Phân lập và khảo sát hoạt tính sinh học của nấm cộng sinh Địa y nigrovothelium tropicum

Phụ lục 4: Kết quả phân tích tương quan phi tuyến tính giữa tỷ lệ ức chế enzyme o-glueosidase với nồng độ cao chiết thu được từ sinh khối nắm ở môi L6 trường PDA 12 tui Phy tue 5: Kết

‘TRUONG DAI HQC SU PHAM THÀNH PHÓ HỖ CHÍ MINH

NGUYÊN HỎNG LINH

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGANH SU PHAM SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DÂN KHOA HỌC

TS TRẤN THỊ MINH ĐỊNH

“Tôi xin cam đoan khóa luận là công trình do tôi nghiên cứu, dưới sự hướng dẫn của Tiền sĩ Trần Thị Minh Định, không sao chép của ai do tôi tự nghiên cứu, đọc, dịch

tải liệu, tổng hợp và thực hiện Nội dung lý thuyết trong khóa luận tôi có sử dụng mộc

sổ tải liệu tham khảo như đã tình bảy trong phần tà liệu tham khảo Các sổ liệu,

chương trình phẫn mễm và những kết quả trong khóa luận là trung thực và chưa được

bố tong bắt kỹ một công trình nào khác.

LỜI CẢM ƠN

Em xin gii lời cảm sơ chân thành đến Tẫ sĩ Trần Thị Minh Định, giảng viên

"hướng dẫn đẺ tài, đã định hưởng và dẫn dắt en trong quá trnh thực hiện khỏa luôn

tốt nghiệp Sự giúp đỡ và động viên của cô là một món quà to lớn đối với em trong

suốt thời gian thực hiện đề tài

Bên cạnh đó, em xin được gii lời cảm ơn đến cô Trần Thị Hiểu, chuyên viên phòng thí nghiệm Sinh hóa - Vĩ sinh khoa Sinh học cũng như cúc thủy cô, anh chỉ, bạn bè nghiên cứu thuậc khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm Thành phổ Hồ Chỉ

"Minh và Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học Trường Đại học Khoa học tự

nhiên đã hỗ trợ em mau chóng hoàn thành thí nghiệm

Sự có mặt của các bạn sinh viên thực hiện đề tài ở phòng thí nghiệm Sinh hóa —

Vi sink cũng như các bạn cùng khỏa 46 Khoa Sink hoc, Trường Bai học Sư phạm

với em, giúp khỏa luận của em có thể hoàn thành đẳng tiễn am xin chân thành cảm ơn thầy có khoa Sinh học — Trường Đại học Su phạm

Thành phổ Hô Chí Minh đã xây dựng cho em nên táng kiển thức vững vàng, tạo điều

Aiện tất nhất để em thực hiện khỏa luận Những lời nhận xé và góp ÿ của thầy có là

bai hoc kinh nghiệm quý báu dành cho em

Cuối cũng, không thể đùng từ ngữ nào để thễ hiện lòng biắt em vô bờ của com

cối với gia đình, cha mẹ, người đã sinh thành, nuôi nẵng, tạo mọi điều kiện tắt nhất

đề con được học hành, tin cân với thé git to lồn và tươi sing, cho con ttn theo

“đuổi tắc mơ của mình

Thành phố Hỗ Chỉ Minh, ngày 26 thắng 04 năm 2024

SINH VIÊN

NGUYÊN HỎNG LINH

DANH MỤC CÁC TỪ VIÉ

DANH MUC BANG

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề à

2 Mục đích nghiên cứu

3 Đối tượng nghiên cứt

.4 Nhiệm vụ nghiên cứu e«eeeeeeeeeeeeeerrtrrerrtrirrrrrierorŸ'

5 Phạm vi nghiên c 2

hot gian và địa điểm nghiên cứu

CHUONG 1 TONG QUAN

4

1-1 Tổng quan về địa y

1.2 Tổng quan v8 nim Nigrovothetium tropic suns

1.3.1.1 Tống quan vé enzyme -glucosiđase -«< Ổ 13.1.2

của bệnh ng quan về bệnh đái tháo đường tuýp 2 và các biến chứng

1.3.1.8 Các chất ức chế enzyme a-glueosidase

°

1.3.2.1 Thng quan về vi khuẩn Staphylococeus aureus

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ‹ -.«‹ -eee CHUONG 2 VAT LIEU VA PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2 2,1, Vật liệu nghién Cth nnmnnnnnnennennnnnnnnnnnnnnnn EE

22 Thiết bị và dụng cụ

2.3 Phương pháp,

CHUONG 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả phân lập nắm cộng sinh dia y Nigrovothelium tropicum 18

3.2 KẾt quả nuôi cấy nắm AI: rapieuum

3.2 KẾt quả tạo cao chit ethyl acetate

3.3 Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế enzyme rglucosidase

KẾ quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn S sư KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ

trường PDA 6 twin

Phụ lục 4: Kết quả phân tích tương quan phi tuyến tính giữa tỷ lệ ức chế

enzyme o-glueosidase với nồng độ cao chiết thu được từ sinh khối nắm ở môi

L6

trường PDA 12 tui

Phy tue 5: Kết quả phân tích tương quan phí tuyến tính giữa tỷ lệ ức chế

„PL7 trường S412 tuần

DANH MỤC CÁC TỪ VIET TAT

Enzyme a-glucosidase inhibitors

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1, Bán đỏ phân bố địa y Nigrovothelium tropicum trên thể giới [19] 5

