Phân lập chủng xạ khuẩn streptomyces spp có khả năng kháng khuẩn từ Đất của một số Đầm nuôi hải sản

Việc sản sinh một loạt các hợp chất hóa học phổ rộng của Streptomyces là một lợi thế, tiềm năng tạo ra các hợp chất đối kháng và kháng khuẩn, nhóm xạ khuẩn này đã được nghiên cứu, sản x

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ ĐẤT CỦA MỘT SỐ

ĐẦM NUÔI THỦY SẢN

HỌC VIÊN: LÊ THỊ TUYẾT MAI

HÀ NỘI – 2023

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ ĐẤT CỦA MỘT SỐ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS Vũ Thị Bích Huyền

HÀ NỘI - 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Lê Thị Tuyết Mai, học viên cao học khóa 2021-2023 Trường Đại học

Mở Hà Nội, chuyên ngành Công nghệ sinh học, xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và hoàn thiện luận văn này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ của các thầy cô, các anh chị em, đồng nghiệp và gia đình Với lòng trân trọng và vô cùng biết ơn tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn tới:

Các thầy cô Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm Đại học Mở

Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và cho tôi có một môi trường học tập tốt

Bộ môn Di truyền – Hóa Sinh, khoa Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội - nơi tôi công tác, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này

TS Vũ Thị Bích Huyền Bộ môn Di truyền – Hóa Sinh, khoa Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội – người đã tận tình chỉ bảo tôi trong nghiên cứu khoa học, PGS.TS Phạm Thị Tâm đã hỗ trợ tôi giải quyết những khó khăn trong quá trình hoàn thành luận văn, đóng góp những ý kiến quý báu cũng như tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này

Xin cảm ơn gia đình đã luôn đồng hành, hỗ trợ tôi trong suốt thời gian học tập Xin cảm ơn bạn bè, anh chị em đồng nghiệp, các bạn học viên cao học đã giúp đỡ, chia sẻ và động viên tôi trong suốt thời gian qua!

Đề tài nghiên cứu này được thực hiện dưới sự tài trợ bởi đề tài cấp Quốc gia,

DANH MỤC VIẾT TẮT

STT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ và nghĩa Việt

NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung

tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia)

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài……… 1

2 Mục tiêu nghiên cứu……… 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

5 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 3

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về xạ khuẩn 4

1.1.1 Đặc điểm 4

1.1.2 Vai trò 5

1.2 Đặc điểm chi Streptomyces 7

1.3 Nghiên cứu sử dụng Streptomyces spp trong thủy sản 8

1.3.1 Trên thế giới 9

1.3.2 Ở Việt Nam 10

1.4 Probiotic trong nuôi trồng thủy sản 10

1.5 Sơ lược về một số vi khuẩn gây bệnh ở thủy sản 14

1.5.1 Vi khuẩn Vibrio 14

1.5.2 Vi khuẩn Aeromonas 15

1.5.3 Vi khuẩn Edwarsiella 15

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Vật liệu nghiên cứu 17

2.1.1 Mẫu đất 17

2.1.2 Vi khuẩn 17

2.1.3 Tôm sú 17

2.1.4 Hoá chất 17

2.1.5 Thiết bị thí nghiệm 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Sơ đồ các bước tiến hành 18

2.2.2 Phương pháp phân lập xạ khuẩn 19

2.2.3 Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn của các mẫu xạ khuẩn 19

2.2.4 Định danh loài bằng gene rRNA 16S 20

2.2.5 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hoá 20

2.2.6 Xác định các enzyme ngoại bào của các chủng xạ khuẩn 21

2.2.7 Xác định tế bào máu tổng số và hoạt tính phenoloxidase (PO) khi cho tôm sú sử dụng xạ khuẩn 21

2.2.8 Xác định khả năng bảo vệ của các mẫu xạ khuẩn phân lập đối với tôm thử thách với các chủng gây bệnh 22

2.2.9 Xác định hoạt tính thực bào 23

2.2.10 Đánh giá khả năng tăng cường chuyển hoá thức ăn và tăng trưởng ở tôm sú 24

2.2.11 Bảo quản chủng giống: 24

2.2.12 Phương pháp xử lý số liệu 24

PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25

3.1 Kết quả phân lập xạ khuẩn 25

3.2 Đánh giá khả năng kháng khuẩn trong điều kiện in vitro của các mẫu xạ khuẩn phân lập 27

3.3 Định danh các chủng xạ khuẩn tuyển chọn bằng phương pháp phân tích trình tự gen 16S 30

3.4 Đánh giá đặc điểm sinh hóa của các mẫu Streptomyces spp 31

3.5 Đánh giá ảnh hưởng của Streptomyces spp phân lập từ Thái Bình đối với chủng V parahaemolyticus và chủng V harveyi trong điều kiện in vivo trên tôm sú 33

3.6 Đánh giá đặc tính probiotic của hai chủng Streptomyces drozdowiczii TBL1.3 và Streptomyces coelicoflavus TBL 1.6 37

3.6.1 Xác định các enzyme ngoại bào của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 38

3.6.2 Hiệu quả tăng cường miễn dịch của các chủng Streptomyces ở tôm 39

3.7 Mức độ tăng trưởng của tôm ở các bể thí nghiệm 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

1 Kết luận 45

2 Kiến nghị 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

PHỤ LỤC 52

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Sơ đồ các bước thực hiện chính 18

Hình 3.1 Một số hình ảnh xạ khuẩn đã phân lập 25

Hình 3.2 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của xạ khuẩn phân lập từ Thái Bình bằng phương pháp thỏi thạch 28

Hình 3.3 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của xạ khuẩn phân lập từ An Giang

và Nam Định bằng phương pháp thỏi thạch 29

Hình 3.4 Cây phát sinh chủng loại 31

Hình 3.5 Tỷ lệ gia tăng tỷ lệ sống sót của tôm sú được thử tháchvới vi khuẩn

V parahaemolyticus HOU/BT01 34

Hình 3.6 Tỷ lệ gia tăng tỷ lệ sống sót của tôm sú được thử tháchvới vi khuẩn

V parahaemolyticus HOU/BT15 34

Hình 3.7 Tỷ lệ gia tăng tỷ lệ sống sót của tôm sú được thử tháchvới vi khuẩn

V parahaemolyticus HOU/ST08 35

Hình 3.8 Tỷ lệ gia tăng tỷ lệ sống sót của tôm sú được thử tháchvới vi khuẩn

V harveyi VH/BT12 36

Hình 3.9 Tỷ lệ gia tăng tỷ lệ sống sót của tôm sú được thử tháchvới vi khuẩn

V harveyi VH/ST02 36

Hình 3.10 Kết quả xác định enzyme ngoại bào của các chủngStreptomyces drozdowiczii TBL1.3 và Streptomyces coelicoflavus TBL 1.6 38

Hình 3.11 Kết quả xác định enzyme ngoại bào của Streptomyces drozdowiczii TBL1.3 và Streptomyces coelicoflavus TBL 1.6 39

Hình 3.12 Mức độ gia tăng tỷ lệ tế bào máu tổng số ở tômsử dụng các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 40

Hình 3.13 Mức độ gia tăng hoạt tính thực bào của tôm sử dụng xạ khuẩnvới

vi khuẩn V parahaemolyticus HOU/BT15 41

Hình 3.14 Mức độ gia tăng hoạt tính thực bào của tôm sử dụng xạ khuẩnvới

vi khuẩn V harveyi VH/ST02 41

Hình 3.15 Mức độ gia tăng hoạt tính phenoloxidase trong máu tômsử dụng

các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 42

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số loại kháng sinh được sản xuất từ xạ khuẩn 6 Bảng 3.1: Bảng miêu tả màu sắc các khuẩn lạc các mẫu xạ khuẩn 26 Bảng 3.2 Khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của các chủng xạ khuẩn phân lập

từ Thái Bình 27 Bảng 3.3 Khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của các chủng xạ khuẩn phân lập

từ An Giang 28 Bảng 3.4 Khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của các chủng xạ khuẩn phân lập

từ Nam Định 29 Bảng 3.5 Danh sách các chủng xạ khuẩn Streptomyces được định danh 30

Bảng 3.6 Đánh giá đặc điểm hình thái của 12 chủng Streptomyces spp 32

Bảng 3.7 Đánh giá khả năng sử dụng một số loại đường của 12 chủng

Streptomyces spp 32

Bảng 3.8 Tăng trưởng về trọng lượng của tôm sau 60 ngày thí nghiệm 43

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Việt Nam với 3260 km đường bờ biển có nguồn thủy hải sản vô cùng phong phú Theo trung tâm thông tin và thống kê Bộ nông nghiệp và PTNT năm 2023, tổng sản lượng thủy sản đạt 9,269 triệu tấn Trong đó, sản lượng khai thác thủy sản đạt 3,861 triệu tấn; sản lượng nuôi trồng thủy sản đạt hơn 5,408 triệu tấn Sự gia tăng diện tích và kỹ thuật nuôi thuỷ sản thâm canh hóa mang lại hiệu quả kinh tế lớn, tuy nhiên đi kèm đó là những rủi ro xuất hiện và lây lan nhiều dịch bệnh nguy hiểm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản lượng nuôi trồng thủy sản Do vậy, việc tìm kiếm các giải pháp nhằm kiểm soát nguồn gây bệnh trên động vật thuỷ sản định hướng đến phát triển bền vững nghề nuôi trồng thủy sản là rất cấp thiết

Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật khuẩn tiềm năng lớn với nhiều sản phẩm thứ cấp được khai thác Trong số hơn 8000 chất kháng sinh trên thế giới thì có tới 80% là các

kháng sinh được sản sinh bởi xạ khuẩn Streptomyces spp là nhóm xạ khuẩn đa dạng

về loài và có nhiều ứng dụng trong thực tiễn Việc sản sinh một loạt các hợp chất hóa

học phổ rộng của Streptomyces là một lợi thế, tiềm năng tạo ra các hợp chất đối

kháng và kháng khuẩn, nhóm xạ khuẩn này đã được nghiên cứu, sản xuất các hợp chất quý ứng dụng trong bảo vệ thực vật, trong y học, dùng làm chế phẩm sinh học… Hiện nay, ngày càng nhiều mầm bệnh kháng thuốc trên động vật thuỷ sản do lạm dụng các chất kháng sinh Sử dụng các chế phẩm sinh học có thể là một lựa chọn thay thế cho kháng sinh Các nghiên cứu cho thấy rằng các thức ăn bổ sung

Streptomyces spp có thể bảo vệ cá và tôm không bị nhiễm các mầm bệnh, thay đổi

hệ vi sinh vật đường ruột cũng như gia tăng sự phát triển của các sinh vật dưới

nước, giúp cải thiện chất lượng nước Một số nghiên cứu đã cho thấy Streptomyces

được sử dụng với vai trò như là một probiotic trong nuôi trồng thủy sản do có khả năng sản xuất siderophores, enzyme (You et al, 2005) Chế phẩm sinh học

Streptomyces giúp điều hòa hệ vi sinh vật, đặc biệt là tăng quần thể vi khuẩn khoáng

hóa protein và amoni hóa, đẩy nhanh quá trình phân hủy chất thải và cũng cải thiện chất lượng nước bằng cách giảm nồng độ amoniac (NH3) Việc tiêu thụ thức ăn kết hợp với khả năng chịu pH thấp và khả năng kháng enzyme đường ruột của men vi

sinh Streptomyces có thể nâng cao hiệu suất tăng trưởng của vật nuôi bằng cách cung cấp nguồn protein tốt Probiotics Streptomyces thể hiện khả năng tiết ra các

exoenzym thủy phân giúp cải thiện hoạt động phân giải tinh bột và phân giải protein trong đường tiêu hóa của vật nuôi để sử dụng thức ăn hiệu quả hơn; cuối cùng góp phần vào hiệu suất tăng trưởng tốt hơn của vật nuôi

Việt Nam là một quốc gia nhiệt đới, thuận lợi cho vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng phát triển, do đó có thể phát hiện nhiều chủng xạ khuẩn bản địa có khả năng sinh các hợp chất thứ cấp quý hiếm Xạ khuẩn phân bố chủ yếu trong đất, đây chính là nguồn tài nguyên dồi dào cho những nghiên cứu phát hiện và khai thác các chủng xạ khuẩn ở nhiều lĩnh vực trong đó có nuôi trồng thuỷ sản

Từ những lý do trên, đề tài “Phân lập chủng xạ khuẩn Streptomyces spp có khả năng kháng khuẩn từ đất của một số đầm nuôi thủy sản” được tiến hành

nhằm mục tiêu phân lập một số chủng xạ khuẩn Streptomyces spp phục vụ cho việc

phát triển chế phẩm probiotic cho ngành nuôi trồng thủy sản

2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập các chủng xạ khuẩn Streptomyces spp từ đất vùng nuôi thuỷ sản và

đánh giá tiềm năng kháng vi khuẩn gây bệnh của các chủng xạ khuẩn phân lập, định hướng phát triển sản phẩm probiotic cho tôm sú

3 Nội dung nghiên cứu

1- Phân lập xạ khuẩn Streptomyces spp từ các mẫu đất của đầm nuôi thủy sản

2- Đánh giá sơ bộ khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh của các chủng

Streptomyces spp phân lập được trong điều kiện in vitro

3- Đánh giá hiệu quả ức chế chủng Vibrio parahaemolyticus và Vibrio harvey của các chủng xạ khuẩn tiềm năng Streptomyces spp trên tôm sú

4- Đánh giá đặc tính probiotic của các chủng tuyển chọn

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

4.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả phân lập và đánh giá các đặc điểm của một số chủng Streptomyces

spp từ đất đầm nuôi thuỷ sản góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu về sự đa dạng của xạ khuẩn ở nước ta

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Các chủng xạ khuẩn Streptomyces spp có hoạt tính kháng khuẩn cao có thể

được sử dụng nhằm phát triển chế phẩm probiotic cho động vật thuỷ sản (tôm sú)

5 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Đề tài được nghiên cứu tại phòng Sinh học phân tử, phòng Hóa sinh - Tế bào Khoa Sinh học, Trường học Sư phạm Hà Nội và Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Mở Hà Nội

Thời gian nghiên cứu: Đề tài được nghiên cứu từ: tháng 05 năm 2022 đến tháng 11 năm 2023

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về xạ khuẩn

1.1.1 Đặc điểm

Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc ngành Tenericutes, giới vi khuẩn thật (Bacteria), lớp Actinobacteria, dưới lớp Actinobacteridae, bộ Actinomycetales, bao

gồm 10 dưới bộ, 35 họ, 110 chi và hơn 1000 loài trong đó có 478 loài thuộc chi

Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi còn lại được xếp vào nhóm xạ khuẩn

hiếm (Lê Gia Hy at al., 2005)

Vào cuối thế kỷ XX, xạ khuẩn được phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái và sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn theo các khóa phân loại Bergey (1989)

và chương trình xạ khuẩn quốc tế ISP (1974) Màu sắc khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn khi nuôi trên các môi trường từ ISP 1 đến ISP 7 thường khác nhau, đây là yếu

tố để phân loại xạ khuẩn theo khóa định tên loài xạ khuẩn ISP (1974) và khóa phân loại Bergey (Stanley et al.1989) Khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất của chủng

xạ khuẩn so với bảng màu Tresner và Backus (Tresner, 1963) Màu sắc khuẩn ty khí sinh của chủng xạ khuẩn được chia thành 8 nhóm màu: nhóm màu trắng (white), nhóm màu xám (grey), nhóm màu đỏ (red), nhóm màu vàng (yellow), nhóm màu xanh lục (green), nhóm màu xanh da trời (blue), nhóm màu tím (violet), và nhóm màu không xác định (X) Khả năng sinh sắc tố tan và sự hình thành melanin, đặc điểm hình dạng cuống sinh bào tử, hình dạng bào tử, sự hình thành bào tử cũng là một trong những tiêu chuẩn cơ bản để phân biệt các chủng xạ khuẩn Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa thường được kết hợp sử dụng trong phân loại xạ khuẩn là khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nito, khả năng kháng khuẩn, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng phân hủy các chất khác nhau nhờ hệ thống enzyme… Cùng với sự phát triển của khoa học và công nghệ, việc định danh các loài dễ dàng hơn với dữ liệu trình tự nucleotide của đoạn gen 16S rDNA

Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên: đất, nước, không khí, ký sinh trong thân, củ, rễ cây Đa số xạ khuẩn là các vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, phát triển tốt ở môi trường trung tính và hơi kiểm, nhiệt độ tối thích cho sự sinh trưởng và phát triển của xạ khuẩn là 20-45ᵒC (Lê Gia Hy at al., 2005)

Tế bào xạ khuẩn có cấu tạo dạng sợi, phân nhánh, kích thước nhỏ, sống hoại sinh và ký sinh Xạ khuẩn là vi khuẩn Gram dương, trên môi trường đặc phát triển thành các khuẩn lạc chắc, xù xì, có dạng da, dạng nhung tơ hay dạng dẻo Khuẩn lạc

xạ khuẩn có màu sắc khác nhau tùy thuộc vào loài và điều kiện môi trường Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn được phân biệt ở hướng sinh trưởng trong và ngoài mặt môi trường thạch tạo thành hệ sợi khí sinh và hệ sợi cơ chất Phần cuối của hệ sợi khí sinh thường biến thành cuống bào tử có nhiều loại hình dạng khác nhau: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc đơn…

Xạ khuẩn không bền vững về mặt di truyền và thường xảy ra sự xắp xếp lại trong phân tử DNA, điều này tạo ra tính đa dạng của hình thái Yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể (các plasmid) đem lại cho tế bào nhiều đặc tính quý giá như có thêm khả năng phân giải một số hợp chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với kháng sinh…

