Với mục đích phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp Bacteriocin, khảo sát ảnh hưởng và điều kiện nuôi cấy lên sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp Bacteriocin của chủng phân lập được, mời các bạn cùng tham khảo luận văn tốt nghiệp đại học Phân lập chủng vi khuẩn lactic và khảo sát khả năng sinh tổng hợp Bacteriocin. Hy vọng nội dung luận văn phục vụ hữu ích nhu cầu học tập và nghiên cứu.
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HỐ HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
PHÂN LẬP CHỦNG VI KHUẨN LACTIC
VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG
HỢP BACTERIOCIN
SVTH: LÊ THỊ HỒNG VÂN
CBHD: THS NGUYỄN VŨ TUÂN
Trang 2TĨM TẮT LUẬN VĂN
Trong cơng nghệ thực phẩm vi khuẩn lactic được sử dụng rộng rãi từ rất lâu đời bởi ứng dụng phong phú của nĩ trong cuộc sống Những nghiên cứu gần đây cho thấy vi khuẩn lactic cịn cĩ khả năng sinh tổng hợp các bacteriocin, những peptide hoạt tính kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh mế sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật Để cĩ
những khảo sát sâu hơn trước hết cần phải cĩ chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp được
bacteriocin cao Vì vậy chúng tơi tiến hành nghiên cứu nhằm mục đích:
- Phân lập chủng vi khuẩn cĩ khả năng sinh tổng hợp được bacteriocin
- Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuơi cấy lên sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng phân lập được
Ching vi khuẩn sẽ được phân lập từ các nguồn tự nhiên như sữa tươi tự lên men, các
loại rau quả muối chua (cải muối chua, cà pháo muối chua, dưa giá), kim chỉ và giá đỗ
Qua quá trình thí nghiệm, ta cĩ được chủng vi khuẩn lactic phân lập từ sữa tươi tự lên men
thể hiện vùng ức chế Ƒ¿sferia monocytogenes chứng tỏ cĩ khả năng sinh tổng hợp được bacteriocin
Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên sự sinh trưởng và sự sinh tổng hợp
bacteriocin của chủng nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp bacteriocin Từ kết quả đạt
được thì khi nuơi cấy chủng trong mơi trường dịch thể MRS cĩ pH ban đầu 6.0 ở nhiệt độ 30°C chủng sẽ sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin tốt nhất Khi đĩ, độ đo quang O.D 600nm = 1.417 va hoat tinh bacteriocin dat 2250 AU/ml
Tĩm lại, nghiên cứu đã phân lập được chủng vi khuẩn lactic yêu cầu từ sữa lên men tự nhiên và điều kiện nuơi cấy tối thích để chủng sinh trưởng, sinh tổng hợp bacteriocin cao nhất là trong mơi trường dịch thể MRS cĩ pH ban đầu 6.0 ở 30°C
Với những ý nghĩa của nghiên cứu, em hy vọng sẽ làm được những khảo sát cĩ ý nghĩa và gĩp phần tạo nền tảng cho những nghiên cứu sau này, mang lại những giá trị thật lớn
trong việc bảo quản thực phẩm, đảm bảo an tồn thực phẩm và nâng cao giá trị sống của
Trang 3MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
TOM TAT LUAN VAN ii
MỤC LỤC iv
DANH MUC HINH vi
DANH MUC BANG vii
MO DAU ccccccccssssseccccsssvessccssscececsssveeccensnseessessuvevecearavesecsesseeccessnetesesssnnerecsesaneseeee 1
Chương 1: TỔNG QUAN
1.1 VI KHUẨN 8 0 0 3
1.1.1 Đặc điểm chung - +: + SE hư crec 3
1.1.2 Các chủng vi khuẩn cĩ khả năng sinh tổng hợp bacteriocin 8
IV ;Ÿ (095) :9i9 0004 a 12
1.2.1 Sơ lược về bacferiocim - cv gi 12
1.2.2 Bacteriocin từ LA - - con nh ng ng ng ng ng 13
1.2.3 Bacteriocin từ vi khuẩn khác .- 5 552 se crxscvee 22
1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin 23 1.2.5 Định vị và tỉnh sạch bacteriocin - co se veseo 26 1.2.6 Ứng dụng của bacteriocin 2s sex re crxxerea 27 IV YAY (00): 0 00) 0 0 30 1.3 PHẦN LẬP VI KHUẨN LLACTIC -¿+-©2222©2z+tvtEEEEEErrrrrrrrrrrrrrree 33 Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 NGUYEN LIỆU - 2 SE S2< Sự kề SE ST TT TT TT TT TH 37
2.1.1 Ching vi sinh vật và mơi trường nuơi cấy, giữ giống 37
2.1.2 Nguồn nguyên liệu phân lập - ©5552 55 Sex sex ceers 37
Trang 42.3.1 Phương pháp dan đều và cấy ria 5-55 ĂS sec 40
2.3.2 Phương pháp định danh tế bào vi khuẩn -. - 5-5 - se =2 41
2.3.3 Khảo sát các điều kiện nuơi cấy ảnh hưởng lên sự sinh trưởng và sinh
tổng hợp bacteriocin của chủng mới phân lập .- 5-5 5c + 43
Chương 3: KẾT QUA VA BAN LUẬN
A ^
3.1 PHAN LAP 9Ĩ 9 6 0000000 0000000 000 00000.000.000 00.000 0.000.000.000 000.0 00 0.0.0.0 00.0 00 0700 0.0 070.000 0 00-0 0 000.00 00.00 0.0.0.0 0 08.0.0000 06.680 0 0 068.08 45
3.2 KHAO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG VÀ SINH TONG HOP BACTERIOCIN CUA
CHỦNG MỚI PHÂN LẬP THEO THỜI GIAN NUƠI CẤY sec: 51
Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
AL KET LUAN occccccccccccsesscssessescssessesussucscssesucsusssscsessessssssescsessesisssesssieareacsaesaseasanees 60 4.2 KIEN NGHI oo cccccccccccsecscsscssescssessessssucssssesscasssscsesssecsssssecsessesscseacsissresreseeseeasanees 60 TAI LIEU THAM KHAO .ccccccccccscsccssssscscsscocsssssscsssveasscsscasavsssacasssavavaueacassasaves 62
Trang 5MỞ ĐẦU
Ngày nay, nhu cầu ăn uống của xã hội ngày càng được nâng cao Cũng từ đĩ, việc an tồn vệ sinh thực phẩm đang được chú trọng và đẩy mạnh Bảo quản thực phẩm nĩi chung và phụ gia thực phẩm hay bao bì thực phẩm nĩi riêng đang là những vấn để nĩng bỏng của xã hội
Nếu như những chất phụ gia thực phẩm cĩ nguồn gốc hĩa học tác dụng phổ rộng
với nhiều lồi sinh vật và gây ảnh hưởng đến sức khỏe của con người thì những hướng nghiên cứu trên những chất chống vi sinh vật mới cĩ nguồn gốc tự nhiên, an tồn và đặc
hiệu đối với từng lồi vi sinh vật gây hại đang được quan tâm [27]
Và việc tìm ra bacteriocin là một bước ngoặt lớn trong bảo quản thực phẩm Đây là
những chất cĩ nguồn gốc sinh học đã được cho phép sử dụng trong bảo quản thực phẩm ở
nhiều nước phát triển Lồi cĩ khả năng sinh tổng hợp ra nĩ cũng khơng cĩ gì xa lạ với chúng ta, đĩ là các vi khuẩn lactic, những vi khuẩn mà con người sử dụng trong thực phẩm hang ngan nim nay [16] Bacteriocin tiv Lactococcus lactis là các protein nhỏ, bển nhiệt, chống vi sinh vat Nisin 14 m6t bacteriocin được sử dụng rộng rãi do cĩ hoạt tính với phổ
rộng kháng các vi khuẩn G”, bao gém Listeria monocytogenes, ngan chan sy phat trién cia
bao tf nay mam Bacillus va Clostridium [18]
Các chủng vi khuẩn lactic là các vi sinh vật quan trọng nhất trong sản xuất các thực phẩm lên men hằng ngày như bơ, sữa chua, kem, phomai Chúng sản xuất rất nhiều các
hợp chất cĩ hoạt tính kháng khuẩn, bao gồm bacteriocin Các hợp chất này xuất hiện như
là sản phẩm cuối của quá trình biến dưỡng [7]
Những chủng vi khuẩn lactic khác nhau sẽ cĩ khả năng sinh tổng hợp những loại bacteriocin khác nhau, với số lượng khác nhau [27] Vì vậy mà việc tìm ra các nguồn tự
nhiên để cĩ thể phân lập ra những chủng vi khuẩn cĩ khả năng sinh tổng hợp hàm lượng chất chống vi sinh vật cao là cần thiết
Trang 6quản thực phẩm an tồn là cần thiết và cĩ ý nghĩa quan trọng Trong bài nghiên cứu này, chúng ta sẽ xây dựng những bước khởi đầu cho việc khảo sát sâu rộng hơn và cĩ giá trị ứng dụng hơn Mục tiêu nghiên cứu của luận văn gồm:
- Từ những nguồn tự nhiên như sữa, kim chi, các rau quả muối chua, giá đỗ phân
lập chủng vi khuẩn lactic cĩ khả năng sinh tổng hợp bacteriocin
- Khảo sát sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin chủng phân lập
được
- Khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện nuơi cấy như pH, nhiệt độ lên sự sinh
Trang 7Chương 1:
TỔNG QUAN
1.1 VIKHUẨN LACTIC
1.1.1 Đặc điểm chung
1.1.1.1 Hình thái và dinh dưỡng của vỉ khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic (Lactic acid bacteria-LAB) là các vi khuẩn G', chịu acid, khơng hình