Hình 2.1 Mẫu địa y N sopicum được thu tại thành phố Quảng Ngãi, tinh Quảng

Hình 2.2 Sơ đồ mô tả quy trình phân lập nắm cộng sinh đa y “4

Hinh 2.3 Sơ đổ mô tả quy trình tg0 cao ethyl acaetate tir nắm cộng sinh dia y 15

Hình 24 Sơ đồ mô tả quy ình kháo sắt hoạt tính kháng khuẩn l6 Hình 3,1 Khuẩn lạc Ä: mpieum sau 2 tuần mui cấy 18 Hình 3.2 Khuẩn lạc N tropicum sau 10 tuần môi cấy is Hình 33 Kết qua mudi nm N srpicum trên mỗi trường MY 10 9

Hình 3.4 Kết quả nuôi cấy nắm N /ropicwmn trên môi trường S4 20

Hinh 3.5 Két qua nui edy nim N rropicum trên môi trường PDA, 21 Hinh 3.6, B6 thi thé hign si tuomg quan gta ty I te ché enzyme aeglucosidase vi logaritnằng độ cao từ sinh khối nắm được nuôi ở môi trường PDA 6 tuần 2

Hình 3.7 Đồ thị thể hiện sự tương quan giữa tỷ lệ ức chế enzyme ø-glueosidase với Hình 3S Đồ thị thể hiện sự tương quan giữa tỷ lệ ức chế enzyme ø-glueosidase với

logarit nồng độ cao từ sinh khối nắm được nuôi ở môi trường S4 12 tuần 30

Hình 3.9 Kết quả khảo sắt hoạt

acetate thu duge tr nim e6ng sinh diay N tropicum 3

Hình 3.10

king khuẩn đối với S aureus cia cao ethyl

t quả khảo sắt hoạt tính Kháng khuẩn Š auzes eiia cao ethyl acetate

thủ được từ nắm cộng inh địa y A ropicum trên môi tường MY10 P2

Hình 3.11 Kết quả khảo sát hoạt tinh kháng khuẩn S- auzews cla cao ethyl acetate

thủ được từ nắm cộng inh địa y N ropicum trên môi trường PDA PLs Hình 3.12 Kết quả khảo sắt hoạt tinh kháng khuẩn S, aureus eli cao ethyl acetate thụ được từ nắm cộng sinh địay Ä!mppicm trên môi trường S4 PLA

Bang 2.1 Danh sách thiết bị dùng trong đề tài 12

Bảng 2.2, Danh sách hóa chất được sử dụng trong để tải ụ Bảng 2.3 Thành phần môi trường nuôi cấy nắm cộng sinh địa y 4 Bang 3.1 Bing tinh bay sinh khdi cao chigt ethyl acetate eiia nm eng sinh diay N

Bang 3.2 Til Ge ché enzyme a-glucosidase cia cao chiét ethyl acetate của nắm cộng

Bảng 3.3 Tỷ lệ ức chế enzyme ø-glucosidase của cao chiết từ sinh khối nấm được

Bảng 3.4, TY Ig te chế enzyme o-glucosidase của cao chiết từ sinh khối nắm được

Bảng 3.5 Tỷ lệ ức chế enzyme ø-glueosidase của cao chiết từ sinh khỏi nắm được

Bảng 3.6, Hoại tính kháng Khun cia cao ethyl acetate thu duge ừ nắm cộng inh địa

Bang 3.7 Két qua khio sit hoat tinh Khéng khaaurn S aureus của các miu cao ethyl acetate thu duge tr nim eGng sinh dia y N, ropicum PLI Bảng 3.8 Kết quả phân tích tương quan phí tuyển tính giữa tỷ lệ ức chế enzyme ø- slueosidase với nồng độ cao chiết thu được từ sinh khối nắm ở môi trường PDA 6

Bảng 3.9 Kết quả phân tích tương quan phi tuyển tính giữa tỷ lệ ức chế enzyme ø-

glueosidase với nồng độ cao chiết thu được từ sinh khối nắm ở môi trường PDA I2

Bảng 3.10 Kết quả phân tích tương quan phi tuyển tính giữa tỷ lệ ite ché enzyme a glueosidase với nồng độ cao chiết thu được từ sinh khối nắm ở mỗi trường S4 12

tuần, PLT

MODAU

do chon dé tai

Địa y là đạng sống cộng sinh của nắm (mycobiont) v6i một (hoặc một số) tảo bay vi khuẩn lam có khả năng quang hợp (photobion0, đóng vai trò quan trong trong

quá trình sinh địa hóa [1] Nhiễu nghiên cứu đã chỉ ra rằng, địa y có khả năng tạo ra

các chất chuyển hóa thứ cắp hiểm hoặc không thể tìm thấy ở sinh vật khác [2], [3] Các chuyển hóa thứ cp thường chiếm từ 0,1% đến 50% khổi lượng khô của tân

và phần lớn trong số đó được tạo ra bởi nắm cộng inh địa y 4] Với sự phát triển của

kỹ thuật hiện đại, địa y khiến giới khoa học cảng bắt ngờ hơn với những hoạt tính

sảnh học do hợp chất chuyển hóa thứ cấp mã chúng sản xuất, ma ra hung di mi diy

tiềm năng cho ngành y dược bởi tính ứng dụng cao của những hợp chất đó trong việc

