Luận văn tốt nghiệp đại học Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Lactic có khả năng kháng khuẩn từ các sản phẩm thủy sản lên men trình bày về phân lập một số dòng vi khuẩn Lactic trong các sản phẩm mắm và nước mắm, kiểm tra khả năng sinh chất kháng khuẩn từ các nhóm vi khuẩn Lactic phân lập được.
Trang 1
TRƯỜNG ĐẠI HOC TAY DO KHOA SINH HOC UNG DUNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐỘ TAY DD UNIVERSITY
LUAN VAN TOT NGHIEP DAI HOC CHUYEN NGANH: NUOI TRONG THUY SAN
MA SO: 304
PHAN LAP VA TUYEN CHON
VI KHUAN LACTIC
CO KHA NANG KHANG KHUAN
TU CAC SAN PHAM THUY SAN LEN MEN
Sinh viên thực hiện
PANG THI THU THAO MSSV: 0753040084 LỚP: ĐH NTTS K2
Cần Thơ, 2011
Trang 2TRƯỜNG ĐẠI HOC TAY DO KHOA SINH HOC UNG DUNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐỘ TAY DD UNIVERSITY
LUAN VAN TOT NGHIEP DAI HOC CHUYEN NGANH: NUOI TRONG THUY SAN
MA SO: 304
PHAN LAP VA TUYEN CHON
VI KHUAN LACTIC
CO KHA NANG KHANG KHUAN
TU CAC SAN PHAM THUY SAN LEN MEN
Cán bộ hướng dẫn Sinh viên thực hiện
PGs.Ts NGUYÊN VĂN BÁ PANG THI THU THAO
ThS NGUYEN THANH TAM
Trang 3XÁC NHAN CUA HOI DONG BAO VE LUAN VAN
TOT NGHIEP DAI HOC
Luận văn kèm theo đây với tựa đê: “Phân lập và tuyên chọn vi khuân lactic cĩ khả năng kháng khuân từ các sản phầm thủy sản lên men”
Do sinh viên Đặng Thị Thu Thảo thực hiện và báo cáo đã được Hội đồng chấm luận văn thơng qua
Phan biện Ủy viên
Trang 4LOI CAM TA
Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Tây Đơ đã tạo điều
kiện tốt cho tơi học tập và sinh hoạt Cảm ơn quý Thầy Cơ Khoa Sinh Học Ứng
Dụng đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt cho tơi những kiến thức quý báu về
cơ sở ngành cũng như chuyên ngành từ những ngày đầu bước chân vào trường
đến nay
Đề tài “Phân lập và tuyển chọn vì khuẩn lactic cĩ khả năng kháng khuẩn từ các sản phẩm thủy sản lên men” được kết thúc thành cơng Tơi xin chân thành
cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Thầy Nguyễn Văn Bá đã hỗ trợ mơi trường
nuơi cấy và các dụng cụ đặc trưng cho thí nghiệm, Thầy Nguyễn Thành Tâm
luơn theo sát hướng dẫn đề tài và cung cấp một số tài liệu liên quan Cảm ơn Cơ
Trần Ngọc Huyền — cán bộ phịng thí nghiệm đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để
đề tài kết thúc đúng thời hạn và xin cảm ơn anh
Lê Văn Tồn (lớp ĐH NTTS K2) cùng hai em Nguyễn Thị Thùy Trang và
Dương Thị Bé Ba (lớp ĐH NTTS K3) đã đồng hành và giúp đỡ tơi trong suốt
quá trình thực hiện
Cảm ơn Thay cé van học tập Tạ Văn Phương , Thầy Nguyễn Lê Hồi Phương (Khoa cơ bản) và các thành viên lớp DH NTTS K2 đã sát cánh cùng tơi trong
suốt quá trình học tập tại trường
Chân thành cảm ơn!
Trang 5TOM TAT
Vi khuẩn lactic cĩ ý nghĩa rất quan trọng trong các quá trình lên men thực phẩm Chúng sinh ra nhiều chất để bảo vệ thực phẩm như: axít lactic, H;ạO; và chất kháng khuẩn Do đĩ, việc tìm ra những chất kháng khuẩn sinh ra từ vi khuẩn lactic nhằm bỗ sung cho những nghiên cứu về chất kháng khuẩn và ứng dụng chất kháng khuẩn vào trong nuơi trồng thủy sản Nghiên cứu sử dụng mơi trường MRS để phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic, sử dụng phương pháp trực tiếp để kiểm tra sự kháng lại vi khuẩn Pediococcus pentosakeus Két qua cho thấy cĩ tổng số 83 dịng vi khuẩn lactic được phân lập từ 37 mẫu mắm và nước mắm (thu ngẫu nhiên ở những chợ thuộc vùng nước ngọt và nước lợ mặn)
và cĩ 19 dịng cho vịng kháng khuẩn đối với dịng chỉ thị Độ dày vịng kháng
khuẩn từ 0,1 — 0,85 cm, trong đĩ cĩ 9 dịng vi khuẩn lactic cho bề dày vịng
kháng khuẩn lớn nhất (hơn 0,6 cm), 1 dịng cho bề dày vịng kháng khuẩn 0,1 cm là nhỏ nhất Như vậy, cĩ thê sử dụng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm lên
men thủy sản để kháng lại vi khuân Pediococcus pentosakeus
Trang 6MUC LUC Trang LOI CAM TA i TOM TAT ii
MUC LUC iii
DANH SACH BANG Y
DANH SÁCH HÌNH vỉ
DANH MỤC TỪ VIET TAT vii
CHUONG 1: DAT VAN DE 1
INN€G oan .Ơ 1 0:10 0/210 00 2 IS [0Ni00/18i (0a 0 2
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1 Một số quy trình lên men thủy sản -. - 2 252 ©52+Sz+EE£+EE£EE£EEE+rxerxerrxrrxrrreere 3 »X„A 840.0 .ƠỖƠƠỒÕỒƠỒƠƠỊƠỊ 7
2.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn lên men axit lactic - + 2 s+s+szEzzzzzze+Ezzzzzrszeee 7
2.2.2 Cơ chế của quá trinh lên men axit lactiC 2-22 sz2z©szz£zzszzzzzzzzzzszccze 8 2.3 Mối quan hệ giữ axit lactic với cá và các sản phẩm từ cá - -2-7sccsecsa 8
9 8 0 8n .šải‡4434 ,HL , 9
2.5 Dịng chỉ thị PediocoCCMS D€HfO.SGÌKlLS - 55 «Hư ng 12 2.6 Những nghiên cứu trong và ngOàầi HƯỚC - +5 s tưng re 13 2.6.1 Những nghiên cứu trong HƯỚC . - - - << + SH nh ng 13 2.6.2 Những nghiên cứu ngồi ƯỚC - - «+ ng ng ng ng ng 14
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU L5 3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 2- 2 2©2Z+S++EE+EEEEEEEEEEEEErxerkerrerrkrkerree 15
cần? ha 15
3.1.2 Thời gian thực hiện - + + + + 9x nọ in ưm 15
3.2 (Gái) sốc 0h 15
3.3 Phương pháp nghiÊn CỨU . - Ă- «Ăn nọ Hư 17 3.3.1 Phương pháp thu và bảo quản mẫu . 2 2 +©7*+x+xeEcxerrxrrerxrrrerrees 17
3.3.2 Phuong pháp phân lập VKL từ mẫu mắm . 2 2 2° zEzzzzzzzzzzzczz 18
3.4 Phân tích và xử lý số liệu 2 2©2£©s+©E£EEEEEZ+EEEEEEEEEEEEEEEEEEAECEECEECrerrkrrerred 20
°Nx cá c4 20
3.4.2 Phân tích khả năng kháng khuân . - 2-22 222 ©xz£zz£zz+zxrxrrzrred 20
CHƯƠNG 4: KÉT QUÁ THẢO LUẬN 21
4.1 Phân lập một số dịng VKL từ các sản phẩm thủy sản lên men - 21
