đang có xu hướng phổ biến trên thị trường không chỉ vì mùi hương mà bên cạnh đó còn đem lại một vài ích lợi khác như tinh dầu húng quế có các chất có khả năng làm tinh thần thoải mái, gi
Phân loại thực vật
Nguồn gốc
▪ Húng quế (Ocimum basilicum L.), một thành viên của họ Lamiaceae là một loại thảo mộc hàng năm mọc ở một số vùng vòng quanh thế giới (Amir và cộng sự, 2011)
▪ Theo tác giả Tran và cộng sự (2018) húng quế có nguồn gốc từ Ấn Độ và Trung Quốc do điều kiện khí hậu thuận lợi mà hiện nay được trồng phổ biến ở nhiều nước nhiệt đới và ôn đới ở Châu Á, Châu Phi, Trung và Nam Châu Mỹ
▪ Trên thế giới có nhiều loại húng quế, nhưng húng quế Việt Nam có mùi dịu nhẹ hơn Ở Việt Nam, húng quế được trồng ở nhiều tỉnh Cây ưa sáng và ẩm, sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm, thích hợp với đất phù sa và đất thịt Mùa ra hoa thường vào tháng 7 đến tháng 9 (Lê, 2018).
Đặc điểm hình thái
▪ Cây mọc quanh năm, cỏ đứng, cao 0,5-1,2m, rất phân nhánh, toàn cây có mùi thơm Thân non màu xanh có phớt tía hoặc màu tía, rất ít lông Lá đơn, mọc đối chéo chữ thập Phiến lá hình trứng nhọn ở đầu và đáy phiến hình nêm men dần xuống cuống, kích thước 3-8 x 2-5cm, màu xanh lục, mặt trên đậm hơn mặt dưới, bìa có răng cưa cạn ở 2/3 phía trên, nhiều đốm tuyến Gân lá hình lông chim, nổi rõ ở mặt dưới, 6-8 cặp gân phụ hơi cong lên ở mép lá, có ít lông tơ
4 ngắn Cuống lá màu xanh nhạt, hình trụ hơi phẳng ở mặt trên, dài 2-5cm ít lông ngắn Cụm hoa ở ngọn cành kiểu chùm xim bó hoặc chùm xim biến dạng hình tháp Cánh hoa màu trắng hồng, rìa màu hồng Quả bế tư, màu đen, hình trứng ngược, dài khoảng 1,2mm (Lê, 2018)
▪ Hoa màu trắng, hồng và đôi khi tím, hoa có 6 bông, có cuống, gần như phần nách không cuống Trong số hơn 65 loài Ocimum, húng quế là cây trồng có tinh dầu chính được trồng thương mại ở nhiều nước Húng quế có mùi đặc trưng và cay (Amir và cộng sự, 2011)
▪ Húng quế là một loại thảo mộc phân nhánh mọc thẳng cao từ 0,3-1,3m, có lá màu xanh nhạt, mượt Lá của nó rất đơn giản, đối diện, dài 3-11cm, rộng 1- 6cm, hình trứng, nhọn và thường có răng chứa nhiều tuyến dầu lưu trữ tinh dầu (Al Abbasy và cộng sự, 2015).
Ứng dụng trong y học cổ truyền
▪ Ở dạng tươi, lá húng quế thường được dùng làm gia vị, nguyên liệu chế biến món ăn hàng ngày, Trong y học truyền thống, nhờ vào đặc tính chống viêm, chống oxy hóa và kháng khuẩn của cây, húng quế cũng được sử dụng để thúc đẩy tiêu hóa, kích thích lưu thông hô hấp, giảm các triệu chứng cảm lạnh và giảm bớt các vấn đề về tiêu hóa (Tran và cộng sự, 2018)
▪ Nó được coi là có lợi trong y học dân gian để điều trị bệnh tiểu đường, rối loạn hô hấp, dị ứng, dạ dày, chuột rút, nôn mửa, táo bón, đau đầu (Al-Maskri và cộng sự, 2011)
▪ Nó được sử dụng trong y học cổ truyền ở Ấn Độ, để điều trị các bệnh nhiễm trùng khác nhau, rối loạn da và gan, cảm lạnh, ho, sốt và sốt rét Húng quế là một nguồn tuyệt vời của β-carotene, magie, sắt và canxi (Abou và cộng sự, 2015)
▪ Bên cạnh đó các nghiên cứu của tác giả Võ và cộng sự (2020) cho thấy tinh dầu cây húng quế Ocimum basilicum L ngoài khả năng kháng khuẩn
(Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,
Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa), kháng nấm
(Candida albicans, Candida glabrata), chống oxi hóa còn có khả năng chống ung thư cổ tử cung (Hela) và ung thư gan (Hep-2).
