Khả năng kháng khuẩn của chủng probiotic đối với vi khuẩn sinh men b lactamase phổ rộng (ESBL)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HCM KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC BỘ MƠN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGÔ THANH PHONG KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHỦNG PROBIOTIC ĐỐI VỚI VI KHUẨN SINH MEN β-LACTAMASE PHỔ RỘNG (ESBL) Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã ngành: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ Tp HCM, tháng 05 năm 2018 CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐHQG Tp-HCM Cán hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thúy Hƣơng Cán chấm nhận xét 1: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng Cán chấm nhận xét 2: TS Võ Đình Lệ Tâm Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ Trƣờng Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 26 tháng 05 năm 2018 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: Chủ tịch hội đồng : PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƢỢNG Phản biện 1: PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG Phản biện 2: TS VÕ ĐÌNH LỆ TÂM Ủy viên: TS HỒNG ANH HỒNG Thƣ ký: TS HUỲNH NGỌC OANH Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trƣởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn đƣợc sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƢỢNG TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Ngô Thanh Phong MSHV: 1570769 Ngày, tháng, năm sinh:20/11/1990 Nơi sinh: Vĩnh Long Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số: 60420201 I TÊN ĐỀ TÀI: Khả kháng khuẩn chủng probiotic vi khuẩn sinh men β-lactamase phổ rộng (ESBL) II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Tuyển chọn số chủng probiotic có khả kháng khuẩn vi khuẩn sinh men β-lactamase phổ rộng (ESBL) - Sàng lọc chủng probiotic phân lập đƣợc có khả kháng với chủng vi khuẩn sinh men -lactamase phổ rộng ESBL (Escherichia coli, Salmonella Newport Salmonella Bovismorbificans) - Khảo sát số hoạt tính chủng sàng lọc - Khảo sát khả kháng chủng vi khuẩn sinh ESBL với chủng tuyển chọn phƣơng pháp nuôi cấy đồng thời - Bảo quản định hƣớng tạo chế phẩm men vi sinh III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 10/07/2017 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 17/06/2018 V CÁN BỘ HƢỚNG DẪN: PGS TS Nguyễn Thúy Hƣơng Tp HCM, ngày tháng năm 2018 CÁN BỘ HƢỚNG DẪN PGS.TS Nguyễn Thúy Hƣơng CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO PGS.TS Nguyễn Thúy Hƣơng TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân trọng cảm ơn: - PGS TS Nguyễn Thúy Hƣơng hƣớng dẫn tận tình giúp đỡ suốt thời gian nghiên cứu luận văn Thạc sĩ - Các thầy cô Khoa Kỹ Thuật Hóa học, Bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học, sau đại học trƣờng Đại học Bách Khoa TPHCM - Đồng nghiệp Labo Vi Sinh Vật - Trung tâm Kiểm Nghiệm An Tồn Thực Phẩm Khu Vực Phía Nam – Viện Y tế Công Cộng TPHCM tạo điều kiện tốt để thực luận văn tốt nghiệp - Đặc biệt, xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến cha mẹ động viên, hỗ trợ mặt để tơi hồn thành tốt nghiên cứu TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Chúng tơi thực nghiên cứu nhằm mục đích tuyển chọn số chủng vi khuẩn probiotic có khả