an nẽ 21 4.1.2 Tăng sinh mẫu lần 1 2-2- 22 2£ EE£EEEE£EZEE£EEZEEEEZEEZEEZrEzrErrerrzrezrree 21
Trang 7
4.1.4 Tht catalase va nhudm Gram e 25
4.1.5 Tăng sink mau Lan 2 cccccccscssscssssssscssssssseesscssessecesseneesecsnecsecsecsseesecseceseeseesees 26
"on 6 26
4.2 Kiểm tra khả năng sinh CKK từ các dịng VKL thu được - 5 s+- 26
4.2.1 Tối ưu hĩa quy trình . 2 2 2s s£Es£++z+x£EE£ExE£zz+xzrxzrrerrerrrrxrrxrrxee 26
4.2.2 Thử khả năng sinh CKK từ các dịng VKL thu được . - - 27
CHUONG 5: KET QUÁ ĐÈ XUẤT 31
{chẽ a Ẽ 31 5.2 ĐỀ XUẤC, - 22-222 22t 2 H2 2 E1212112712211121.1.2TT1.2T1.1.1E -1 T1.TT111-1.1-11111.1 Lee 31
Trang 8DANH SACH BANG
Trang Bang 2.1: Các đặc tính CKK của VK - << 55 << 94935338531 55555555555525552 10
Bảng 3.1: Tên và địa điểm thu mmẫu - 2-2 2 <2 E14 E38 E£EZEEEE3 C2222 17 Bảng 4.1: Địa điểm và số lượng mẫu thu ¿252 2 S2 s€E2£2£E*£k2czczzcsee 21
Bảng 4.2: Kết quả tăng sinh lần 1 .- 2 2< 22s S52 E225 E13 1215 s2 sec 22
Bảng 4.3: Kết quả cấy ria VKL trên đĩa thạch .- 2-2 2 ss££s£s2£sczscsee 23 Bảng 4.4: Kết quả thử khả năng sinh chất kháng khuân . -5 5: 28
Bảng 4.5: Kết quả thử với Pediococcus penfOsdiS e5 5s ceccsccscscrscsee 30
Bảng A1: Thành phần mơi trường MRS _broth - 2 ° 5< 2 e2 se scsced A Bảng A2: Thành phần mơi trường MRS_agar 2 << se se s eersced A ;10MÊG:ïá 8 08088 DI
Trang 9DANH SACH HINH
Trang
Hình 2.1: Quy trình sản xuất mắm cá 2- 2° 2 ©©< set E22 EEE3 2 E22 22 5E 3 Hình 2.2: Quy trình sản xuất mắm tÉp .-. - 2< s£ sEk£ sEEZE2EES E2 E22 2 5E 4 Hình 2.3: Quy trình sản xuất mắm tơm - 2£ s£ s£+£ E2 EzEEs E2 2z z2 se 5 Hình 2.4: Quy trình sản xuất mắm ruỐc - 22s 2s sEEs E22 22s s2 5E 5 Hình 2.5: Quy trình sản xuất nước mắm .-. 2 2s 2+2 s£Es£s£Ez E2 22s s2 se 6
lsi1:09/Äsz/2⁄//2/42 (271B .4 - 12
Hình 3.1: Quy trình phân lập mẫu mắm - 2 2 2© 2£ £ES£S£E£E#£zczscsee 19 Hình 3.2: Tối ưu hĩa quy trình °- < << ®£E£ % €E*££ 1£ 4k2 ckczee 19 Hình 3.3: Phương pháp trực tiẾp .- © << ke E43 33 cv ckcrec 20 Hình 4.1: Cách xác định sự phát triển của VIKL 22 se sezsxe£ 21 Hình 4.2: Khuẩn lạc cĩ khả năng phân giải CaCO¿, 2 e2 Se£ 25
Hình 4.3: Vi khuẩn Gram dương (vật kính 100X) và mẫu thử catalase âm tính 25
Hình 4.4: Vịng kháng khuân của mẫu 2-2 s22 E££E££ 222 xe, 27 Hình 4.5: Vịng kháng khuẩn sinh ra từ 'VK 2- 2 2 2£ s2 s2 z2: 30
DANH MUC TU VIET TAT
VKL: Vi khuẩn lactic
Trang 10CHUONG 1
DAT VAN DE 1.1 Giới thiệu
Ở nước ta, nuơi trồng thủy sản ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế Trong những năm gần đây, nhằm nâng cao năng suất thủy sản phục vụ nhu cầu xuất khẩu nên mức độ nuơi thâm canh hĩa ngày càng cao Bệnh trên tơm, cá
và các lồi thủy đặc sản khác cũng xuất hiện ngày càng nhiều Bệnh đã gây
nhiều tơn thất cho nghề nuơi thủy sản Sản phẩm làm ra khơng được tiêu thụ hoặc chất lượng sản phẩm giảm, khơng đảm bảo cho tiêu dùng và xuất khâu Do đĩ, cơng tác phịng trị bệnh trong nuơi trồng thủy sản đang địi hỏi cấp bách
(Bùi Quang Tẻ, 2008) Tuy nhiên, nhiều sản phẩm thuốc thủy sản hiện nay đã
dần mất tác dụng với các loại mầm bệnh quen thuộc do việc sử dụng thuốc quá mức và khơng đảm bảo liều lượng theo yêu cầu dẫn đến tình trạng kháng thuốc của các loại mầm bệnh ngày một gia tăng Việc sử dụng các dịng vi khuân cĩ
lợi để ức chế hay tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh hiện đang được chú trọng, đặc biệt
là nhĩm vi khuẩn lactic (VKL)
VKL là tên gọi của nhĩm vi khuẩn sinh ra axit lactic như là sản phẩm chính
trong quá trình chuyển hố chất bột đường và chúng được xếp vào họ Lactobacteriaceae (Lê Văn Nhương và csv., 2009) VKL cĩ ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn với axit lactic là nguyên liệu rất cần thiết của nhiều ngành cơng nghiệp Đặc biệt, trong cơng nghiệp chế biến và bảo quản thực phẩm như sữa chua, các loại dưa từ rau củ, các loại sản phẩm thủy sản lên men (Lương Đức Phẩm, 2004) Trong quá trình lên men, VKL sinh ra các axit hữu cơ, chúng tạo ra mơi trường khơng thích hợp cho sự phát triển của những vi sinh
vật gây bệnh hay gây hư hỏng sản phẩm, tác động lên màng tế bào chất của vi
khuẩn, ánh hưởng đến chức năng bảo vệ và chức năng dinh dưỡng của màng tế bào, ức chế quá trình vận chuyên chủ động của màng tế bào Axit lactic dễ dàng
thấm qua màng tế bào, làm giảm pH nội bào hoặc tự oxi hố, làm dừng quá
trình trao đổi chất, gây chết những tế bào nhạy cảm với nĩ (Lê Văn Nhương và csv., 2009)
Nhằm làm tiền đề cho việc nghiên cứu dịng VKL cĩ khả năng sinh chất kháng khuẩn tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản hiện nay, đề tài
“Phân lập và tuyển chọn một số dịng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm thủy
Trang 111.2 Mục tiêu nghiên cứu
Nhăm tìm ra một sơ dịng VKL cĩ khả năng sinh chật kháng khuân từ các sản phầm thủy sản lên men
1.3 Nội dung nghiên cứu
e Phân lập một số dịng VKL trong các sản phẩm mam va nước mắm
© Kiểm tra khả năng sinh chất kháng khuẩn từ các nhĩm VKL phân lập
được
Trang 12CHUONG 2
LUOQC KHAO TAI LIEU
2.1 Một số quy trình lên men thủy sản
Mam 1a san phẩm đặc trưng của các tỉnh Nam Bộ, tùy vào điều kiện tự nhiên