Thành phần hóa học có trong tinh dầu
▪ Tinh dầu Ocimum basilicum L thể hiện một loạt các hợp chất hóa học đa dạng và phong phú, tùy thuộc vào sự thay đổi về kiểu hình hóa học, màu sắc của lá và hoa, mùi thơm và nguồn gốc của cây Các thành phần chính bao gồm chavicol methyl ether hoặc estragole, linalool và eugenol (Abou và cộng sự, 2015)
▪ Theo tác giả Marotti và cộng sự (1996) tinh dầu cũng sở hữu chất kháng khuẩn và một số thành phần của nó chẳng hạn như 1,8-cineole, linalool và long não được biết đến là có hoạt tính sinh học
▪ Theo tác giả Tran và cộng sự (2018) các nghiên cứu thực nghiệm đã chỉ ra thành phần hóa học của húng quế thay đổi đáng kể Ví dụ, trong khi lá húng quế được thu thập ở Thổ Nhĩ Kỳ và Iran được phát hiện có nhiều estragole (52,6% trong mẫu lá thu được ở Thổ Nhĩ Kỳ, lần lượt là 52,4% và 40,4% ở lá húng quế tím và lá húng quế xanh), các nghiên cứu khác chỉ ra rằng các giống cây trồng khác như lá húng quế ở Brazil và Pakistan chứa thành phần chủ yếu là linalool với nồng độ dao động từ 56,7-69,3%
▪ Qua nghiên cứu của tác giả Al-Maskri (2011) và cộng sự cho thấy số lượng hợp chất và tỷ lệ phần trăm của chúng đã được tìm thấy có sự thay đổi với các mùa khác nhau L-linalool đã được xác định là thành phần cốt lõi của tinh dầu húng quế Ocimum basilicum (26,5-56,3%) Một số thành phần khác có mặt với một lượng đáng kể là geraniol (12,1-16,5%), 1,8-cineole (2,5-15,1%), p-allylanisole (0,2-13,8%) và DL-limonene (0,2-10,4%) β-farnesene mặc dù là một trong những nguyên tố chính trong thành phần tinh dầu được chiết xuất trong mùa đông (6,3%) và mùa xuân (5,8%) nhưng chỉ hiện diện với một lượng nhỏ trong chiết xuất tinh dầu vào mùa hè
▪ Đối với húng quế (Ocimum basilicum L.) ở Bình Định thì tác giả Võ và cộng sự cho thấy rằng nó là nguồn tinh dầu có chứa các thành phần có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm Hàm lượng tinh dầu chiết xuất từ cây húng quế trồng ở Bình Định thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước chiếm hàm lượng 0,64% theo khối lượng mẫu tươi Kết quả phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) tinh dầu cây húng quế trồng ở Bình Định cho thấy tinh dầu có chứa 25 cấu tử (đã được định danh) với tổng hàm lượng là 99,99% Cấu tử chính trong tinh dầu là methyl chavicol (85,92%)
▪ Luong và cộng sự (2022) nghiên cứu lá húng quế (Ocimum basilicum L.) được thu hái tại Thanh Hóa Thành phần hóa học của tinh dầu (Ocimum basilicum L.) đã được GC-MS kiểm tra Các thành phần được xác định chiếm 0,5-0,6% Có
23 hợp chất và thành phần chính các hợp chất là estragole (92,16%), 1,8-cineole (1,69%), 3-carene (0,99%) và trans-α-bergamotene (0,52%)
▪ Bên cạnh đó nhờ vào nghiên cứu của tác giả Lê (2018) đã cho thấy rằng phần trên mặt đất của cây húng quế chứa tinh dầu có hàm lượng cao nhất lúc cây đã ra hoa Lượng tinh dầu chứa trong cây húng quế khá cao là 0,5-1,7%, trong tinh dầu có linalool (60%), cineole, estragole (methyl chavicol) cùng một số chất khác như germacrene D, tau-cadinol, δ-gurjunen, δ-cadinene,…
Hình 2.1: Thành phần hóa học chính trong tinh dầu
Tác dụng của tinh dầu
▪ Tinh dầu húng quế đã được sử dụng trong nhiều năm để làm hương vị thực phẩm và một số sản phẩm như nha khoa và răng miệng cũng như trong nước hoa (Lachowicz và cộng sự, 1996)
▪ Hơn nữa, dữ liệu khoa học đã chứng minh rằng sự chống oxy hóa của các loại hợp chất dễ bay hơi trong tinh dầu húng quế làm cho nó trở thành một chất lành mạnh của hệ thống miễn dịch (Al-Maskri và cộng sự, 2011)