ức chế nhiễu loi enzyme

Việc ức chế enzyme được ghí nhận là hoạt tính có giá trị trong điều trị của địa y bởi hoạt động mắt kiểm soát của một số cnzyme tạo ra các bệnh ảnh hưởng nghiêm trọng đến đời sống con người, ví dy nhur enzyme a-glucosidase Hign nay, việc ức chế tháo đường tuýp , một trong những bệnh không lây truyền phổ biến nhất thể giới

Đái tháo đường dẫn phát nhiều biến chứng đe dọa sức khỏe và tính mạng người bệnh

như: nhiễm toan ceton, các biển chứng iền quan đến mắt, thân, nhi máu cơ tim, dt quy [5] Thuốc điều trị đái tháo đường tuýp 2 đường uống được sử dụng phổ biến trong lâm sing là acarbose, migltol và voglibose với phương hướng chính là ức chế

ảnh hướng đến chất lượng cuộc sống người dùng như chán ăn, ảnh hưởng đến chức

năng của gan, buồn nôn, tiêu chảy, nhiễm lactie acid [6] [7] Với những ảnh hướng

tiêu cực đó, nhiều công trình nghiên cứu đã được triển khai nhằm tìm kiếm các hợp

chất mới có tác dụng phụ hơn trong vige te ehé enzyme a-glucosidase vi dia y li một đối tượng nghiên cứu đầy tiềm năng trong số những đổi tượng có nguồn gốc tự niga,

BBén canh tiém ning điều trị đái tháo đường tuýp 2, dia y còn nội bật với khả

năng tiêu diệt vi khuẩn khi tình trạng kháng penicilin - thuốc kháng sinh phổ biến

hiện nay ở vi khuẩn đang ngày cảng trở nên phổ biển và trở thành vẫn để toàn cần, đồi hỏi những hợp chất khác để điễ trị hiệu quả cc bệnh in quan đến nhiễm khuẩn Cho đến hiện tạ đã có nhiều đề tải công bố hoạt tinh ức c glueosidase và kháng khuẩn mạnh của các loài địa y, chứng minh của địa y trong ứng dụng y học [3] Tuy nhiên, đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào

Nigrovothetium tropicum Dé tim hiểu thêm về hoạt tính sinh học của nắm cộng sinh địa y này, đề tài Phân lập và khảo sát hoạt tính sinh học của nấm cộng sinh Nigrovothetium tropicum được thực hiện

2 Me đích nghiên cứu

Phân lập và khảo sắt hoạt tính sinh học của nắm cộng sinh từ địa y N: opiewm

3 Đối tượng nghiên cứu

Nắm cộng sinh địa y A./ropicum

.4 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Phân lập nắm tir dia y N mopicum

= Nudi ndim dia y da phan lap được trên môi trường MY 10, PDA và SA

- Thủ sinh khdi ném NV tropicum 6 sau khoảng thời gian 4 tuần, 6 tuần, 8 tu

10 tuần và 12 tuần sau khi nuôi cấy

= Tao cao ethyl acetate tr sinh kh nd,

~ Khảo sát hoạt tinh ức chế enzyme a-glucosidase va hoạt tính kháng khuẩn đối

+64 Staphylococcus aureus cia cao chidt ethyl acetate

5 Pham vi nghiên cứu

Nghiên cứu chỉ tiến hành phân lập nắm cộng sinh Migrovothcliưm tropicum tir

01 mẫu địa y thu ở thành phố Quảng Ngãi, tỉnh Quang Ngai (15.1042, 108.8060) vào

tháng 4 năm 2023 và đánh giá hoạt tính kháng khuan Staphylococcus aureus vi hoat

tính ức chế enzyme œ-glucosidase của cao cthyl aetate từ sinh khôi nắm cộng sinh

địa y NI tropieum

“Thời gian: 6 tháng (10/2023 ~ 3/2024)

Địa điểm: Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh hóa - Vi sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Su phạm Thành phố Hồ Chí Minh

| Tong quan ve dja y

Địa y là đạng sống cộng sinh phổ biển của nắm soi (mycobiont) và một (hay một số) vì sinh vật quang hợp (photobion) là vỉ ảo hoặc vỉ khuẩn lam, hoặc cả hai: dạng sống đặc biệt này giáp chúng có thể phát triển trong những điều kiện khắc nghiệt

như độ âm và nhiệt độ cực đoan, được cho là dạng sống cộng sinh rất thành công

trong giới nắm theo quan hóa [], |8]: Song, địa y vẫn nhạy cảm với sự thay

đổi đột ngột của thời tiết nên chúng thường được xem là một nhân tổ để các nhà nghiệt sửa đánh giá mức độ ô nhiễm trong khu vực

CCó khoảng 100 loài vi sinh vật quang hợp cộng sinh với 13.500 loài nắm hình thành nên địa y, trong đó có hơn 9894 nắm thuộc ngành Ascomycota, sé in fi Ki Basidiomyeota [9], (0) Tên của địa y tương ứng với loài nắm cộng sinh của chúng (8)