đặc trưng của mỗi vùng mà các sản phẩm mắm cũng đa dạng khơng kém Ở các tỉnh đầu nguồn như An Giang, Đồng Tháp nổi tiếng với các sản phẩm mắm cá nước ngọt như mắm cá Lĩc, mắm cá Trèn, mắm cá Rơ Cĩ nhiều cơ sở mắm đã đăng kí bảng quyền thương hiệu và được xuất khẩu như Mắm bà giáo Khỏe, Mắm cơ Tư Âu Về các tỉnh ven biển Bạc Liêu, Cà Mau cũng vang danh với các loại mắm cá đặc trưng của vùng nước lợ mặn như: mắm cá Phi, mắm cá biển, mắm Ba khía, mắm Tép Mam prohoc một sản phẩm mắm quen thuộc của người dân Khmer hay mắm Tơm chà đặc sản của vùng Gị Cơng, Tiền Giang Phần lớn các sản phẩm mắm đều sản xuất theo phương pháp lên men truyền
thống
Quy trình sản xuất của một số sản phẩm mãm
Quy trình làm măm cá cĩ 4 cơng đoạn: làm cá, muơi cá, thính cá, chao mắm Cá làm sạch bỏ ruột, mang, vậy r Ướp muối vào bụng, vào lưng (1 kg mudi cho 5 kg cá) Cho vào mái đầm đậy kín (1 tháng) y Vớt cá ra đê ráo và rãi thính vào lưng, vào bụng Cho vào mái đầm đậy kín (2 tháng)
Trang 13Quy trình làm mắm tép Tép sơng làm sạch, rửa nước muơi Trộn đều với rượu (khoảng 30 phút) U6p gia vi: tỏi, riêng, ớt, đường, nước mắn
Trang 14Quy trình làm mắm tơm Tép tươi sống đem say hoặc chà nát
Trộn muối vừa đủ sao cho enzyme trong ruột tép hoạt động được Cho vào dụng cụ chứa, phơi nắng, khuây đêu r 6 — 12 tháng Mam tơm cĩ màu và hương vị đặc trưng
Hình 2.3: Quy trình sản xuất mắm tơm
(Nguồn: Nguyên Văn Mười, 2009)
Các cơng đoạn làm mam rudc Ruốc tươi đem xào sơ với một ít muơi hạt Ỷ Phơi nắng y Khoang 1 gid
Cho vào cối quết thật nhuyễn với muơi trăng mịn theo cơng thức 3 ruộc: 1 mudi Dé vai gid cho ngam mudi y
Mắm lên men chua, chuyén sang màu đỏ tươi và dậy mùi
thơm là dùng được
Hình 2.4: Quy trình sản xuất mắm ruốc
Trang 15Trong các sản phẩm lên men thủy sản, nước mắm là loại sản phẩm được nhắc đến nhiều nhất Nước mắm được sản xuất hầu hết các nước Châu Á tuy nhiên mỗi quốc gia cĩ phương pháp lên men truyền thống khác nhau, tạo sản phẩm cĩ giá trị dinh dưỡng và giá trị cảm quan khác nhau Về cơ bản, nước mắm là dung dịch đạm (chủ yếu là các axit amin) được tạo thành do quá trình thủy phân protein nhờ các hệ enzyme proftase cĩ trong cá
Quy trình sản xuât nước mắm truyên thơng Lua chon Xử lý Vv Tron mudi Lén men Làm nguội thành phâm Nước mắm Hình 2.5: Quy trình sản xuất nước mắm
(Nguồn: Nguyên Văn Mười, 2009)
Trang 162.2 Vi khuẩn lactic
Lên men lactic là quá trình thu nhận năng lượng nhờ VKL, bao gồm sự biến đơi một phân tử đường thành 2 phân tử axit lactic và năng lượng tách ra
(Lương Đức Phẩm và csv, 2009):
C¿ẴH;;O; =2CH;CHONCOOH + 0,075x101
VKL được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae Các sản phẩm lên men axit
lactic truyền thống đã được sử dụng lâu đời như lên men rau hoa quả, lên men
thịt, lên men cá Nhưng mãi đến năm 1878, Lister mới phân lập được VKL, ơng gọi vi khuẩn này là Bacterium lactic (hién nay goi 1A Trestococcus lactic) Từ đĩ đến nay, nhiều loại VKL được phát hiện và ứng dụng cĩ ích của chúng ngày càng được mở rộng ra nhiều lĩnh vực, đặc biệt là thực phẩm và thực phẩm chức năng Cơng nghiệp lên men để sản xuất axit lactic cĩ thể nĩi được hình thành từ năm 1881 (Nguyễn Lân Dũng và csv, 1997)
Những lồi vi khuẩn lactic khác nhau cĩ sự thích nghi để phát triển rộng rãi trong điều kiện mơi trường khác nhau, và chúng được phơ biến rộng rãi trong tự
nhiên Vi khuẩn lactic thường được tìm thấy ở đường tiêu hĩa (dạ dày và ruột
non) của các lồi động vật khác nhau (chuột, lợn, gia cầm và con người) (Tannock, 1988 được trích dẫn bởi Einar Ringø eí a/, 1997) Trong sữa và các san pham tir stra (Sharp, 1981 duoc trich din béi Einar Ring¢ et al., 1997), cdc sản phẩm thủy sản (Manguin và Novel, 1994 duoc trich dan béi Einar Ringo et ai., 1997), và trên một số bề mặt hệ thực vật (Keddie, 1959 được trích dẫn bởi Einar Ringø e al., 1997) Chúng thường được dùng trong sản xuất và bảo tơn các sản phẩm thực phẩm như pho mát, thịt, sữa chua (McKay và Baldwin, 1990
được trích dẫn bởi Einar Ringo e¿ øl., 1997) Một vài VKL được tìm thấy trong
các sản phẩm thủy sản lên men của Hàn Quốc (Lee, 1993 được trích dẫn bởi Gyu Sung Cho va Hyung Ki Do, 2006) Ngoai dac tinh lén men axit lactic, VKL cịn giúp chuyển hố thức ăn trong cơ thể, hạn chế sự phát triển của vi sinh vật
gây bệnh (tạo ra axit formic, axit bezoic, H;ạO›, chất kháng khuẩn ), giúp phịng một số bệnh (cao huyết áp) (Lê Văn Nhuong va csv, 2009)
w oK - e RK an e
2.2.1 Dac diém cua vi khuan lén men lactic
Vi khuẩn lên men axit lactic cĩ hai dạng hình chính là hình cầu và hình que
Tuy nhiên, khi nuơi cấy trong điều kiện mơi trường hay các điều kiện ngoại
cảnh khác nhau thì cĩ hình dạng khác nhau nhưng chúng đều cĩ một số đặc
điểm sau: chúng là những vi khuẩn Gram dương, khơng cĩ khả năng sinh bào
tử, catalase âm tính, oxydase âm tính, khử natri âm tính và hầu hết đều khơng
Trang 17cĩ mặt oxy, là loại cơ thể duy nhất cĩ khả năng lên men hiếu khí cũng như yếm khí (Lê Văn Nhương và csv , 2009)
Theo hình dáng tế bào và cách sắp xếp tế bào trong mơi trường người ta thường chia VKL thành 4 giống (4 chỉ): Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và
Leuconotoc Các chủng thuộc 4 chỉ này cĩ thể lên men đồng hình hay dị hình
Các chủng lên men đồng hình thường được sử dụng để bảo quản thực phẩm, ướp chua cá thịt, trong sản xuất axit lactic (Lương Đức Phẩm, 2004)
2.2.2 Cơ chế của quá trình lên men lactic
Trong quá trình lên men axit lactic, cơ chất đầu tiên tham gia vào quá trình lên men là đường glucose hoặc fructose Khi sử dụng nguồn nguyên liệu là các
đường đơi hay các chất chứa gốc đường thì trước khi tham gia vào quá trình lên
