2.1 Nội dung nghiên cứu
Phân lập nam Trichoderma spp. từ đất trồng và định danh dựa vào đặc điểm hình
thái bảo tử, cụm bào tử, cành sinh bảo tử của chúng.
Đánh giá khả năng đối kháng của nam Trichoderma spp. đối với các nam gây bệnh lở cô rễ trên cây họ cà trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới.
2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 5/2023 đến tháng 11/2023
Địa điểm: Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm bệnh cây khoa Nông học Trường Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh.
2.3 Đối tượng và vật liệu, dụng cụ nghiên cứu 2.3.1 Đối tượng nghiên cứu
Các mẫu đất trồng cây họ cà.
Nam bệnh Rhizoctonia bicornis chủng ODT02, Fusarium oxysporum chủng KTDT22, Pythium vexans ching KTDT22, được cung cấp bởi phòng thí nghiệm tại Bộ môn Bảo vệ Thực vật, khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí
Minh.
2.3.2 Vật liệu và dụng cụ thí nghiệm
Mẫu đất được thu thập tại các tinh Lâm Đồng, Bình Dương và Tây Ninh dé phân lập nam Trichoderma spp.
Nguồn nam bệnh Rhizoctonia bicornis chủng ODT02, Fusarium oxyporum ching KTDT22, Pythium vexans chủng KTDT22, được cung cấp bởi phòng thí nghiệm tại Bộ môn Bảo vệ Thực vật, khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh.
Hình 2.1 Mẫu Rhizoctonia bicornis chủng ODT02 (A), Fusarium oxysporum
KTDT0I (B), Pythium vexans KTDT22 (C)
Hạt giống cà chua F1(311) của Công ty TNHH Đại Địa.
Thiết bị sử dụng: Tủ cấy, nồi hấp khử trùng, cân điện tử (PX224, Ohaus, Mỹ), tủ cay khử trùng (2AC2 - 6E8, Esco, Singapore), tủ say (MC40L, ALP, Japan), tủ hap, tủ định ôn, lò vi sóng, bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, kính hiển vi (CX23, Olympus, Japan), micropipette, ống đong, đèn côn.
Hóa chất:
Môi trường PGA (Potato — Glucose — Agar). Thành phan môi trường: Khoai tây (200 g), Agar (20 g), Đường Glucose CứHzOs.HzO (20 g), Nước cat (1000 ml). Hap
khử trùng ở 121°C trong 20 phút.
Môi trường PDA (Potato — Dextrose — Agar). Thành phan môi trường: Khoai tây 200g), Agar (20g), Đường Dextrose CứeHzOs.HaO (20g), Nước cat (1000 ml). Hap khử
trùng ở mức 20 phút.
Môi trường WA (Water Agar medium). Thanh phan: Nước cat (1000 ml), Agar (20 g). Phương pháp điều chế: Hap khử tring ở mức 121°C, 1 atm, trong 20 phút.
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp thu mẫu, phân lập và định danh nấm Trichoderma spp.
2.4.1.1 Phương pháp thu thập mẫu dat
Thu thập mẫu đất tại các tỉnh Bình Dương, Lâm Đồng, Tây Ninh chọn các khu
19
trồng cây họ cà lâu năm không sử dụng thuốc hóa học và không sử dụng các chế phẩm nao có chứa nam Trichoderma spp.. Tại mỗi khu trồng cây họ cà lấy 5 điểm gồm 4 góc và giữa vườn. Tại các điểm lấy mẫu, lấy mẫu đất quanh vùng rễ cây trồng và không tập trung vào một điểm duy nhất. Lay 200 g/vi trí đất từ mặt đất đến độ sâu 20 — 25 cm, sau đó tiễn hành trộn các mẫu đất đã lấy vào nhau và lay đại điện 200 g/vườn thu mẫu. Mẫu đất nên được giữ trong túi nilon và ghi chép chỉ tiết thông tin vùng cây trồng, số lượng mẫu, điểm lay mẫu (Roger Shivas va Dean Beasley, 2005).