thành bào tử, hình que hoặc hình cầu [2] Một số lồi hiếu khí và cĩ thể sử dụng oxygen
thơng qua enzyme flavoprotein oxidase, trong khi những giống khác ky khí nghiêm ngặt
Vi khuẩn lactic phát triển tối ưu ở pH 5.5—5.8 và và cĩ nhu cầu dinh dưỡng phức tạp đối v6i cdc amino acid, peptide, nucleotide base, vitamin, khống, acid béo và carbohydrate
[1, 45]
Những vi khuẩn này sản xuất acid lactic như là sản phẩm cuối cùng của quá trình lên
men carbohydrate Dic diém nay da gan lién LAB với thực phẩm lên men để acid hố
ngăn chặn sự phát triển của tác nhân gây hư hỏng Protein bacteriocin được sản xuất bởi nhiều chủng LAB, cung cấp một hàng rào ngăn cần vi sinh vật gây hư hỏng và gây bệnh
[11]
LAB được sử dụng rộng rãi trong sản xuất sản phẩm lên men bởi vì hoạt tính trao đổi chất đặc biệt của nĩ Sự acid hố, sản phẩm của acid hữu cơ, và các chất kháng khuẩn
khác như bacteriocin, gĩp phần to lớn trong bảo quản thực phẩm bằng cách ức chế mầm
bệnh và chất gây ơ nhiễm Sự chuyển hố lactose nhờ nuơi cấy vi khuẩn lactic đã làm cho thực phẩm lên men dễ tiêu hố hơn Nhiều hoạt tính biến dưỡng và enzyme của LAB dẫn
đến sự sản xuất các chất dễ bay hơi hình thành mùi thơm và hương vị đặc trưng cho san
phẩm lên men [45]
Các giống của LAB chủ yếu là Lacfobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, LacfOCOCCHs,
Trang 8(a)
(b)
(c)
Hình 1.1: Hình ảnh một số vi khudn lactic: (a) Lactococcus lactis, (b) Streptococcus thermophilus, (c) Lactobacillus helveticus [11]
1.1.1.2 Trao đổi chất của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic được chia thành ba nhĩm dựa trên mơ hình lên men - _ Lên men đồng hình: sản xuất hơn 85% acid lactic từ glucose
- _ Lên men đị hình: sản xuất chỉ 50% acid lactic và một lượng ethanol, acid acetic va
CO»
-_ Được biết đến như là giống lên men đị hình sản xuất DL~lactic acid, acid acetic va CO; [45]
Trang 9thành acid lactic Qua trình này sinh 2 phân tử ATP cho mỗi glucose được tiêu thụ Đại diện cho kiểu lên men này là các gidéng Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus,
Pediococcus va Lactobacillus nhém I
LAB lên men dị hình phân giải glucose theo con đường pentose phosphate Một phân
tử glucose-6-phosphate ban đầu bị khử hydro thành 6-phosphogluconate và sau đĩ khử
nhĩm carboxyl hình thành một phân tử CO; Kết quả 14 pentose—5—phosphate bi chia ra thành một glyceraldehyde phosphate (GAP) và một phân tử acetyl phosphate GAP sau đĩ được chuyển hố thành lactate như trong lên men đồng hình, với acetyl phosphate bị biến đổi thành ethanol qua chat trung gian 14 acetyl-CoA vA acetaldehyde Vé mat ly thuyét,
sản phẩm cuối (bao gồm ATP) được sản xuất cĩ số lượng bằng với từ quá trình đị hố một
phân tử glucose Các LAB lên men dị hình bắt buộc gồm Leuconosfoc, Oenococcus, Weissella, va Lactobacillus nhém II [45, 47] - Phdn gidi protein [11] Protein bị cắt thành những hợp chất nhỏ hơn proteinase Protein +H,0 ————————————* polypeptide
Hoạt tính này của Lacfobacilius trong hệ thống đường ruột làm thuỷ phân protein bởi
hệ vi sinh vật tiêu hố đễ dàng, một đặc tính cĩ giá trị cao cho trẻ em, người bệnh và người già
- - Phân giải lipid [11]
Phức hợp chất béo bị cắt thành các hợp chất nhỏ hơn
lipase
Triglyceride (chất béo) › Acid béo + glycerol
Hoạt tính này được sử dụng trong việc thiết kế chế độ dinh dưỡng cho trẻ em, người bệnh và người già Bằng chứng từ thử nghiệm y khoa và lâm sàng cho thay Lactobacillus cĩ thể phân hủy cholesterol
Trang 10LAB cé enzyme f-galactosidase, glycolase va lactic dehydrogenase (LDH) san xuat acid lactic ti lactose Acid lactic dudc xem là cĩ một số chức năng sinh lý như:
- Lầm tăng sự tiêu hố protein sữa bằng cách kết tủa chúng trong sữa đơng
- Cải thiện khả năng sử dụng calcium, phosphor và sắt - Kích thích sự bài tiết dịch từ da day
- Làm gia tăng nhu động ruột
- Cung cấp nguồn năng lượng cho quá trình hơ hấp
Vị trí đồng phân quang học của acid lactic được sản xuất dựa vào bản chất của mơi
trường Hình dạng cấu trúc của các isomer nầy như sau:
COOH COOH
H nS: OH HO m—— C-—=H
CH 3 CH 3
D (-) levorotatory lactic acid L (+) dextrorotatory lactic acid
Ở người, cả hai isomer đều được hấp thụ lên thành ruột Trong khi L (+) lactic acid được chuyển hố hồn tồn nhanh chĩng trong tổng hợp glycogen, D (-) lactic acid được
tổng hợp ít hơn, và acid khơng được chuyển hố sẽ được thải ra trong nước tiểu Khả năng
chuyển lactose thành acid lactic được sử dụng điều trị thành cơng bệnh khơng dung hợp lactose Những người mắc bệnh này khơng thể chuyển hố lactose bởi vì thiếu hệ thống enzyme cần thiết hoặc chúng hoạt động khơng bình thường Acid lactic làm thấp pH mơi
trường ruột xuống khoảng 4 đến 5 để ngăn cản sự phát triển của vi sinh vật gây thối rữa
và E coli, vi sinh vật địi hỏi pH mơi trường tối ưu là 6 đến 7 Một vai acid dé bay hơi sản xuất trong quá trình lên men cũng cĩ hoạt tính ức chế dưới điều kiện thế oxy hố khử thấp
[45]
1.1.1.3 Sdn xudt cdc chất đổi kháng
LAB cũng ức chế sự phát triển của vi sinh vật cĩ hại gây thối rữa thơng qua các sản phẩm chuyển hố như hydrogen peroxide, carbon dioxide, điacetyl và đặc biệt là
Trang 11Sản phẩm chuyển hố của LAB sử dụng để chống lại các vi sinh vật gây thối rữa và
chức năng sinh hĩa cĩ thể ức chế vi sinh vật của chúng được tĩm tắt trong bảng dưới đây
Bảng 1.1: Một số sản phẩm chuyển hĩa của LAB và phương thức hoạt động của chúng [44, 45] Sản phẩm chuyển hố Phương thức hoạt động Ngăn cản sự khử nhĩm carboxyl, 1.Carbon dioxide giảm tính thấm của màng 2 Diacetyl Phản ứng với protein gắn arginine 3 Hydrogen peroxide/ Lactoperoxidase Oxy hố các protein cơ bản
Acid lactic bị phân ly đi xuyên qua
màng, làm thấp pH nội bào Nĩ gây
4 Acid lactic
trở ngại quá trình chuyển hố như oxi hố khử phosphor Ảnh hưởng đến màng, tổng hợp 5 Bacteriocin protein va DNA
Bacteriocin sản xuất bởi LAB là chủ để của các nghiên cứu lớn bởi vì hoạt tính kháng khuẩn của chúng chống lại sự sản sinh vi khuẩn làm hư hồng thực phẩm Chủng sản xuất
bacteriocin của LAB rất quan trọng trong việc cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong đường ruột Bacteriocin là protein cĩ hoạt tính sinh học, cĩ khả năng ngăn ngừa sự xâm
nhiễm của vi sinh vật bằng cách ức chế chúng và liên kết với receptor đặc biệt của tế bào
Hiện nay, cĩ những mối quan tâm về việc ứng dụng bacteriocin trong cả bảo quản thực
phẩm và ức chế mầm bệnh vi khuẩn Hầu hết các bacteriocin đều được chiết xuất từ vi
khuẩn hên quan trong lên men thực phẩm Sự sản xuất bacteriocin và tính kháng được
Trang 12Hiện nay, các nghiên cứu đi sâu vào việc mở rộng hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin, đáng chú ý là nisin cùng với những nhân tố kháng khuẩn khác như hệ thống lactoperoxide hiện diện trong sữa, các tác nhân khác và các bacteriocin khác [16]
1.1.2 Các chủng vi sinh vật cĩ kha năng sinh tổng hợp bacteriocin 1.1.2.1 Chủng Lactococcus lactis
(a) Giới thiệu [1 1]
Ching Lactococcus lactis (Lc lactis) lA c4c vi sinh vat quan trong nhat trong san xuat
thực phẩm lên men hằng ngày như bơ, sữa chua, kem, fromage Chúng sản xuất nhiều hợp
chất cĩ hoạt tính kháng khuẩn, bao gồm bacteriocin Các hợp chất này xuất hiện như là sản phẩm cuối của quá trình biến dưỡng
Dựa vào đặc tính sinh héa, Lc lactis dudc phan thanh: Lc lactis subsp lactis, Lc lactis subsp cremoris va Lc lactis subsp cremoris Lc lactis subsp lactis c6 kha năng phát triển
duoc 6 nhiét dé 40°C, séng dudc 6 néng dé mudi Ain lén dén 4.0% va san xuat dudc
amonia ti arginine trong khi Lc lactis subsp cremoris khéng cĩ tinh chat nay Lec lactis
subsp lactis biovar diacetylactis dudc phan biét dựa vào khả năng chuyển héa citrate