men chúng phải được thủy phân thành glucose hay fructose nhờ các enzyme tương ứng Lên men axit lactic là quá trình chuyển hố yếm khí đường thành axit lactic (Lé Van Nhuong va csv, 2009)
Cĩ 2 kiểu len men lactic Trong lên men lactic đồng hình thực tế chỉ xuất hiện axit lactic, cịn trong lên men dị hình các sản phẩm cuối cùng khá đa dạng: axit lactic, etanol, axit acetic và CO; Chỉ cĩ lên men lactic đồng hình là cĩ ý nghĩa
về mặc cơng nghiệp (Nguyễn Lân Dũng và csv, 1997)
2.3 Mối quan hệ giữa axit lactic với cá và các sản phẩm từ cá
VKL khơng được coi là thuộc về mơi trường thủy sản, nhưng cĩ một số lồi vi khuẩn như: Carnobacterium, Vagococcus, Lactobacillus, Enterococcus,
Lactococcus đã được tìm thấy trong các lồi cá nước ngọt và mơi trường nước
nuơi (Austin, 1992 được trích dẫn bởi Ringø e/ ai., 2000) Carnobacteria, Carnobacteria piscicola chiếm phần lớn và thấp nhất là Carnobacteria divergens, đã cĩ những ghi nhận về các giỗng vi khuẩn này như một phần của hệ vi sinh đường ruột của nhiều lồi cá Mặt khác, Carnobacteria piscicola (Baya et al., 1991 được trích dẫn bởi Einar Ringg et al., 1997) va Lactobacillus sp cĩ mỗi quan hệ với cá bệnh (Cone, 1982 được trích dẫn bởi Einar Ring¢ et al., 1997) Tuy nhiên, sự quan trọng của Carnobacferia như là một tác nhân gây bệnh cá nhưng khơng thể đánh giá chính xác (Schillinger và Holzapfel, 1995 được trích dẫn bởi Ulrike Lyhs, 2002)
Một vài nghiên cứu liên quan đến sản phẩm cá được đĩng gĩi và hút chân đã được thực hiện tập trung vào ảnh hưởng của chế biến và trên các vi sinh vật chất
lượng Sau khi kết thúc quá trình giữ lạnh ở nhiệt độ khác nhau, VKUL qua quá
trình kiểm tra cĩ từ 10” — 10” CFU/g (Schulze, 1985 được trích dẫn bởi Zorn er al., 1993) Trong nghiên cứu của Zorn é/ al (1993) mat số vi khuẩn
Trang 18Carnobacteria vượt trội trong sản phẩm cá Hồi đĩng gĩi hút chân khơng được
bảo quản ở nhiệt độ 8 °C và 20 °C Một số nghiên cứu trước kia trên sản phẩm cá được hút chân khơng giữ lạnh Sau khi kết thúc giai đoạn giữ lạnh sự biến đổi
của hệ sinh vật tỷ lệ với vi khuẩn lactic, Enferobacteriaceae và một số vi khuẩn khác đã được quan sát thấy trong sản phẩm được lưu trữ ở nhiệt độ ướp lạnh
Mật số VKL tir 10° — 10° CFU/g (Joffraud et al., 2001 duoc trich din béi Ulrike
Lyhs, 2002) Trong một vài trường hợp, số lượng vi khuẩn lactic 10 — 107
CEU/g cùng với mật số vi khuẩn Gram âm từ 10° - 10’ CFU/g (Paludan-Miiller et al., 1998 duoc trich dan béi Ulrike Lyhs, 2002)
Theo Leroi et al., (2001) (được trích dẫn bởi Ulrike Lyhs, 2002) phan biét tại thời điểm hỏng cho cùng một loại sản phẩm cá cĩ ba loại vi khuẩn khác nhau: lactobacilli, một hỗn hợp của lactobacilli và En/erobacteriaceae hoặc một hỗn hợp của VKL và Brochothrix thermospacta VKL trong sản phẩm giữ lạnh hút chân khơng bị hư hỏng được tìm thấy các giống vi khuan Lactobacillus, Leuconostoc, Lactococcus và Carnobacteriưm Theo Magnusson và
Traustadottir (1982) cho rằng chỉ cĩ vi khudn Lactobacilli homofermentative
trong chân khơng đĩng gĩi lạnh cá trích hun khĩi (được trích dẫn bởi Ulrike
Lyhs, 2002)
2.4 Chất kháng khuẩn (CKK)
Trong các sản phẩm chuyển hố cĩ khả năng ức chế vi sinh vật của VKL thì chất kháng khuân được các nhà khoa học và nhà cơng nghiệp thực phẩm đặc
biệt chú ý CKK của VKL bắt đầu được nghiên cứu từ những năm 1940 Từ đĩ
đến nay đã cĩ rất nhiều CKK khác nhau được phát hiện (Lê Văn Nhương và csv, 2009) Nisin là CKK được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất, được sử dụng trên 40 nước khác nhau (Delves — Brought,J,1990 được trích dẫn bởi Adisorn Swetwiwathora et al., 2009) Theo tai liệu gần đây nhất thì CKK được
định nghĩa như sau: “CKK là các polypeptit cĩ tính kháng khuẩn, được sản sinh
trên các riboxom hoặc các protein cĩ khả năng kháng khuẩn chống lại một phổ
hẹp các lồi vi khuẩn họ hàng gần gũi” (Lê Văn Nhương và csv, 2009) Người
ta đã chứng minh chắc chắn rằng nhiều loại VKL sản sinh ra CKK (Cleveland et al., 2001; O Sullivan et al., 2002 dugc trich din béi Pongtep Wilaipun et al.,
Trang 19Hién nay, CKK dugc chia thanh 4 nhém
Nhĩm I: là nhĩm lantibiotic, là loại polypeptit cĩ khối lượng phân tử nhỏ (< 5 KDa), chứa amino acid lanthionine, B — methyllanthionine
Nhĩm II: gồm các CKK khơng phải là lantibiotic, khối lượng phân tử nhỏ (< 10 KDa) Cấu trúc gấp nếp đ, bền nhiệt, cĩ thể chịu được nhiệt độ khoảng
100 — 121 °C
Nhĩm III: các CKK cĩ khối lượng phân tử lớn (>30 KDa), khả năng bền nhiệt
cao
Nhĩm IV: Đây là nhĩm CKK phức tạp Trong cấu trúc phân tử ngồi protein, chúng cịn chứa các thành phần khác là lipid, carbohydrat Tiêu biểu của nhĩm nay là: plataricin S, leconocin S, lactocin 27 và pediocin SJ — 1
Trong đĩ, nhĩm I và II được nghiên cứu nhiều nhất và chúng cũng đa dạng
nhất
Bảng 2.1: Các đặc tính CKK của VKL
Chất kháng Tên Phổ ức chế pH Khối Enzyme
khuẩn vi khuẩn hoạt lượng bất hoạt sản xuất động phân tử (Da) 1 Lantibiotic
Nisin A Lactococcus Vi khuẩn 2-7 3353 a lactic subsp lactic Gram (+) chymotr ATCC 11454 ypsin,
nisinase Nisin Z Lactococcus Vi khuan
lactic subsp lactic Gram (+) NIZO 22186
Lacticin 481 Lactococcus LAB,Clostridiu 2 — 8 2901 a
lactic subsp lactic m chymotr CNRZ 481 tyrobutyricum ypsin,
ficin,
proteina
se K
LactoceinS Lactobacillus Staphycoccus <5,5 3778 Trysin, sake 145 carnosus protease
Trang 21Co ché tac dung cia CKK cia VKL