kháng chủng vi khuẩn sinh men β-lactamase phổ rộng (ESBL) Từ 324 chủng vi khuẩn probiotic, sàng lọc đƣợc chủng có khả kháng với chủng Escherichia coli, Salmonella Newport, Salmonella Bovismorbificans sinh ESBL có hoạt tính probiotic Trong đó, chúng tơi tuyển chọn đƣợc chủng Lactobacillus pentosus (L33.5) vừa có khả kháng chủng vi khuẩn sinh ESBL vừa mang hoạt tính cao chủng probiotic Số lƣợng vi khuẩn sinh ESBL giảm rõ rệt đƣợc nuôi cấy đồng thời với Lactobacillus pentosus (L33.5) giảm nhiều tỷ lệ kháng 1:1, tỷ lệ giảm sau 4h nuôi cấy Escherichia coli, Salmonella Newport Salmonella Bovismorbificans lần lƣợt 22,39%, 21,97%, 25,41% Sau thời gian tháng, bảo quản chủng Lactobacillus pentosus (L33.5) phƣơng pháp đơng khơ có tỉ lệ sống cao 96,80% Đồng thời, chế phẩm men vi sinh Lactobacillus pentosus (L33.5) phối trộn sữa bột có tỷ lệ sống đạt 81,25% sau tuần bảo quản This study is aimed to select a number of probiotic strains resistant to extended spectrum beta-lactamase (ESBL) producing strains From 324 probiotic strains, we screened strains that expressed resistance to ESBL- Escherichia coli, ESBL- Salmonella Newport, ESBL- Salmonella Bovismorbificans and probiotic activity As the result, we selected Lactobacillus pentosus strain L33.5 which had strong resistance against these ESBL producing strains when they have been cocultured in the fluid media with rate of 1:1 then the strongest decline ESBL producing strains Escherichia coli 22,39%, Salmonella Newport 21,97%, Salmonella Bovismorbificans 25,41% The lyophylization method for preservation of Lactobacillus pentosus strain L33.5 is stable storage (96,80%) for months Besides, this strain maintained a stable survival rate of 81,25% after 3-week mixing with milk powder LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học độc lập riêng Các số liệu sử dụng phân tích luận văn có nguồn gốc rõ ràng, công bố theo quy định Các kết nghiên cứu luận văn tơi tự tìm hiểu, phân tích cách trung thực, khách quan phù hợp với thực tiễn Việt Nam Các kết chƣa đƣợc công bố nghiên cứu khác Học viên Ngô Thanh Phong MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan probiotic 1.1.1 Khái niệm probiotic 1.1.2 Một số chủng vi khuẩn đƣợc sử dụng làm probiotic 1.1.2.1 Vi khuẩn sinh acid lactic (LAB) 1.1.2.2 Bifidobacterium sp 1.2 Vi khuẩn kháng kháng sinh vi khuẩn sinh men β-lactamase phổ rộng (ESBL) 1.2.1 Lịch sử định nghĩa vi khuẩn kháng kháng sinh 1.2.2 Tình hình nhiễm khuẩn sinh men β-lactamase phổ rộng (ESBL) giới 1.2.3 Tình hình nhiễm khuẩn sinh men β-lactamase phổ rộng (ESBL) Việt Nam 1.3 Các chế tác động vi khuẩn probiotic 10 1.3.1 Chức rào cản 10 1.3.2 Cạnh tranh với vi khuẩn gây bệnh 11 1.3.3 Tăng cƣờng hệ miễn dịch 11 1.3.4 Ức chế mầm bệnh 12 1.3.5 Bacteriocin – hợp chất kháng khuẩn điển hình vi khuẩn sinh acid lactic 15 1.3.6 Tính an tồn chủng probiotic 18 1.4 Tình hình nghiên cứu khả kháng khuẩn chủng probiotic 20 1.4.1 Thế giới 20 1.4.2 Việt Nam 22 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Vật liệu 24 2.1.1 Các chủng vi khuẩn khảo sát 24 2.1.2.Vi khuẩn thị 24 2.2 Dụng cụ - thiết bị - mơi trƣờng hóa chất 24 2.2.1 Dụng cụ 24 2.2.2 Thiết bị 25 2.2.3 Mơi trƣờng hóa chất 25 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Sàng lọc chủng probiotic có khả