6 dia y, nim dim nhigm vai trò hấp thụ nước và khoáng chất cho tản, bên cạnh

đồ côn tạo ra nhiều chất chuyển hỏa thứ cắp trong quả trình sinh trưởng giúp bảo vệ

tảo công sinh khỏi ánh nắng gay gắt [3]; cụ thể là từ các con đường acelyl

polymalonyl, mevalonic va shikimate Cho dén nam 2020, hon 1.000 chất chuyên hóa thứ cấp thủ được từđịay trong các công trình nghiên cứu Người ta đã phát hiện nhiều chit depsie, depsidone, dibenzofura, quinon, chromone, carotenoid, polysaccharide, địa y đã được nghiên cứu về hành phần polysaccharide trong hợp chất chuyển hóa thứ cấp, phát hiện có ba loại cấu trúc polyeaechaide chính bao gồm: glucan, J-

glucan và galactomannan [II], [12], [13] Trong đỏ polysaccharide thuộc loại -

gluean và galaclomannan đã được cho là cố ý nghĩa trong phân loại hóa học [11] (14), [I5] Điều này được chứng minh qua một số công trình nghiên cứu tách nắm và chất chuyển hóa thứ cắp ~ polyeaecharide - tương tự như địa y, tong khi tảo th tạo

ra những loại khác [15] Việc sản xuất các chất chuyển hồa thứ cắp ở địa y chịu ảnh

hưởng bởi cde yi tổ môi trường bao gồm ánh sáng, tác động của ta UV, độ cao, nhiệt

“độ và mùa [16] Bên cạnh môi trường thì tuổi của địa y cũng đóng vai t quan trọng trong kha ning sin xuất các hợp chất chuyển hóa thứ cấp

Một số loài địa y, chẳng hạn nhw Cerraria islandica va Lobaria pulmonaria, 43

.được sử dụng trong y học cổ truyền từ thời cổ đại để điều trị nhiễu loại bệnh [17], Tắt

lên tới 57% tông khối lượng các chất chuyển hóa [18]: nhiều loài trong số chúng được

chứng mình là có tắc đụng chống ung thư, kích thích miễn địch, kháng virus cũng nhự các loại hoạt tính sinh học khác

1.2 Ting quan về nấm Nigrovothelium tropicum

Lodi: Nigrovothelium tropicum

Mình 1.1 Bản đồ phân bổ địa y Nigrovothetium tropicum trên thể giới [19] Địa y N tropicum, thue chi Nigrovothelium, ho Trypetheliaceae, được cho là

có quan hệ gần gũi với loài Trypethetium tropicum Địa y N tropicum duge Robert Licking và cộng sự phân loại vào năm 2016, được xem là loài điễn hình của chỉ Nigrovothelium với các điểm đặc trưng như sau

nâu ô iu, đường kính <I0 cm, bên trên có các hạt như mụn cóc; trê vỏ có th lớp sụn dày, lớp vỏ photobiont và phần tiy diy

"Thể quả mọc đơn độc nhưng dày đặc và thường hợp lại với nhau, trên mỗi thể

quả có một lỗ nhỏ; đường kính thể quả từ 0.2-0.3 mm, không cuống, cao < 0.25 mm, lồi lên bể mặt tản, mẫu đen, vùng trung m có mầu xám; miệng của túi bảo từ có thể

thấy dưới dạng những chắm đen nhỏ Phin dé thể quả (cxeipulum) đây 50 ~ 100

m, bị eatbon hỏa Có 8 bảo tử hình thoi trong mỗi túi bảo tử Hiện vẫn chưa có

nghiên cứu nào xác định thành phần các chất chuyển hóa thứ cắp của nắm cộng sinh

địa y N ropicum [20]

"Theo cơ sở dữ liệu từ năm 1886 đến 2024 của Tài nguyên dữ liệu sinh học cốt

lõi toàn cầu (Global Core Biodata Resource ~ GBIF), diay N rupicum được tìm thấy nhiều ở khu vục miễn đông Bắc Mỹ, Nam Mỹ, châu Phi, Thái Lan, miễn nam Việt

Nam và châu Úc [21]

Tổng quan về hoạt tính sinh học

13.1 Ting quan v8 hogt tính ức chễ enspm€ ø-glueosidase 1.3.1.1 Tong quan véensyme a-glucosidase

Enzyme, bin chất là protein, có tính chọn lọc cao đối với chất nền, hiện diện

trong mọi tẾ bảo inh vật, đồng vai rổ xúc tác cho các phân ứng nh học, Hầu như Auge xi ác bởi chúng thường có tốc độ nhanh hơn nhiều so với khi không có Enzyme a-glucosidase (EC 32.120, maluse) là một enzyme thuộc nhóm

glyeosidase có Khả năng thủy phân liên kết L glycoside và thủy phân oligosaccharide vi giai phéng a-D-glucose tur do, làm tăng lượng đường trong máu tên goi_maltase, glucoinvertase, glocosidosurase, maltase-glucoamylase, a glucopyranosidase, glucosidoinvertase, a-D-glucosidase, a-glucosidase hydrolase, a-

1 4-glucosidase

‘Sau khi enzyme a-glucosidase tgo ra các đường dơn từ thúc ăn đã được nạp vào

co thé, insulin với bản chất là một loại hormone được sản xuất bởi tế bào beta của đảo

lượng dự trữ của cơ thẻ Tuy nhiên, những bệnh nhân mắc bệnh đái tháo đường tuýp

2 gặp ình trang không thể sử dụng insuli hoặc insuin không thể thực hiện chức năng, tong cơ th Tình trạng này còn khiển cơ thể không thé nạp insulin ngoại sinh, khiến cũng trở nên khó khăn Chính vỉ vậy, đường huyết của họ rất ao sau khi ăn do glucose không được hấp thụ vào tế bảo [24)