▪ Tuy nhiên, gần đây các công dụng tiềm năng của tinh dầu Ocimum basilicum L., đặc biệt là chất chống vi trùng và chất chống oxy hóa cũng đã được điều tra Các loại tinh dầu Ocimum basilicum thể hiện rộng rãi và ở các mảng khác nhau của các hợp chất hóa học, tùy thuộc vào sự thay đổi về kiểu hình, màu sắc của lá và hoa, hương thơm và nguồn gốc của cây (Amir và cộng sự, 2011)
▪ Trong đó, linalool đã được công nhận là thành phần chính của tinh dầu húng quế trong nhiều nghiên cứu trước đây Linalool là một loại rượu terpene tự nhiên được tìm thấy trong nhiều loại gia vị và hoa Nó được sử dụng để các sản phẩm vệ sinh nước hoa và các chất làm sạch bao gồm xà phòng, chất tẩy rửa, dầu gội đầu và kem dưỡng da (Al-Maskri và cộng sự, 2011)
▪ Thử nghiệm tinh dầu của Ocimum basilicum L đã chỉ ra rằng một lượng cao hàm lượng eugenol ức chế sự tổng hợp của tế bào máu, phân loại húng quế thành chất chống đông máu tự nhiên (Stanojevic, 2017) γ-cadinene β-ocimene
Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
▪ Tác giả Võ và cộng sự (2020) qua việc khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu chiết xuất từ cây húng quế trồng ở Bình Định cho thấy thời gian trích ly tốt nhất ở 3 giờ
▪ Tác giả Lê (2018) cũng cho thấy thời gian trích ly ở 3 giờ cho ra hàm lượng tinh dầu cao nhất đối với húng quế được trồng tại Khánh Hòa
▪ Đối với tác giả Luong và cộng sự (2022) nghiên cứu lá húng quế (Ocimum basilicum L.) được thu hái tại Thanh Hóa cho thấy thời gian ly trích tốt nhất để cho ra hàm lượng tinh dầu cao nhất là 2,5 giờ
▪ Tác giả Abou và cộng sự (2017) đã thu hoạch húng quế từ một đồn điền rộng 15 ha, gần Novi grad và cho biết tinh dầu Ocimum basilicum được chưng cất ở thời gian 2 giờ cho ra hàm lượng tốt nhất
▪ Theo tác giả Marotti và cộng sự (1996) tinh dầu từ các nguồn hạt giống khác nhau được gieo trồng trong 3 tuần cho ra hàm lượng cao nhất trong 2 giờ trích ly
▪ Tác giả Rabbani và cộng sự (2015) thì cho thấy tinh dầu được trích ly ở thời gian 3 giờ đối với húng quế được thu hoạch ở Isfahan
▪ Tác giả Amir và cộng sự (2011) cũng cho thấy thời gian trích ly được hàm lượng tinh dầu cao nhất ở 3 giờ với tỉ lệ nguyên liệu : nước là 1 : 5.
Tổng quan về vi khuẩn
Nguyên nhân gây bệnh
▪ Phần lớn các bệnh nhiễm trùng là do virus gây ra Cảm lạnh thông thường là do virus trong hầu hết các trường hợp và không cần sử dụng tác nhân kháng khuẩn trừ các ca nhiễm phức tạp Hầu hết các trường hợp nhiễm trùng, cảm lạnh là do virus và do đó không cần điều trị bằng thuốc kháng sinh Việc sử dụng thuốc
9 kháng sinh đối với các trường hợp nhiễm trùng, bệnh nhẹ có thể là 1 trong những nguyên nhân gây nên sự đề kháng kháng sinh như hiện nay (Lê, 2018)
▪ Kháng sinh thông thường là sản phẩm tự nhiên được tổng hợp bởi các thành phần chất hóa học hoặc các vi sinh vật có khả năng chống lại các vi khuẩn và các tác nhân gây bệnh khác Một vài thành phần đã và đang được tổng hợp hoàn toàn và phát triển được gọi là thuốc kháng sinh Sự biến đổi hóa học thành các phân tử kháng sinh ban đầu đã được tạo ra để tăng hiệu lực, cải thiện khả năng hòa tan, khả năng dược động học và tránh các cơ chế đề kháng kháng sinh (Foster, 2017)
▪ Sử dụng kháng sinh không hợp lý đã tạo ra sự tồn tại phụ cận – tức là tạo ra các vi khuẩn đề kháng được kháng sinh do cơ chế chọn lọc qua nhiều con đường khác nhau Chúng ta phát minh ra các kháng sinh với mục tiêu kháng lại các vi khuẩn và các tác nhân gây bệnh, nhưng rồi chính việc sử dụng lạm dụng kháng sinh dẫn tới hậu quả chính chúng ta đang dạy cho các vi sinh vật gây bệnh cách đề kháng lại các kháng sinh mà chúng ta đang có (Phạm, 2017).
