Bài viết trình bày kết quả nghiên cứu về tác dụng của hai chất thuộc nhóm Benzimidazon là LAN và OM lên các enzim của quá trình đường phân của Streptococcus mutans UA159 và tác dụng ngăn chặn sự ức chế hoạt tính của các enzim này nhờ tác phân khử Β-MCE.
28(3): 66-70 9-2006 Tạp chí Sinh học -mercaptoethanol ngăn chặn khả ức chế benzimidazon hoạt tính số enzim đờng phân chủng vi khuẩn Streptococcus mutans UA159 Nguyễn Thị Mai Phơng Viện Công nghệ sinh học Robert E Marquis Trờng đại học Rochester, Hoa Kỳ Các chất benzimidazon dẫn suất chúng nh omeprazon (OM) hay lansoprazon (LAN), đợc sử dụng rộng rãi để kiểm soát sinh axit mức thông qua ức chế enzim H+/K+ PATPaza tế bào tiết axit [6, 9] Các chất đợc sử dụng rộng rãi để điều trị bệnh viêm loét dày Benzimidazon có số tính chất đặc biệt Thứ nhất, chất phân cực; điều có nghĩa qua màng tế bào cách dễ dàng Thứ hai, chúng bazơ yếu (pKi = 4,0 - 5,0), tập trung phận tÝch l axit Thø ba, chóng rÊt kh«ng bỊn dung dịch axit; thời gian phân hủy chúng khoảng phút pH = 1,0 khoảng 20 phút pH = 7,4 Do đó, benzimidazon tiỊn chÊt (prodrug), cã thĨ tËp trung t¹i bé phËn bị axit hóa tế bào đích đó, đợc chuyển thành dạng hoạt động (active form) [7, 9] Cơ chế tác động benzimidazon nói chung xảy bắt đầu việc đợc proton hoá để tạo thành sunphenamit, dạng hoạt động Dạng hoạt hoá tơng tác cộng hóa trị với nhóm sunphydryn gốc xystêin vùng ngoại bào enzim H+/K+ P-ATPaza, ức chế hoạt tính enzim [3] Công trình nghiên cứu Olbe cs [9] phát thấy tác nhân khử nh dithiothreton (DTT) hay glutathion (GSH) có khả ngăn chặn tạo liên kết S-S benzimidazon enzim đích, làm tác dụng chóng Sù axit hãa còng lµ u tè chÝnh cđa bệnh đờng miệng, mà trớc tiên bệnh sâu răng, dẫn đến làm sói mòn chất khoáng gây sâu Vi khuẩn liên quan trực tiếp đến bệnh sâu đột biến streptococci có khả 66 chịu axit cao có khả đờng phân hóa mạnh Các loại đờng nh glucoza, sacroza, fructoza sau đợc tế bào vi khuẩn tiếp nhận thông qua hệ thống enzim vận chuyển đờng photphotransferaza (PTS), đợc đồng hoá nhờ trình đờng phân để sinh axit có axit lactic, nguyên nhân trực tiếp gây sâu [1] Kết nghiên cứu trớc [8] phát thấy benzimidazon có khả ức chế mạnh sinh axit tế bào streptococci Các chất có tác dụng ức chế enzim màng tham gia vào trình vận chuyển đờng PTS FATPaza Vậy enzim trình đờng phân có phải đích tác dụng chất benzimidazon hay không tác nhân khử nh GSH hay -mercaptoethanol (-MCE) có khả ngăn chặn ức chế hoạt tính enzim chất benzimidazon hay không vấn đề cần phải tiếp tục làm sáng tỏ Bài báo trình bày kết nghiên cứu tác dụng hai chất thuộc nhóm benzimidazon LAN OM lên enzim trình đờng phân Streptococcus mutans UA159 tác dụng ngăn chặn ức chế hoạt tính enzim nhờ tác nhân khử -MCE I phơng pháp nghiên cứu Nguyên liệu Chủng vi khuẩn Streptococcus mutans UA159 quà tặng giáo s Robert E Marquis, Trờng đại học Rochester, Hoa Kỳ Đây chủng vi khuẩn có lý lịch rõ ràng đợc nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu sâu giới sử dụng OM hay LAN enzim, hóa chất dùng nghiên cứu đợc mua từ hãng Sigma (Hoa Kỳ) Phơng pháp a Chuẩn bị tế bào thấm (permeabilized cells) - Tế bào, sau đợc rửa hai lần dung dịch muối KCl 50 mM có chứa MgCl2 mM, đợc