1.3.1.2 Tổng quan về bệnh đái thảo đường tưƒp 2 và các biển chứng của bệnh

‘Dai tháo đường (ĐTĐ) là một trong những bệnh không lây nhiễm phổ biến trên

toàn cầu Trên toàn th gi e6 415 triệu người mắc bệnh ĐTP và ước tính có khoảng

193 triệu người mắc bệnh ĐTP chưa được chẳn đoán Bệnh TD có hai thể phỏ bin

Nguyên nhân của bệnh ĐTĐ tuýp | 1a do cơ thể không thể tự sản xuất insulin vì tế

bảo beta của tụy bi phá hủy, chịu ảnh hưởng bởi tinh di tuyễn Bệnh ĐTĐ tuýp 2, hơn 90% số

sắc về tâm lý và thể chất cho cả bệnh nhân và người chăm sóc, đồng thời đặt gánh

nặng lớn lên hệ thống chăm sóc sức khỏe [24)124}

Theo Liên đoàn ĐTĐ Quốc tế (IDF), dén nam 2019, toàn thé giới đã có 463

loét sâu hơn và dễ bị nhiễm khuẩn, đặc biệt ở chỉ đưới Còn tổn thương ở hệ thống

mạch máu lớn có thể gây xơ vữa động mạch, dẫn đến tình tạng thiểu máu cục bộ, hoặc rối loạn chức năng miễn địch [24]

Vity Ig mic bệnh ĐTĐ ngây cảng tăng cũng như các biến chứng của nó, năm

2013, IDE đã để xuất các chiến lược hữu ích để điều trị bệnh ĐTĐ, tập trung vào việc không đăng thuốc (tự kiểm soát dường huyết và chế độ ăn kiêng), các loại thuốc như

thuốc tác động vào insulin trong thời gian ngắn (sulfonylurea va glinide), thuốc ức

ché enzyme glucosidase (AGIs), insulin và ác liệu pháp dựa trên increin cũng được ứng dụng lâm sản nhằm tác động lên mức đường huyttăng lên sau bữa ăn 13.13 Cúc chất ác ché enzyme aeglucosidase

Trong điều trị lâm sảng, thuốc điều trị bệnh ĐTĐ thường hướng đến mục

số ba loại AGIs d6, acarbose có hiệu quả nhất trong việc ức chế glueoamylase, uerase, mallase và dextranase Trong khi miglill có khả năng ức chế sự hoạt động của suerase và maltase hơn acatbose và cũng hoạt động trên isomaliase, nhưng lại

không có tác dụng với ø-amylase Voglibose được phân lập từ môi trường nuôi cấy

Streptomyces, day la loai thuốc te ché enzyme phan giải đường mạnh với đối tượng trong liu trình điều trị ĐTĐ, tùy vào đặc điểm ca bệnh và nhu cầu của người bệnh Tuy nhiên, việc sử dụng AGIs thưởng xuyên trong thời gian đài đã mang lại

nhiều tác dụng phụ không mong muỗn cho bệnh nhân Ví dụ như chắn n, buồn nôn, tiêu chiy, nim lati acid [2] Để gia tăng hiệu quả điều tị lên mức tối ưu với

những tác dụng phụ bị hạn chế tối thiểu, nhiều công trình nghiên cứu tìm kiểm chất

tre ché enzyme arglucosidase được tiền hành Trong số những nguồn chất ức chế

eneyme arglueosidass tự nhiền,địy đang là một đổi tượng đy i

bắt buộc ở nhiệt 46 18°C - 40°C [30]

S aureus (bao gém cả các ching khám thuốc nhu S.aureus khing methicillin)

được tìm thấy trên da và màng nhây, con người được xem là 6 chứa chính của chúng

BI) Mặc dù $ awreus thường tổn tại như một phần của bộ vi sinh vật cộng sinh ở

người nhưng ở điều kiện nhất định, nó cũng có thẻ trở thành mầm bệnh cơ hội, gây ra

nhiễu loi bệnh từ nhiễm trăng da nhẹ, chẳng hạn như mụn nhọt, chốc lỡ, viêm mô tế

bảo, viêm nang lông, nhọt, hội chứng bỏng da và áp xe, đến các bệnh đe dọn tinh

mạng như viêm phối, viêm mảng não, viêm tủy xương, vie nội tâm mạc, hội chứng

sốc nhiễm độc, nhiễm khuẩn huyết và nhiễm trùng huyết [32]

S8: amres là một trong những mầm bệnh hàng đầu gây tử vong liên quan đến

kháng kháng inh Sự xuất hiện của các chủng kháng kháng sinh tr thành vấn đ toàn

cầu tong y học lâm sàng Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu và phát triển nhưng vẫn chưa có vaccine nào được phê duyệt sử dụng lâm sàng để chẳng lại S, aureus (32) 1-4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Địa y là đối tượng các nhà inh thái và phân loại học chủ ý nghiên cứu từ lâu

Với nhiều tiềm năng sinh học chưa được khai thác, ngày nay, nghiên cứu các ch

chuyển hóa thứ cấp của địa y dẫn trở thành một xu hướng mới của khoa học nhằm

tim ra các nguồn được liệu mới cho y học

"Về các nghiên cứu hoạt tỉnh kháng khuẩn của địa y, các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước đã có nhiều thành tựu nỗi bật