CKK của VKL dù thuộc nhĩm này hay nhĩm khác nhưng chúng đều cĩ một cơ chế tác dụng chung Đĩ là chúng tấn cơng màng tế bào nhạy cảm, gây tổn thương màng khơng thé khắc phục được, tế này sẽ chết do nội chất thốt ra ngồi Sỡ dĩ CKK cĩ thể tắn cơng vì chúng cĩ dạng hồ tan, dễ dàng xâm nhập vào tế bào, làm mắt lực đây proton (PMF), làm giảm thế năng của màng nguyên
sinh chất và thay đổi pH nội bào, từ đĩ tế bào khơng thể tổng hợp được màng tế bào và tế bào bị chết (Lê Văn Nhương và csv , 2009)
2.5 Dịng chỉ thi Pediococcus pentosakeus
Phan loai Pediococcus (Claussen 1903) Nganh: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ: Lactobacillaceae Giống: Pediococcus
Lồi: Pediococcus pentosakeus
Nhĩm Peđiococcus dạng hình cầu, cĩ thể đứng riêng lẻ, kết đơi hay kết chuỗi
hoặc tạo đám tỷ cầu hay bát cầu khuẩn Hình dạng, kích thước và sự sắp xếp của
tế bào cũng cĩ thể thay đổi phụ thuộc vào thành phần của mơi trường, điều kiện
ngoại cảnh khi nuơi cấy tế bào (Lê Văn Nhương và csv, 2009)
Hình 2.6: Pediococcus
Pediococcus cĩ hoạt tính thủy phân protein rất yếu, Gram dương, quá trình trao
đổi chất của nĩ là quá trình lên men đồng hình Chúng là những vi khuẩn yếm khí tùy tiện, cĩ thể phát triển trên mơi trường rắn với sự cĩ mặt của khơng khí Ching này yêu cầu rất cao về thành phần dinh dưỡng từ mơi trường Vì chúng
Trang 22khơng cĩ khả năng sinh tơng hợp các chất cần thiết cho sự phát triển của cơ thé Các lồi Pediococcus khác nhau về tính chịu nhiệt, chịu axit và chịu NaCl
2.6 Những nghiên cứu (rong và ngồi nước 2.6.1 Những nghiên cứu trong nước
Hiện nay, ở nước ta việc nghiên cứu về CKK do VKL sinh tổng hợp nên đã và
đang được nhiều nhà khoa học quan tâm Tuy nhiên, các nghiên cứu về ứng
dụng của CKK cịn ít và chưa thu được những kết quả khả quan Một số nghiên cứu tiêu biêu về VKL và CKK
Tuyển chọn định hướng VKL sinh CKK từ một số thực phẩm giàu protein lên men lactic ở Việt Nam (Mai Thị Hang va csv, 2000)
Phân lập và tuyển chọn một số chủng VKL sinh chất diệt khuẩn sinh học
CKK (Nguyễn Thị Hương Trà và csv, 2001)
Tối ưu hố quá trình lên men Ew/ecocin của chủng vi khuẩn enterococus sp Tn43 phân lập từ nem chua Phần I-Nghiên cứu ảnh hưởng của một sé yéu t6 toi kha nang sinh bacteriocin cia ching VKL Enterococus sp Tn43 34 (Lé Thanh Mai va csv, 2001)
Nghiên cứu cơng nghệ sản xuất CKK từ chủng VKL ST20 (Nguyễn Thị
Hương Trà và csv, 2002)
Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp CKK của lồi Lacfobacillius plantarum L24 (Nguyén Thi Hoai Ha và csv, 2005) Trung tâm Cơng
nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội
Một số đặc tính của CKK sản xuất bởi vi khuan Lactobacillus
acidophilus Lê Thị Hồng Tuyết và Hồng Quốc Khánh Viện Sinh học Nhiệt Đới, Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam
Trang 232.6.2 Những nghiên cứu ngồi nước
Hiện nay việc nghiên cứu, ứng dụng CKK do VKL sinh tổng hợp nên đang là một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học quan tâm Cũng đã cĩ những cơng trình nghiên cứu và ứng dụng thành cơng, gĩp phân vào việc nâng cao chât lượng cuộc sống của nhân loại CKK là một chất cĩ khả năng ức chế một số vi
khuẩn gây bệnh, nhờ khả năng này mà việc ứng dụng của VKL được đa dạng và
phong phú hơn CKK đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu từ rất
lâu và đạt nhiều thành tựu
Theo Kekessy e/ aÍ., (1970) đã nghiên cứu một phương pháp mới trong việc phát hiện CKK Chủng vi sinh vật đối kháng được nuơi ủ trên đĩa
mơi trường thạch dinh đưỡng, sau đĩ tạo giếng cĩ đường kính 0.5 mm
bằng cách đục bỏ agar trên đĩa Cho một lượng vi khuẩn cĩ khả năng sinh tổng hợp CKK vào giếng, sau thời gian nuơi ủ vịng kháng khuẩn sẽ xuất hiện, thê hiển bởi một vịng sáng rõ quanh giếng
Nam 1976 tai Minnesota, Tagg et al., đã nghiên cứu về những loại CKK của vi khuẩn gram dương và cho ra nhiều kết quả cĩ giá trị Nghiên cứu
đã cho biết được tính đối kháng của CKK, cách đặt tên và phân loại
CKK, chiết tách và tinh sạch CKK, phân tích hoạt tính CKK, các loại hoạt động của CKK và ứng dụng của CKK,
Năm 1992 tại Laramie, Yang eí aÏ, đã nghiên cứu một phương pháp mới
để chiết tách một lượng lớn CKK từ VKL Phương pháp này dùng mơi
trường pediocin ẤcH, msin, sakacIn A, leuconocin Lcm] làm tăng hiệu
quả chiết tách và thu được một lượng CKK nhiều hơn quá trình phân lập
Năm 1999 tại Bỉ, Raf Callewaert và Luc De Vuyst đã nghiên cứu việc sinh tổng hợp CKK của Lactobacillus amylovorus DCE 471 và cĩ ứng
dụng cải tiến và làm ốn định các sản phẩm lên men Việc sinh tổng hợp thu nhận CKK bị ức chế bởi nồng độ của nguồn nitrogen
Năm 1999 tại Pakistan, Khalid et al., di nghién ctu tim ra mét loai CKK mới cĩ tên lactocin LC-09 Lactocin LC-09 được phân lập từ chủng vi khuẩn lactobacillus cĩ trong một mẫu bệnh
Năm 2002 Soore và cv đã nghiên cứu việc tạo ra một chất kháng đặc biệt của VKU gọi là CKK CKK được sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm tự nhiên cĩ khả năng thay thế các loại hố chất bảo quản khác CKK cĩ bản chất là protein nên rất an tồn đối với sức khoẻ con nguoi
Trang 24Nam 2002 tai Thai Lan, Pongtep Wilaipun et al da tim thay kha nang sinh CKK cua Enterococcus faecium duoc phân lập từ các sản phẩm thủy sản lên men của Thái
Nam 2004, Todorov, S.D., Van Reenen, C.A va Dicks K.M (Nam Phi)
đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp CKK của chủng Lactobacillus
plantarum ST13BR , mot chung duoc phan lap tir bia Barley
Năm 2006, 50 chủng VKL được tìm thấy từ sản phẩm lên men truyền