Quy ước đặt tên mẫu đất: T — số thứ tự mẫu đất, trong đó T là Trichoderma.
Bảng 2.1 Mẫu đất thu thập trên các ruộng rau
STT Tên mẫu Địa điểm thu mẫu Tọa độ
1 TT, 12 Đạ Sar, Đà Lạt, Lâm Đồng 12°00'04.5"N 108°30'18.0"E 2 13, 14 Đạ Sar, Đà Lạt, Lâm Đồng 12°00'06.1"N 108°30'20.8"E 3 15, T6 Da Sar, Da Lat, Lam Đồng 12°00'05.6"N 108°30'21.3"E
4 T7, T8 Phước Sang, Phu Giáo, Binh 11°21'19.8"N 106°45'47.8"E Duong
5 T9, T10 Phước Sang, Phú Giáo, Binh 11°21'41.0"N 106°45'18.8"E Dương
6 TII Phước Sang, Phú Giáo, Bình 11°21'56.4"N 106°45'01.1"E Dương
ei T12 Long Mỹ, Long Thanh Bắc, Tây 11°17'25.5"N 106°08'31.6"E
Ninh
8 T13,T14 Long My, Long Thanh Bac, Tay 11°17'25.3"N 106°08'23.6"E
Ninh
9 T15 Long Mỹ, Long Thanh Bắc, Tây 11°17'37.1"N 106°08'28.5"E
Ninh
2.4.1.2 Phương pháp phân lập nắm Trichoderma spp. từ mẫu dat
Nắm được phân lập từ đất bằng phương pháp đặt bẫy dùng giấy lọc của Soytong và Quimio (1989). Các mẫu đất được phơi khô và ghiền nhỏ, sau đó đất nghiền được cho vào đĩa petri đường kính 8 cm với lượng khoảng 2/3 đĩa, đất được làm âm bằng nước cất vô trùng. Các mảnh giấy lọc vô trùng, kích thước 1 x 1 cm? được đặt trên bề mặt đất trong đĩa petri. Các đĩa petri đựng mẫu đất được ủ trong tủ ôn ở điều kiện 28°C và hàng ngày kiểm tra sự hình thành sợi nắm trên bẫy giấy. Khi sợi nắm xuất hiện thì chuyển lên môi trường WA có bổ sung kháng sinh ampicillin (100 mg/l) và streptomycin, sau đó tiếp tục cấy truyền lên môi trường PDA đề làm thuần.
Lưu giữ nguồn bang cách cấy sợi nam Trichoderma spp. vào ông thạch nghiêng
chứa môi trường PGA.
2.4.1.3 Định danh nam Trichoderma spp. dựa vào đặc điểm hình thái
Dựa trên cở sở của thí nghiệm khảo sát đặc điểm sinh học ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của nam 7zichoderma spp. và các đặc điểm hình thái nam
Trichoderma spp. (Chiristian và Harman, (1998); Samuels va Hebbar, (2015)) đã mô tả:
Hình thai, màu sac tan nam trên môi trường PDA
Hình dang cành sinh bào tử: Canh sinh bao tử của nam Trichoderma là một nhóm sợi bén vào nhau, cành sinh bao tử không màu, mọc lên từ những cum doc theo sợi nam.
Trên cành sinh bao tử có đính các thé bình là những tế bào hình to có dạng bình thót cô, mọc theo cụm hoặc mọc riêng lẻ tùy loài, trên đầu thê bình có đính bào tử.
Hình dạng thé bình: Thẻ bình có thé mọc đơn lẻ hoặc mọc theo cụm 2 — 4 cái/cụm, trên các thé bình có các bào tử.
Hình dạng, màu sắc bào tử: bào tử màu xanh, có nhiều dạng khác nhau, có khi hình tròn, hình cầu, hình trứng, hình elip, một số loại lại có hình chữ nhật.