Trong nghiên cứu của Lauinger và cộng sự vào năm 2013 [33], các tác giả đã so sánh khả năng ức chế của chiết xuất địa y vào giai đoạn xăm nhập trong gan của Plasmodium berghei, ký sinh trùng sốt rết, vị (#)-usnie, vulpie, evemie acid và psoromie acid Nghiên cứu phát hiện usnie acid thể hiện hoạt động ở giai đoạn nhiễm

trùng gan và độ đặc hiệu ở giai đoạn cao nhất (giai đoạn nhiễm trừng gan cổ IC là

323 HỒM, gái đoạn máu có Ca là 47.3 uM), Các tác gi đã báo cá rằng 3 hợp chất

khác đã ức chế ít nhất 01 enzyme (beta-ketoacyl-ACP reductase, enoyl-ACP

reductase, betahydroxyacyl-ACP dehydratase) tir con đường sinh tổng hợp acid béo

(FAS-I cia trùng sốt rét, Ngoài ra, các hợp chất này cũng được đánh giá dựa trên

toàn bộ tế bảo và các chất tương đồng Fabl của S aureus, Mycobacterium tuberculosis

va Escherichia coli, Theo cae nghién erwin vitro, eée hap chit hoat déng giản tiếp bằng cách gắn vào các vị trí ập thể trên Bé mit protein cia enzyme FAS-II Ba din loại ví sinh vật gây bệnh, các nhà nghiên cứu báo cáo rằng các dẫn xuất usnje acid và phức hợp kim loại có tác dụng khng khuẩn mạnh,

‘Nam 2016, tác dụng điều trị của usnie acid, một trong những chất chuyển hóa

địa y được nghiên cứu rộng rải nhất và hiện điện trong các chỉ địa y Alectoria, Cladonia, Evernia, Lecanora, Ramalina va Usnea, chéng lại bệnh cầu trùng đã được

báo cáo rằng liều usnie acid 100 mg/kự thể hiện hoạt tính kháng cầu trùng tốt hơn so

với toltrazuril [34]

“Trong một nghiên cứu khác, Shrestha và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng kháng

sinh của 34 chiết xuất địa y ở Bắc Mỹ trong tre ché vi khuan S aureus, Pseudomonas

aeruginosa, S aureus khing methicillin và vi khuẩn E, coli Chiết xuất acetone của Vulpicida canadensis, Letharia vulpina vi L colunbiana đã được chứng mình có khả

~500 ngiml

năng ức chế E coli, Ngoai tri L pulmonaria,

dụng ức chế vi khuẩn Gram đương với giá trị MIC nằm trong khoải [35]

Năm 2018, Tatipamula và cộng sự đã Khao sit kha ning re ché enzyme a

glucosidase cia cao ethyl acetate duge tach chiét tir dja y Parmotrema tinctorum,

khẳng định rằng tincorum cỏ khả năng kiểm soát bệnh BTD [36], Năm 2020, Dương Thúc Huy và các cộng sự đã tiền hành nghiên cứu điều tra các hợp chất hóa học loài địa y Pammstremu tsavoense, phiin lập thành công 5

glucosidase với giá trị ICso nằm trong khoảng tử 10.7 đến 17,6 wM, thấp hơn nhiều

3o với aeatbose đối chứng dương (IC.› 449 M) [37] Năm 2021, một nghiên cứu

khác của Dương Thúc Huy đã tìm thấy C43-spitoterpenoid mới reieulain (1), được

phân lập từ địa y P reticulatum; năm hợp chất được phân lập từ đó bao gồm: Zorin

(2), leucotylin (3), lupeol (4), betuinie acid (5) và dĩhydroreynosin(6) Tắt cả các hợp

chất được đánh giá là có khả năng ức chế œ-glucosidase Hợp chất 1 cho thấy sự ức

chế mạnh nhất, với giả tị ICo là 3,90 M, thấp hơn nhiều so với đối chứng dương: tinh acarbose (ICs0 165 4M) [38]

Gin diy, nim 2022, tại Việt Nam, Dỗ Thanh Hùng và đồng nghiệp đã khảo sắt các hợp chất đơn chất từ nguồn địa y được phân lập và xác định trước đó: 35-

dihydroxybenzoic acid (1), 3,5-dihydroxybenzoate methyl (2), 3,5-dihydroxy-4-

methylbenzoic acid (3), 3,5-dihydroxy-4-methoxylbenzoic acid (4), 3-

ydroxyoreinol (5), atranol (6), methyl hematommate (7) vi methyl Beorsellinate (8),

methyl orsellinate (9) và D-montagnetol (10) đã brom hỏa Quá trình brom hóa được

áp dụng cho các hợp chất (®), (9), (10) sử đụng thuốc thử Nar/H;O;, thù được sản bromo-D-montagnetol (10a) vi 35-dibromo-D-montagnetol (10b) Các hợp chất

được đánh giá về khả năng ức chế a-glucosidase va hoat tinh khéing khudn chống lại

vi khuẩn gây bệnh, Enterococcus faecium khang khing sinh, S aureus và Acinetobacter baumannii Hp chit (8) cho thấy kha ning te ché acglucosidase manh hơn các hợp chất khác có giả trị ICo là 24,0 g/mL Hp chit (9a) thé hig hoat tinh đăng chú ý ức chế § aurus với giá tị MIC là 4 ugjmL [39] Dầu tháng 9 năm 2022, Nguy

armotrena teanoense và phân lập được chất mới là Pamnosidone K có hoạt tinh te

Thị Hoài Thu và cộng sự đã nghiên cứu dia y

chế enzyme a-glueosidase với giá trị ICso là 3,12 uM [40]

"Tuy nhiên, cho đến đầu năm 2024 vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào khảo sát hoạt tinh oxy hóa, kháng khuẩn hay ức chế enzyme œ-glueosidase của các hợp chất chuyển hỏa thứ cắp thu được ừ diay N tropicum.