Một số vi khuẩn gây bệnh
Staphylococcus aureus là một loài Gram dương và hình thành các cụm giống như nho không đều Nó không di động, không sinh bào tử và catalase dương tính Nó phát triển nhanh chóng và phong phú trong điều kiện hiếu khí (Foster, 2002)
Mầm bệnh chính gây ra bệnh nhiễm trùng trên toàn thế giới nói chung và nhiễm trùng vết thương nói riêng (4,6% - 54,4%) Chúng gây nhiễm trùng da và các bệnh nguy hiểm như: nhiễm trùng máu và mô mềm, đường tiết niệu,… (Chakraborty và cộng sự, 2011)
Chiếm 30% trong cơ thể người khỏe mạnh Gây nhiễm trùng bằng các gen độc hại khác nhau như độc tố và enzyme (Rasheed và cộng sự, 2021)
Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn Gram âm, hình que, vi khuẩn sinh bào tử và đơn bào P aeruginosa phát triển tốt ở 25°C -37°C và khả năng phát triển ở 42°C giúp phân biệt nó với nhiều loại khác loài Pseudomonas P aeruginosa là một loại vi sinh vật phổ biến có khả năng sống sót trong nhiều điều kiện khác nhau (Wu và cộng sự, 2015)
P.aeruginosa thường là mầm bệnh gây các bệnh nhiễm trùng máu, nhiễm trùng vết mổ, xơ nang, AIDS, các bệnh ác tính khác Chủng này thường lây nhiễm từ môi trường, ít lây nhiễm từ người sang người (Yetkin và cộng sự, 2006)
P.aeruginosa là vi khuẩn sử dụng phổ biến trong công nghiệp do thể hiện nhiều đặc điểm khác nhau trong nhiều loại môi trường Sử dụng chúng như chất kiểm soát sinh học và như chất kích thích tăng trưởng trong mảng sản xuất hợp chất kháng khuẩn (Uzair và cộng sự, 2018)
Escherichia coli là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi phong phú nhất trong hệ thực vật đường ruột của con người Trong khi E coli thường có vẻ là một loài cộng sinh vô hại, thì trong các trường hợp khác, các chủng E coli có thể gây bệnh cho người và được nhóm thành nhiều loại bệnh khác nhau (Jaureguy và cộng sự, 2008)
E coli một thành viên của họ vi khuẩn Enterobacteriaceae, là một loài hội sinh, nó sống trong mối quan hệ cùng có lợi với vật chủ và hiếm khi gây bệnh Các đặc điểm riêng biệt của E coli, chẳng hạn như dễ xử lý, có sẵn trình tự bộ gen hoàn chỉnh và khả năng phát triển trong cả điều kiện hiếu khí và kỵ khí, khiến nó trở thành sinh vật chủ quan trọng trong công nghệ sinh học (Allocati và cộng sự, 2013)
Trực khuẩn Gram (-) kỵ khí tùy nghi thuộc chi Escherichia của vi khuẩn đường ruột Chúng phân bố rộng rãi, chủ yếu sống trong ruột già của người Mặc dù chủng E.coli được cho là vô hại và hiếm khi gây bệnh ở người khỏe mạnh nhưng trong đó một số chủng có thể gây bệnh đường ruột ở cả người khỏe mạnh và người bị suy giảm hệ miễn dịch (Gomes và cộng sự, 2016)
Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật
Phương pháp khuếch tán trên thạch - Phương pháp đục lỗ (Nguyễn và cộng sự, 2013):
▪ Nguyên tắc: Thực hiện các thao tác trong tủ cấy vô trùng Dùng micropipette hỳt 100àl dịch vi khuẩn nhỏ vào giữa đĩa thạch, dựng que thủy tinh trỏng đều đến khi mặt thạch khô Sau 15 phút thực hiện đục lỗ trên mặt thạch, mỗi lỗ cách nhau khoảng 20mm Thực hiện bơm chất thử, đặt đĩa vào tủ ấm ở 37°C/24 giờ Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn.
Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu húng quế
▪ Theo Võ và cộng sự (2020) tinh dầu có khả năng ức chế mạnh sự phát triển của nấm Candida albicans, chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus và chủng vi khuẩn Escherichia coli với đường kính vòng vô khuẩn lần lượt là 22mm, 17mm và 16mm ở nồng độ 50àl tinh dầu
▪ Nghiên cứu của Luong và cộng sự (2022) với nồng độ pha loãng 2,0 mg/ml, vòng kháng khuẩn có đường kính đo được so với vòng kháng của E coli là 6,2 mm, khả năng ức chế là 11,42% Khả năng ức chế vi khuẩn E coli tăng dần từ nồng độ 2,0 mg/ml đến 12,0 mg/ml và đến nồng độ 14 mg/ml vi khuẩn không phát triển Ở nồng độ 12,0 mg/ml vòng kháng khuẩn là 48,2 mm khả năng ức chế E coli là 89,20%
▪ Theo Hussain (2007) tinh dầu của O basilicum thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh ở nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), chỉ ra rằng S aureus và B subtilis là những vi sinh vật nhạy cảm nhất có vùng ức chế lớn nhất (22,2 × 24,4 mm), (20,4 26,1 mm) và giá trị MIC thấp nhất (0,9 mg/ml), (0,8 mg/ml)
▪ Qua nghiên cứu của Al Abbasy và cộng sự (2015) vùng ức chế 4 loại vi khuẩn ở nồng độ 10àl tinh dầu được quan sỏt thấy theo thứ tự sau: B cereus (25 mm),
E coli (11 mm), S.typhimurium (10 mm), S aureus (9 mm) S cholermidis, K.pneumoniae và P aeruginosa được phát hiện có khả năng kháng cao đối với tinh dầu O basilicum
▪ Kết quả thử nghiệm khuếch tỏn trờn đĩa thạch ở nồng độ 100àl cú kết quả như sau: S aureus (29,20 - 30,56 mm), B cereus (10,66 - 16,11 mm), E coli (17,48
- 23,58 mm) và với P aeruginosa có vùng ức chế tối đa MIC cho vi khuẩn gram (+): B cereus (36 - 18 àg/ml), S aureus (18 àg/ml) đối với vi khuẩn gram (-):
E coli và P aeruginosa là (18 - 9 àg/ml) (Amir và cộng sự, 2011).