Hình dạng bào tử hậu: Hình cầu, bán cầu hoặc hình trứng.
Nam được quan sát hình thái, màu sắc tan nam, bao tử nam, hình dạng cành sinh
bao tử, thé bình, cách mọc trên môi trường PDA. Bào tử của nắm Trichoderma spp. là
một khôi tròn mọc lên ở dau cuôi của cuông, sinh bao tử và phân nhiêu nhánh, bào tử
21
có màu xanh lục đặc trưng, một số Ít có màu trắng, chủ yếu hình cầu, hình ellip hoặc oval. Dưới kính hiển vi ở vật kính 40X, quan sát các loại bào tử, thé bình, đo ngẫu nhiên bào tử và thể bình ở mỗi loại theo kích thước chiều dài và chiều rộng. Từ đó tính được sự biến động chiều, chiều rộng và kích thước trung bình của bảo tử và thể bình. Kích
thước bảo tử được tính theo công thức:
l= all x Ẻ x 1000
10076 (um)
Trong đó:
1: Kích thước bảo tử (um)
L: Số vạch đọc được trên kính
G: độ phóng đại của vật kính đang quan sát (10X, 40X, 100X)
2.4.2 Phương pháp đánh giá tính đối kháng trong điều kiện phòng thí nghiệm và trong điều kiện nhà lưới.
2.4.2.1 Phương pháp đánh giá tính đối kháng trong điều kiện phòng thí nghiệm Các thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng được tiến hành theo phương pháp
của Soytong, 1988.
Chuẩn bị đĩa petri chứa môi trường thạch PDA, tiễn hành cấy đối xứng qua tâm 2 loại nam Trichoderma spp. và nam gây bệnh lở cô rễ (Rhizoctonia bicornis, Fusarium oxysporum, Pythium vexans) trên bề mặt môi trường trong dia petri 8em. Dùng khoan thạch hình trụ có đường kính 5 mm, vô trùng, khoan lay mot phan thạch ở ria tan nắm
Trichoderma spp. va đặt vào dia petri (đường kính 8c m) chứa môi trường PDA, khoảng
cách đặt khoanh thạch và mép đĩa là 1,5 cm. Sau ngày nuôi cấy tiễn hành cấy khoanh tản sợi nắm bệnh đối xứng vào trong đĩa petri. Tiến hành nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ
từ 28 — 30°C.
Thí nghiệm được tiến hành theo 3 NT;
+ 1: Nam Trichoderma spp.
+ 2: Nam Trichoderma spp. va nam gây bệnh lở cô rễ (Rhizoctonia bicornis,
Fusarium oxysporum, Pythium vexans)
+ 3: Nam gây bệnh lở cô rễ (Rhizoctonia bicornis, Fusarium oxysporum,
Pythium vexans)
Thí nghiệm được bố tri theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tô với 3 lần lặp lại mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri.
Tricoderma Nắm gây bệnh
Hình 2.2 Bồ trí thí nghiệm đồng nuôi cay Trichoderma với nam gây bệnh
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Theo dõi sự phát triển của đường kính của nắm đối kháng, nam gây bệnh và sự lan at nhau của chúng bằng cách đo đường kính vùng nam phát triển.
Chỉ tiêu theo dõi: Do bán kính trung bình theo công thúc:
R= (dị + d2)/2
Trong đó :
dị: bán kính từ tâm gây bệnh nghiên góc 45° về phía trên nắm đối kháng do: bán kính từ tâm đối xứng nắm gây bệnh về phía tâm nắm đối kháng
Công thức tính hiệu quá ức chế trong phòng thí nghiệm ký hiệu PIRG
PIRG (Percent Inhibition of Radical Growth) = (R1 - R2)/R1 x 100.