thống suan-tsai của Đài Loan Với các chủng sau khi phân lập tiếp tục nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hố và khả năng sinh tơng hợp CKK
Năm 2006, Stefan Marcinowski cho biết kẹo cao su cĩ chứa các chủng vi
khuẩn cĩ lợi lactobacillus do cơng ty hố chất BASE của Đức phát triển
Đây là sản phẩm giúp người dùng loại trừ các bệnh về răng miệng Thang 3/2007, Todorov, S.D va Leon M.T Dicks K.M (Nam Phi) da nghiên cứu khả năng sinh tong hop CKK cua ching Lactobacillus pentosus ST712BZ duoc phan lap tir boza
Các nhà nghiên cứu CSIRO để tìm ra một vài CKK và sử dụng chúng để
tiêu diệt những con vi khuẩn gây bệnh trên gà và lợn
Bộ gen cho phân tử CKK sẽ được chèn vào gen vi khuẩn khơng gây bệnh
hoặc vi rút mà cĩ thể sinh sản và tiết ra CKK Lợi ích chính của việc sử
dụng CKK là nĩ sẽ giảm mầm bệnh nguy hiểm của con người chống cự
Trang 25CHUONG 3
VAT LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU
3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 3.1.1 Địa điểm
Phịng thí nghiệm — Khoa Sinh Học Ứng Dụng - Trường Đại Học Tây Đơ 3.1.2 Thời gian thực hiện Từ tháng 3 năm 2011 đến tháng 5 năm 2011 3.2 Vật liệu nghiên cứu Dụng cụ thí nghiệm cỗ định Tủ cấy vi sinh CEMACO Tủ ấm vi sinh Memmert Tủ lạnh SanYo Tủ sấy Memmert
Nồi Autolave STURDY — SA 300 VF Máy khuấy từ Yellowline Cân 2 số lẻ Sartorius Tủ hút Dụng cụ thí nghiệm khơng cố định May Vortex Ơng nghiệm cĩ nắp, giá để ống nghiệm Dia petri, cc 100 ml
Micropipet BIOHIT 20 — 200 pl , 100 — 1.000 pl , 1.000 — 5.000 ul;
Dau tip 200 pl, 1.000 yl, 5.000 pl
Đèn cơn, hột quẹt
Đũa tán thủy tinh đầu tam giác, que cây đầu nhọn, que cấy đầu trịn
Cây nhíp, dao mơ nhỏ, kéo
Bao hấp, giấy bạc gĩi, thun, parafilm, bọc, băng keo giấy, bơng gịn, giấy thắm
Khay nhựa, hộp nhựa nhỏ, thao nhựa, bình tia Ống falcon 2 ml, ống effendoft 1,5 ml
Chai thủy tỉnh nẫu mơi trường 500 mi, cá tử
Găng tay, khâu trang
Trang 26Mơi trường nuơi cây
Mơi trường MRS_ broth (Lacfobacilus MRS Broth, MERCH - Đức)
Mơi trường MRS_ agar (Lacfobacius MRS Agar, MERCH — Đức) Các loại hố chất Calcium carbonate (CaCO3), Sodium chloride (NaCl) Glycerol 30% Nước cất, nước muối sinh lý 9%o Cơn 70% và cồn 96% Hố chất nhuộm Gram Hố chất thử catalase Nguồn mẫu chỉ thị Pediococcus penfosakeus từ Khoa Nơng Nghiệp — Trường Đại học Kyushu, Nhật Bản
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp thu và bảo quản mẫu
Mẫu mắm được thu ngẫu nhiên tại các chợ Châu Đốc, Trung tâm thương mại
Tp Cần Thơ (đặc trưng vùng nước ngọt), chợ Bạc Liêu, chợ Sĩc Trăng (đặc trưng vùng nước lợ mặn) Mẫu được giữ riêng biệt từng loại trong hộp nhựa nhỏ đặt tại phịng thí nghiệm với nhiệt độ phịng
Bảng 3.1: Tên và địa điểm thu mẫu
STT Tên mẫu Điểm thu
Trang 2714 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 Nước mắm Hồng Dai Nước mắm Kabin
Nước mắm Nam Ngư
Nước mắm Thanh Liêm
Nước mắm Nam Ngư chua ngọt
Mam ruéc Tri Hai
Mam ruốc Huế Mắm tép Mắm tơm Mắm lĩc Bạc Liêu Mam trén Mam sac A Mam sac B Mam ruốc Mam ba khía Mam c4 com Mắm cá biển A Mắm cá biển B Mắm rơ Mắm cá đối, cá cơm Mắm prohoc A nhiễn Sĩc Trăng Mắm prohoc B to Mắm sặc Mam ném pha san
3.3.2 Phương pháp phân lập VKL từ mẫu mắm
Theo De Man et al., (1960) (duoc trich din béi Gyu Sung Cho va Hyung Ky Do, 2006) VKL dugc phan lập trên mơi trường MRS_agar sau đĩ được U ở 30 °C trong 48 — 72h để khuẩn lạc phát triển Khuẩn lạc được chọn một cách ngẫu nhiên và được làm thuần bằng phương pháp cấy truyén (Leisner et al., 1997 được trích dẫn bởi Gyu Sung Cho và Hyung Ky Do, 2006)
Những dịng thuần của VKL được tăng sinh trong mơi trường MRS_broth (pH 6,5) và được ủ ở 30 °C trong 24h Tất cả các dịng thuần này được trữ trong mơi
trường MRS_broth cĩ chứa glycerol 20% và ủ lạnh 6 4m 70 °C (Gyu Sung Cho và Hyung Ky Do, 2006) Quy trình phân lập mẫu mắm được thực hiện tương tự theo Penson Jumriangrit (2004)
Trang 28Mau mam \ Nuơi tắng sinh trong mơi trường MRS_ broth, nước cât, muơi sinh lý Trữ 1 mi mau trong ơng fancol, giữ lạnh ủ24h t° 30 °C \ VKL Cấy lên đĩa thạch đã phân lập MRS_agar 4 ml thử các đ phương pháp kiêm eee tra kha nang sinh \ 308 chat kháng khuân từ A âu đã phân 14 Lây 1 khuân lạc riêng lẽ ú 2h mau đã phần lập t 30°C nuơi tăng sinh trong ơng nghiệm MRS_ broth 5Š ml
Hình 3.1: Quy trình phân lập mẫu mắm
Trang 29Sau khi tối ưu, chọn thời gian tăng sinh tốt nhất dé tiến hành thử khả năng sinh
CKK của các dịng phân lập được với dịng chỉ thị Pediococcus pentfosakeus
bằng phương pháp trực tiếp (Coventry e/ al., 1997 được trích dẫn bởi Penson
Jumriangrit, 2004) theo sơ đồ Hình 3.3 Đồ ống MRS_agar chứa Pediococcus pentosakeus lên đĩa đã ủ Ủ24h 5 30°C y VKL da tang sinh cay 1 diém lén dia MRS_agar Xuất hiện khuẩn Ủ 24h lac cua VKL 30C Quan sắt vịng kháng khuân Hình 3.3: Phương pháp trực tiếp 3.4 Phân tích và xử lý số liệu 3.4.1 Phân tích VKUL ® Quan sát hình dạng khuẩn lạc © Do kích thước khuẩn lạc e Quan sat su phan giai CaCO;
3.4.2 Phân tích khả năng kháng khuẩn
e© Đo kích thước vịng kháng khuẩn e© Quan sát hình dạng vịng kháng khuẩn
Số liệu được tổng hợp và phân tích trên phần mềm Microsoft Excel
Trang 30CHUONG 4
KET QUA THAO LUAN
4.1 Phân lập một số dịng VKL từ các sản phẩm thủy sản lên men
4.1.1 Thu mẫu
Mẫu được thu ngẫu nhiên tại các chợ và trung tâm thương mại Kết quả được
thê hiện qua Bảng 4.1 Cĩ tổng số 37 mẫu được thu tại các vùng nước ngọt và lợ mặn Cụ thể như vùng nước ngọt Châu Đốc (An Giang), Cần Thơ, Tiền Giang và vùng nước lợ mặn Sĩc Trăng, Bạc Liêu