1.1.2 Vai trò

Xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng, chúng tham gia vào vòng tuần hoàn vật chất khép kín do có khả năng phân giải các chất hữu cơ như cellulose, kitin, keratin, pectin, linhin…làm cân bằng các thành phần vật chất, giúp bảo vệ môi trường, tăng

độ phì nhiêu của đất (Biền Văn Minh, 2000) Chúng là những sinh vật phong phú nhất tạo thành các sợi giống như sợi trong đất và tạo ra mùi “đất” đặc trưng của trái cây tươi Chúng đóng vai trò chính trong quá trình tuần hoàn chất hữu cơ; ức chế sự phát triển của một số mầm bệnh thực vật trong vùng rễ và phân hủy các hỗn hợp polymer phức tạp trong thực vật, động vật chết và nguyên liệu nấm tạo ra nhiều enzyme ngoại bào có khả năng dẫn điện cho cây trồng sản xuất Đóng góp chính trong việc đệm sinh học của đất, kiểm soát sinh học môi trường đất bằng cách cố định nitơ và phân hủy các hợp chất có trọng lượng phân tử cao như hydrocarbon trong đất bị ô nhiễm là đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn Bên cạnh đó, họ còn được biết là có khả năng cải thiện sự sẵn có của các chất dinh dưỡng, khoáng chất, tăng cường sản xuất các chất chuyển hóa và thúc đẩy tăng trưởng thực vật Hơn nữa, vi

khuẩn Actinobacteria không gây ô nhiễm môi trường, thay vào đó chúng giúp cải

thiện chất lượng đất một cách bền vững bằng cách hình thành và ổn định các đống

phân trộn, hình thành các khối ổn định và kết hợp với các vi sinh vật đất khác để phân hủy các tàn dư thực vật cứng như cellulose và tàn dư động vật để duy trì trạng thái cân bằng sinh học của đất

Xạ khuẩn có khả năng hình thành chất kháng sinh có tính kháng khá rộng Dưới đây là bảng các chất kháng sinh hiện nay có nguồn gốc từ xạ khuẩn:

Bảng 1.1 Một số loại kháng sinh đƣợc sản xuất từ xạ khuẩn

Xạ khuẩn được coi là nguồn mạnh nhất để sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp, kháng sinh và các hoạt chất có hoạt tính sinh học khác Người ta đã xác định rằng mỗi chủng xạ khuẩn có thể có tiềm năng để tạo ra 10-20 chất chuyển hóa thứ cấp (Kemung et al, 2018) Một số trong chúng có khả năng sinh đồng thời hai hay nhiều chất kháng khuẩn có tác dụng và cấu trúc tương tự nhau (Sosio M et al, 2000; Nolan R et al, 1998; Vi Thị Đoan Chính, 2009)

Một số loài xạ khuẩn còn có khả năng tạo ra các chất điều tiết sinh trưởng, các phytohoocmon rất có giá trị với cây trồng (Lê Thị Hoa, 1998) Một số còn có thể sinh ra các loại vitamin nhóm B, tiền vitamin A, một số axit hữu cơ và axit amin (Nguyễn Thị Khá, 2011)

Ngoài ra xạ khuẩn còn sản sinh các chất ức chế phân chia tế bào, các enzyme, chất ức chế enzyme, chất ức chế miễn dịch, kháng côn trùng, diệt cỏ Với những tiềm năng này mà chúng được nghiên cứu rộng rãi, đưa vào ứng dụng sản xuất

thuốc kháng sinh trong y học, nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm cũng như bảo

vệ môi trường

1.2 Đặc điểm chi Streptomyces

Streptomyces là một chi thuộc giới Vi khuẩn, ngành Actinomycetota, lớp Actinomycetes, bộ Streptomycetales và họ Streptomycetaceae (Schoch Cl et al,

2020) Nó được đề xuất lần đầu tiên vào năm 1943 (Waksman et al, 1943) và ban đầu được phân loại dựa trên hình thái, kiểu hình hóa học, mô hình đường toàn tế bào, cấu hình phospholipid và axit béo, thành phần của thành tế bào và sau đó dựa trên các đặc điểm cấu tạo kiểu hình và kiểu gen của nó Cho đến nay, 1147 loài và

73 phân loài Streptomyces đã được mô tả hợp lệ (www.bacterio.net)

Streptomyces có nhiều trong tự nhiên và tồn tại ở dạng bào tử không hoạt động

trước khi chúng có được điều kiện thuận lợi để phát triển Streptomyces trải qua chu

kỳ phát triển sau: (1) giai đoạn phân bào ban đầu (sự phân tán bào tử trong quá trình hình thành bào tử); (2) nảy mầm (các bào tử phân tán lắng xuống và nảy mầm); (3)

sự hình thành sợi nấm sơ cấp (sự phát triển của sợi nấm sinh dưỡng); (4) sự hình thành sợi nấm thứ cấp (sự phát triển của sợi nấm trên không); và (5) bào tử (sự hình thành bào tử)

Một số chủng Streptomyces là mầm bệnh liên quan đến con người, động vật hoặc thực vật Thành tế bào của Streptomyces chứa một lưới peptidoglycan đơn giản

bao quanh màng tế bào chất (Gago G et al, 2011) Sự hình thành hình thái ở

Streptomyces được xác định bằng cách hình thành các sợi nấm trên không (có thể

biệt hóa thành bào tử hoặc bào tử đốt) xuất hiện từ sợi nấm cơ chất có chứa axit diaminopimelic là axit diamino chiếm ưu thế (Ellid MA et at, 2007; Han JH et al,

LL-2012) Các bào tử giúp tăng cường khả năng sống sót của Streptomyces trong đất trong giai đoạn ngủ đông vì Streptomyces có khả năng chống lại sự thiếu hụt nước

và chất dinh dưỡng cũng như nhiệt độ khắc nghiệt (Samac DA et al, 2023)

Các nhà phân loại đã sử dụng hàng loạt các điều kiện và các khóa phân loại

khác nhau để xác định thành phần loài của chi Streptomyces Ủy ban Quốc tế về

phân loại xạ khuẩn ISP đã nêu ra các môi trường chuẩn và phương pháp chung để phân loại nhóm vi sinh vật này

1.3 Nghiên cứu sử dụng Streptomyces spp trong thủy sản

Nuôi trồng thủy sản bền vững gần đây đã nổi lên như một giải pháp thay thế

có lợi nhuận để cung cấp chế độ ăn giàu protein cho người tiêu dùng Cách nuôi cá, động vật có vỏ nhân tạo này không chỉ giúp đáp ứng nhu cầu toàn cầu mà còn góp phần phục hồi nguồn tài nguyên thiên nhiên đang cạn kiệt Sản lượng nuôi trồng thủy sản toàn cầu (chỉ động vật thủy sản) đạt kỷ lục 87,5 triệu tấn vào năm 2020 (FAO, 2022), theo báo cáo gần đây của Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (OECD) và Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp (FAO) của Hoa Kỳ Các quốc gia (LHQ) dự kiến đạt 103 triệu tấn vào năm 2030, tăng 17,7% so với năm 2020 (FAO, 2021) Hiện nay Châu Á đóng góp khoảng 90% vào sản lượng toàn cầu Với sự gia tăng thương mại hóa và tăng cường sản xuất nuôi trồng thủy sản, tỷ lệ mắc bệnh, suy thoái môi trường và ô nhiễm hóa chất là những vấn đề chính trong nuôi cá và đối mặt với thiệt hại kinh tế lớn (Bondad-Reantaso et al., 2005) Vì vậy, kháng sinh được sử dụng để quản lý dịch bệnh cũng như để tăng trưởng cho cá trong nhiều năm nhưng có nguy cơ lây truyền vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc từ môi trường nước sang người và các động vật khác (Das et al., 2010)

Tiềm năng sản xuất các hợp chất hóa học đa dạng từ Streptomyces đã mang lại

ưu thế cho việc sản xuất các hợp chất đối kháng và kháng khuẩn tiềm năng, có thể

có giá trị trong việc phát triển chế phẩm sinh học trong ngành nuôi trồng thủy sản Khả năng sản xuất các hợp chất đối kháng có thể giúp chế phẩm sinh học cạnh tranh với chất dinh dưỡng của vật chủ

Các phương pháp sử dụng Streptomyces trong nuôi trồng thủy sản và các lợi

ích liên quan của chúng được liệt kê dưới đây

1- Khi sử dụng qua kỹ thuật tiêm bắp, sẽ làm giảm sự xuất hiện của virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) (Jenifer J et al, 2015)

2- Khi được sử dụng/bổ sung qua thức ăn, sẽ mang lại nhiều tác dụng có lợi (Ajmal Khan S., et al, 2006)

3- Khi thêm trực tiếp vào ao dưới dạng phụ gia nước sẽ làm giảm số lượng

Vibrio (García-Bernal M., et at, 2010)

4- Khi thêm vào ao nuôi cấy hoặc tiêm phòng sẽ làm tăng sự phân hủy chất hữu cơ (Aftabuddin S., et al, 2013)

5- Khi được sử dụng dưới dạng tế bào Streptomyces được bao bọc sinh học ,

sẽ làm tăng khả năng sống sót chống lại Vibrio (Das S., et al, 2010)