23
Trong đó:
+ PIRG: Hiệu suất đối kháng
+ R1: Là bán kính phát triển tan nắm của nam gây bệnh cấy đối chứng.
+R2: Là bán kính phát triển của tan nắm gây bệnh khi cấy với đối kháng.
Hoạt tính đối kháng quy ước và theo dõi quá trình đối kháng, cách thức tấn công
của nam 7?ichoderma spp. lên nam gây bệnh.
+ Hiệu suất đối kháng rất cao: Soi nam và bào tử của nấm Trichoderma sinh trưởng va phát triển trên bề mặt của các loại nam gây bệnh (Rhizoctonia bicornis, Fusarium oxysporum, Pythium vexans) hoặc sợi nam và bào tử của nam Trichoderma phát triển bao quanh các loại nắm bệnh hình thành bào tử ngay ria soi nam bénh, ngan can sự phat triển của chúng (PIRG > 75%).
+ Hoạt suất đối kháng cao: Soi nam Trichoderma sinh trưởng và phát triển trên bề mặt của các loại nam bệnh (Rhizoctonia bicornis, Fusarium oxysporum, Pythium
vexans), hoặc nam Trichoderma phát triên bao quanh các loại nam bệnh hình thành bào
tử ngay ria sợi nắm bệnh, ngăn cản sự phát triển của chúng (PIRG: 61 - 75%).
+ Hiệu suất đối kháng trung bình: Soi nam Trichoderma phát triển qua giữa đĩa, tạo thành hàng rao ngăn can sự phát triển của các loại nắm bệnh (Rhizoctonia bicornis, Fusarium oxysporum, Pythium vexans) nhưng không tác động đến các loại nam gây hại
(PIRG: 50 - 60%).
+ Hiệu suất đối kháng kém: Sợi nam Trichoderma và các loại nam gây hại (Rhizoctonia bicornis, Fusarium oxysporum, Pythium vexans) phát triển đều nhau và
không có sự chênh lệch cao (PIRG < 50%).
2.4.2.2 Phương pháp đánh giá đối kháng trong điều kiện nhà lưới
Từ kết quả đánh giá khả năng đối kháng của Trichoderma spp. trong điều kiện phòng thí nghiệm đối với nam gây hai (Rhizoctonia bicornis, Fusarium oxysporum, Pythium vexans), chọn 2 dong Trichoderma spp. có hiệu suất đối kháng cao nhất dé thực hiện thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng trong điều kiện nhà lưới (chon dong nam đối kháng có hiệu suất đối kháng cao nhất với 2 dòng trong 3 dòng nắm gây hại). Cây
trồng được chọn đề đánh giá khả năng đối kháng là cây cà chua.
Thí nghiệm được tiến hành trong khay hình chữ nhật (13 x 12 x 10 em) với giá thé là hỗn hợp đất : tro trau : xo đừa : phân bò theo tỷ lệ I1 : 1 : 1 : 1. Hỗn hợp đất được hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C trong 20 phút trước khi sử dụng.
Hạt giống cà chua được ươm trồng và chăm sóc cho đến khi cây nảy mầm có thể tién hành mang đi thí nghiệm.
Phương pháp thực hiện
Hai chủng nam Trichoderma đôi kháng mạnh nhất trong phòng thí nghiệm được nuôi cấy trên môi trường PDA khoảng 7 ngày. Cho 10 mL nước cất thanh trùng vào từng đĩa petri, dùng lam kính sạch cạo nhẹ phần sợi nam, lọc qua vải lọc đã thanh trùng, thu được huyền phù bao tử nam. Mật số bào tử nắm được dém trên buồng đếm bao tử và điều chỉnh đến mật số 105 bảo tử/mL.
Tiến hành lây nhiễm và xử lý chế phẩm
Pha dịch bào tử: cho 5 mL nước cat đã thanh trùng vào đĩa petri có chứa nam (đã hình thành bào tử) nuôi cấy trên môi trường PDA, dùng lam kính cao đi lớp sợi nắm sau đó loc lấy dịch huyền phù bao tử điều chỉnh mật số bào tử đến nồng độ 10° bào tử/mL bằng buồng đếm hồng cầu.