hoà đệm tris-HCl 75 mM (pH = 7,0) cã chøa MgSO4 10 mM Sau thêm toluen (tỷ lệ 1:10), dịch tế bào đợc trộn ®Ịu vµ đ ë 37°C TÕ bµo đợc nhanh chóng làm đông lạnh sau đợc làm tan 37C Chu kỳ đợc lặp lại hai lần Toluen đợc loại bỏ cách ly tâm Tế bào thấm đợc hòa trở lại đệm tris-HCl đợc cất giữ 70C đến dùng đợc dùng trực tiếp cho phân tích b Xác định hoạt độ enzim - Hoạt độ enzim glyxêraldehyt-3phốtphát dehydrogenaza (GAPDH) đợc xác định theo phơng pháp Scheek Slater [10] Hoạt độ enzim đợc xác định thông qua việc theo dõi trình khử NAD+ thành NADH tế bào thấm đáp ứng lại bổ sung glyxêraldehyt-3-phốtphát vào hỗn hợp phản ứng Một đơn vị hoạt độ enzim GAPDH lợng enzim cần thiết để khử àmole NAD+ thành NADH phút điều kiện phản ứng - Hoạt độ pyruvat kinaza (PK) đợc xác định theo phơng pháp mô tả Iwami & cs [5] Hoạt độ enzim đợc xác định dựa lợng pyruvat đợc tạo thành Pyruvat đợc định lợng nhờ enzim lactat dehydrogenaza với có mặt NADH Một đơn vị hoạt độ enzim lợng enzim cần thiết để biến đổi àmole phốtpho enol pyruvat (PEP) thành pyruvat phút điều kiện phản ứng - Hoạt độ lactat dehydrogenaza (LDH) đợc xác định theo phơng pháp Iwaimi & cs [5] dựa việc đo thay đổi độ hấp thụ A340 tơng ứng với oxi hoá NADH thành NAD+ khử pyruvat thành lactat Một đơn vị hoạt độ LDH lợng enzim cần thiết để lµm chun hãa µmole pyruvat thµnh lactat mét phút điều kiện phản ứng - Hoạt độ aldolaza đợc xác định phơng pháp quang phổ dựa biến đổi NADH thành NAD+ có mặt GAPDH trio phốtphat isomeraza [5] Một đơn vị hoạt độ aldolaza lợng enzim cần thiết để làm chuyển hóa àmole fructoza 1,6bi-phốtphat thành fructoza 6-phốtphat phút điều kiện phản ứng tơng ứng với oxy hóa NADH thành NAD+ II Kết thảo luận Benzimidazon ức chế hoạt độ số enzim trình đờng phân chủng vi khuẩn S mutans UA159 Đờng phân chức vi khuẩn gây bệnh sâu nh đột biến streptococci [1] Trong mảng bám (dental plaque) tồn chu trình pH luân phiên cao thấp, tuỳ thuộc vào mức ®é tiªu thơ ®−êng cđa vËt chđ Sù sinh tr−ëng vi khuẩn xảy pha pH cao Ngay đột biến streptococci, tác nhân gây sâu răng, sinh trởng giá trị pH < 5,0 chúng tiến hành trình đờng phân Vì thế, đờng phân chìa khoá tính gây bệnh vi khuẩn chịu axit nằm mảng bám nh S mutans Sự ức chế trình đờng phân LAN OM mà phát trớc ®©y ë chđng S mutans GS-5, d−êng nh− còng cã liên quan đến enzim đờng phân tế bào chất Để kiểm tra giả thiết này, lựa chọn bốn enzim trình đờng phân chđng S mutans UA159 lµ aldolaza, GAPDH, PK vµ LDH để nghiên cứu Kết hình cho thấy tất enzim chịu tác động OM LAN Các enzim aldolaza, GAPDH LDH tỏ nhạy cảm rõ rệt với benzimidazon, aldolaza enzim nhạy cảm Hoạt độ enzim lại khoảng 30% so với đối chøng sau xư lý víi OM vµ LAN 0,5 mM GAPDH nhạy cảm với tác nhân nghiên cứu nhạy cảm LDH Hoạt độ lại GAPDH LDH theo thứ tự khoảng 50% 60% nồng độ OM LAN 0,5 mM PK tỏ không bị ức chế OM LAN Sự nhạy cảm GAPDH, aldolaza LDH enzim có chứa nhóm thiol trung tâm hoạt động, dễ dàng tạo liên kết cộng hoá trị thông qua 67 cầu S-S với OM LAN dạng hoạt động, dẫn đến làm hoạt tính enzim Các chất benzimidazon dờng nh qua màng tế bào tơng tác với đích tác dụng bên tế bào Sự thâm nhập có lẽ thực đợc nhờ việc màng tế bào bị phá huỷ từ trớc đó, trình