6- Khi phun lên các tấm lót thức ăn dưới dạng hỗn dịch vi khuẩn, sẽ làm tăng

tỷ lệ sống sót trong thí nghiệm thử thách (Bernal MG., et al, 2017)

7- Khi dùng dưới dạng chiết xuất thô, cho thấy hoạt động trung bình chống lại các mầm bệnh liên quan đến cá (Saha S., et al, 2021)

8- Khi được bổ sung dưới dạng protein đơn bào (SCP), sẽ tăng cường sự tăng trưởng (Selvakumar D., et al, 2013)

1.3.1 Trên thế giới

Trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản, các sản phẩm sinh học đã được nghiên cứu để sản xuất các chất như bacteriocins, siderophores, hydrogen peroxide, enzyme và các axit hữu cơ Nghiên cứu của nhóm nghiên cứu You và cộng sự đã

ghi nhận rằng một chủng Streptomyces cụ thể có khả năng sản xuất siderophores, và

họ đã đề xuất rằng việc sử dụng Streptomyces sp có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của mầm bệnh Vibrio sp., chủng vi khuẩn gây bệnh trong môi trường nước

(You et al., 2005)

Streptomyces không chỉ sản xuất các hợp chất gây suy giảm hình thành màng

sinh học, mà còn tham gia vào các hoạt động cảm biến chống lại các tác nhân gây

bệnh Cộng thêm đó, Streptomyces đã được chứng minh có khả năng chống độc lực

vi khuẩn Vibrio sp (Iwatsuki et al., 2008) Nghiên cứu của Jenifer và đồng nghiệp (2015) đã ghi nhận rằng Streptomyces cũng có khả năng hỗ trợ thủy sản chống lại

virus, đặc biệt là các virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) Trong một thí

nghiệm, việc bổ sung nhóm Streptomyces RL8 và BMix-StrepMix vào thức ăn cho tôm đã dẫn đến tỷ lệ sống trên tôm gần 95% sau khi gây nhiễm tôm với vi khuẩn V

parahaemolyticus CAIM 170

Một số nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng việc bổ sung probiotic vào thức ăn

hoặc nước có thể cải thiện hiệu suất tăng trưởng của tôm L.vannamei (Liu et al.,

2009) Điều này được chứng minh thông qua khả năng sản xuất các enzyme ngoại

bào như protease, lipase, carbonhydtrolases, các yếu tố quan trọng tham gia vào quá trình tiêu hóa của tôm Một số chủng xạ khuẩn còn có khả năng sản xuất enzyme ngoại bào, hỗ trợ phân hủy các chất hữu cơ như cellulose, lipit, protein, tinh bột Trong ngành nuôi trồng thủy sản, thức ăn thường chứa protein từ bột cá, đây là loại thức ăn thiết yếu nhưng chi phí cao Do giá cả của bột cá biến động và cao, nhu cầu về các nguồn protein thay thế có giá rẻ hơn đã tăng lên Trong số các nguồn protein hiện nay, nguồn từ vi sinh vật dường như là một sự thay thế tiềm năng cho

bột cá, chiếm đến 25%–50% Protein đơn bào từ Streptomyces spp hiện đang là một

trong những nguồn protein thay thế được sử dụng và đánh giá về hiệu suất chuyển đổi thức ăn và tăng trưởng cho cá và tôm

1.3.2 Ở Việt Nam

Nhóm nghiên cứu (Tan và et al , 2016) đã chứng minh Streptomyces albus có

khả năng sản xuất các hợp chất ức chế và các chất chuyển hóa liên quan đến sự hình

thành màng sinh học của các tác nhân gây bệnh như V harveyi, V vulnifi cus, và V

anguillarum

Xu hướng hiện nay là sử dụng các vi khuẩn đối kháng thay thế cho kháng sinh trong việc nâng cao hiệu quả xử lý môi trường ở các ao nuôi (Nguyễn Hoàng Minh Huy, 2006), xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn được nghiên cứu để phân hủy các hợp chất

hữu cơ và hạn chế sự gia tăng các mầm bệnh như V parahaemolyticus, V harveyi

trong ao (Nguyễn Lân Dũng và cs., 1978)

Nghiên cứu của Võ Hồng Phượng et al (2019) cho thấy chế phẩm vi sinh bao

gồm chủng Bacilllus licheniformis (B1), chủng B subtilis (S5) và chủng

Streptomyces X285 sử dụng kết hợp với liều lượng 1g/m3, xử lý định kỳ 2 lần/tuần

có khả năng nâng cao tỷ lệ sống của tôm với tỷ lệ bảo hộ (RPS) trên 80% sau khi

gây nhiễm V parahaemolyticus trong điều kiện phòng thí nghiệm

1.4 Probiotic trong nuôi trồng thủy sản

Probiotic đã được áp dụng như một chất kích thích tăng trưởng và tăng sức đề kháng chống lại các bệnh do vi khuẩn đường ruột ở động vật nuôi kể từ những năm

1970 Được coi là ứng viên tiềm năng để thay thế kháng sinh trong chăn nuôi, từ sau năm 2006 khi Liên minh Châu Âu cấm sử dụng kháng sinh như một phụ gia

trong thức ăn chăn nuôi để kích thích tăng trọng Nghiên cứu trong và ngoài nước

về probiotic đã chỉ ra những lợi ích của chúng khi được thêm vào thức ăn hoặc nước, bao gồm tăng tỉ lệ sống sót, tăng cường chuyển hóa thức ăn, giảm bệnh tật, và giảm tỷ số chuyển đổi thức ăn (FCR) cho nhiều loài tôm cá nuôi (Wu et al., 2021; Van et al., 2021)

Probiotics được biết đến dưới nhiều tên gọi như “chế phẩm vi sinh”, “vi khuẩn

có lợi” hoặc “vi sinh vật hiệu quả” bao gồm các vi khuẩn như Lactobacillus,

Actinomycetes, Nitrobacteria, vi khuẩn chuyển hóa đạm, Bifidobacterium, nấm

men, và nhiều loại khác Những chủng vi khuẩn có lợi này đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện chất lượng nước trong môi trường nuôi cá và hạn chế sự phát triển của mầm bệnh, từ đó tăng cường năng suất của vật nuôi Probiotics còn được

sử dụng như một phương tiện kiểm soát dịch bệnh, bổ sung hoặc thậm chí thay thế kháng khuẩn Các chủng probiotic thường sử dụng cho động vật thủy sản bao gồm

L acidophilus, B subtilis, S cerevisiae, được thêm vào thức ăn để hỗ trợ tiêu hóa

thông qua khả năng sản xuất enzyme ngoại bào và tăng cường đề kháng bằng cách

ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh đường ruột Các vi khuẩn Bacillus như

B subtilis, B licheniformis, B amiloliquefacien thường được sử dụng để xử lý môi

trường ao nuôi bằng cách phân hủy bùn và bã hữu cơ Ngoài ra, các vi khuẩn nitrat

hóa như Nitromonas, Nitrobacter cũng được áp dụng để giảm khí độc hại trong ao nuôi thông qua quá trình chuyển hóa nitrogen Các chủng Thiobacillus được sử

dụng để khử kim loại nặng trong môi trường ao nuôi Các nhóm vi tảo, nấm men, vi khuẩn gram dương và gram âm đều được sử dụng trong lĩnh vực này

Theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 2012, để một chủng

vi sinh vật được chọn lọc làm probiotic (dùng qua đường tiêu hóa), nó cần đáp ứng các tiêu chí sau: (1) Phải xác định được giống loài của vi sinh vật, và nó phải an toàn cho sức khỏe của động vật và người tiêu dùng sản phẩm động vật, không gây bệnh; (2) Chủng vi sinh vật cần có khả năng chịu được pH của dịch vị và muối mật

để có thể tồn tại khi đi qua dạ dày và xuống ruột; (3) Phải có khả năng kết dính vào niêm mạc ruột để bám trụ, sinh sản và phát triển mà không bị loại thải ra khỏi đường tiêu hóa; (4) Cần có khả năng sản xuất enzyme ngoại bào để hỗ trợ quá trình

tiêu hóa và có tính năng điều biến miễn dịch (5) Phải có khả năng sản xuất các chất kháng khuẩn sinh học (bacteriocins) để ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh

Trong quá trình sản xuất công nghiệp, các chủng vi khuẩn này được lên men

để sinh khối trong điều kiện tối ưu, được thiết kế phù hợp với điều kiện sinh trưởng của từng loại vi khuẩn Tuy nhiên, khi sử dụng, môi trường trong ao nuôi hoặc đường tiêu hóa của tôm cá có thể khác biệt đáng kể so với môi trường lên men sinh khối trong quá trình sản xuất Sự thích nghi và phát triển của lợi khuẩn trong môi trường mới này không thể dự đoán trước Nếu môi trường là thích hợp, lợi khuẩn sẽ thích nghi và phát triển, làm tăng hiệu quả sản phẩm Ngược lại, nếu môi trường không thích hợp, lợi khuẩn có thể không thích nghi và sẽ nhanh chóng suy giảm, làm giảm hiệu suất của sản phẩm

