phân lập chủng vi khuẩn LACTIC và khảo sát khả năng sinh tổng hợp BACTERIOCIN

trình bày phân lập chủng vi khuẩn LACTIC và khảo sát khả năng sinh tổng hợp BACTERIOCIN

Phân lập chủng vi khuẩn lactic và Phân lập chủng vi khuẩn lactic và khảo sát khả năng sinh tổng hợp khảo sát khả năng sinh tổng hợp bacteriocin bacteriocin SVTH: Lê Thò Hồng Vân CBHD: ThS. Nguyễn Vũ Tuân Luận văn tốt nghiệp đại học Luận văn tốt nghiệp đại học NỘI DUNG  TỔNG QUAN  MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU  NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP  KẾT QUẢ  KẾT LUẬN  Vi khuẩn lactic  Các vi khuẩn G + , chòu acid, không hình thành bào tử, hình que hoặc hình cầu.  Nhu cầu dinh dưỡng phức tạp (amino acid, carbonhydrate, khoáng, vitamin .)  Sản phẩm chuyển hóa: acid lactic, diacetyl, ethanol, CO 2 , bacteriocin…  Được sử dụng rất nhiều trong thực phẩm Tổng quan  Bacteriocin  Là các peptide do vi khuẩn tổng hợp, ức chế mạnh mẽ sự sinh trưởng của một số vi khuẩn khác  Bacteriocin điển hình: nisin, diplococin, (từ Lactococcus), pediocin (từ Pediococcus), lactocidin, acidolin, lactocin, (từ Lactobacillus)…  Ứng dụng: chất kháng sinh, chất phụ gia thực phẩm Và trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu phân lập các chủng có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin Tổng quan o L.G. Stoyanova et al. (2005) phân lập được Lc. lactis từ sữa tươi tách béo tự lên men o Phân lập từ kim chi của Sang Hee Park et al., 2003 o Nghiên cứu trên giá đỗ của M. Nomura et al., 2007 o Phân lập từ thức uống, rau quả lên men truyền thống Malaysia của Ahmad Faris Mohd Adnan và Irene K.P. Tan, 2006 o Phân lập từ thức uống lên men truyền thống Uganda – bushera của C.M.B.K. Muyanja et al., 2003 o L. Aquilanti et al., 2006 phân lập từ fromage Canestrato Pugliese Mục tiêu nghiên cứu  Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp bacteriocin từ các nguồn tự nhiên (sữa tươi lên men, rau quả muối chua, kim chi và giá đỗ).  Khảo sát sự ảnh hưởng của pH, nhiệt độ lên sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng phân lập được. Nguyên liệu  Chủng vi sinh vật  Listeria monocytogenes  Chủng vi khuẩn lactic phân lập  Môi trường phân lập và nuôi cấy  MRS  TSA  Nguồn phân lập o Sữa tươi tự lên men o Rau quả muối chua (cải muối chua, cà pháo muối chua, dưa giá, kim chi) o Giá đỗ Chọn nguồn phân lập (sữa, rau quả muối chua, giá đỗ) Tách loại từng loài vi sinh vật thuần khiết bằng phương pháp dàn đều và cấy ria trên môi trường MRS Phân biệt bằng đặc tính chủng vi khuẩn (hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, nhuộm Gram) Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp bacteriocin bằng phương pháp Agar Well Diffusion Phương pháp: Phân lập Phương pháp: Khảo sát Dòch nuôi cấy Ly tâm lạnh (4 o C, 4000 v/ph, 20ph) Dòch lỏng Sinh khối vi khuẩn Pha loãng, ly tâm lạnh lại (2 lần) Thử hoạt tính bacteriocin (pp Agar Well Diffusion) Đo quang (O.D 600 nm ) Kết quả phân lập: Từ nguồn sữa tươi tự lên men  Có 3 loại khuẩn lạc - (1a) lớn, trắng đục, bóng mòn - (1b) hơi lớn, trắng hơi trong, bóng mòn - (1c) nhỏ, màu trắng đục, bề mặt nhám, mép xung quanh có răng cưa  Quan sát hình thái - (1a) Tế bào lớn, tròn, đơn hoặc kết đôi, có nhân - (1b) Tế bào nhỏ, tròn, đơn, đôi hoặc kết chuỗi ngắn - (1c) Tế bào nhỏ, hình tròn, xếp thành chuỗi dài, không chuyển động [...]...   