Một trong những đặc điểm quan trọng nhất trong cơng nghiép cia ching Le lactis 1a plasmid được mã hố, cĩ nghĩa là plasmid mang gen cĩ các đặc tính như biến dưỡng lactose và sản xuất proteinase cũng như tính kháng bacteriophage Các plasmid biến
dưỡng quan trọng khác và chức năng của chúng ở Lac/ococcus cũng đã được mơ tả Do đĩ,
hiện nay chúng ta đã cĩ những hiểu biết về gen plasmid kiểm sốt biến dưỡng đường
sucrose, galactose, mannose, xylose, glucose, sử dụng citrate, tính kháng phage, biến
dưỡng và giới hạn DNA, sự tập hợp tế bào, sản xuất bacteriocin Thêm vào đĩ,
Lactococcus chứa nhiều plasmid, kích cỡ từ 1 đến >100 kbp Plasmid mã hố cho
bacteriocin thường lớn và kích thước của chúng từ 81 đến 133 kbp Chủng Lc /acfis thường
cĩ từ 2 đến 11 plasmid DNA, trong khi số lượng phổ biến thường là từ 4 đến 7
Trang 13> Biến dưỡng protein
Giống như tất cả các LAB khác, Løcfococcus cĩ nhu cầu đinh dưỡng phức tap Dé
phát triển, chúng đồi hỏi các protein, peptide, các amino acid đặc biệt, các nucleic acid và vitamine, Trong sữa, nồng độ isoleucine, leucine, valine, histidine va methionine can
thiết cho Lactococcus 14 thấp hơn 1 mg/l Nĩ bao gồm các amino acid tự do, cĩ mặt ban đầu trong sữa, cung cấp nguồn nitơ cho khoảng 2% mật độ tế bào cuối cùng Casein, cĩ
khoảng 80% protein hiện diện trong sữa, trở thành nguồn nitơ sơ cấp sau khi dùng hết nitơ từ các nguồn khơng phải protein
> Bién du@ng lactose
Biến dưỡng lactose cia ching Le lactis khdc véi bién đưỡng lactose của các vi khuẩn
lactic khác Khác biệt là ở sự dị hố cùng lúc glucose và galactose Chức năng của con đường đĩ đối với Lactococcus là để sinh năng lượng và acid lactic là sản phẩm phụ
> Biến dưỡng citrate
Trong nhém Lactococcus thi chi Lc lactis subsp lactis biovar diacetylactis la cĩ khả
năng biến dưỡng citrate hiện diện trong sữa Sản phẩm cuối cùng của biến dưỡng citrate
la diacetyl, acetoin, 2,3 butanediol, acid acetic và carbondioxide, chúng tạo nên hương vị cho các loại thực phẩm bơ sữa lên men
Citrate được vận chuyển vào tế bào mà khơng cân cĩ sự biến đổi Ở Le lactis subsp
lactis biovar diacetylactis, phan ứng này được xúc tác bởi citrate permease > Sinh tổng hợp bacteriocin
Các chủng thuộc lồi Lc lactis cé6 khả năng sinh tổng hợp rất nhiều các hợp chất cĩ
hoạt tính kháng khuẩn bao gồm cả bacteriocin Các hợp chất này xuất hiện như là sản
phẩm cuối của quá trình biến dưỡng
+ * ` ` Z * a tA + s * a ˆ
Bacteriocin từ Lactococcus 1a cdc protein nhỏ, bền nhiệt, chống lại các vi khuẩn lân
Trang 143354 kDa, thuộc nhĩm lantibiotic, được ứng dụng nhiều trong bảo quản thực phẩm Nisin
gây cản trở việc cung cấp năng lượng của tế bào bằng cách tạo nên bào tử trên màng và làm mất điện thế màng Nisin cĩ hoạt tính với phổ rộng kháng các vi khuẩn G”, bao gồm
cả L monocytogenes, ngăn chặn sự phát triển của bào tử ndy mam Bacillus va Clostridium
và thơng qua việc thêm calcium, nĩ sẽ cĩ hoạt tính kháng lại một số vi khuẩn G” Một hợp chất khác, lacticin 3147 được xác định là từ Lactococcus thu nhận từ chủng Irish Kefir st dụng trong sản xuất bơ Bacteriocin này ngăn cản các mầm bệnh từ vi khuẩn G' như Staphylococcus, Clostridium, Listeria spp., Streptococcus [10]
Ngay nay, nisin 1A bacteriocin tY LAB duy nhất được cho phép làm chất phụ gia thực phẩm Hai sản phẩm khác là ALTA 2431 và Microgard đã được phát triển làm chất kéo đài tuổi thọ thực phẩm dựa trên sản phẩm lên men thơ của LAB
1.1.2.2 Các chủng vi khuẩn lactic khác cĩ khả năng sinh tổng hop bacteriocin
Một số chủng vi khuẩn lactic khác cĩ khả năng sinh tổng hợp bacteriocin được tổng hợp trong bảng 1.2 Bảng 1.2: Một số bacteriocin, chủng sản xuất và đặc tính tiêu biểu Bacteriocin | Vi sinh vat MW Đặc tính (Da)
Laticin Le lactis 2847 | Bén nhiệt ở 100°C trong 10 phút ở pH 5
3714 hay 90°C ở pH bằng 7 trong 10 phút Nhạy
cảm với trypsin, L Ì_chymotrypsin, proteinase K, và pronase E, kháng pepsin [37]
Plantaricin | Lactobacillus 3500- | On định ở nhiệt độ phịng và nhiệt độ thấp,
C plantarum 4000 | bén nhiét 6 100°C trong 60 phtt hay 121°C
trong 10 phút Hầu hết ổn định ở pH acid
hay trung tính Nhạy cảm với pronase, trypsin, và LÍ chymotrypsin, kháng lại
Trang 15pepsin, proteinase K, LÍ amylase, và lipase [21]
Bavaricin A | Lactobacilus 3500- | Bên nhiệt ở 100°C trong 60 phút Ổn định ở
bavaricus 4000 | pH bang 2.0 đến 9.7, nhạy cảm với pepsin, trypsin, pronase E, proteinase K và chymotrypsin A, khang lai véi catalase
[30]
Piscicolin Carnobacterium | 4416 | On định ở pH bằng 2 sau khi lưu trữ 2 tháng
126 piscicola JG126 tai 4°C Bền nhiệt tai 100°C trong 120 phút
tại pH 2-3, trở nên ít ổn định hơn khi pH
tăng Nhạy cảm với LÍ chymotrypsin, LL chymotrypsin, protease type I, XIV, XXIII, va trypsin, khang catalase, lipase và
lyzozyme [25]
Variacin Micrpcoccus 2658 | On định ở pH ty 2 dén 10, bén nhiét 115°C varians trong 20 phút, nhạy cảm với pronase E,
proteinase K, ficin, khang catalase [14] 1.2 BACTERIOCIN 1.2.1 So lugc vé bacteriocin
Bacteriocin là tên chung của các peptide do vi khuẩn tổng hợp cĩ hoạt tính kìm hãm
đặc hiệu hay ức chế mạnh mế sự sinh trưởng và phát triển của một số vi khuẩn khác
Điểm đặc biệt của các bacteriocin là chúng khơng cĩ hoạt tính kháng sinh điển hình, nghĩa là chúng chỉ kìm hãm nhưng khơng trực tiếp làm chết vi sinh vật Chính vì lý do nầy nên thời kỳ đầu người ta chỉ tập trung vào phát triển các chất kháng sinh, cịn các chế phẩm bacteriocin bị xem nhẹ và khơng được quan tâm đúng mức Theo thời gian sử dụng
chất kháng sinh hiện tượng kháng thuốc xuất hiện và ngày càng trở nên trầm trọng đã
gián tiếp xác nhận đặc tính quý giá của các bacteriocin là nguy cơ gây ra hiệu ứng trên
Trang 16được phục hổi và phát triển Các chế phẩm bacteriocin điển hình là n¡sin, điplococin, subtilin, lactostrepcin, bacteriocin S50, monocin (từ Lactococcus), pediocin A, pediocin PA—1, pediocin AcH (tit Pediococcus), lactocidin, acidolin, acidolin, acidophilin, reuterin, lactocin F, lactocin 27, helveticin J (t¥Y Lactobacillus), leuconocin S, carnocin UI49, micrograd (ti Leuconostoc), propionicin PLG—1, jensenin G (từ Propionicbacterium) [28]
Bacteriocin được tìm thấy lần đầu tiên bởi Gratia vào năm 1925, được sản xuất bởi
một chủng E coii để chống lại các chủng khác trong dịch nuơi cấy Thuật ngữ “colicine ” được đặt tên bởi Gratia và Fredericq (1946), cịn “bacteriocin” được sử dụng bởi Jacob et aÍ (1953) như là thuật ngữ chung cho các protein cĩ đặc tính kháng khuẩn cao Thuật ngữ
colicine ngày nay là để chỉ các protein cĩ tính kháng khuẩn được sản xuất bởi nhiều lồi
E coÏï và các lồi thuộc họ Emterobacteriaceae [28] 1.2.2 Bacteriocin từ LAB
Hầu hết các nghiên cứu về bacteriocin tập trung chủ yếu ở nhĩm vi khuẩn lactic vì
từ xa xưa người ta đã biết sử dụng vi khuẩn lactic trong bảo quản thực phẩm và ngăn ngừa sự nhiễm các vi khuẩn gây bệnh Bởi vì LAB và chất chuyển hố của chúng đã được tiêu thụ với số lượng cao qua nhiều thế hệ người tiêu thụ các thực phẩm truyền thống mà khơng cĩ ảnh hưởng cĩ hai nao, LAB tiếp tục như là nguồn sản xuất bacteriocin sử dụng
trong thực phẩm, kể cả dạng hợp chất tinh khiết hay dịch chiết từ mơi trường phát triển
Cĩ thể thu được bacteriocin thơ bằng cách nuơi chủng LAB sản xuất bacteriocin trên một phức hợp cơ chất Dịch lên men thơ cĩ chứa các chất khác bên cạnh bacteriocin LAB là vi khuẩn nuơi cấy được sử dụng đầu tiên trong ngành sản xuất thực phẩm lên men, chúng hiển nhiên được sử dụng nhiều nhất cho sự biến đổi gen để tạo các chủng cơng nghiệp bị thiếu gen điều hồ sinh tổng hợp nên bacteriocin mong muốn [27]