Hầu hết các sản phẩm probiotic hiện nay trên thị trường thường được nhập khẩu, điều này đặt ra thách thức về khả năng thích nghi và phát triển của lợi khuẩn trong điều kiện môi trường và đường tiêu hóa của động vật nuôi bản địa Vì vậy, nghiên cứu và đánh giá về khả năng thích nghi của lợi khuẩn, đặc biệt là những lợi khuẩn có nguồn gốc bản địa (phân lập từ môi trường ao nuôi, ruột tôm cá tại Việt Nam), là cần thiết để đảm bảo hiệu quả của sản phẩm

Trong môi trường tự nhiên, hệ vi sinh vật luôn duy trì trạng thái cân bằng, tạo nên một hệ sinh thái đặc trưng để duy trì sự sống Ruột động vật chứa hơn 500 loài vi sinh vật cộng sinh, đóng vai trò hỗ trợ tiêu hóa, cung cấp chất dinh dưỡng và điều biến miễn dịch Sự mất cân bằng trong hệ sinh thái đường ruột xảy ra khi vi khuẩn gây bệnh có điều kiện phát triển mạnh mẽ hơn Các nghiên cứu từ FAO (2016) đã báo cáo rằng

khi bệnh đường ruột do Vibrio spp trong đường tiêu hóa của tôm xảy ra, có thể đạt

>10^6 CFU/g Tương tự, vi khuẩn gây hại trong nước ao nuôi tôm cá đạt >10^4 CFU/ml là dấu hiệu của một đợt dịch bệnh hiện đang diễn ra hoặc sắp xảy ra

Để đạt được sự cạnh tranh sinh học và duy trì cân bằng sinh thái, probiotic cần được đưa vào với hàm lượng cao hơn so với mức vi khuẩn gây bệnh hiện diện trong môi trường Dưới mức này, probiotic sẽ không có điều kiện phát triển và sẽ bị lụi

tàn Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng để tăng hiệu quả sử dụng thức ăn chứa L

acidophilus, cần cung cấp ở mức 210^6 CFU/g (Jin et al., 2000), và để ngăn ngừa

bệnh đường ruột, cần cung cấp 510^9 CFU/ngày (Galdeano and Perdigon, 2006)

Ngoại trừ các loài vi khuẩn thuộc giống Bacillus có khả năng hình thành bào

tử và chịu tác động của điều kiện ngoại cảnh, chất lượng sản phẩm ít biến động Các chủng lợi khuẩn khác trong sản phẩm probiotic ở dạng tế bào sinh dưỡng có thể bị ảnh hưởng bởi điều kiện ngoại cảnh, dẫn đến giảm hàm lượng lợi khuẩn trong quá trình bảo quản, vận chuyển và phân phối, đặc biệt là trong các sản phẩm chứa vi

khuẩn nitrat hóa như Nitrosomonas, nitrobacter Theo tiêu chuẩn của WHO, một

sản phẩm probiotic đủ tiêu chuẩn cho việc sử dụng cho người phải chứa hàm lượng lợi khuẩn tối thiểu là 10^8 CFU/g

Cơ chế hoạt động của vi khuẩn probiotic trong nuôi trồng thủy sản chưa được nghiên cứu đầy đủ và hệ thống Tuy nhiên, theo một số công trình công bố gần đây,

có thể xác định các khía cạnh cơ chế hoạt động nhất định như sau: (1) Cạnh tranh và

ức chế: Vi khuẩn Probiotics có thể cạnh tranh và loại trừ vi khuẩn gây bệnh hoặc tạo ra các hoạt chất ức chế sự phát triển của chúng (2) Cung cấp chất dinh dưỡng: Probiotics có thể cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết, giúp tăng cường dinh dưỡng cho vật nuôi (3) Cung cấp men tiêu hóa: Vi khuẩn probiotics có thể cung cấp men tiêu hóa, gia tăng quá trình tiêu hóa ở vật nuôi (4) Phân hủy vật chất hữu cơ và chất độc: Probiotics có thể trực tiếp hấp thụ hoặc phân hủy vật chất hữu cơ và chất độc trong nước, từ đó cải thiện chất lượng nước (5) Thay đổi quá trình trao đổi chất và kích thích hệ miễn dịch: Vi khuẩn Probiotics có thể thay đổi quá trình trao đổi chất của vi khuẩn và/hoặc kích thích hệ miễn dịch của vật chủ

Những nghiên cứu và ứng dụng của vi khuẩn probiotics trong nuôi trồng thủy sản đã được tiến hành trên toàn cầu, nhằm cải thiện quần thể vi sinh vật trong

hệ thống nuôi trồng thủy sản Vadstein et al., (1993) đề xuất việc bổ sung trực tiếp

vi khuẩn chọn lọc như một biện pháp kiểm soát quần thể vi khuẩn trong giai đoạn phát triển ấu trùng của cá biển Sorgeloos (1994) nói về việc cấy vi khuẩn có lợi vào bể trước khi thả cá bột, nhấn mạnh rằng điều này không chỉ giảm cơ hội cho các vi khuẩn gây bệnh mà còn có tác động tích cực khi vi khuẩn có lợi phát triển trong đường ruột của cá bột Việc sử dụng khẩu phần ăn có chứa probiotics có thể

hữu ích khi cá bị stress do môi trường hoặc thao tác Trong nuôi giáp xác, probiotics cũng đóng một vai trò quan trọng Nogami và Maeda (1992) tìm hiểu về

vi khuẩn PM-4, được phân lập từ ao nuôi ghẹ, và phát hiện rằng nó giảm số lượng

Vibrio spp trong nước nuôi ghẹ (Portunus trituberculatus) và tăng năng suất ấu

trùng ghẹ

Jiravanichpaisal và Chuaychuwong (1997) sử dụng Lactobacillus sp trong nuôi tôm sú (P monodon) để hạn chế bệnh gây ra bởi nhóm Vibrio và bệnh đốm trắng, xác định được hoạt động ức chế của Lactobacillus sp trên nhóm Vibrio, E

coli và Staphylococcus sp Hiệu quả của việc sử dụng probiotics liên quan đến

nhiều yếu tố, và tuy hiện nay đã được khẳng định trong điều kiện môi trường kiểm soát tốt, nhưng chưa có sự chứng minh rõ ràng về hiệu quả khi sử dụng chúng trong môi trường ao nuôi ngoài trời với biến động lớn

1.5 Sơ lƣợc về một số vi khuẩn gây bệnh ở thủy sản

Các nhóm vi khuẩn gây bệnh trên thủy sản bao gồm vi khuẩn gây bệnh ở môi

trường nước ngọt (các chủng Aeromonas spp và Edwardsiella spp.) và môi trường nước mặn (các chủng Vibrio spp.)

1.5.1 Vi khuẩn Vibrio

Vibrio là phẩy khuẩn Gram âm, kích thước 0,3-0,5x1,4-2,6 µm được phân

lập từ môi trường nước mặn và trong đường tiêu hóa của động vật Chúng không sinh bào tử, là vi khuẩn kị khí tùy nghi, phát triển trong môi trường nước mặn và cửa sông

Vibrio là loại vi khuẩn cơ hội gây bệnh trên tôm Một số loài thường gặp là :

V cholera, V.parahaemolyticus, V.alginolyticus, V.vulnificus,…thường gây ra các

bệnh nghiêm trọng cho tôm như bệnh phát sáng, bệnh đốm trắng, bệnh hoại tử gan thận cấp tính, nếu môi trường tiếp tục tăng lượng vi khuẩn thì tôm sẽ chết rải rác rồi hàng loạt trong thời gian ngắn hoặc chuyển bệnh thành mãn tính Mùa vụ xuất hiện bệnh tùy theo địa điểm và tùy theo loài

Một số triệu chứng của thủy sản khi nhiễm Vibrio

- Tôm kéo đàn bơi lòng vòng, nổi lên mặt nước hoặc dạt bờ

- Tôm lờ đờ, kém hoặc bỏ ăn, có thể hôn mê

- Tôm, cua biến đổi màu vỏ thành xanh hay đỏ, vỏ bị ăn mòn trở nên mềm và xuất hiện các vết hoại tử