kháng với chủng vi khuẩn thị sinh ESBL 27 2.3.2 Khảo sát số hoạt tính chủng sàng lọc 28 2.3.2.1 Khả chịu acid muối mật chủng probiotic 28 2.3.2.2 Định lƣợng L (+) acid lactic D (-) acid lactic 29 2.3.2.3 Thử nghiệm khả sinh yếu tố gây độc 30 2.3.2.4 Thử nghiệm tính kháng kháng sinh 30 2.3.3 Khảo sát khả kháng chủng vi khuẩn thị sinh ESBL chủng tuyển chọn phƣơng pháp nuôi cấy đồng thời 31 2.3.4 Bảo quản định hƣớng tạo chế phẩm men vi sinh 33 2.3.4.1 Bảo quản chủng probiotic 33 2.3.4.2 Định hƣớng tạo chế phẩm probiotic 35 2.4 Xử lý số liệu 36 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 37 3.1 Kết sàng lọc chủng probiotic khả kháng chủng vi khuẩn thị sinh ESBL 37 3.2 Khảo sát số hoạt tính chủng sàng lọc 39 3.2.1 Khả chịu acid muối mật chủng probiotic 39 3.2.2 Kết định lƣợng L (+) acid lactic D (-) acid lactic 43 3.2.3 Kết đánh giá khả sinh yếu tố gây độc 44 3.2.4 Kết đánh giá khả kháng kháng sinh 44 3.3 Kết khảo sát khả kháng chủng vi khuẩn thị sinh ESBL với chủng tuyển chọn phƣơng pháp nuôi cấy đồng thời 47 3.4 Bảo quản định hƣớng tạo chế phẩm men vi sinh 50 3.4.1 Bảo quản chủng probiotic 50 3.4.2 Định hƣớng tạo chế phẩm probiotic 51 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 4.1 Kết luận 54 4.2 Kiến nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AM Ampicillin C Chloramphenicol CAZ Ceftazidime CL Clindamycin CTX Cefotaxime ESBL Extended spectrum beta-lactamase Er Erythromycin FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations GRAS Generally Recognized as Safe GM Gentamycin LAB Vi khuẩn sinh acid lactic KM Kanamycin ST Streptomycin TE Tetracycline V Vancomycin WHO World Health Organization DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số chủng probiotic thƣờng đƣợc bổ sung vào thức ăn cho ngƣời động vật Bảng 1.2 Một số chế tác động probiotic lên tế bào ruột ngƣời14 Bảng 1.3 Bacteriocin số loài vi khuẩn Lactobacillus 17 Bảng 2.1 Chủng vi khuẩn thị sinh ESBL 24 Bảng 2.2 Diễn giải hoạt tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn đĩa thạch 28 Bảng 2.3 Tiêu chí xác định nhạy cảm với kháng sinh 31 Bảng 2.4 Nồng độ vi khuẩn sau tăng sinh 32 Bảng 2.5 Khả ức chế vi khuẩn probiotic với vi khuẩn sinh ESBL qua với tỉ lệ nhiễm khác 33 Bảng 2.6 Khảo sát điều kiện bảo quản chủng probiotic 34 Bảng 2.7 Khảo sát tỉ lệ sống vi khuẩn probiotic chế phẩm 36 Bảng 3.1 Hoạt động kháng khuẩn chủng probiotic với vi khuẩn thị 37 Bảng 3.2 Kết thử nghiệm yếu tố gây độc chủng probiotic 44 Bảng 3.3 Kết thử nghiệm kháng sinh đồ chủng probiotic 45 Bảng 3.4 Kết tỉ lệ sống chủng L pentosus (L33.5) thời gian bảo quản 50 Bảng 3.5 Kết tỉ lệ sống chủng L pentosus (L33.5) chế phẩm probiotic 52 ... chọn số chủng vi khuẩn probiotic có khả kháng chủng vi khuẩn sinh men β -lactamase phổ rộng (ESBL) Từ 324 chủng vi khuẩn probiotic, chúng tơi sàng lọc đƣợc chủng có khả kháng với chủng Escherichia... animalis, B thermophilum, B breve, B longum, B infantis B lactis [16] 1.2 Vi khuẩn kháng kháng sinh vi khuẩn sinh men β -lactamase phổ rộng (ESBL) 1.2.1 Lịch sử định nghĩa vi khuẩn kháng kháng sinh. .. trùng vi khuẩn sinh ESBL gây Trong đó, vi? ??c sử dụng probiotic kháng lại vi khuẩn sinh men  -lactamase phổ rộng hƣớng nghiên cứu khả thi giới xu [1] Đề tài ? ?Khả kháng khuẩn chủng probiotic vi khuẩn