3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Dược liệu
▪ Húng quế tươi được trồng tại Bình Dương được mua ở chợ Hàng Bông (467 Phú Lợi, Thủ Dầu Một, Bình Dương)
▪ Bộ phận của cây được sử dụng trong đề tài là lá trưởng thành (sử dụng ở dạng tươi)
▪ Nguyên liệu tươi được mua trước khi tiến hành quá trình ly trích tinh dầu.
Vi sinh vật
Các thử nghiệm được thực hiện trên 3 chủng vi sinh vật, được cung cấp bởi phòng Vi sinh – Đại học Mở CS3 (Bình Dương)
Hóa chất
Môi trường thử nghiệm
▪ Môi trường tăng sinh và nuôi cấy vi khuẩn: môi trường NB và NA
▪ Môi trường pha loãng vi khuẩn: nước muối sinh lý
▪ Môi trường thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn (khuếch tán kháng sinh trong thạch đục lỗ): môi trường MHB + Agar
▪ Tất cả môi trường sau khi pha xong được hấp tiệt trùng ở 121°C/15 phút Môi trường đã hấp tiệt trùng nhưng chưa sử dụng được bảo quản trong tủ lạnh ở 2-
Thiết bị dụng cụ
▪ Bộ chiết xuất tinh dầu Clevenger (bình cầu, nhánh gạn, ống hoàn lưu)
▪ Các dụng cụ khác để sử dụng trong quá trình: cân kỹ thuật, bếp đun bình cầu, becher, ống đong, đĩa petri, que cấy, tăm bông tiệt trùng, que trải tam giác, đèn cồn, micropipette, ống nghiệm
▪ Dụng cụ dùng trong thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn được hấp tiệt trùng ở
121°C trong 20 phút, sấy ở nhiệt độ 80°C, sau đó để ở nhiệt độ phòng cho nguội trước khi sử dụng
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp ly trích tinh dầu
Xác định nơi mua nguyên liệu
Xử lý nguyên liệu (loại lá dập, héo, úng)
Bỏ vào bình cầu Thêm nước theo tỉ lệ
Lắp hệ thống chưng cất Chưng cất hơi nước Để nguội
Làm khan nước bằng Na 2 SO 4
Thu tinh dầu Xác định thành phần hóa học bằng phổ GC-MS
Hình 3.1: Sơ đồ phương pháp ly trích tinh dầu
▪ Đầu tiên tìm nguồn mua húng quế cố định để đảm bảo xác định chính xác các yếu tố gây ảnh hưởng đến lượng tinh dầu của cây húng quế ở vị trí đó
▪ Húng quế khi mua xong sẽ tiến hành lấy các lá trưởng thành, loại bỏ các lá non (do lượng tinh dầu không nhiều) và các lá bị hư (vì có thể gây ảnh hưởng đến chất lượng tinh dầu)
▪ 200g lá húng quế đã cân được đem đi cắt thành các sợi khoảng 1-2 cm
▪ Lá húng quế sau khi được cắt nhỏ được bỏ vào bình cầu, thêm nước theo các tỉ lệ khác nhau (1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6) nhằm khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/nước tối ưu
▪ Lắp xong bộ hệ thống chưng cất hơi nước thì để nước chạy dọc ống hoàn lưu (điều này giúp khí nóng sau khi bay lên gặp sẽ ngưng tụ thành giọt nước và chảy xuống nhánh gạn) và tiến hành đun trên bếp đun bình cầu
▪ Kết thúc thời gian ly trích thì tắt bếp đun bình cầu đợi dung dịch tinh dầu + nước trong nhánh gạn nguội nhưng vẫn để nước tiếp tục chạy trong ống hoàn lưu trước khi thực hiện thu tinh dầu có trong nhánh gạn
▪ Kiểm tra dung dịch nước và tinh dầu trong nhánh gạn đã nguội thì tiến hành loại bỏ phần lớn lượng nước có trong đó ra 1 becher nhiều nhất có thể (không cần xả quá sát phần tinh dầu để tránh vô tình làm mất lượng tinh dầu trong quá trình loại bỏ nước)
▪ Tiến hành thu lượng tinh dầu còn trong nhánh gạn ra 1 becher sạch khác
▪ Lượng tinh dầu thu được trong becher có thể còn một ít lượng nước nên sử dụng một lượng Na 2 SO 4 phù hợp để làm khan lượng nước còn dư
▪ Tiến hành đổ tinh dầu đã được làm khan vô ống đong 5 ml để xác định lượng tinh dầu thu được ở các tỉ lệ khác nhau sau thời gian chưng cất
▪ Sau khi tiến hành chưng cất hơi nước để chiết xuất tinh dầu húng quế ở các tỉ lệ nguyên liệu : nước khác nhau (1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6) thì xác định được tỉ lệ húng quế : nước phù hợp để cho ra được lượng tinh dầu cao nhất