- Ấu trùng tôm có hiện tượng phát sáng, ấu trùng bào ngư chuyển hồng sang

đỏ

- Cua nhiễm bệnh sau 1 đế 2 ngày, máu có hiện tượng vón cục

- Cá mú trên thân xuất hiện các đốm xuất huyết, mù mắt

- Cá song nhiễm bệnh trên gan có các đốm trắng

1.5.2 Vi khuẩn Aeromonas

Vi khuẩn Aeromonas hydrophila thường trú ngụ tại môi trường nước ấm và

vùng nước lợ ven biển ở các khu vực có nhiệt độ nóng ẩm Loại vi khuẩn này tiết ra

ngoại độc tố tương tự vi khuẩn Vibrio cholerae gây ra bệnh tả Do vậy, khi nhiễm phải vi khuẩn Aeromonas hydrophila sẽ gây ảnh hưởng đến đường tiêu hoá và xuất

hiện các triệu chứng lâm sàng của bệnh tả ở thể nhẹ

Aeromonas có thể gây bệnh đốm đỏ trên cá nước lạnh và cá nước ấm, chúng

gây bệnh trên cá không khỏe Chúng là mầm bệnh cơ hội trong các tình huống sốc

môi trường Tỷ lệ chết ở thuỷ sản bởi Aeromonas từ 30-70% ở cá giống, có thể gây

chết 100%

Vi khuẩn Aeromonas làm thay đổi những chỉ tiêu về miễn dịch, chỉ số sinh

hóa, nhiễm trùng trong máu trên cá Chép Ấn, Trôi đen, Trôi trắng (Jaya Kumari et

al, 2005) Cá Hồi nhiễm A hydrophila có số lượng bạch cầu cao hơn (R

Čož-Rakovac, 2001)

Năm 2012, A Hydrophila đã gây chết hàng loạt cá tra (2,402 ha) tại Đồng bằng

sông Cứu long

1.5.3 Vi khuẩn Edwarsiella

Edwardsiella Ictaluri thuộc họ Hafniaceae và được mô tả như một loại vi

khuẩn hình que ngắn, gram âm, và có lông roi Vi khuẩn này gây ra bệnh nhiễm trùng huyết ở cá da trơn và có khả năng lây nhiễm cho nhiều loài cá khác nhau, đặc biệt là cá da trơn và cá nước ngọt Các triệu chứng bệnh bao gồm vết thương nhỏ trên da, khối u rỗng phát triển bên trong cơ, và mất sắc tố da Các vết thương dưới

cơ, biểu bì có thể gây hoại tử vùng cơ xung quanh

Bệnh thường xuất hiện ở nhiệt độ 30ᵒC, đặc biệt trong điều kiện ao nước bị ô nhiễm hoặc môi trường sống của cá không ổn định về nhiệt độ, độ hòa tan oxy, khi đánh bắt, hoặc vận chuyển

Khi bị nhiễm bệnh, cá có thể thể hiện những triệu chứng như ăn chậm, chán

ăn, tiết nhiều chất nhầy trên da, xuất huyết, viêm sưng và lở loét ở vị trí bị tấn công Các biểu hiện này có thể tiếp theo là cá treo thẳng đứng trên mặt nước, sưng bụng

và giảm ăn do stress Những dấu hiệu này là đặc điểm của bệnh nhiễm trùng huyết,

và cá có thể chết nhanh sau khi thấy các triệu chứng

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Mẫu đất

Mẫu để phân lập xạ khuẩn là đất ao nuôi tôm cá, đất rừng ngập mặn ở các tỉnh Thái Bình, Nam Định, An Giang Mẫu được lấy ở độ sâu 10 – 15 cm so với bề mặt, đựng trong các ống falcon 50 ml bảo quản ở 4°C và được đưa về phòng thí nghiệm khoa Sinh học – Đại học Sư phạm Hà nội phân lập từ tháng 4 đến tháng 5 năm

2022

+ Tỉnh An Giang: 9 mẫu đất thu từ ao nuôi tôm nước lợ

+ Tỉnh Thái Bình: 28 mẫu đất nước ngập mặn vùng nước lợ và vùng nước mặn + Tỉnh Nam Định: 10 mẫu đất nước vùng ngập mặn và vùng nước ngọt

trước khi sử dụng cho thí nghiệm, tôm được kiểm tra âm tính với V

parahaemolyticus, V harveyi bằng kỹ thuật PCR

2.1.4 Hoá chất

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

LB Broth (Luria Bertani Broth, Himedia, Ấn Độ)

BHI Broth (Brain Heart Infusion Broth, Himedia, Ấn Độ)

TSA (Tryptone Soya Agar, Himedia, Ấn Độ)

TCBS Agar (Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar Himedia, Ấn Độ)

Môi trường phân lập xạ khuẩn: Strach Casein Agar (HiMedia, Ấn Độ)

Môi trường xác định hình thái, đặc điểm sinh hóa International Streptomyces Project (ISP) gồm các môi trường từ ISP1 đến ISP9 theo các tác giả (Phụ lục 1) Hoá chất dùng đề tách chiết hợp chất, nhuộm: Etyl acetate, methanol, lugol, TCA 10%

2.1.5 Thiết bị thí nghiệm

Một số thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu như: Tủ cấy vô trùng (Sanyo, Nhật Bản), máy lắc Gyromax 737R (Amerex Instrument, Đức), máy PCR (Eppendorf AG 22331, Đức), nồi hấp vô trùng (Nhật), tủ ấm nuôi khuẩn (Memmert, Đức), tủ lạnh -20℃ (Sanyo, Nhật Bản), bộ điện di ngang (Advance Tech, Nhật Bản), máy vortex (IKA, Đức), máy li tâm (Sorvall, Mỹ), máy quang phổ tử ngoại khả biến (UV/VIS Spectrophotometer, Nhật Bản)

Các dụng cụ: ống nghiệm, đĩa Petri, đầu pipette, ống eppendorf, que cấy, đèn cồn, kính hiển vi, lamen, lam kính, thùng nuôi cá, máy sục khí cho bể tôm

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các mẫu vi khuẩn và

chọn lọc mẫu có hoạt tính kháng khuẩn

Định danh xác định các mẫu Streptomyces sp

Đánh giá tác động của các chủng

Streptomyces trên tôm sú

2.2.2 Phương pháp phân lập xạ khuẩn

Mẫu đất trầm tích được phơi khô ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày để loại bớt vi sinh vật trong đất (Ali et al., 2013) 1g mẫu được hoà trong 9 mL dung dịch PBS pH7, lắc kỹ trong 30 phút, sau đó, để lắng mẫu trong 15 phút, dịch nổi tiếp tục được pha loãng theo hệ số 10 để đạt nồng độ 10-6

100 µl dịch mẫu được cấy trải lên môi trường Strach Casein Agar (HiMedia,Ấn Độ) chứa cycloheximide (25 µg/mL) và nalidixic acid (50 µg/mL), đĩa nuôi cấy được giữ ở 28°C trong 1-2 tuần Khuẩn lạc của xạ khuẩn có đặc điểm rắn chắc, xù xì, có thể có dạng da, dạng phấn, dạng nhung, dạng vôi, trường hợp không có sợi khí sinh, khuẩn lạc có dạng màng dẻo (Jensen et al., 2005) Xạ khuẩn được cấy thuần trên môi trường thạch ISP2 chứa cycloheximide, nalidixic acid với nồng độ như trên

2.2.3 Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn của các mẫu xạ khuẩn Phương pháp khuếch tán thỏi thạch

Các mẫu xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường starch casein agar trong 7

ngày ở 28°C Các chủng vi khuẩn Edwarsiella ictaluri (5 chủng vi khuẩn kí hiệu E1, E2, E3, E4, E5); Aeromonas hydrophila (2 chủng vi khuẩn kí hiệu A1, A2);

Vibrio parahaemolyticus (3 chủng kí hiệu HOU/BT01, HOU/BT15, HOU/ST08); V harveyi (2 chủng kí hiệu VH/BT12, VH/ST02) được tăng sinh để đạt mật độ tương

ứng với OD (optical density) bằng 106 CFU/ml Dịch nuôi cấy vi khuẩn được cấy gạt trên đĩa LB Thỏi thạch (6 mm) của xạ khuẩn đã nuôi cấy được đặt lên trên mặt thạch ở các đĩa này, để vào ngăn mát tủ lạnh 8h để hoạt chất khuếch tán ra môi trường Đĩa thạch thí nghiệm được nuôi ở 37℃ trong 24h, hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu xạ khuẩn được xác định bằng vùng vô khuẩn hình thành xung quanh thỏi thạch

Chỉ tiêu theo dõi là đường kính vòng vô khuẩn trên đĩa thạch (mm) Đường kính vòng vô khuẩn càng lớn thì khả năng kháng khuẩn càng cao

Kích thước thực vòng vô khuẩn = D – d (mm) Trong đó D: đường kính vòng vô khuẩn, d: đường kính thỏi thạch

Tính kháng khuẩn được biểu hiện khi vòng vô khuẩn rộng hơn 2mm

D – d < 5mm: tính kháng yếu

D – d từ 5mm - 10mm: tính kháng trung bình

D – d > 10mm: tính kháng mạnh

2.2.4 Định danh loài bằng gene rRNA 16S

DNA tổng số của các mẫu xạ khuẩn được chiết tách bộ kit QIAamp DNA Blood Mini (Qiagen, Đức) theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Cặp mồi 27F: AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’ và 1492R: TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’ (Lane et al., 1991) được sử dụng để khuếch đại gen rRNA 16S có kích thước khoảng 1,5 kb Phản ứng khuếch đại gen được thực hiện bằng bộ kit PCR Master (iNtRON, Hàn Quốc) với thể tích cuối cùng là 50μl chứa khuôn mẫu DNA Các điều kiện chu kỳ nhiệt như sau: biến tính ban đầu