Phân lập được chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin Thời gian, pH và nhiệt độ ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Điều kiện nuôi cấy thích hợp trong MRS:    Nuôi cấy 20 giờ ở 30oC pH ban đầu = 6.0 Công thức Nisin Cơ chế kháng khuẩn Cơ chế sinh tổng hợp 1 Cơ chế sinh tổng hợp 2 Phân loại Bacteriocin Bacteriocin Bacteriocin vi khuẩn. .. Không có vòng ức chế loại Kết quả Kết quả khảo sát: Sự sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin Kết quả khảo sát: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin Ở 25oC (pH ban đầu = 6.0) Ở 37oC (pH ban đầu = 6.0) to = 30oC to = 37oC to = 25oC Kết quả khảo sát: Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin pHban đầu = 5.0 (ở nhiệt độ 30oC)... với protein gắn arginine 3 Hydrogen peroxide/ Oxy hoá các protein cơ bản Lactoperoxidase 4 Acid lactic Acid lactic bò phân ly đi xuyên qua màng, làm thấp pH nội bào Nó gây trở ngại quá trình chuyển hoá như oxi hoá khử phosphor 5 Bacteriocin Ảnh hưởng đến màng, tổng hợp protein và DNA Bacteriocin và chủng VSV Bacteriocin VSV Laticin 3714 Lc lactis MW (Da) 2847 Plantaricin C Lactobacillus plantarum 35004000... hoặc kết đôi, có nhân - (2d) Tế bào nhỏ, tròn, riêng rẽ hoặc kết chuỗi ngắn Kết quả phân lập: Từ nguồn giá đỗ  Chỉ có 1 loại khuẩn lạc (3a) trắng sữa, nhỏ, bề mặt bóng mòn, mép không có răng cưa  Quan sát hình thái Tế bào nhỏ, tròn, xếp riêng rẽ hay thành từng đôi Kết quả Chủng phân lập 1b Nhuộm Gram KT hoạt tính bacteriocin Kết quả G+ Có vòng ức chế Nhận 1c G+ Không có vòng ức chế loại 2a G+ Không... proteinase K, và pronase E, kháng pepsin Ổn đònh ở nhiệt độ thấp, bền nhiệt ở 1000C trong 60ph hay 1210C trong 10ph Nhạy cảm với pronase, trypsin, và α–chymotrypsin, kháng lại pepsin, proteinase K, α–amylase, và lipase Bền nhiệt ở 1000C trong 60ph Ổn đònh ở pH 2.0 đến 9.7, nhạy cảm với pepsin, trypsin, pronase E, proteinase K và chymotrypsin A, kháng lại với catalase Bacteriocin và chủng VSV Bacteriocin. .. XXIII, và trypsin, kháng catalase, lipase và lyzozyme Ổn đònh ở pH từ 2 đến 10, bền nhiệt 1150C trong 20ph, nhạy cảm với pronase E, proteinase K, ficin, kháng catalase Các yếu tố ảnh hưởng Môi trường nuôi cấy Nguồn C, N, khoáng, chất tăng độ nhớt cho môi trường (agar, dextran, glycerol, hay tinh bột) Điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, thời gian, oxy, pH) Sự sinh tổng hợp bacteriocin Chất ức chế bacteriocin và. .. (các enzyme, acid teichoic) Tinh sạch bacteriocin Dòch nuôi cấy Phá vỡ tế bào, ly tâm/ trích ly bằng acid hay nước nóng Tiền xử lý Dòch thô Lắng tủa phân đoạn với acid, muối, ethanol, hoặc các hỗn hợp khác nhau Cô đặc dựa vào kích cỡ Tinh chế (sắc ký lọc gel, lọc qua máy siêu lọc, ly tâm) Dựa vào điện tích Bacteriocin (sắc ký trao đổi ion, điện chuyển) Ứng dụng bacteriocin Trong bảo vệ sức khoẻ con... ion, điện chuyển) Ứng dụng bacteriocin Trong bảo vệ sức khoẻ con người  Trong bảo quản thực phẩm Phụ gia thực phẩm: giảm khả năng chòu nhiệt của vi khuẩn (để cải  thiện hiệu quả thanh trùng ngay ở chế độ thanh trùng ôn hoà hơn) và kìm hãm, ngăn ngừa quá trình thối rữa (trong trường hợp nếu còn bào tử sót) nisin-nitrite ...Kết quả phân lập: Từ nguồn rau quả muối chua Có 4 loại khuẩn lạc - (2a) trắng, đục, kích thước nhỏ - (2b) trắng, trong, kích thước hơi lớn - (2c) màu trắng đục, kích thước lớn - (2d) (kim chi) trắng, trong, bề mặt hơi mờ, rất nhỏ Quan sát hình thái - (2a) Tế bào nhỏ, tròn, kết chuỗi ngắn - (2b) Tế bào nhỏ, que dài - (2c)... Nuôi cấy 20 giờ ở 30oC pH ban đầu = 6.0 Công thức Nisin Cơ chế kháng khuẩn Cơ chế sinh tổng hợp 1 Cơ chế sinh tổng hợp 2 Phân loại Bacteriocin Bacteriocin Bacteriocin vi khuẩn G- Bacteriocin từ LAB Bacteriocin từ Archaea: halocin và sulfolobicin Nhóm I Nhóm II Nhóm III Các peptide nhỏ có chứa các amino acid không phổ biến Các peptide nhỏ (< 10 kDa), bền nhiệt, có chứa ít nhất một cầu nối disulfur Các protein