▪ Khi đã xác định được tỉ lệ húng quế : nước phù hợp để chiết xuất ra được lượng tinh dầu cao nhất thì tiến hành sử dụng tỉ lệ phù hợp đã tìm được để thực hiện
17 chiết xuất ở các khoảng thời gian khác nhau (1 giờ, 1 giờ 30 phút, 2 giờ, 2 giờ
▪ Thực hiện lại các quy trình như ở trên nhằm xác định được thời gian phù hợp nhất kết hợp với tỉ lệ húng quế : nước đã tìm ra để cho ra hàm lượng tinh dầu cao nhất
▪ Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần
Hình 3.2: Bộ chưng cất Clevenger
Phân tích thành phần hóa học có trong tinh dầu húng quế (Ocimum
Thành phần hóa học có trong tinh dầu húng quế (Ocimum basilicum L.) được xác định bằng phương pháp chạy phổ GC-MS tại Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ (1B, đường TL29, phường Thanh Lộc, quận 12, TP HCM)
Nguyên tắc: sự kết hợp của 2 kỹ thuật phân tích khác nhau, sắc ký khí (GC) và khối phổ (MS), sử dụng để phân tích các hợp chất hữu cơ và sinh hóa phức tạp Thiết bị gồm 2 thành phần chính Phần sắc ký khí phân tách các hợp chất thành các xung hóa chất tinh khiết dựa trên độ bay hơi bằng cách cho khí trơ (pha động) chạy qua pha tĩnh trong cột Quang phổ của các hợp chất được thu thập khi chúng thoát ra khỏi cột sắc ký bằng máy quang phổ khối, giúp xác định và định lượng các chất theo tỷ lệ khối lượng trên điện tích (m/z)
Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu
Chuẩn bị môi trường tăng sinh vi khuẩn
Cấy truyền lên môi trường NA
Xác định khả năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp đục lỗ thạch
Cấy trang trên môi trường MHA Đục lỗ + Bơm tinh dầu Đọc kết quả
Hình 3.3: Sơ đồ phương pháp đục lỗ
Chuẩn bị môi trường thử nghiệm
▪ Môi trường sử dụng cho phương pháp này là NA Sau khi pha và hấp tiệt trùng ở 121°C/15 phút, môi trường được cho vào mỗi đĩa petri (đã tiệt trùng) có đáy phẳng và đặt lên mặt phẳng để thạch có bề dày đồng nhất khoảng 4 mm Thể tích môi trường khoảng 20 mL/đĩa đối với đĩa φ 90 mm với các chủng vi khuẩn Để nguội ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, nếu chưa sử dụng thì để trong tủ lạnh từ 2-8°C Khi sử dụng, nếu đĩa ướt, để đĩa trong tủ ấm ở 35°C khoảng 10-30 phút cho đĩa khô hoàn toàn Các hộp thạch chỉ nên được dùng trong vòng 1 tuần kể từ ngày pha
Dung dịch chuẩn độ đục 0,5 McFarland
▪ Pha dung dịch A (BaCl 2 2H 2 O) với nồng độ 0,048M
▪ Pha dung dịnh B (H 2 SO 4 ) với nồng độ 0,36N
▪ Pha dung dịch chuẩn độ đục: 0,5 ml dung dịch A + 99,5 ml dung dịch B
▪ Đo độ đục chuẩn 0,5 McFarland có độ hấp thụ ở bước sóng 625 nm đạt 0,08 đến 0,1
Chuẩn bị dịch khuẩn thử nghiệm bằng phương pháp tăng sinh để pha huyền dịch vi khuẩn
▪ Trên mặt thạch phân lập thuần khiết, chọn ít nhất từ 3-5 khóm vi khuẩn giống nhau và cấy truyền vào 6-7 ml môi trường lỏng thích hợp – NB
▪ Ủ canh cấy lỏng NB ở 121°C/15 phút trong tủ ấm
▪ Dùng môi trường lỏng hay nước muối sinh lý vô khuẩn để điều chỉnh độ đục của canh cấy vi khuẩn đang tăng trưởng này đến độ đục chuẩn 0,5 McFarland Để thực hiện chính xác bước này thì có thể dùng mắt thường bằng cách dùng đủ ánh sáng để so sánh tube chứa vi khuẩn với tube chứa độ đục 0,5 McFarland trên mặt băng keo đen
Trải dịch khuẩn trên mặt thạch
▪ Trong vòng 15 phút sau khi pha huyền dịch vi khuẩn, dùng micropipette hút 10àl bơm lờn mặt thạch đó được hong khụ
▪ Trải dịch vi khuẩn đã được bơm lên mặt thạch MHA đã hong khô trước đó Trải bằng cách cấy trang dịch khuẩn lên mặt thạch, dùng que trải thủy tinh đã hơ qua ngọn lửa đèn cồn (thử nguội bằng cách chạm thử qua mặt đĩa petri), trải dịch khuẩn bằng cách trang trên mặt thạch MHA, tiếp tục như vậy để đảm bảo trải đầy vi khuẩn lên mặt thạch Đục lỗ thạch để thử hoạt tính