5’-ở 94°C trong 5 phút, 35 chu kỳ 5’-ở 94°C trong 60 giây, 57°C trong 60 giây và 72°C trong 90 giây; và kéo dài ở 72°C trong 5 phút

Các sản phẩm PCR khuếch đại đã được kiểm tra trên gel agarose 1%, được giải trình tự tại công ty giải trình tự 1st BASE, Seri Kembangan, Selangor, Malaysia Các trình tự đã được phân tích BLAST (//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast) để phân tích tương đồng Cây phát sinh chủng loại thể hiện mối quan hệ di truyền giữa chủng xạ khuẩn nghiên cứu và các loài khác hiện có trên dữ liệu GenBank được xây dựng bằng phầm mềm Mega5.0 theo phương pháp Neighbor Joining

2.2.5 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hoá

Xạ khuẩn được lấy cả phần sợi cơ chất mọc trong thạch, cơ chất khí sinh và bào tử nghiền trong 5ml nước cất vô trùng, lắc đều và thu dịch huyền phù chuyển nuôi trong bình tam giác 100 ml chứa 30 ml ISP1 Nuôi lắc 170 vòng/phút ở nhiệt

độ 28℃ Sau 48 giờ nuôi, ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút, thu cặn và rửa cặn bằng NaCl 0,85%, rửa lại 2 lần Cặn được hòa lại với 5 ml nước cất vô trùng thu được dịch cấy Dịch cấy đem cấy trên các đĩa petri chứa môi trường ISP1, ISP2, ISP3, ISP4, ISP5, ISP6, ISP7, ISP9 để theo dõi đặc điểm hình thái

Các chủng xạ khuẩn sau khi sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn sẽ được nuôi cấy trên môi trường thạch ISP1, ISP2, ISP3, ISP4, ISP5, ISP6, ISP7, ISP9 ở 30℃ để

quan sát đặc điểm hình thái dựa trên các đặc điểm nuôi cấy bao gồm: màu sắc của khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất, hình thái khuẩn lạc sau 7 ngày, 14 ngày

2.2.6 Xác định các enzyme ngoại bào của các chủng xạ khuẩn

Các mẫu xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP2 trong 7 ngày ở 30°C Đục các thỏi thạch chứa xạ khuẩn đường kính 8mm đặt lên đĩa môi trường LB agar

có chứa các cơ chất tinh bột (xác định hoạt tính amylase), sữa gầy (xác định hoạt tính protease), CMC (xác định hoạt tính cellulase) Để đĩa vào ngăn mát tủ lạnh 8h

để enzyme khuếch tán vào môi trường, sau đó để vào tủ ấm ở nhiệt độ 40°C Sau thời gian nuôi ủ, vòng phân giải thể hiện hoạt tính amylase, cellulase được kiểm tra bằng thuốc thử lugol, hoạt tính protease được nhận diện bằng dung dịch TCA 10% (trichloroacetic acid) Sau khoảng 48-60h thử bằng thuốc thử Đối với mỗi loại enzyme dùng thuốc thử đó đổ 10ml lên mặt môi trường, tráng đều và gạn thuốc thử sau 5 phút Chỉ tiêu theo dõi là đường kính vòng phân giải trên đĩa thạch (mm) Đường kính vòng phân giải càng lớn thì khả năng sinh enzyme càng cao (William

S, 1983)

Kích thước thực vòng phân giải = D – d (mm)

Trong đó D: đường kính vòng phân giải, d: đường kính thỏi thạch

D-d ≥ 25mm: hoạt tính enzyme rất mạnh

D-d ≥ 20mm: hoạt tính enzyme mạnh

D-d ≥ 10mm: hoạt tính enzyme trung bình

D-d ≤ 10mm: hoạt tính enzyme yếu

2.2.7 Xác định tế bào máu tổng số và hoạt tính phenoloxidase (PO) khi cho tôm sú sử dụng xạ khuẩn

Tôm sú được cho ăn thức ăn bổ sung riêng rẽ các chủng xạ khuẩn tiềm năng, ngày cho ăn 1 lần, liều lượng 108 CFU/g Sau khi cho ăn 15- 60 ngày, định kỳ 15 ngày 1 lần lấy máu của tôm (50 μL) bằng siringe vô trùng 1mL chứa 450 μL chất chống đông máu (30 mM trisodium citrate, 340 mM sodium chloride, 10 mM EDTA và 115 mM glucose) Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: tế bào máu tổng số, hoạt tính thực bào, hoạt tính phenoloxidase (Pope et al., 2011)

Xác định tế bào máu tổng số

Các mẫu máu tôm được nhuộm bằng Rose Bengal, thực hiện đếm tế bào máu bằng buồng đếm hồng cầu và quan sát mẫu dưới kính hiển vi (10X) Tổng số tế bào máu được tính toán theo phương pháp của Hou và Chen (2005) theo công thức:

Số tế bào máu/mL = ( )

a, b, c, d là số lượng tế bào ở 04 ô của buồng đếm

104 là thể tích buồng đếm

10 là độ pha loãng máu

Xác định hoạt tính phenoloxidase (PO)

Hoạt tính của PO được xác định theo phương pháp của Hernández- López et al., 1996, cụ thể: 100 μL máu tôm được pha trong eppendorf chứa 900 μL chất chống đông máu Ống chứa máu được ly tâm ở 800 vòng ở 4oC trong 20 phút rồi loại bỏ dịch nổi, phần kết tủa được hòa trong 1 mL dung dịch cacodylate citrate (Natri cacodylate 0,01 M, Natri clorua 0,45 M, Trinatri citrat 0,01 M, pH 7,0) và được ly tâm lại ở điều kiện như trên Kết tủa tiếp tục được hòa với 200 μL dung dịch caccodylate, 100 μL mẫu được ủ với 50 μL trypsin (1 mg/mL) trong 10 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó, 50 μL L-dihydroxy phenylalanine (L-DOPA) (Hi Media, USA) có nồng độ 3 mg/mL được thêm vào đồng thời với 800 μL cacodylate, giữ eppendorf chứa mẫu trong 5 phút Sau đó, mẫu được đo bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 490 nm Mẫu đối chứng gồm 100 μL mẫu máu tôm được ủ với 50 μL cacodylate (thay cho trypsin), và 50 μL L-DOPA

2.2.8 Xác định khả năng bảo vệ của các mẫu xạ khuẩn phân lập đối với tôm thử thách với các chủng gây bệnh

Tôm sú sạch bệnh được nuôi thuần trong các bể thuỷ tinh có dung tích 100 lít, mỗi bể 30 con tôm Tôm ở bể thí nghiệm được cho ăn bổ sung riêng rẽ các mẫu xạ khuẩn với liều 107-1011 CFU/ml trong 7 ngày, sau đó tôm ở các bể sẽ được thử thách bằng phương pháp ngâm với 5 chủng vi khuẩn thí nghiệm gồm 3 chủng

Vibrio parahaemolyticus kí hiệu HOU/BT01, HOU/BT15, HOU/ST08; 2 chủng V harveyi kí hiệu VH/BT12, VH/ST02, liều thử thách của mỗi chủng gây bệnh là 106

CFU/ml Kiểm tra tôm đã nhiễm chủng gây bệnh trên cơ sở các dấu hiệu đặc trưng của bệnh và phân lập lại từ mẫu nội tạng của tôm ở môi trường chọn lọc, xác định lại chủng vi khuẩn gây bệnh bằng phương pháp PCR Tiếp tục nuôi tôm thí nghiệm trong 15 ngày với thức ăn bổ sung xạ khuẩn

Ở bể đối chứng xạ khuẩn, tôm được cho ăn hằng ngày với thức ăn bổ sung các mẫu xạ khuẩn theo liều như tôm thí nghiệm; bể đối chứng thử thách, tôm được ngâm riêng rẽ với các chủng vi khuẩn thí nghiệm, thức ăn của nhóm này không chứa xạ khuẩn

Sự gia tăng về tỷ lệ sống sót giữa nhóm cho ăn xạ khuẩn và không có xạ khuẩn được tính theo công thức sau:

Sự gia tăng Survival rate (%) = (A/30-B/30) x100 trong đó: A: số tôm ăn xạ khuẩn sống sót sau 15 ngày thử thách

