phút Quả thể có chứa bảo từ nắm được cắt nhỏ bing dao mổ tiệt trùng, quan sát bảo tử nắm dưới kính hiển vi, ding micropipette hiit bao tir va chuyển sang môi trường MY 10

24,3, Phương phip (go eao thé ethyl acetate vit methanol Sinh khối nim được thủ sau các giai đoạn 4, 6,8, 10 twin nuôi cấy va siy khô sinh khối nắm ở 50*C cho đến khi khối lượng không đổi Sinh khối

nghiền nát thảnh bột và được ngâm với dung môi (methanol và ethyl acetate) cho

Ấm khô được

đến khi không côn lâm đổi mau dung mỗi Sau đó lọ bỏ inh khối nắm và thụ địch

chiết, làm bay hơi dung môi trong dịch chiết nắm bằng máy cô quay chân không

Cao nắm thu được để bay hơi cho khô dung mỗi ở nhiệt độ phòng và bảo quản ở nhiệt độ 4*C để khảo sát hoạt tính sinh bọc

24.4.1 Hoat tinh kháng oxy hố

Khảo sắt khả năng kháng oxy hố của các nghiệm thức cao chiết dựa trên phương pháp khử gốc tư do DPPH được thực hiện theo như Brand-Wiliams

lộng bằng dung mơi để cĩ nồng độ từ 00 ~ I,56 ngímL Lấy 02 mÏ, dung địch cao

\g nghiệm cùng với 1 mL DPPH (80 uM), ci

bu ign thuomg trong vịng 30 phút Sau đĩ, các mẫu được đo OD ởi

bước sĩng 517 nm Methanol được sử dụng làm đối chứng âm Mẫu đối chứng

đương là vitamin C, cao chiết và DPPH được pha lồng trong dung mơi methanol Khả ning de chế gốc tự do DPPH được xác định thơng qua cơng thức sau:

x 100%

d= u2-13)

A1: Giá tị OD của mẫu đối chứng âm

.A3: Giá tị OD của mẫu thử sau phân ứng

“A3: Giá tị OD của mẫu chỉ cĩ dung mơi và cao chiết

I4: Phần trăm bẫy gbe DPPH

2.4.4.2 Hogt tink kháng khuẩn

Để khảo sắt hoạt tính kháng khuẩn ta dùng phương pháp khuếch tín trong mơi

trường rắn [69] Mỗi vi khuẩn khảo sắt được nuối cấy trên mỗi trường MHA trong

16 — 2# giờ, Cao chiết được hồ lan trong dung mơi DMSO để được nồng độ 10

mg/ml Vi khuẩn pha lỗng cĩ độ đục 0,5 MeFarland, ứng với giả trị OD 600 nm từ

0,0§ đến 0,12 Sau đĩ, vỉ khuẩn pha lỗng được trải đều trên bề mặt địa thạch, để

khơ đĩa thạch 1Š phút Sau khi đĩa thạch khơ, ta dùng ống khoan thạch cĩ đường

kinh 10 mm để đục lỗ, ding pipet tet tring hút 100 gL, cao cho vào mỗi lỗ Đĩa thạch được ư trong vịng 16 ~ 1S tiếng ở 37%C Đối chứng âm là DMSO 99,9%, 2.4.4.3 Hogt tinh ite ché enzyme a-glucosidase

Phương pháp khảo sắt hoạt tinh tie ché enzyme a= glucosidase da theo mơ tả của H Q Dong và cộng sự năm 2012 [70] Enzyme œ - glucosidase (0.2 U/mL),

cao chiết pha trong dung dich DMSO 5% (dimethyl sulfoxide) Hén hợp gồm 50 HL

ru cao chiét va 40 jl enzyme ủ trong vòng 20 phút (37°C), sau 46 thém 40 yl co

chất pNPG và tiếp tục ủ 20 phút để phản ứng xảy ra Phản ứng kết thúc bằng cách

thêm 130 pL NasCOs 0.2 M Cuối cùng

405 nm, Đối chứng âm là dung dịch DMSO 5% Tỉ lệ phần tăm (%) enzyme

hợp phán ứng được đo OD ở bước sóng

a glucosidase bite ché dug tính (heo công thức

Phan trăm ức chế (%

Al: gid tri OD của hỗn hợp sau phản ứng

A2: giá trị OD của blank mẫu

“3: giá trị OD của hỗn hợp phân ứng không cổ cao ỉ