Bảng 4.1:Địa điểm và số lượng mẫu thu
Vùng thu Tên tỉnh Số lượng mẫu
Nước ngọt Châu Đốc (An Giang) 9 Tién Giang 1 Can Tho 12 Nước lợ mặn Bạc Liêu 11 sĩc Trăng 4
Qua Bảng 4.1 cho thây, cĩ 22 mẫu mắm và nước mắm được thu tại các vùng nước ngọt và 15 mẫu được thu tại những vùng nước lợ mặn
4.1.2 Tang sinh mau lần 1
Mẫu mắm sau khi thu về tiến hành tăng sinh lần 1 ở 30 °C, thời gian 24h trong 3 loại mơi trường khác nhau MRS_broth, nước cất và nước muối sinh lý đã thanh
tring (phy luc C)
Hình 4.1: Cách xác định sự phát triển của VKL
Ghỉ chú: A — mẫu chưa tăng sinh; B — mâu sau tang sinh
Trang 31Bảng 4.1: Kết quả tăng sinh lần 1 STT Tên mẫu Điểm thu Mơi trường nuơi nước mudi MRS
cat sinhly broth
1 Mam linh Chau Déc + + + 2 Mam sac + - + 3 Mam léc + - + 4 Mắm chốt + - + 5 Mắm rơ + - + 6 Mam trén + - + 7 Mắm rơ lớn + + + 8 Mèvinh + + + 9 Mắm rơ phi + + + 10 Mắm ruốc Bà2 TiềnGiang = + + + 11 Mam linh Can Tho + + + 12 Mamsac + + + 13_ Nước mắm Quốc Hải + + + 14 Nước mắm Hồng Đài + + - 15_ Nước mắm Kabin + + + 16 Nước mắm Nam Ngư + + +
17 Nước mắm Thanh Liêm + +
18 Nước mắm Nam Ngư chua ngọt - - -
Trang 32Tăng sinh mẫu lần 1 cĩ 36 dịng phát triển trong mơi trường nước cất, 30 dịng
phát triển trong mơi trường nước muối sinh lý 9%o, 32 dịng phát triển trong mơi
trường MRS_broth Sự khác nhau giữa số lượng vi khuẩn cĩ xuất hiện trong các mơi trường khơng cao Vì VKL cĩ khả năng phát triển trong những điều kiện
mơi trường khắc nghiệt (Lương Đức Phẩm, 2004)
Trong đĩ, cĩ 27 mẫu cĩ phát triển được trong cả 3 mơi trường Mẫu nước mắm Nam Ngư chua ngọt do cĩ chứa tỏi ớt (đây là chất diệt khuẩn) nên vi khuân khơng phát triển, tăng sinh mẫu khơng lên Các mẫu mắm thu ở vùng nước lợ
mặn vi khuẩn đều lên tốt trong các mơi trường nuơi so với mẫu thu ở vùng nước
ngọt Cĩ thể nguồn mẫu thu từ vùng nước ngọt cĩ hàm lượng dinh dưỡng khơng cao nên khi cân mẫu cho vào nuơi tăng sinh thì khơng đủ dinh dưỡng cho sự
phát triển của vi khuẩn
4.1.3 Cay ria trén dia petri
Những mẫu mắm tăng sinh lần 1 cĩ vi khuẩn phát triển được mang di cay ria tiếp tục lên mơi trường MRS_agar cĩ bỗ sung CaCOa 0,6% Đĩa sau khi cây được quấn giấy parafim xung quanh và cho vào tủ ủ ấm 6 30 °C sau 24h quan
sát, kết quả được thể hiện ở Bảng 4.3
Bảng 4.3: Kết quả cấy ria vi khuẩn trên đĩa thạch
J Nước muơi
- - Nước cât sinh lý - MRS_broth Tên mầu Diém thu Ket Ket Ket
Tang qua Tang qua Tang qua sinh cây sinh cay sinh cay
lanl ria lanl ria lần 1
Trang 33
Mam ruéc Tri Hai
Mam ruốc Huế Mắm tép Mắm tơm + + + + + Mắm lĩc Bạc Liêu Mắm trèn Mắm sặc A Mắm sặc B Mắm ruốc Mắm ba khía Mắm cá cơm Mắm cá biển A Mắm cá biển B Mam rơ Mắm cá đối, cá cơm Mắm prohoc A nhiễn Sĩc Trắng Mam prohoc B to Sac ++ +++ +++ + +++ t + ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + +++++ + + ++++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + I + + + Mam ném pha san Ghi chú: - khơng lên khuẩn lạc + cĩ lên khuẩn lạc
Kết quả cấy ria cĩ 82 đĩa pêtri xuất hiện sự phát triển của khuẩn lạc Trong đĩ,
cĩ 15 đĩa mẫu bị nhiễm nắm, 67 đĩa mẫu khơng nhiễm nắm và được 57 mẫu cĩ
khả năng phân giải CaCOa
Qua quá trình quan sát khuẩn lạc nhận thấy đa số khuẩn lạc phân lập được cĩ dạng hình trịn, một số cĩ hình dạng trịn khơng đều rìa dợn sĩng Bè mặt khuẩn lạc lồi, nhấn bĩng, một số khác bề mặt gồ ghé, lõm ở giữa Khuẩn lạc sau một thời gian phát triển đặc tính nhày Màu sắc khuẩn lạc thường cĩ màu trăng sữa, trăng trong hoặc màu trắng đục, để một thời gian chuyển sang màu vàng kem Đặc biệt, khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của axit Trong quá trình phát triển của VKL đã tạo ra các chất biến dưỡng cùng với các sản phẩm của trao đổi chất, mà
cụ thể là axit lactic Axit lactic này tác dụng với CaCO; duoc bỗ sung vào mơi
trường trong quá trình nuơi cấy, lượng CaCO; xung quanh khuẩn lạc bị chuyển
hĩa thành muối canxi, CO; và H;O, nhờ thế mà duy trì được pH ở mức 5.5 — 6 (Lương Đức Phẩm, 2004) trả lại vùng mơi trường xung quanh khuẩn lạc trong như
ban đầu Bề dày của vịng trong này biểu thị lượng axit sinh ra nhiều hay ít
Trang 34
Hình 4.2: Khuân lạc cĩ khả năng phân giải CaCOa
4.1.4 Thử catalase và nhuộm Gram
Tiến hành thử catalase và nhuộm Gram cho những đĩa cĩ sự phát triển của khuẩn lạc (phụ lục E) Qua kết quả nhuộm Gram cho thấy các dịng vi khuẩn đều là vi khuẩn Gram dương bắt màu tím sen với thuốc nhuộm và cĩ dạng hình que, sống đơn, đơi hoặc kết thành chuỗi ngắn, một số dịng cịn gom thành cụm Qua phép thử catalase tồn bộ các dịng được phân lập đều âm tính với catalase Những thơng tin này đều phù hợp với mơ tả của các nghiên cứu trước đây (Pongtep Wilaipun et al., 2002; Penson Jumriangrit, 2004; Nguyễn Võ Mỹ
Ngân, 2010)
Hinh 4.3: Vi khuẩn Gram dương (vật kính 100X) và mâu thử catalase âm tính
Các dịng vi khuẩn phân lập được đều cĩ đặc tính giống như các nghiên cứu đã được cơng bố về VKL như: hình que ngắn, khơng sinh enzyme catalase, gram
dương, tạo vịng trong đối với mơi trường cĩ bổ sung CaCOs và một điều quan
trọng là mơi trường dùng cho cơng tác phân lập và tách rịng là MRS, mơi
trường đặc hiệu cho lồi Løcfobacilus Như vậy, tất cả những dịng vi khuẩn
được phân lập chứng thực là nhĩm VKL
Trang 354.1.5 Tang sinh mau lan 2
Tién hanh tang sinh lần 2 cho các đĩa chứa mẫu sau khi được xác định là VKL Tăng sinh mẫu ở 30 °C trong ống nghiệm chứa mơi trường MRS_broth cĩ bố sung NaCl 0,6% (cho những mẫu mắm thu ở vùng nước lợ mặn) (Komkhae Pilasombut et al., 2005) Theo Pongtep Wilaipun et al (2002), cac dong VKL