▪ Sau khi trang vi khuẩn trên mặt thạch đã khô, đánh số vị trí cần đục lỗ trên mặt đĩa petri khô đã được trải vi khuẩn
▪ Đục lỗ thạch theo vị trí đã đánh dấu trên đĩa petri
▪ Bơm kháng sinh theo từng nồng độ vào các giếng đã đục: giếng 1 bơm nước (đối chứng âm), các giếng còn lại thực hiện bơm tinh dầu theo các nồng độ thử nghiệm khỏc nhau (50àl, 25àl, 12,5àl)
▪ Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần
4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1 Hiệu suất ly trích tinh dầu
Kết quả hàm lượng tinh dầu ở các tỉ lệ nguyên liệu : nước khác nhau
Bảng 4.1: Kết quả khảo sát hàm lượng tinh dầu ở các tỉ lệ nguyên liệu : nước khác nhau
Tỉ lệ nguyên liệu : nước
Lượng tinh dầu thu được (g)
Trung bình lượng tinh dầu thu được (g)
Sau quá trình xử lý thống kê ta được bảng như sau:
Bảng 4.2: Kết quả xử lý thống kê dựa trên tỉ lệ nguyên liệu : nước
Nghiệm thức Tỉ lệ nguyên liệu : nước Lượng tinh dầu thu được (g)
* Trong cùng một cột các giá trị có cùng mẫu tự không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 0,05 qua phép thử Duncan
• Có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức trong thí nghiệm qua thống kê
• Lượng tinh dầu của tỉ lệ 1 : 3 là cao nhất (0,251) so với các nghiệm thức còn lại
Hình 4.1: Sơ đồ hàm lượng tinh dầu ở các tỉ lệ nguyên liệu : nước khác nhau
Nhận xét: Qua bảng 4.1 và hình 4.1 cho thấy tỉ lệ nguyên liệu : nước ở tỉ lệ 1 : 3 cho ra hàm lượng tinh dầu cao nhất vì nếu cho quá ít nước (đối với tỉ lệ 1 : 2) thì không đủ thẩm thấu vào các tế bào lá để phá vỡ túi tinh dầu, khi cho quá nhiều nước (đối với các tỉ lệ còn lại) thì có thế dẫn đến việc hòa tan mốt số cấu phần dễ hòa tan vào nước.
Kết quả hàm lượng tinh dầu ở các khoảng thời gian khác nhau
Bảng 4.3: Kết quả khảo sát hàm lượng tinh dầu ở các khoảng thời gian khác nhau
Lượng tinh dầu thu được (g)
Trung bình lượng tinh dầu thu được (g)
Tỉ lệ húng quế : nước
Sau quá trình xử lý thống kê ta được bảng như sau:
Bảng 4.4: Kết quả xử lý thống kê dựa trên các khoảng thời gian khác nhau
Nghiệm thức Thời gian trích ly Tinh dầu thu được
* Trong cùng một cột các giá trị có cùng mẫu tự không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 0,05 qua phép thử Duncan
• Có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức trong thí nghiệm qua thống kê
• Hàm lượng tinh dầu của thời gian 2 giờ, 2,5 giờ, 3 giờ là cao nhất (0,249) so với các nghiệm thức còn lại
Hình 4.2: Sơ đồ hàm lượng tinh dầu ở các khoảng thời gian khác nhau
Nhận xét: Qua bảng 4.3 và hình 4.2 cho thấy ở thời gian 2 giờ trích ly cho ra được hàm lượng tinh dầu cao nhất và ổn định nhất đối với các thời gian trích ly khác Từ đó cho thấy phải tìm được thời gian phù hợp vì thời gian trích ly quá ngắn (1 giờ, 1,5 giờ) sẽ chưa đủ để nước thẩm thấu vào tế bào để phá vỡ hoàn toàn các túi tinh dầu ở lá
1 giờ 1,5 giờ 2 giờ 2,5 giờ 3 giờ
Kết quả phân tích phổ GC-MS
Bảng 4.5: Kết quả phân tích phổ GC-MS
Mass Độ tương hợp khối phổ
Nhận xét: Qua bảng 4.5 và hình 7.1 (phần phụ lục) cho thấy hàm lượng hợp chất cao nhất có trong tinh dầu húng quế là estragole (78,328%) Bên cạnh đó có thêm các hợp chất khác cũng chiếm hàm lượng tương đối như linalool (5,097%), γ-muurolene (3,632%), β-ocimene (1,890%), γ-cadinene (1,347%) và các thành phần khác
Bảng 4.6: Hàm lượng (%) các thành phần hóa học của tinh dầu húng quế thu được ở Bình Dương so với Bình Định
▪ Kết quả phổ GC-MS cho thấy hàm lượng (%) các thành phần hóa học có trong tinh dàu húng quế được trồng tại Bình Dương, Việt Nam có những thành phần chính tương đồng với húng quế được trồng tại Bình Định, Việt