bảo vệ tế bào khỏi bị tổn thơng môi trờng bị axit hoá Có thể thấy benzimidazon dờng nh không tác nhân kháng vi khuẩn đờng miệng có triển vọng mà có tác dụng lên đối tợng vi khuẩn khác Tuy nhiên, để tác nhân có tác dụng, pH môi trờng phải pKa OM LAN nằm khoảng 4,0 Nh vậy, mảng bám ví dụ tốt để tác nhân kháng khuẩn kiểu phát huy tác dụng Một điều thú vị là, trung tâm nhiễm khuẩn, pH thờng bị giảm thÕ c¸c chÊt kh¸ng khn kiĨu benzimidazon sÏ cã hiƯu Đối với thể thực bào, pH bên thực bào thờng giảm xuống đủ thấp để hoạt hóa benzimidazon, nhờ giết chết tế bào bị bao vây Tuy vậy, số trờng hợp, benzimidazon tác dụng, ví dụ nh vị trí bị viêm quanh răng, pH dờng nh lại có xu hớng tăng lên có trình phân huỷ protein [8] 120 % so víi ®èi chøng % so víi ®èi chøng 120 90 60 30 90 60 30 DC §C OM OM LAN LAN GAPDH Aldolaza 120 % so víi ®ãi chøng % so víi ®èi chøng 120 90 60 30 §C OM LAN 90 60 30 LDH §C OM LAN PK Hình Tác dụng ức chế OM LAN lên hoạt độ số enzim trình đờng phân chủng vi khuẩn S mutans UA159 OM (0,5 mM) LAN (0,5 mM) đợc ủ với tế bào nguyên vẹn 30 phút pH 5,0, trớc tiến hành tạo tế bào thấm để xác định hoạt độ enzim -mercaptoethanol ngăn chặn ức chế hoạt độ số enzim trình đờng phân chủng S mutans UA159 gây chất benzimidazon Các nghiên cứu trớc [2, 4] cho thấy chế để chất benzimidazon ức chế trình đờng phân dờng nh giống với chế tác dụng chất lên P-ATPaza Cơ chế đặc trng việc hình thành cầu disulphit 68 tác nhân kháng khuẩn protein đích Giá trị pH thích hợp cho liên kết nằm khoảng pH < 5,0, khoảng pH cho phép proton hoá benzimidazon thành dạng hoạt động Các kết trình bày hình cho thấy, có mặt OM LAN 0,5 mM ức chế hoạt độ enzim aldolaza, GAPDH, LDH khoảng từ 4070% so với đối chứng -MCE nồng độ mM hầu nh ảnh hởng tới hoạt độ enzim Tuy nhiên, có mặt đồng thời hai chất hoạt độ enzim nghiên cứu không bị ức chế LAN hay OM Phát đợc tìm thấy số công trình nghiên cứu trớc với vi khuẩn Helicobacter pylori [9] Sự ngăn chặn khả ức chế hoạt độ enzim benzimidazon nhờ -MCE dờng nh đơn giản MCE phản ứng với benzimidazon để trung hoà chúng, nhờ ngăn cản hình thành cầu disunphit benzimidazon enzim đích Điều đợc chứng minh thí nghiệm tác nhân phải 80 40 Aldolaza % so v í i ® è i c h ø n g 120 120 120 % so ví i ® è i ch ø n g % so ví i ®è i ch øn g 160 đợc thêm vào hỗn hợp phản ứng có tác dụng Tuy nhiên, chế chi tiết phản ứng ngăn chặn ức chế cha đợc xác định Tác dụng ngăn chặn ức chế hoạt độ enzim đờng phân benzimidazon đợc phát thấy với tác nhân khử GSH (số liệu không trình bày đây), nhng mức độ yếu so với -MCE Nh vậy, tác dụng benzimidazon thực tế bị giảm đáng kể có mặt tác nhân khử Đây điều cần lu ý trình trị liệu sử dụng chất kháng khuẩn kiểu 90 60 30 GAPDH 90 60 30 LDH H×nh Tác dụng -MCE đến khả ức chế OM LAN số enzim trình đờng phân chủng vi khuẩn S mutans UA159 (1) ®èi chøng; (2) LAN 0,5 mM; (3) OM 0,5 mM; (4) β-MCE 1mM; (5) LAN 0,5 mM + β-MCE mM; (6) OM 0,5 mM + β-MCE mM Các tế bào nguyên vẹn (intact cells) đợc ủ víi LAN (0,5 mM) hay OM (0,5 mM) vµ β-MCE (1 mM) 15 ë pH 5,0 tr−íc tiến hành tạo tế bào thấm để xác định hoạt độ enzim III Kết luận Ngoài khả ức chế enzim P-ATPaza hay enzim sinh amonia acginin deiminaza ureaza nh