1.2.2.1 Phân loại bacteriocin [18, 24, 27, 28]
Trang 17Nhĩm I: gồm các lantibiotic là các peptide nhỏ cĩ chứa các amino acid khơng phổ biến như lanthionine (Lan), L Ì_ methyllanthionine (MeLAn), dehydrodlanine, và dehydrobutyrine Nhĩm I được chia thành 2 nhĩm nhỏ tuỳ theo cấu trúc hố học và hoạt
tính kháng khuẩn
- - Nhĩm Ta: lantibiotic type A là các peptide được kéo đài ra với mạng lưới tích điện
dương, hoạt động thơng qua việc hình thành các lỗ trên màng tế bào vi khuẩn Một số
nhĩm như pep-5 chứa 3 nối monosulfite, epidermin chứa 4 nối monosulfite, nisin A và Z, subtilin thì lại chứa 5 cầu nối monosulfite Kích thước phân tử của lớp phụ Ia dao động từ
1959 kDa ở duramycin đến 4635 kDa ở carnocin U9
-_ Nhĩm lb: lantibiotic type B là các phân tử peptide hình cầu nhỏ hơn và cĩ một điện
tích âm hoặc khơng tích điện, hoạt tính kháng khuẩn liên quan đến sự ức chế các enzyme đặc biệt Một số các bacteriocin lớp phụ Ib như mersacidin, actagardin, cinnamycin và mutacin A Trong đĩ mutacin À tạo ra bởi Streptococcus mutan
Nhĩm II: Các peptide nhỏ (< 10 kDa), bển nhiệt, khơng cĩ các amino acid biến đổi sau
dịch mã cĩ chứa ít nhất một cầu nối disulfur cần thiết cho hoạt động của chúng Là nhĩm
bacteriocin lớn nhất trong hệ thống phân lớp này, các peptide được chia thành 3 nhĩm phụ
- Nhom Ila bao gém peptide giống pediocin, cĩ trình tự liên ứng đầu N-Tyr Gly— Asn-Gly-ValL_Xaa-Cys Nhĩm phụ này được quan tâm nhiều bởi vì hoạt tính kháng
Listeria, ching lam mat cân bằng điện tích và tao 16 thing làm rị rĩ các chất phân hữu cơ và gây chết tế bào đích
- - Nhĩm IIb gồm các bacteriocin địi hỏi phải cĩ 2 peptide khác nhau để cĩ hoạt tính
như lactococcin GLI cL, lactococcin M/N, plantaricin EF, JK, enteriocin LS50A va
enteriocin L50B
- — Nhĩm IIc: bao gồm tất cả các bacteriocin nhĩm 2 khơng phụ thuộc IHa và IIb,
peptide cĩ nhĩm thiol cĩ hoạt tính, địi hỏi phải cắt giảm nhĩm cysteine để cĩ hoạt tính
Nhĩm III: nhĩm này hiện vẫn chưa được mơ tả kỹ Nhĩm này cĩ các protein lớn (>30
Trang 18helveticus 481 và lactacins A và B tạo bởi L acidophilus, helveticin V, acidophilicin A Những loại này ít được các nhà khoa học trong lĩnh vực thực phẩm quan tâm
Klaenhammer (1999) để nghị thêm nhĩm 4, là nhĩm chứa các bacteriocin phức tạp, địi hỏi carbohydrate hay lipid để cĩ hoạt tính Tuy nhiên bacteriocin của nhĩm này chưa
được miêu tả nhiều ở mức độ sinh hố để mở rộng định nghĩa Nhĩm này bao gồm cả
glycoprotein như lactocin 27 hoặc lipoprotein như lacstrepcin [27]
Hình 1.2: Cơng thức của Nisin A [24]
1.2.3.2 Co ché sinh téng hop bacteriocin
a Gene va sinh tong hợp
Bacteriocin được tổng hợp với ribosome Gen mã hố cho sản xuất và miễn dịch của bacteriocin thường được tổ chức thành các operon cluster Nhĩm gene bacteriocin cĩ thể được định vị trên nhiễm sắc thể (subtilin và mersacidin), cũng cĩ thể được định vị trên plasmid (divergicin A va sakacin A), hay 1a trén transposon (nisin va lacticin 481) [18]
Trang 19biệt chỉ đường cho enzyme sinh tổng hợp đi tới nơi thích hợp để thực hiện sự biến đổi các amino acid và ổn định hình dạng của domain propeptide [18, 28]
Gene mã hố cho sinh tổng hợp bacteriocin nhĩm II như lactococccin A, B, và M,
pediocin PA-1/AcH, và plantaricin A cĩ nhiều điểm giống nhau trong tổ chức gen, bao
gồm một gen cấu trúc mã hoa cho tién peptide, theo sau bởi một gen miễn dịch, gen dé vận chuyển và protein phụ thêm Một số trường hợp đã tìm ra được gen điều hồ Các
protein phụ thêm là rất cần thiết để các bacteriocin nhĩm II được xuất ra Khơng cĩ bản
sao nào của các protein phụ thêm ở lantibiotic được tìm thấy [16, 1§]
Sự tạo các bacteriocin vi khuẩn G” thường cần nhiều gen ví dụ như cụm gen tao nisin: - Nis A: prepeptid
- Nis B, nis C: enzyme bién déi amino cacid - Nis P: ct c4c peptide leader
- Nis L, nis FEG: mién dich
- Nis R, nis K: diéu hoa va biéu hién [18] b Cơ chế
Hầu hết các bacteriocin được tổng hợp như là các tiền peptide ở dạng bất hoạt mang một peptide chỉ đạo cĩ đầu N gắn với tiền peptide tại đầu C Đối với lantibiotic, gốc
serine, threonine, và cystein trong phần tiển peptide phải trải qua bước kéo đài biến đổi sau dịch mã để hình thành Lan/MeLan Con đường sinh tổng hợp của lantibiotic đi theo một kế hoạch chung: hình thành tiền peptide, phản ứng biến đổi, phản ứng tách rời phân
hủy peptide chỉ đạo và di chuyển tiền peptide đã được biến đổi hay tiền peptide trưởng thành xuyên qua màng tế bào chất Sự tách rời peptide chỉ đạo cĩ thể diễn ra trước, trong
suốt quá trình hay sau khi xuất ra khỏi tế bào Trong sản xuất lantibiotic nhĩm I, như trong
Trang 20Hình 1.3: Cơ chế sinh tổng hợp Nisin theo 5 bước [18]
Bacteriocin nhĩm II được sinh tổng hợp như là một tiền peptide cĩ chứa một trình tự chỉ đạo đầu N bảo tơn và một điểm làm phân tách protein, với ngoại lệ là bacteriocin nhĩm IIc, được sản xuất với một trình tự đơn đầu N điển hình dạng sec và được tiến hành thơng qua một con đường cịn chưa được biết rõ Khơng giống như lantibiotic, bacteriocin nhĩm II khơng trải qua quá trình biến đổi sau dịch mã Sau khi hình thành tiễn peptide,
tiền peptide được tách khỏi peptide chỉ đạo đồng thời với việc được xuất ra khỏi tế bào [18]
Peptide chi đạo cĩ một vùng nhận biết điều khiển tién peptide trong su6t qué trinh
trưởng thành, và protein vận chuyển, bảo vệ chủng hoang dại bằng cách giữ lantibiotic ở
trạng thái khơng cĩ hoạt tính khi nĩ ở bên trong sinh vật sản xuất, và tương tác với domain
tién peptide dé chắc chắn rằng cĩ một cấu hình phù hợp cần thiết cho tương tác enzyme-—
Trang 21Hình 1.4: Cơ chế sinh tổng hợp bacteriocin nhĩm II theo 4 bước [18]
c Cơ chế kháng khuẩn của bacteriocin [16, 18]
Hầu hết các bacteriocin hoạt động bằng cách tạo kênh hay lỗ trên màng làm phá huỷ năng lượng hữu ích của tế bào sống Các bacteriocin cia vi khudn G* thường khơng cĩ receptor đặc hiệu để hút bám mặc dù vẫn cĩ những ngoại lệ Hoạt động khác với vi khuẩn
G ở hai điểm chính sau:
- _ Việc tao bacteriocin thì khơng cần thiết phải gây chết cho vi sinh vật sản xuất Sự
khác biệt này là do cơ chế vận chuyển để giải phĩng bacteriocin Ở một vài vi sinh vật thì
phụ thuộc vào hệ thống tiết Ngồi ra, ở vi khuẩn G* c6 sự điều hồ đặc hiệu bacteriocin nên các bacteriocin chỉ dựa vào hệ thống điều hịa của tế bào chủ
- - Hầu hết các bacteriocin kích thước nhỏ hoạt động trong phạm vi pH rộng từ 3 — 9,
thậm chí acidocin B cĩ thể hoạt động ở pH 11, ở điểm đẳng điện cao cho phép chúng
tương tác với bể mặt điện tích âm của màng tế bào vi khuẩn Đối với các bacteriocin phổ
Trang 22Sau đĩ sự liên kết của các phân tử bacteriocin với nhau sẽ tạo thành những lỗ xuyên màng
làm mất gradient và gây chết tế bào
Lớp lipid tích điện âm của màng tế bào chất là receptor đầu tiên cho bacteriocin trong
việc hình thành lỗ Ví dụ như nisin: xử lí tế bào bằng nisin cho thấy nĩ tạo ra khe hở cho
tia UV chiếu được vào trong nội bào; nisin là một bacteriocin cĩ các phần tích điện dương:
liên kết với màng lipid tích điện âm, hình thành lỗ, bên cạnh đĩ làm trung hồ điện tích
của màng, làm mất đi lực vận chuyển proton Do cĩ sự hình thành lỗ khơng đặc hiệu, các chất nhỏ như ion, ATP thốt ra ngồi, cịn các chất lớn như protein khơng thốt ra tạo nên
điện thế màng, làm tế bào chết từ từ Một số bacteriocin từ vi khuẩn G” cĩ thể làm bất
hoạt các tác nhân gây bệnh Œ' khi sử dụng tác nhân cĩ tính kìm kẹp (chelating) như EDTA
để phá hủy các đặc tính của lớp rào cản bên ngồi vi khuẩn Œ Ngồi ra, nisin cho thấy là cĩ tác dụng gây ra sự tự phân của tế bào, gia tăng áp suất nội bào làm cản trở chuyển hĩa
năng lượng, ngăn can sự phục hồi vách tế bào