tăng sinh trong mơi trường MRS_broth ở nhiệt độ 30 °C sẽ sinh CKK tốt nhất và khả năng chất kháng khuẩn này sẽ giảm đi khi tăng nhiệt độ
Kết quả tăng sinh lần 2 tất cả 56 đĩa lên khuẩn lạc phát triển tốt trong mơi
trường MRS_broth Cĩ 26 mẫu khơng phát triển được do bị nhiễm nắm trong
quá trình thao tác, do phịng thí nghiệm được sử dụng chung cho các hoạt động
khác nhau và khơng phải là khu vực cách ly so với mơi trường bên ngồi nên
khả năng nhiễm nắm và tạp khuẩn sẽ cao Tiến hành lập mẫu và trữ các dịng vi khuẩn đã phân lập được
4.1.6 Lưu trữ mẫu Mẫu được trữ đưới 2 dạng
e Lỏng: rút 1 ml mẫu đã tăng sinh cho vào falcon 2 ml chứa 1 ml dung
dịch glycerol 30% đã thanh trùng, lắc đều trên máy vortex và quấn kín
bằng giấy parafim Mẫu được trữ lạnh ở âm 80 °C
e© Khuẩn lạc: cấy mẫu đã tăng sinh lên mặt phẳng nghiêng của mơi trường
MRS_agar trong ống effendoft 1,5 ml, mỗi mẫu cấy vào 3 ống, đem ủ ấm ở 30 °C đến khi xuất hiện khuẩn lạc rõ (48h) Mẫu được giữ trong ngăn
mát tủ lạnh
4.2 Kiểm tra khả năng sinh CKK từ các dịng VKL thu được
4.2.1 Tối ưu hĩa quy trình
Chọn ngẫu nhiên 3 mẫu 78, 80 và 83 tiến hành tối ưu hĩa theo quy trình Hình 3.2, nhằm xác định thời điểm sinh chất kháng khuẩn nhiều nhất trong điều kiện
thí nghiệm hiện tại của các dịng vi khuẩn được phân lập, với dịng chỉ thị là Pediococcus pentosakeus
Kết quả tối ưu hố được thể hiện ở Hình 4.4 cho thấy mẫu nuơi tăng sinh ở 30 °C, thời gian 48h cho kết quả tốt nhất (C) với vịng kháng khuẩn rõ, đường
kính vịng 1,3 cm
Trang 36Hình 4.4: Vịng kháng khuẩn của mẫu
4.2.2 Thử khả năng sinh CKK từ các dịng VU thu được
Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 5ml mơi trường MRS agar va cdc dong vi khuan đã phân lập được nuơi tăng sinh ở 30 °C, thời gian 48h Tiến hành thử khả năng
sinh CKK với dong chi thi Pediococcus pentosakeus bằng phương pháp trực tiếp
Qua Bảng 4.4 cho thấy VKL cĩ khả năng sinh CKK, kết quả này phù hợp với
kết quả của Penson Jumriangrit (2004) nghiên cứu về khả năng sinh CKK từ các sản phẩm thủy sản lên men của Thái Lan Khả năng sinh CKK của những dịng
VKL là khác nhau, phụ thuộc vào: dịng vi khuẩn, điều kiện nuơi cấy, giai đoạn
phát triển, thời gian nuơi cấy Đa số những dịng vi khuẩn lactic sau 8h bắt đầu
sinh CKK, vịng kháng khuẩn khá rõ sau 12 giờ và đạt bề dày lớn nhất sau 18h — 24h, sang 48h vịng kháng khuẩn mờ dẫn và đến 72h gần như khơng thấy, kết
quả tương tự Mai Đàm Linh và csv (2007)
Cĩ 21 mẫu khơng cho vịng kháng khuẩn ở cả 3 lần thử và 19 mẫu nghỉ ngờ cĩ
vịng kháng khuẩn do vịng mờ, khĩ do được độ dày vịng kháng khuẩn Trong
Trang 38Những mẫu nghỉ ngờ cĩ khả năng kháng khuẩn và những mẫu cho vịng kháng
khuẩn tốt được đem thử tiếp với dịng chỉ thị Pediococcus pemtosakeus thời gian
nuơi khuẩn lạc của mẫu 48h (gấp đơi lần thử trước) Kết quả cho thấy đường
kính vịng kháng khuẩn rõ và to hơn đối với những mẫu cho vịng kháng khuẩn tốt ở lần thử đầu, cịn những mẫu nghỉ ngờ nhiều cũng cho vịng kháng khuẩn rõ
và to như mẫu 16, 81, 82 Mẫu ủ 48h khuẩn lạc phát triển lớn hơn vì thế mà khả năng sinh chất kháng khuẩn cũng nhiều hơn khuẩn lạc nhỏ ủ trong 24h (De Man et ai., 1960 được trích dẫn bởi Gyu Sung Cho và Hyung Ky Do, 2006) Kết quả được thê hiện ở Bảng 4.5
Trang 39Bảng 4.5: Kết quả thử với Pediococcus pentosakeus
Mã Khuân lạc nuơi24h Khuẩn lạc STT mẫu (cm) nuơi 48h lnI1 lân2 lân3 (cm) Tên mẫu 1 1 2 01 0,1 0,2 Linh MRS CD 2 6 03 O02 045 0,5 Linh muối CÐ 3 7 ? ? 9 0,15 Mắm ruốc Bà 2 MRS TG
4 10 04 04 04 0,5 Nước mắm Quốc Hải MRS CT
5 11 ? ? ? 0,1 Nước mắm Hồng Đài nước CT
6 16 ? ? ? 0,65 Nước mắm Hồng Đài nước CT 7 34 ? 0,15 01 0,85 Sac A MRS BL 8 36 ? ? ? 0,2 Lĩc nước BL 9 40 015 0/1 0,1 0,3 Mam ruéc MRS BL 10 41 03 03 043 0,7 Sic MRS ST 11 43 0,15 01 0,15 0,5 Lĩc muối BL 12 63 03 0/2 9 0,7 Léc MRS BL 13 71 01 02 0,1 0,35 Biển B muối BL 14 78 015 01 015 0,7 Rơ MRS BL 15 79 03 9 0,3 0,4 Cá đối muối BL l6 80 0,25 0,1 9 0,65 Rơ lớn MRS CĐÐ 17 81 9 9 9 0,65 Rơ nước BL 18 82 2 2 2 0,7 Cá đối MRS BL 19 83 04 03 04 0,7 R6 mudi BL Qua Bảng 4.5 cho thấy mẫu cĩ độ dày nhỏ nhất là 0,1 cm và lớn nhất là 0.85
cm Trong đĩ, cĩ 5 dịng cho vịng kháng khuẩn với độ dày 0,1 — 0.3 cm, cĩ 5
dịng cho độ dày vịng trong khoảng lớn hơn 0,3 — 0,6 và cĩ 9 dịng cĩ độ dày
vịng kháng khuẩn hơn 0,6 cm
Trang 40CHUONG 5 KET LUAN DE XUAT 5.1 Két luan
e© Trong các sản phẩm thủy sản lên men như các loại mắm, nước mắm, mắm ruốc cĩ chứa vi khuẩn lactic Đã phân lập được 83 dịng vi khuẩn
lactic từ 37 mẫu mắm và nước mắm
e Qua quá trình khảo sát đã xác định được 19 dịng vi khuẩn lactic cĩ khả năng sinh chất kháng khuẩn Trong đĩ, cĩ 12 dịng VKL được phân lập từ các loại mắm ở vùng nước lợ mặn, 4 dịng VKL được phân lập từ mẫu vùng mắm nước ngọt và 3 dịng từ các sản phẩm nước mắm đĩng chai e Độ dày vịng kháng khuẩn với vi khuẩn Pediococcus pentosakeus
từ 0,1 — 0,85 cm Trong đĩ cĩ 9 dịng vi khuẩn lactic cho bề dày vịng kháng khuẩn lớn nhất (hơn 0,6 cm), 1 dịng cho bề dày vịng kháng
khuẩn 0,1 cm là nhỏ nhất
5.2 Đề xuất
Đẻ đưa kết quả khảo sát vào thực tiễn, cần tiến hành thêm các khảo sát thử khả
năng diệt các mầm bệnh trên động vật thủy sản, đặc biệt là bệnh do vi khuẩn
Gram âm và Gram dương gây ra
Cần định danh những dịng vi khuẩn lactic cĩ khả năng sinh chất kháng khuân