B: số tôm không ăn xạ khuẩn sống sót sau 15 ngày thử thách

30: số tôm trong mỗi bể

2.2.9 Xác định hoạt tính thực bào

Hoạt tính thực bào được xác định theo phương pháp của Lin et al., 2013 Tôm sau khi được cho ăn xạ khuẩn 15 ngày thì được thử thách riêng rẽ với 20 μL

của các chủng vi khuẩn có độc tính cao bao gồm V parahaemolyticus HOU/BT15,

V harveyi VH/ST02 (106 CFU/ml) Tôm thí nghiệm được đưa trở lại bể trong 3 giờ rồi lấy máu để kiểm tra hoạt tính thực bào 50μL máu tôm được pha với 50μL dung dịch chống đông rồi ủ ở 4oC trong 30 phút Sau đó, 50μL mẫu được đưa vào máng chứa lam kính (Shandon, UK) của máy Cytospin 4 rồi ly tâm với tốc độ 1.000 vòng/phút trong 3 phút Sau khi ly tâm, lam kính đã gắn mẫu được ngâm 5 phút trong ethanol 95% (Thermo Scientific, USA) và làm khô tự nhiên trong không khí Mẫu được nhuộm bằng dung dịch Giemsa trong 30 phút và quan sát bằng kính hiển

vi quang học Các tế bào máu thực hiện chức năng thực bào bao gồm tế bào hạt, tế bào bán hạt và tế bào Hyaline Hoạt tính thực bào, còn gọi là tỷ lệ thực bào được tính theo qua công thức sau:

Tỷ lệ thực bào (%) =

2.2.10 Đánh giá khả năng tăng cường chuyển hoá thức ăn và tăng trưởng ở tôm sú

Tôm sú được bố trí ngẫu nhiên 60 con/bể Hằng ngày cho ăn thức ăn bổ sung riêng rẽ xạ khuẩn tiềm năng, ngày cho ăn 1 lần, liều lượng 108 CFU/g Bể đối chứng

không sử dụng xạ khuẩn Tôm thí nghiệm được theo dõi trong vòng 60 ngày

Hằng ngày quan sát các biểu hiện bắt mồi và vận động của tôm, đồng thời, ghi nhận số tôm chết Định kỳ 15 ngày/lần kiểm tra trọng lượng, sau 60 ngày thí nghiệm, thu hoạch toàn bộ tôm thí nghiệm để xác định trọng lượng cuối cùng

Các thông số theo dõi được tính toán theo các công thức sau:

Tỷ lệ sống (%) = (Số tôm tại ngày thứ 60 × 100)/ Số tôm ban đầu

Tỷ lệ gia tăng khối lượng (WG-weight gain): WG (%) = (Wf - Wi) *100/Wi

Hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR: Food Conversion Ratio) FCR = Tổng lượng thức

ăn tiêu thụ (kg)/ Tổng khối lượng tôm thu được (kg)

2.2.11 Bảo quản chủng giống:

Để bảo quản chủng giống, các chủng xạ khuẩn đã được làm thuần trên môi trường SCA đem bảo quản trong dung dịch glycerin 20% ở -20ᵒC

2.2.12 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu thí nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học bằng chương trình Microsoft Exel (2010) và phần mềm xử lý thống kê SPSS (ver.20) Sự sai khác giữa các giá trị được xác định bằng phân tích NOVA với α = 0,05

PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Kết quả phân lập xạ khuẩn

Từ các mẫu thu từ ao nuôi tôm của tỉnh An Giang, Thái Bình, Nam Định tiến hành phân lập các chủng xạ khuẩn Sau 7-11 ngày, nhiệt độ tủ nuôi ở 28°C trong điều kiện hiếu khí các khuẩn lạc xuất hiện Từ các đĩa phân lập, lựa chọn những khuẩn lạc có đặc điểm hình thái giống xạ khuẩn: bề mặt khô ráo, bám chắc vào môi trường… được nuôi thuần trên môi trường SCA Kết quả phân lập và lưu giữ được

40 mẫu có hình thái khuẩn lạc giống xạ khuẩn Các mẫu đã được làm thuần và bảo quản trong dung dịch glycerin 20% ở -20ᵒC

Hình 3.1 Một số hình ảnh xạ khuẩn đã phân lập

Phần lớn các khuẩn lạc có màu trắng hoặc xám, một số ít có màu vàng, nâu hoặc xanh biển Bề mặt khuẩn lạc có dạng da, dạng nhung, dạng vôi, dạng phấn… Một số chủng có mùi hương rất mạnh

Từ kết quả thu được cho thấy, mẫu thu được từ vùng đất ngập mặn và nước ngọt của tỉnh Nam Định cho số lượng xạ khuẩn 17 mẫu, từ vùng đất ngập mặn và lợ của tỉnh Thái Bình cho số lượng xạ khuẩn 14 mẫu, mẫu từ ao nuôi tôm nước lợ của

An Giang cho 9 mẫu được thể hiện trong bảng 3.1 và hình 3.1

Bảng 3.1: Bảng miêu tả màu sắc các khuẩn lạc các mẫu xạ khuẩn

STT Kí hiệu Đặc điểm hình thái STT Kí hiệu Đặc điểm hình thái

1 AG8.9 Khuẩn lạc bào tử trắng, mặt

phía sau màu nâu 21 TBL 12 Khuẩn lạc vàng

2 AG12.1 Khuẩn lạc màu trắng vàng 22 TBL 1.3 Khuẩn lạc trắng xanh

3 AG2 Khuẩn lạc màu nâu 23 TBL 10.1 Khuẩn lạc trắng nhợt

4 AG1 Khuẩn lạc vàng trắng 24 NĐ 12.6 Khuẩn lạc trắng nhợt

5 AG12 Khuẩn lạc trắng 25 NĐ3 Khuẩn lạc màu trắng, mặt

phía sau trắng

6 AG8 Khuẩn lạc trắng, mặt sau nâu 26 NĐ7 Khuẩn lạc màu trắng, viền hồng

7 AG 6 Khuẩn lạc cam bào tử đen 27 NĐ5 Khuẩn lạc trắng bào tử màu

12 TBL 2 Khuẩn lạc trắng xanh 32 NĐ 1.3 Khuẩn lạc trắng

13 TBL 3 Khuẩn lạc trắng vàng 33 NĐ 1.4 Khuẩn lạc trắng nhợt, sinh

18 TBL 8 Khuẩn lạc trắng, bào tử xám 38 NĐ 10.2 Khuẩn lạc trắng, nhỏ

19 TBL7 Khuẩn lạc trắng, bào tử đen 39 NĐ 10.3 Khuẩn lạc trắng

20 TBL 9 Khuẩn lạc vàng 40 NĐ 10.4 Khuẩn lạc trắng, bào tử xám

3.2 Đánh giá khả năng kháng khuẩn trong điều kiện in vitro của các mẫu xạ

khuẩn phân lập

Các mẫu xạ khuẩn đã phân lập được nuôi cấy trên môi trường starch casein

agar trong 7 ngày Đánh giá khả năng ức chế các chủng vi khuẩn Edwarsiella

ictaluri (5 chủng vi khuẩn kí hiệu E1, E2, E3, E4, E5); Aeromonas hydrophila (2

chủng vi khuẩn kí hiệu A1, A2); Vibrio parahaemolyticus (3 chủng kí hiệu HOU/BT01, HOU/BT15, HOU/ST08); V harveyi (2 chủng kí hiệu VH/BT12,

VH/ST02) bằng phương pháp khuếch tán thỏi thạch (6 mm) Hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu xạ khuẩn được xác định bằng vùng vô khuẩn hình thành xung quanh thỏi thạch

Kết quả sàng lọc 40 mẫu xạ khuẩn đã chọn lọc được 20 mẫu xạ khuẩn có khả năng kháng các chủng vi khuẩn thí nghiệm Kết quả đánh giá được thể hiện trong bảng 3.1; 3,2; 3.3 và hình 3.2; hình 3.4

Bảng 3.2 Khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của các chủng xạ khuẩn phân

5 26.30.

6

8.60.

6 8.21.0 15.31 91.1 28 3 - 130 81.0 121.1 HOU/ST0

0 -

11.32.

1 6.71.1 - 161 9 3 - 16.01.

0 - E2 15.30.

6 - - - - 141 - - 13.70.

6 - E4 10.01.

0 - - - - 201 - - 10.01.

0 - E5 10.31.

1

6.71.

1 - - - 151 9 3 - 10.31.

1 A1 9.62.5 6.70.

6 9.11.1 16 3 71.1 29 3 - 13 3 90.2 111.

0 A2 9.01.7 - 7.21.2 16 3 111.2 29 3 9 3 13 3 91.0 111.1

Bảng 3.3 Khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của các chủng xạ khuẩn phân

lập từ An Giang

Các chủng

Vi khuẩn

Vòng vô khuẩn ở thỏi thạch của các chủng xạ khuẩn (D – d (mm)

AG8.9 AG12.2 AG8.1 AG 12.1 AG 6 AG12

HOU/BT01 28.1

 1.0 16.1 1.0 11.0  1.0 29.0  0.1 13.0

1.0 9.0 0.0 HOU/BT15 26.2  3 15.1  0.5 9.0  1.0 28.3  0.7 13  0.0 8.0  1.0

HOU/ST08 26.1  3 15.3  0.3 11.3  0.7 28.3  1.0 12.0  0.0 8.3  0.7

VB/BT12 26.3  3 18.0  1.0 13.1  1.3 27.2  1.1 13.0  1.0 12.3  0.3 VH/ST02 26.1  3 17.0  1.0 13.2  1.0 28.0  1.0 15.3  0.7 12.2  0.3 E1 14.1  3 - 11  3 9.1  1.1 13  3 -