Trang 23Người ta cho rằng các bacteriocin nhĩm IIa cĩ thể tự tạo lỗ xuyên qua màng tế bào vì chúng là những bacteriocin cực nhỏ và lưỡng cực Các cystibiotic thuộc lớp IIe như cerecin 7/8, enterocin B, carnobacteriocin A và devergicin A cĩ đặc điểm là cĩ cấu trúc bậc 2 cĩ sự hiện diện các vùng lớn bao quanh gần như tồn bộ vùng ky nước Trong tất cả các
trường hợp phần cystein đầu tiên tìm thấy nằm sau lysin tích điện dương ở cuối phần ưa
nước và phần thứ hai nằm ở 3 trình tự cuối Liên két disulfur cin cho hoạt tính kháng
khuẩn cuộn trong phần C của protein tạo thành cấu trúc ky nước bển vững, ngồi ra trong
phân tử cĩ chứa glycerin nên phân tử rất linh động Chính sự linh động này cho phép
chuyển từ cấu trúc CJ thành L Ì để thích hợp với tính ky nước Chiều dài của vịng ky nước
du đài xuyên qua màng tế bào chất và khi cĩ sự gắn kết một số lượng lớn cấu trúc vịng sẽ gây chết [1ĩ, 18]
Các hiểu biết thơng thường về phổ ức chế của bacteriocin từ vi khuẩn G” là chúng chỉ
+ +4: A K : + + z + 1 ^“ 4 + ` `» ~,
giết giới hạn một số vi khuẩn Œ” khác Phố giết chết đĩng vai trị quan trọng từ những
trường hợp phổ hẹp như Lactococcin A, B, M chỉ giết được Lactococcus đến trường hợp
phổ rộng nhv nisin A, mutacin B cé thể giết được nhiều vi sinh vật như Actinomyces,
Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Gardnerella, Lactococcus, Listeria, Micrococus, Mycrobacterium, Propiobacterium, Streptococcus va Staphylococcus Ngudc lại với những hiểu biết trên là các bacteriocin cũng cĩ hoạt tính chống lại các vi khuẩn Œ gây bệnh như : Campylobacter, Haemophilus, Helicobacter và Neisseria [18]
1.2.3 Bacteriocin từ các lồi vi khuẩn khác
> Bacteriocin vi khudn Gram âm |30, 34]
Vi khuẩn G san xuất nhiều bacteriocin khdc nhau, chúng được đặt tên theo tên giống (ví dụ như klebicin của Klebsiella pneumoniae) hay theo tên lồi (ví dụ như colicin của E coli, marcescin cla Serratia marcescens, alveicin cia Hafma alvei và cloacin của Enterobacter cloacae) cia vi khuẩn sản xuất Bacteriocin do Pseudomonas sản xuất được gọi là pyocin
Klebicin, alyeicin và marcescin cũng cĩ phạm vi giết giới hạn 6 cdc loai Klebsiella,
Trang 24cứu rộng rãi Gen pyocin được mã hố trên nhiễm sắc thể và thường gặp ở Pseudomonas Cĩ 3 dạng pyocin đã được mơ tả: dạng E, dạng R, và dạng S Pyocin dạng R và dạng F
được sản xuất bởi 90% và dạng S được sản xuất bởi 70% các chủng P aeruginosa được
nghiên cứu Pyocin dạng E và R là bacteriocin dạng đuơi phage, kháng nuclease và protease Pyocin dạng S là bacteriocin nhạy cảm với protease tương tự như colicin
Nhĩm gen colicin gồm 3 gen liên kết chặt chẽ với nhau, mã hố cho các protein gây
độc, protein miễn dịch và protein phân giải Colicin giết tế bào đích bằng cách hình thành
lỗ, bằng hoạt tính nuclease hay bằng cách làm gián đoạn vách tế bào Sự định hướng của gen colicin với gen miễn dịch là khác nhau trong trường hợp nhĩm gen colicin hình thành
lỗ hay hoạt tính nuclease Trong trường hợp hình thành lỗ, gen miễn dịch được định hướng đối điện với gen gây độc, cĩ thể giết tế bào từ bên ngồi bằng cách khoang một lỗ lên màng tế bào
> Bacteriocin từ Archaea: halocin va sulfolobicin [34]
Cho đến nay, các archaeocin đã được mơ tả đặc điểm chỉ từ hai nhém: nhém Archaea đặc biệt ưa mặn sản xuất halocin, nhĩm Archaea đặc biệt ưa nhiệt sản xuất sulfolobicin
Hau hét Archaea đều sản xuất kháng sinh, người ta cho rằng cĩ hang trăm halocin khác
nhau, nhưng chỉ cĩ 7 halocin và một sulfolobicin đã được thu nhận và mơ tả đặc điểm đầy đủ Halocin rất đa dạng về kích cỡ (thay đổi từ 3-35 kDa), bển nhiệt, và phụ thuộc muối Phổ hoạt tính khá rộng với hoạt tính giết chết các haloarchaea khác Hiện nay, chỉ cĩ
halocin H6/H7 là được biết rõ về cơ cấu hoạt động, nĩ ức chế kênh vận chuyển Na'/H” ở
cả tế bào haloarchaea và động vật cĩ vú
Halocin cĩ thể là peptide (Llio kDa, gọi là microhalocin), hay là protein (>10 kDa), cĩ hoạt tính kháng sinh, được sản xuất bởi các thành viên của ho Halobacteriaceae
1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp bacteriocin 1.2.4.1 Mơi trường nuơi cấy
Kelstrup và Gibbons (2002) đã thấy rằng gia tăng tính nhớt của dịch mơi trường bằng
Trang 25của vi khudn Streptococcus c6 lap từ khoang miệng của người và động vật gặm nhấm
Một nghiên cứu khác của M.A Riley (2007) về staphylococcin 1580 cho thấy nuơi trong mơi trường bán rắn sẽ cho năng suất lớn hơn 20 lần so với mơi trường lỏng
Các chất riêng biệt hợp thành mơi trường cĩ thể quyết định sự sản xuất của
bacteriocin Sự sản xuất bacteriocin bởi các chủng khác nhau của S mutans c6 thé lam gia
tăng bằng cách thêm cao nấm men 2% vào mơi trường cơ bản Trypticase Tương tự, sự hình thành butyricin 7423 trong mơi trường được thấy là phụ thuộc với lượng casein hydrolysate thêm vào cho đến tối đa 5% Sự hình thành bacteriocin của các chủng
Corynebacteria và bởi Staphylococcus dudc thay ring phu thudc ham lugng amino acid
trong mơi trường nuơi cấy lon Mangan (2004) được thấy là cần thiết cho nhiều sản phẩm sản sinh trong mơi trường hố học xác định Thêm 0.5% mannitol vào mơi trường brain heart infusion broth làm gia tăng năng suất của staphylococcin 426 nhưng giảm lượng staphylococcin 414 Tương tự, glucose lam gia tăng sự sản xuất streptococcin A-FF22 nhưng làm giảm streptococcin B-74628 Những nghiên cứu khác cho thấy thêm vào cả
glucose hay manitol sẽ làm gia tăng sự sản xuất chất ức chế bởi phage type 71
Staphylococcus trong dich chiét dau nành [13] 1.2.4.2 Điều kiện nuơi cấy
Sự khác nhau của điều kiện mơi trường như nhiệt độ, thời gian, oxy, pH cĩ ảnh hưởng đến năng suất của bacteriocin cĩ hoạt tính Nhìn chung, sự sản xuất bacteriocin tốt hơn ở điểu kiện nhiệt độ tối ưu của chủng sản xuất phát triển Nuơi ở nhiệt độ quá cao cĩ thể
ngăn cản sự sản sinh bacteriocin và đơi khi dẫn đến sự thay đổi các đặc tính một cách khơng thuận nghịch [40]
Việc tạo ra các bacteriocin ở vi khuẩn G* thường khi chuyển từ pha log đến pha ổn định Sản lượng bacteriocin tối đa trong mơi trường cĩ thể thấy ở nhiều pha khác nhau trong chu kỳ tăng trưởng Schlegel và Slade (2002) nhận thấy sự sản xuất streptocin STHI nhiều nhất trong suốt pha log và giảm dần mức độ sản sinh bacteriocin trước khi bước vào pha ổn định Trái lại, sản xuất streptococcin A —- FF22 bắt đầu ở cuối pha log và hoạt tính
Trang 26đạt đến tối đa giữa 24 và 48 giờ phát triển, và sau đĩ suy tàn dần Butyricin 7423 thì được tiết ra trong suốt cuối pha log, tuy nhiên, perfringocin 11105 chỉ xuất hiện nhiều vào pha ổn định và sản phẩm của nĩ dường như lại tiêu hủy một phần tế bào sản xuất
Meitert (2005) đã báo cáo một vai chiing C diphtheriae giai phĩng bacteriocin liên tục nhưng một vài chủng khác lại sản xuất gián đoạn Lachowicz (2002) nghiên cứu khả năng
sản xuất staphylococcin A—1262a trên mơi trường rắn Hoạt tính được nhận thấy đầu tiên
sau 8 giờ, đạt đến tối đa khi từ 18 đến 24 giờ, và sau đĩ giảm dần về 0 Những nghiên cứu
khác cũng nhận thấy hoạt tính bacteriocin bị mất khi nuơi kéo dài Sự ảnh hưởng này cĩ
thể liên quan đến sự xuất hiện của chất bất hoạt bacteriocin hay enzyme tiêu hủy hoặc
thay đổi chúng [38, 40]
Một ảnh hưởng thú vị lên sự phục hổi một số bacteriocin là pH Một nghiên cứu về
điều kiện để tối ưu sản xuất colicin K cho thấy rằng điều chỉnh pH mơi trường là một yếu tố then chốt Một số nghiên cứu tìm thấy rằng sản xuất streptococcin A-FF22 trên agar
Todd—Hewitt sé gia ting khi điều chỉnh pH ban đầu của mơi trường đến 6.5 [13] 1.2.4.3 Sản xuất chất ức chế bacteriocin và chất làm bất hoạt
Davie và Brock (2003) tìm thấy acid teichoic, thường cĩ trong lớp vỏ tế bao S faecalis