CHƯƠNG2 VẶT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Nắm công sinh địa y được phân lập từ mẫu địa y Nigrovothelium tropieum thu

tại thành phố Quãng Ngãi, tinh Quang Ngai (15.1042N, 108.8060E) vào tháng 4 năm

203

'Hình 2.1 Mẫu địa y /V: /ropicwm được thu tại thành phố Quãng Ngãi,

tinh Quang Ngai

Ci hod chất sử dụng trong để tài được tình bày trong bảng 22 Bang 2.2 Danh sách hóa chất được sử dụng trong đề tài

3 | Ethyl acetate 99,5% AR Trung Quốc

4 | Dimethyl sulfoxide VWR International Pháp

5 | Sodium biphosphate Merck Đức

6 | Disodium phosphate BioBasie Canada

7 | Sodium carbonate AR

Guangdong Guanghua | Trung Quốc

8 | Sucrose Sei-Tee Co Lư,

2.3.1 Phương pháp phân lập nắm cộng sinh địa y'

CQuy trình phân lập nắm cộng inh địa y được tham khảo từ ải iệ [41], tỉnh bảy tròng hình 22.

2.3.2, Phurong pháp nuôi nắm cộng sinh đa y

Nấm địa y sau khi được phân lập, được chuyển sang nuôi cấy trong tối với nhiệt

độ 18 + 1°C trên các môi trường có thành phần như trong Bảng 2.3

Bảng 2.3 Thành phần mỗi trường nuôi cấy nấm cộng sinh địa y Tenmar | MaltyeastAgar | Khoaidy Sabouraud 10% sucrose (PDA) 4% D-glucose

Phương pháp tạo caoethylsccte được tham khảo từ tài liệu [12] mô ch ết

ở nhiệt độ 45°C và nghiễn thành bột sau khi khô hoàn toàn, Phần nắm đã xay nhuyễn

được mang đi cân, ghi nhận sinh khối nắm Tiếp theo đó, sinh khối nắm được ngâm

trong ethyl acetate véi tỷ lệ 1:1; hỗn hợp được lọc qua giấy lọc và cô đặc bằng may (để gỉ nhận khối lượng cao

3.3.4 Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học

2.34.1 Hoat tinh ite ché enzyme acglucosidase

"Nguyên tắc của phương pháp được dựa theo cơ chế hoạt động của enzyme a- glucosidase Enzyme a-glucosidase phan giai cơ chất pNPG thành p-nitrophenol, tạo

mẫu vàng cho hỗn hợp sau phản ứng Khả năng hoạt động của chất ức chế enzyme ø-

#lucosidase tỷ lệ nghịch với lượng p-nitrophenol, như vậy nghĩa là sau phản ứng màu

vàng của hỗn hợp cảng nhạt chứng tỏ khả năng te ché enzyme a-glucosidase eva miu cảng cao [43]

Phương pháp khảo sắt hoại tính ức chế enzyme a-glucosidase đựa theo tả liệu

[37] Enzyme a-glucosidase (0,2 U/mL) va cơ chất (5,0 mM p-nitrophenyl-a-D-

glueopyranoside) được hòa tan trong dung dịch đệm natri phosphate 100 mM e6 pH

1a 6.9 Diu tién, cao thd ethyl acetate tr nim cộng sinh địa y được pha loãng trong DMSO thinh nông độ 200 ugimL và thêm vio mdi dia eta dia 96 giémg 50 pL: saw

.đồ mỗi giếng được thêm 40 ụl_ enzyme và ủ ở 37°C trong 20 phút Sau 20 phút, hỗn

hợp được bố sung 40 wL cơ chất và tiếp tục ủ trong 20 phút ở 37°C để phản ứng diễn

ra, Cudi cũng, phản ứng được kết thúc bằng cich cách thêm 130 pL NazCOs

0,2M Hoạt tính ức chế enzyme acglueosidase được định lượng bằng cách đo độ hấp

thụ ở bước sóng 405 nm, Tắt cã các mẫu được phân tích ba lẫn ở 10 nồng độ khác

nhau xung quanh gid tr ICs

‘Ty 1g phin tram ức chế (%) durge tinh theo phuong trình:

hắn tăm úc chế 4) == 22 x 100

‘rong dS, OD miu la gié tr] ODuss eta hỗn hop phản ứng khi có chất ức c

©D đối chứng là giá trị OD4s của hỗn hợp phản ứng khi không có chất ức chế 2.3.4.2 Hoat tinh không khuẩn

"Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của mẫu nắm phân lập được dùng

trong để tải là phương pháp khoanh giấy khuếch tán trong thạch theo Kirby-Bauer

được tham khảo từ tải liệu [44] và [45] được mô tả trong hình 2.4

Pha hỗn dịch vikhuẩn 101V/khoẩn/m

Trải hỗn dịch vi khuẩn lên bề mặt thạch

"Đặt khoanh giấy thấm 1 mg cao chiết cty! ‘acetate én thạch thạch được ở 37+ 3C trong vòng 16 18giờ Hình 2.4 Sơ đồ mô tả quy trình khảo sắt hoạt tính kháng khuẩn

CQuy trình khảo sắt hoạt tính kháng khuẩn chủng S aureus duge tén hành trong

48 tải như sau:

~ Chuẩn bj dia thach Mueller-Hinton (MHA): Céc thinh phin môi trường được côn một cách chính xác theo hướng dẫn và hòa tan vào nước cắt vô trùng, đun sôi,

kiểm tra pH trong khoảng từ 7.2 - 7.4; cuối cũng, môi trường được hắp tiệt trùng Sau Khi hấp xong, tong lúc còn nóng, môi trường được đổ vào đĩa Peti vô trùng với độ dây khoảng 4 mm và đợi đông đặc

= Chuẩn bị chủng vi khuẩn S aureus va pha hin dich vi khuan nồng độ 10 vỉ khuẩn mL,

- Trải vi khuẩn lên đĩa thạch: huyễn phù chứa vỉ khuẩn được tải đều lên bề mặt

môi trường MHA, để khô mặt các đĩa thạch bằng cách đặt chúng vào trong tủ ấm 15

phút trước khi đặt giấy thắm hợp chất chết xuất từ địay

~ Các khoanh giấy thắm chứa I mg hợp chất chiết xuất từ địa y được đặt lên mặt

đũa có ừ 1 đến 3 khoanh giấy); các đa thạch sau đó được lật ngược và

35 + 2°C tong ving 16 18 gi

+ Sau kh ee dia thgch duge ly ra kh tm, hot tinh king khuin duge

xác định bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn tại các vị tí tương ứng của khoanh

giấy (dùng thước đo từ mặt sau của đĩa và không được mở nắp)

“Thí nghiệm sử dụng mẫu đối chứng âm là DMSO.

CHUONG 3 KET QUA VA'THAO LUAN 3.1 Két qua phân lập nắm cộng sinh địa y Nigrovothelium tropicum Sau khi chuyển bảo từ lên đĩa môi trường MYA, i 6 18°C trong 2 twin, Khun

lạc nắm xuất biện có hình dạng chấm nhỏ màu trắng sữa, kích thước đường kính

khoảng I - 2 mm (Hinh 3.1)

"ea,

Hinh 3.1 Khudn ge N tropicum sau 2 twin nudi chy

‘Sau 8 tudn, khuẩn lạc nắm phát triển thành bán cầu lồi lên khỏi bề mặt thạch,

cđường kính khoảng 0,7 cm, màu vàng nhạt Trên b mặt khuẩn lạc xuất hiện các lông

toting, xen ke gta cic to là những giạt địch chiết ỉ màu nâu (Hình 3.2)

Saud sinh trưởng trong môi trường MY 10, khuẩn lạc nắm A: iropicum đã \ tropicum ở môi trường M0

bám chặt vào thạch, lồi lên trên bền mặt môi trường; vỏ nắm có màu nâu đền nâu đen,

viễn bao quanh màu trắng, đường kính khoảng 1,1 em; các giọt dịch chiết đã xuất

hiện nhưng ít và nhỏ, rất khó quan sát Đến tudn thir 6, duémg kính nắm tăng lên 1,3

~ 1.4 em; các sợi nắm mầu trắng xuất hiện, bao phú toàn bộ bề mặt khuẩn lạc, giọt địch chiết màu vàng đến nâu nhạt xuất hiện nhiều hơn, to hơn và đễ quan sắt hơn Ở

tơ xuất hiện vào hai tuin trước bắt đầu giả đi, giọt chiết cũng có màu nâu đen, trần ra

mi trường xung quanh

`" MYIO4 mẫn MYI0 6 tuần MYIO8 tin

MYI0 10 tuin MYIO 12 twin

Hình 3.3 Kết quả nuôi ndm N, /røpicưm trên môi trang MY10

Soi ndm đến tuần thứ 10 có thể quan sát rõ rằng rên vỏ nắm, dịch chiết màu đẹn

hiết ra ngoài môi trường nhiều hơn; lúc này đường kính khuẩn lạc không có thay đổi

lớn Ở tuần thứ 12, các sợi nắm to lên, mọc đây đặc trên võ khuẫn lạc, giọt chiết có

màu nâu đến đen; đường kính khuẩn lạc nằm trong khoảng 2,0 ~ 2,2 em

313.3 Kết quà muôi cấy nấ

‘rong 4 tuần đầu sinh trường trên môi trường S4, khuẩn ạc nắm A: /rupieum có

đường kính khoảng 1,5 cm; có nhiều lông màu nâu bao phủ khắp bé mt khuẩn lạc;

iot chiết đã xuất hiện, mang mẫu nâu đến nâu sim Đến tuần thứ 6, khuẩn lạc chuyển

sang màu nâu đen, đường kính hầu như không thay đôi; giọt chiết cũng chuyển màu

nâu đen, có thé quan sit bing mắt thường: môi trường SB quanh khuẩn lạc bắt đầu

đổi sang mẫu vàng sẵm, khác với môi trường vàng nhạt ban đầu Ở tuằn thứ 8, bề mặt