công bố trớc đây, hai benzimidazon nghiên cứu OM LAN có khả ức chế hoạt độ số enzim trình đờng phân chủng vi khuẩn S mutans UA159 aldolaza, GAPDH LDH Các tác nhân khử nh -MCE hay GSH có tác dụng ngăn chặn khả ức chế OM LAN hoạt độ enzim Nh vậy, benzimidazon tác nhân kháng vi khuẩn ®−êng miƯng còng nh− c¸c vi sinh vËt kh¸c, cã hiệu thông qua nhiều chế tác dụng khác Tài liệu tham khảo Hamilton I R and Buckley N D., 1991: Oral Microbiol Immunol., 6: 65-71 Howden C I., 1991: Clin Pharmacol., 20: 38-49 Im W B et al., 1985: J Biol Chem., 260: 4591-4597 Iwahi T et al., 1991: Antimicrob Agents Chemother., 35: 490-496 Iwaimi Y et al., 1992: Oral Microbiol Immunol., 7: 304-308 Kazimierczuk Z et al., 2002: Acta Biochim Polon., 49: 185-195 Magalhaes P P et al., 2003: Arch Oral Biol., 48: 815-824 Nguyen P T M et al., 2005: Oral Microbiol & Immunol., 20: 93-100 Olbe L et al., 2003: Nature Rev., 2: 132139 10 Scheek R M and Slater E C., 1982: In: Methods in enzymesology (Colowick S.P and Kaplan N O., Eds.): 305-306 Academic Press, San Diego 69 β-mercaptoethanol can Reverse the inhibition of some glycolytic enzyme activities of Streptococcus mutans UA159 by benzimidazoles Nguyen Thi Mai Phuong, Robert E Marquis Summary Benzimidazoles, such as omeprazole (OM) or lansoprazole (LAN), are widely used as proton-pump inhibitors to control stomach hyperacidity and have been found also to have antimicrobial actions against Helicobacter pylori and oral streptococci Our study indicated that OM and LAN affected the glycolysis of oral bacteria by inhibiting the activity of some glycolytic enzymes of Streptococcus mutans UA159 including aldolase, glyceraldehyde phosphate dehydrogenase and lactate dehydrogenase Remaining activity of these enzymes after had been treated with the agents were ca 30%, 50% and 60%, respectively However, pyruvate kinase was not inhibited by OM and LAN Benzimidazoles are effective in the protonated form at acid pH values and cause inhibition of enzymes associated with the formation of drug-target disulphide bonds We found that reducing agents including β-mercaptoethanol and glutathione reversed the inhibition of glycolytic enzyme activities by benzimidazoles The reason for that possibly is the reducing agents neutralized benzimidazoles, avoiding the formation of S-S bonds between the protonated forms of drugs and target enzymes Thus, glycolytic pathway is a potential target for the use of benzimidazoles against oral streptococci and their antimicrobial activity could be eliminated by the reducing agents Ngµy nhËn bµi: 6-1-2006 70 ... định hoạt độ enzim -mercaptoethanol ngăn chặn ức chế hoạt độ số enzim trình đờng phân chủng S mutans UA159 gây chất benzimidazon Các nghiên cứu trớc [2, 4] cho thấy chế để chất benzimidazon ức chế. .. kiện phản ứng tơng ứng với oxy hóa NADH thành NAD+ II Kết thảo luận Benzimidazon ức chế hoạt độ số enzim trình đờng phân chủng vi khuẩn S mutans UA159 Đờng phân chức vi khuẩn gây bệnh sâu nh đột... đờng phân chủng vi khuẩn S mutans UA159 aldolaza, GAPDH LDH Các tác nhân khử nh -MCE hay GSH có tác dụng ngăn chặn khả ức chế OM LAN hoạt độ enzim Nh vậy, benzimidazon tác nhân kháng vi khuẩn