subsp zymogenes X14, gĩp phần vào tính miễn dịch của vi khuẩn này với bacteriocin của chính nĩ sản xuất ra (hemolysin) Việc thải ra các sản phẩm ức chế trong giai đoạn sau
chu trình phát triển là kết quả của sự biến mất của bacteriocin trong mơi trường nuơi cấy
Tương tự, hoạt tính bacteriocin trong dịch nổi mơi trường chứa staphylococcin 1580 được
gia tăng khi thẩm tách, từ đĩ để nghị rằng các chế phẩm này cĩ thể chứa một chất ức chế
khối lượng phân tử nhỏ của bacteriocin
Tất cả bacteriocin được mơ tả đặc điểm đều cĩ chứa một hợp chất protein cần thiết
cho hoạt tính sinh học Sự bất hoạt khơng thuận nghịch của một số bacteriocin cĩ thể là
kết quả từ sự tiêu hủy bởi protease nếu những chất này cũng sản xuất bởi vi khuẩn
Trang 27botulinum và Streptococcus nhĩm A Đun chế phẩm bacteriocin mà ổn định nhiệt sẽ làm
bất hoạt protease, do đĩ bảo vệ bacteriocin [28] 1.2.5 Dinh vi va tinh sach bacteriocin
Nhiều bacteriocin của vi khuẩn G* dường như tơn tại ở hai dạng là liên kết với tế bào
và ở ngồi tế bào Tỷ lệ của mỗi dạng phụ thuộc vào trạng thái sinh lý của mơi trường
Bacteriocin trong phan loại nầy bao gồm megecin C—216, lactocin LP27, staphylococcin 1580, butyricin 7423, staphylococcin C55 và streptococin A—FFE22 Những nhận xét tương tự cũng được báo cáo nhiều với colicin [21]
Trong trường hợp bacteriocin cĩ nhiều ở xung quanh tế bào, các tính chất hố học, cơ
học, enzyme cĩ thể ảnh hưởng đến việc giải phĩng chúng khỏi tế bào Viridin A, B, và C
(bacteriocin cia Streptococcus viridans) c6 thỂ thu được ở trạng thái tế bào tự do (cell-
free) sau khi đồng nhất dịch tế bào sản xuất bacteriocin Staphylococcin 414 cũng được
tìm thấy ở bể mặt tế bào của chủng sản xuất nhưng cĩ thể tách ra bằng cách phá vỡ cơ
học tế bào Trái lại, staphylococcin 462 khơng thể bị hồ tan bằng cách phá vỡ tế bào sản xuất Các nghiên cứu khác cũng chứng tỏ rằng staphylococcin 1580 cĩ thể được trích từ vi khuẩn với 5% NaCl Tuong ty tinh ché colicin E2-W3110 va E3— W3110 va bacteriocin
JF246 của Š marcescens được hỗ trợ bằng cách trich bacteriocin quanh té bao véi 1M
sodium chloride Streptococcin A-FF22 6 dạng liên kết với tế bào cĩ thể được trích bằng cách đun trong axit lỗng Streptococcin, nisin và điplococcin cũng cĩ thể được thu bằng
cách trích với axit từ tế bào sản xuất Trong một số nghiên cứu khác phương pháp xử lý
nhiệt dịch nuơi cấy cia Lactobacillus da gia tăng khả năng giải phĩng lactocin LP27 từ tế
bào Phương pháp trích với axit dường như cĩ hiệu quả trong ví dụ này Donoghue khi sử dụng một phương pháp khác đã nhận thấy rằng megacin C-2l6 và Cx-337 được giải phĩng từ tế bào sinh megacinogenic bằng cách xử lý với lysozyme, kết hợp tiền xử lý với
trypsin Tác giả kết luận rằng megacin được định vị trên bề mặt ngồi tế bào [17]
Trang 28nhau (sắc ký lọc gel, lọc qua máy siêu lọc, ly tâm) hay thay đổi điện tích (sắc ký trao đổi ion, điện chuyển) [32]
Một vấn để chung là sự mất hoạt tính trong quá trình tỉnh chế Do đĩ việc giám sát
hoạt tính bacteriocin (don vi bacteriocin/miligram protein) tại mỗi bước tinh chế và điều
chỉnh khi cĩ thể để tránh việc mất nhiều hoạt tính là rất quan trọng [28]
1.2.6 Ứng dụng bacteriocin
1.2.6.1 Ứng dụng trong bảo vệ sức khoẻ con người
Khi cĩ sự tăng nhanh các vi khuẩn gây bệnh cần phải cĩ phương pháp loại bỏ sự nhiễm Một trong những giới hạn trong việc sử dụng kháng sinh là chúng cĩ phổ ức chế
rộng Điều này sẽ giết khơng đặc hiệu bất kỳ loại vi khuẩn nào khơng kháng thuốc Do
đĩ, kháng sinh tiêu diệt luơn các vi khuẩn cĩ lợi cho sức khoẻ con người Người ta sử dụng bacteriocin như là một giải pháp thay thế Chúng cĩ phổ ức chế hẹp nên cĩ thể xem như
“thuốc độc thiết kế”, nĩ cĩ tác dụng đặc hiệu với các vi khuẩn gây bệnh [41]
1.2.6.2 Ứng dụng trong bảo quản thực phẩm
Hiện nay chỉ cĩ bacteriocin của LAB được phép sử dụng trong thực phẩm lên men vì LAB đã được sử dụng hàng thế kỷ qua để lên men thực phẩm Năm 1988, FDA tiến tới
việc sử dụng nisin trong quá trình khử trùng Pasteur fromage, tạo thành một sự kiện chính thức hợp pháp ở Mỹ trong ứng dụng bacteriocin như là chất phụ gia thực phẩm Khi ước
lượng để sử dụng như là chất phụ gia thực phẩm phải địi hỏi sự đánh giá về tính bền nhiệt khi chúng được sử dụng phổ biến trong quá trình chế biến thực phẩm [41]
Từ rất xa xưa, người ta sử dụng phổ biến nitrate để ngăn chặn sự phát triển của
Clostridium trong thịt nhưng vì sự an tồn cho cơng nghiệp thực phẩm cần phải cĩ một
Trang 29botulinum trong fromage, được thương mại và sử dụng rộng rãi Ưu điểm lớn của nisin là hầu như khơng tác dụng lên các lồi vi khuẩn Œ nên việc sử dụng chúng khơng làm ảnh
hưởng đến hệ vi sinh vật đường ruột cĩ lợi của người, chúng dễ dàng bị phân hủy trong đường tiêu hố và hồn tồn an tồn ở liều sử dụng Ví dụ: liều bảo quản hiệu quả trong
phomát là 100 —- 400 UL/g, trong khi đĩ liều LD50 trên mèo và chuột non thậm chí tới 7 g/kg ngày Chính nhờ đặc điểm trên nên nisin hiện nay đang được triển khai thử nghiệm
ứng dụng làm chất bảo quản thực phẩm ở nhiều quốc gia trên thế giới Trong cơng nghệ chế biến sữa, nisin cĩ thể được sử dụng theo một trong hai cách là: bổ sung chế phẩm nisin trực tiếp vào sữa bột hay vào nguyên liệu sữa trước khi lên men chế biến fromage
hoặc người ta phối hợp sử dụng các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nisin vào trong quá trình lên men fromage, nhằm khắc phục hiện tượng lên men sinh hơi khĩ chịu và kiểm sốt quá trình lên men butyric do vi khuẩn Clostridium gây ra (trong cơng nghệ sản xuất fromage, ở
một số nước người ta sử dụng nitrite để khống chế hai quy trình lên men khơng mong
muốn trên, song một số dẫn xuất của chúng rất độc và cĩ hoạt tính gây ung thư nên người
ta đang nỗ lực tìm kiếm giải pháp thay thế) Tuy nhiên vai trị cơng nghệ của nisin trong
sản xuất fromage vẫn chưa thực sự tìm được vị trí vững chắc [27, 32]
Trong cơng nghệ chế biến đồ hộp, sau quá trình thanh trùng bào tử của một số loại vi khuẩn bền nhiệt vẫn cịn, ví du: C perfringens, C thermocaccharolyticum hay Bacillus
stearothermophilus Trong rất ít trường hợp cĩ thể vẫn cĩ nguy cơ cịn sĩt lại, việc sử dụng
nisin cho các nhĩm sản phẩm này nhằm 2 mục đích là giảm khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn (để cải thiện hiệu quả thanh trùng ngay ở chế độ thanh trùng ơn hồ hơn) và kìm
hãm, ngăn ngừa quá trình thối rữa (trong trường hợp nếu cịn bào tử sĩt) Nhĩm sản phẩm
thường áp dụng là: cà chua nghiền, cà rốt nghiền, các sản phẩm nấm mũ, đậu quả đĩng
hộp [16]
Trong cơng nghệ chế biến các sản phẩm thịt (thịt hun khĩi, đăm bơng, xúc xích, thịt
băm ) người ta đang nỗ lực tìm kiếm các giải pháp cơng nghệ để thay thế cho việc sử
dụng nitrite và nisin hiện đang thu hút được sự quan tâm của các nhà sản xuất, trong đĩ
Trang 30Một nhĩm sản phẩm khác cĩ thể sử dụng hiệu quả nisin là sữa chocolate Sản phẩm
này, do độ acid thấp nên nguy cơ nhiễm vi khuẩn cao hơn, trong khi đĩ nhiệt độ thanh
trùng cao ảnh hưởng tiêu cực đến chất lượng mùi và vị sản phẩm Việc kết hợp sử dụng
nisin cho phép hạ thấp nhiệt độ và thời gian thanh trùng, đồng thời lại cải thiện được chất
lượng sản phẩm (ở nồng độ nisin khoảng 80 Ul/ml đã cĩ khả năng ngăn ngừa hiện tượng lên men thối sản phẩm sữa chocolate ở nhiệt độ thường trong vịng 6 tháng) [16]
1.2.7 Tình hình nghiên cứu
Từ những năm 1676, Antonie van Leuuwenhoek đã ghi nhận về tính kháng trong đĩ sản phẩm từ một lồi vi sinh vật này ngăn cản sự phát triển của một lồi vi sinh vật khác Đã cĩ rất nhiều bài báo và cơng trình nghiên cứu về colicin, bacteriocin, bacteriocin từ LAB, và các ứng dụng đặc biệt của nĩ