Nam (Võ và cộng sự, 2020) như: estragole (metyl chavicol), linalool, β- ocimene, γ-cadinene…
▪ Tuy nhiên, vẫn còn một số hợp chất có trong tinh dầu mà đề tài thu được nhưng không có trong báo cáo của Võ và cộng sự (2020) như: eucalyptol, alcanfor, β-elemen, α-bergamotene, α-guaiene, humulene, β-cubebene, γ- gurjunene, copaene, γ-muurolene
▪ Nguyên nhân dẫn đến thành phần tinh dầu khác nhau có thể do sự khác nhau về điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng, thời điểm thu mẫu, độ tuổi của cây
Hoạt tính kháng khuẩn
Bảng 4.7: Đường kính vòng vô khuẩn ở chủng Staphylococcus aureus
Nồng độ tinh dầu (àl)
Chủng vi sinh vật Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
Trung bình đường kính vòng vô khuẩn (mm)
Bảng 4.8: Đường kính vòng vô khuẩn ở chủng Pseudomonas aeruginosa
Nồng độ tinh dầu (àl)
Chủng vi sinh vật Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
Trung bình đường kính vòng vô khuẩn (mm)
Sau quá trình xử lý thống kê ta được bảng như sau:
Bảng 4.9: Kết quả xử lý thống kê dựa trên đường kính vòng vô khuẩn
E coli Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa
* Trong cùng một cột các giá trị có cùng mẫu tự không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 0,05 qua phép thử Duncan
▪ Có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức trong thí nghiệm qua thống kê
▪ Khả năng ức chế của tinh dầu ở nồng độ 50àl là lớn nhất đối với Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa (2,83 và 1,50) so với các nghiệm thức còn lại
▪ Khả năng ức chế của tinh dầu ở nồng độ 12,5àl là nhỏ nhất đối với
Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa (1,53 và 0,93) so với các nghiệm thức khác
Hình 4.3: Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu
A Escherichia coli, B Staphylococcus aureus, C Pseudomonas aeruginosa
▪ Qua hình 4.3, bảng 4.7 và bảng 4.8 cho thấy tinh dầu Ocimum basilicum L có khả năng ức chế trên các chủng vi khuẩn: Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa
▪ Trong đó, đường kính vùng ức chế lớn nhất là 30mm đối với chủng vi khuẩn
Staphylococcus aureus và 16mm đối với chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
▪ Tác động ức chế của tinh dầu Ocimum basilicum L trung bình đối với chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus và khá nhạy đối với chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
▪ Đối với chủng E.coli không có sự xuất hiện của chủng trên môi trường nên khi bơm tinh dầu vào các giếng thạch thì không thể hiện được hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Ocimum basilicum L đối với chủng này
5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Các điều kiện chưng cất tinh dầu đạt hàm lượng tối ưu
▪ Tỉ lệ nguyên liệu : nước được chưng cất là 1 : 3
▪ Thời gian chưng cất tối ưu là 2 giờ
▪ Thành phần hóa học của mẫu tinh dầu húng quế ly trích từ cây húng quế ở Bình Dương cho thấy estragole, linalool là các cấu phần chính trong tinh dầu, bên cạnh một số khác biệt đặc trưng về các cấu phần nhỏ hơn đã nêu trong bài
Khả năng ức chế của tinh dầu Ocimum basilicum L đối với các chủng vi sinh vật
▪ Không có khả năng ức chế đối với chủng Escherichia coli
▪ Có khả năng ức chế trung bình đối với chủng Pseudomonas aeruginosa và khá nhạy đối với chủng Staphylococcus aureus
▪ Khả năng ức chế của tinh dầu Ocimum basilicum L ở Bình Dương có sự khác biệt đối với tinh dầu được ly trích ở các vùng khác.
Đề nghị
▪ Thử nghiệm lại khả năng kháng của tinh dầu đối với chủng E.coli
▪ Tiếp tục khảo sát khả năng kháng của tinh dầu húng quế đối với các chủng vi sinh vật và nấm.