Kết hợp với các phương pháp hiện đại, những nghiên cứu ngày càng tinh vi va da dang về mọi khía cạnh của bacteriocin Đã cĩ rất nhiều bacteriocin được nghiên cứu và mơ tả
đặc điểm Kevin G Mossie £¿ aÍ (1979) đã mơ tả đặc điểm và phương thức hoạt động của bacteriocin sản xuất bởi ching Bacteroides fragilis, Gerald W Upton et al (1977) đã mơ tả đặc điểm của bacteriocin của Streptococcus phân lập được từ bệnh nhân viêm màng tim
trong Raf Callewaert et al (1999) đã mơ tả đặc điểm và sản xuất amylovorin L471, một bacteriocin tinh chế từ Lactobacillus amylovorus DCE 471
Trang 31ATCC 11454 L sake Lb 706 Sakacin A MRS 25°C, 24h
L carnosum Lml Leuconocin Leml MRS 25 %C, 24h
L plantarum None TGE 30°C, 18h
NCDO 955
L mesenteroides Ly None TGE 30°C, 18h
E faecalis MB1 None TGE 30°C, 18h
Các nhà khoa học đã tích cực nghiên cứu để tìm ra các gen liên quan đến sinh tổng
hợp, điều hồ của bacteriocin và miễn dịch của chủng sản xuất Mặc dù một số
bacteriocin đã xác định được gen mã hố nhưng vẫn cịn rất nhiều điểu chưa rõ ràng, như là cơ chế biến đổi từ tiền peptide thành peptide trưởng thành, các enzyme tham gia, sự sinh tổng hợp được điều hịa như thế nào, đặc biệt là với các bacteriocin lantibiotic Hiện nay, gen mã hố cho nisin đã được tìm thấy và định vị Một số bacteriocin khác cũng đã
được xác định như lactococcin, variacin, lacticin, plantaricin nhưng vẫn cịn nhiều
bacteriocin khác chưa được xác định [16]
Về phương thức hoạt động của bacteriocin, đã đạt được nhiều kết quả và khám phá quan trọng trong vấn để này, ví dụ như lacticin 3147 hình thành lỗ đặc hiệu ion trên màng
tế bào vi khuẩn GÌ Nisin thì liên kết với một chất tẩy cation cĩ hoạt tính bê mặt để thấm
vào vách tế bào vi khuẩn Lactocin 27 tác động lên sự tổng hợp DNA, RNA và protein
[37]
Mặc dù cĩ nhiều bacteriocin được tinh chế, nghiên cứu và mơ tả đặc điểm nhưng chỉ cĩ một số ít được cho là cĩ tiểm năng thương mại Cho đến nay, chỉ cĩ nisin là bacteriocin
tinh khiết duy nhất được sử dụng trong thực phẩm ở Mỹ Nĩ đã được sử dụng như là chất bảo quản thực phẩm ở trên 50 quốc gia, chủ yếu là trong fromage, rau quả đĩng hộp, các sản phẩm qua khử trùng Pasteur như sữa, ngồi ra cịn bảo quản trứng và salad tươi [41]
Ứng dụng của các bacteriocin khác trong bảo quản thực phẩm cũng được nghiên cứu,
Trang 32chế của pediocin PA-i/AcH Nĩ được thêm vào fromage mềm của Mexico rất mẫn cảm với sự nhiễm Listeria Micrograd là kết quả của lên men Propionibacteriưm Nĩ cĩ hoạt tính chống lại vi khuẩn Œ như là Pseudomonas, Salmonella, Yersinia cũng như là nấm men
và nấm mốc Hoạt tính bảo vệ của Microgard gần như là do cĩ sự hiện diện của acid propionic [36] ALTA 2341 được chấp nhận bởi FDA cho sử dụng trong fromage va
yoghurt mùi trái cây Một sản phẩm khác là Bioprofit là hợp chất của chiing Lactobacillus
và Propionibacterium được dùng trong nuơi cấy thơng thường để chống sự phát triển của
nấm men, nim méc, Bacillus spp Clostridium spp và Lactobacillus trong suốt quá trình
lên men bơ sữa [13]
Đặc biệt cĩ một số bacteriocin loại lantibiotic cịn cĩ một số ứng dụng trong y được hiện đang được nghiên cứu Epidermin và Gallidermin (2003) cho thấy hoạt tính kháng Propionibacterium acnes, tác nhân gây mụn trứng cá Những chất bảo quản này đưa đến việc các lantibiotic cĩ thể được sử dụng trong xử lý mụn trứng cá ngồi da như là một liệu pháp thay thế cho các kem erythromycin/vitamin A được sử dụng hiện nay
Tương tự, tính ổn định với acid của nisin (HURST, 1981) đã hướng đến nhiều nghiên cứu gần đây cho rằng nĩ cĩ thể cĩ ảnh hưởng trong chữa trị bệnh viêm loét dạ dày Vì
hoạt tính kháng khuẩn của nĩ là chéng lai Helicoacter pylori D6 nhay cia nisin véi cdc
enzyme tiêu hố lại là trở ngại trong việc sử dụng các chất này trong trị liệu [44]
Nhưng cĩ lẽ ý nghĩa nhất là nhĩm cinnamycin thuộc lantibiotic loại B đã cho thấy ảnh
hưởng của chúng đến chức năng miễn dịch của người, sự tăng nhanh leucocyte cĩ thể
đĩng vai trị quan trọng trong việc bảo vệ chống virus Herpes simplex Do đĩ, ứng dụng tiềm năng của những hợp chất này trong việc chăm sĩc sức khỏe con người là rõ ràng
[14]
Mặc dù cĩ nhiều nghiên cứu trong suốt những năm qua để đạt được hiểu biết sâu sắc
về bacteriocin nhưng vẫn cần tiếp tục tìm hiểu để đạt được sự am hiểu đầy đủ về cơ cấu
phân tử, mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng, cơ cấu hoạt động của bacteriocin Trong
Trang 33biến đổi vẫn cịn chưa hiểu rõ, cơ chế miễn dịch của chủng sản xuất vẫn cịn chưa được trả
lời thoả đáng [19]
Bacteriocin được sử dụng như là chất đặc hiệu chống lại các vấn đề vi khuẩn khĩ giải
quyết Tuy nhiên, tính hiệu quả của nĩ trong thực phẩm cĩ thể bị giới hạn bởi nhiều lý do,
và giá thành sản phẩm là một trở ngại to lớn khi sử dụng chúng làm chất bảo quản thực
phẩm Do đĩ, khơng chỉ tiếp tục nghiên cứu để tìm ra những bacteriocin mới và hiệu quả
hơn mà cịn phải quan tâm đến khía cạnh kinh tế của nĩ [1 1, 39]
1.3 Phân lập vỉ khuẩn lactic
Trên thế giới người ta đã tiến hành phân lập các chủng cĩ khả năng sản sinh
bacteriocin lớn nhất Lồi được nhắc đến nhiều nhất là Lc /aciis với khả năng sản xuất
nisin Vì vi khuẩn lactic là một vi khuẩn được sử dụng rộng rãi nên nĩ được phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau Nguồn phân lập vi khuẩn lactic thường là sữa tự lên men, các sản
phẩm từ sữa như fromage hoặc là các sản phẩm lên men lactic truyền thống của các nước,
như kim chỉ của Hàn Quốc, bushera của Uganda, và đơi lúc nguơn phân lập là các nguyên
liệu của các sản phẩm lên men như rau cải, giá đỗ hay nước hồ, nước giếng, nước bọt
của người [21, 23]
Các phương pháp phân lập dựa trên các đặc tính hình thái và sinh trưởng của chủng
cần phân lập Tất cả gồm 3 bước:
> Tách loại các chủng từ nguồn phân lập ra thành từng chủng riêng rẽ
Mơi trường mà ta phân lập thường chứa rất nhiều lồi vi sinh vật khác nhau bởi nĩ là những mơi trường giàu dinh dưỡng Trong một tổ hợp nhiều chủng lồi như vậy, nhiệm vụ
đầu tiên của chúng ta là phải tách riêng biệt chúng ra thành các chủng thuần khiết Ta cĩ
Trang 34hay M17 ở nhiệt độ 30° trong vịng 48h Dù đã nuơi cấy đúng mơi trường và đúng thời
gian đặc hiệu nhưng trên bể mặt mơi trường vẫn cĩ nhiều loại khuẩn lạc của nhiều lồi
khác nhau vì vậy ta phải tiến hành tách loại thêm vài lần nữa để cĩ thể thu từng chủng thuần khiết [7, 22]
> NhL Ìn danh dựa vào đặc điểm hình thái của chủng
Khi đã tách loại ra thành từng lồi riêng rế, ta sẽ dựa vào các đặc tính hình thái, nhuộm Gram để phân loại, sàng lọc lại các chủng cĩ đặc tính giống lồi mà ta cần phân
lập Đặc tính hình thái ở đây là hình đáng tế bào, khả năng di chuyển, sự sinh bào tử [20, 23]
> Nhận danh nhờ vào các hoạt động sinh hĩa cơ bản
Với các bước sàng lọc ở trên đã loại bớt các chủng khơng cần thiết, ta sẽ tiến hành
nuơi cấy trong các điều kiện khác nhau, thành phần mơi trường đặc biệt khác nhau để
kiểm tra mức độ sinh trưởng, phát triển của từng lồi Tiếp theo ta sẽ khảo sát khả năng chuyển hĩa các chất đặc trưng của lồi hay sản xuất ra các hợp chất đặc biệt [7, 23]
Ví dụ như trong LAB, chúng Lc /zcfš cĩ khả năng sinh trưởng trong mơi trường cĩ
nơng độ muối NaCI lên đến 4%, nhiệt độ của mơi trường cĩ thể lên tới 40°C, ngồi ra nĩ
cịn cĩ khả năng sản xuất ra khí từ glucose, dextran từ sucrose và ammonia từ arginine
Đặc biệt hơn hết là chủng này cĩ khả năng sản sinh ra bacteriocin mà cụ thể là nisin cĩ thể ức chế được một số vi khuẩn G” [22]
Với các phịng thí nghiệm lớn và hiện đại, các chủng phân lập cịn cĩ các bước nhận
danh phức tạp và yêu cầu kĩ thuật cao hơn như kiểm tra gen, kiểm tra vịng plasmid [23]
Sữa và các sản phẩm lên men từ sữa là nguồn thực phẩm dinh dưỡng được sử dụng rộng rãi trên tồn thế giới Trong mơi trường giàu dinh dưỡng như sữa thì cĩ rất nhiều lồi
vi sinh vật phát triển, và nổi bật nhất là các lồi LAB do trong sữa chứa nhiều lactose,
Trang 35Brevibacterium linens, Lactobacillus helveticus, Lactococcus lactis subsp lactis, subsp cremoris, subsp diacetylactis, Leuconostoc lactis, Propionibacterium spp., Steptococcus thermophilus, Candida kefir, Penicillium camembert, Penicillium roqueforti, Bifidobacterium spp., Lactobacillus acidophilus [11]
Trang 36Chương 2:
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 NGUYÊN LIỆU
2.1.1 Ching vi sinh vật và mơi trường nuơi cấy, giữ giống
Chủng vi sinh vật chỉ thị (đùng trong phương pháp kiểm tra bacteriocin —- phương pháp
Agar Well Diffusion) là chủng ctia vi khuan Listeria monocytogenes được cung cấp bởi
phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học, bộ mơn Cơng nghệ sinh học, khoa Kỹ thuật Hĩa
học, trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh Vi khuẩn được lưu trữ giống
trong ống thạch nghiêng trên mơi trường TSA—YE (xem phụ lục) ở nhiệt độ 4°C Canh trường được chuẩn bị bằng cách lấy khuẩn lạc của chủng cho vào ống nghiệm chứa 10 ml
mơi trường dịch thể tryptic soy cĩ bổ sung chất chiết nấm men (TSB - YE) (Xem phụ lục) nuơi cấy ở nhiệt độ 30°C trong vịng 24h
Vi khuẩn lactic cần phân lập cĩ mơi trường phân lập và giữ giống là mơi trường thạch MRS (Man, Rogosa, Sharpe) (Xem phụ lục) và được nuơi ở 30°C trong vịng 48h Sau khi
cĩ được các khuẩn lạc thuần khiết, ta sẽ lấy khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa 10 ml
mơi trường dịch thể MRS (Xem phụ lục) và nuơi cấy ở nhiệt độ 30°C trong vịng 24h 2.1.2 Nguồn nguyên liệu phân lập
> Nguồn 1: Sữa tươi lên men
Trang 37sinh vật khác sản sinh ra Và hiện tượng đơng tụ này bắt đầu xảy ra từ giờ thứ 10 của quá
trình lên men Canh trường này được sử dụng là nguồn phân lập vi khuẩn [31]
za Z + : ˆ ` , *
> Nguồn 2: Các sản phẩm rau cải muối chua (cải muối chua, cà pháo muối chua, dua giá)
Ba loại sản phẩm này được mua ở chợ Hịa Hưng và lấy trực tiếp nước lên men làm
canh trường để phân lập chủng vi khuẩn cần thiết mà khơng cần thêm thao tác lên men
hay xử lý nào khác trong phịng thí nghiệm [12, 23]
> Nguồn 3: Kim chi
Nguồn nguyên liệu sử dụng được mua từ siêu thị Big C Nước lên men của kim chi được pha loấng và phân lập ra các chủng vi khuẩn
> Nguồn 4: Giá
Giá được mua ở chợ Hịa Hưng, đem về xay nhuyễn và pha loấng vào nước vơ khuẩn để làm canh trường chứa vi sinh vật phân lập [35]
Các chủng vi khuẩn trong các sản phẩm lên men là do trong bản thân những loại rau quả đã cĩ sẵn Chúng sử dụng các nguồn đinh đưỡng trong rau quả để phát triển lên Vì
vậy mà ta sẽ dụng chính những rau quả tự nhiên này để làm nguồn phân lập
Trang 38Chọn nguồn phân lập Tách loại thành từng lồi vi sinh vật thuần khiết Phân biệt bằng đặc tính hình thái chủng vi khuẩn Xác định bằng đặc tính sinh lý của chủng vi khuẩn Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp bacteriocin Khảo sát khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của chủng A
Khảo sát các yếu tố điều kiện nuơi cấy ảnh
hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin
Thuyết mình tiến trình thí nghiệm
Từ các nguồn đã chọn, ta tiến hành các thao tác chuẩn bị để cĩ thể phân lập tốt nhất
Pha lỗng các canh trường, tách loại các chủng vi sinh vật riêng rẽ ra khỏi nhau bằng
phương pháp dàn đều và cấy ria Từ các nhĩm vi sinh vật thuần khiết, ta làm các bước
phân loại bằng đặc tính hình thái nhờ vào hình thái khuẩn lạc, hình thái của vi sinh vật khi quan sát dưới kính hiển vi và qua khĩa nhuộm Gram Sau đĩ xác định chủng vi khuẩn lactic bằng khả năng sinh tổng hợp bacteriocin bằng phương pháp Agar Well Diffusion
Với chủng vi khuẩn phân lập được, tiến hành khảo sát sự sinh trưởng bằng phương
Trang 39được đường cong sinh trưởng và mối lên hệ giữa sự sinh trưởng và sinh tổng hợp
bacteriocin cia chủng Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuơi cấy (pH, nhiệt độ) đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin nhằm cải thiện hàm lượng chất ức chế trong
dịch nuơi cấy thu được
2.3 PHƯƠNG PHÁP
2.3.1 Phương pháp đàn đều, cấy ria
Từ canh trường chứa vi sinh vật đã chuẩn bị, tiến hành pha lỗng bằng dung dịch nước
peptone 0,1% theo các cấp 10, 107, 10”, 10f, 10”, 105, 10”, 10, 10” Dùng pipet lấy 0,1ml
canh trường đã pha lỗng cĩ chứa vi sinh vật trong các ống nghiệm theo từng cấp đổ vào từng hộp Petri chứa sẵn mơi trường thạch MRS Lấy que trang đã được vơ khuẩn dàn đều
trên khắp bề mặt thạch Hộp Petri đã cấy vi sinh vật được cho vào tử ấm ở nhiệt độ 30°C,
nuơi cấy trong vịng 48 giờ để thu được các khuẩn lạc mọc trên bể mặt thạch [6]
Chọn những hộp cĩ mật độ khuẩn lạc vừa phải, khơng dày đặc, khơng chồng lên nhau Trên bể mặt thạch lúc này sẽ cĩ nhiều loại khuẩn lạc do nhiều lồi vi sinh vật khác nhau
phát triển lên nên để biết rõ đâu là chủng cần phân lập, phải tiến hành cấy dàn đều thêm 2,3 lần nữa Để phân loại sơ bộ, khuẩn lạc được phân loại dựa theo các hình thái bên
ngồi tương tự nhau thành từng nhĩm và tiến hành làm tiêu bản quan sát trên kính hiển vi,
loại bỏ bớt nấm men và nấm mốc Các khuẩn lạc cịn lại là vi khuẩn, ta cũng sẽ phân loại
theo hình thái bên ngồi như độ trong, độ nhám, màu sắc của khuẩn lạc để pha lỗng từng loại một vào trong dịch peptone 0,1%, cũng tiến hành pha lỗng theo các cấp rồi đổ hộp Petri theo phương pháp dàn đểu như trên Sau vài lần đổ hộp dàn đều tách loại các chủng
vi khuẩn ra khỏi hỗn hợp, ta thu được các khuẩn lạc thuần khiết [12]
Song song với việc phân lập dàn đều ta cịn cĩ thể cấy ria để thu được các khuẩn lạc
thuần khiết mà khơng tốn cơng quá nhiều vào việc pha lodng va dàn đều trên hộp Petri Phân lập cấy ria với các loại khuẩn lạc ta đã tách loại sơ bộ Sau khi phân lập cấy ria, vi
khuẩn sẽ được tách ra khỏi hỗn hợp và phát triển thành một khuẩn lạc riêng lẻ, thuần
Trang 40Sau khi đã phân lập thành các khuẩn lạc thuần khiết của từng lồi một, chủng sẽ được giữ giống trong ống thạch nghiêng trước khi tiến hành các khảo sát khác Các ống giống
được bảo quản ở nhiệt độ 4°C cấy chuyền định kì 3 tuần/lần để đảm bảo các hoạt tính sinh học của chủng [6, 23]
2.3.2 Phương pháp định danh tế bao vi khuẩn 2.3.2.1 Định danh bằng đặc điểm hình thái
Vi chiing Le lactis 1A c6 kha nang sinh tổng hop bacteriocin được sử dụng rộng rãi
nhất nên trong quá trình phân lập, ta dựa vào các đặc tính của lồi này để nhận danh và kiểm tra khả năng sinh tổng hợp bacteriocin
Với khuẩn lạc hồn tồn riêng rẽ từ cấy ria, làm tiêu bản để quan sát độ đồng nhất cũng như hình thái bên ngồi của lồi Trước tiên ta sẽ dựa vào các đặc tính hình thái của
chủng vi khuẩn phân lập được với đặc tính của lồi Lc /acfis Với các đặc tính hình thái
của chủng và của khuẩn lạc như sau: vi khuẩn cĩ tế bào hình trứng cĩ kích thước 0.5—1.0 um, ở đạng riêng rẽ, xếp thành đơi hay chuỗi ngắn, là tế bào vi khuẩn G”, khơng sinh bào tử, khơng cĩ khả năng chuyển động Khuẩn lạc của chủng Le /acfis cĩ màu trắng sữa, hơi
trong, kích thước nhỏ, hình trịn, cĩ bể mặt mịn bĩng [20, 31]
Sau khi loại các lồi khơng phù hợp, tiến hành cấy thạch nghiêng để giữ giống, và sử dụng cho các bước tiếp theo
Nhuộm Gram
Lấy canh trường vi khuẩn được nuơi cấy ở 30°C trong vịng 24h, đem quan sát khả
năng sinh trưởng và tiến hành nhuộm Gram để nhận dạng lồi vi khuẩn mà ta cần phân lập [6]
Vì lồi Lactococci là GÌ nên khi nhuộm Gram sẽ cho các tế bào giữ màu tím của dung
dich tim tinh thé