Công thức tính số bào tử
A =(400 x ax 10 x 10°)/b
Trong do:
a: Số lượng bào tử đếm trong 16 6 lớn b: số ô con trong 16 ô lớn = 400 ô n: nồng độ pha loãng của dịch bảo tử 10 : hằng số
Tiến hành xử lý nam:
+ Đối với NT có xử lí nấm đối kháng: Tưới 20 mL dịch huyền phù bào tử nam/chau mật độ 10° bào tử/mL ở thời điểm 7 ngày trước khi gieo hạt
2)
+ Đối với NT có xử lí nắm bệnh: Mầm bệnh được cây trực tiếp giá thể tự nhiên vỏ trâu và hạt kê (tỉ lệ 1 : 1), tiến hành nhân sinh khối khoảng 18 — 21 ngày và sau đó bón trực tiếp vào đất trồng.
+ Đối với NT có xử lý chế phẩm sinh học: Pha nước cất đã thanh trùng với chế phẩm sinh học theo các nồng độ đã quy định sẵn ứng với từng nghiêm thức tưới vào chậu ở thời điểm 7 ngày trước khi gieo hạt.
+ Đối với NT có xử lý nắm đối kháng và nắm bệnh: Tưới 20 mL dịch huyền phù bao tử nam đối kháng/chậu mật độ 10° bào tử/mL ở thời điểm 7 ngày trước khi gieo hạt, sau đó cây sinh trưởng đến lúc đạt 2 lá mầm bắt đầu cấy nắm bệnh trực tiếp đã qua xử lý bằng vỏ trau và hạt kê trước đó vào bề mặt đất với tỉ lệ 60 gam nắm bệnh/chậu 500 gam đất.
Bồ trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bồ trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 9 nghiệm thức (NT), mỗi NT
là 10 chậu cà chua và 1 NT là 3 LLL.
+ NTI: Nam Trichoderma | và hỗn hợp (R. bicornis + F. oxysporum + P. vexans) + NT2: Nam Trichoderma 2 va hỗn hợp (R. bicornis + F. oxysporum + P. vexans) + NT3: Nắm Trichoderma 1, Trichoderma 2 và hỗn hop (R. bicornis + F.
oxysporum + P. vexans)
+ NT4: Hỗn hợp 3 loại nam (R. bicornis + F. oxysporum + P. vexans) + NTS: Nam Trichoderma |
+ NT6: Nam Trichoderma 2
+ NT7: Nam Trichoderma 1 va Nam Trichoderma 2
+ NT8: H20
+ NT9: Chế phẩm sinh học HLC Trichoderma va (R. bicornis + F. oxysporum +
P. vexans)
Thi nghiệm được tiến hành khi cà chua có dấu hiệu bị bệnh sau khi NSCB
Chỉ tiêu theo dõi
Quan sát mỗi ngày, theo dõi tỉ lệ bệnh ở thời điểm nghiệm thức đối chứng xuất hiện bệnh đầu tiên, theo dõi tỉ lệ bệnh và chỉ số bệnh ở các thời điểm 9, và 21 ngày sau xử lý nam, tính hiệu lực tròng trừ (HLPT) tai thời điểm 9, 12, 15, 18 NSCB. Đánh giá chỉ số thôi rễ được ghi lại theo thang điểm 1 — 4, có điều chỉnh của Hwang va Chang (1989),
như sau: 1 = 1 — 10%, 2 = 11 - 25%, 3 = 26 — 50% và 4 = 51 — 100% (cây héo).
Công thức tinh (theo QCVN 01 — 160: 2014/BNNPTNT):
Phương pháp tính toán và xử lí:
Tỷ lệ bệnh (%) = (A/B) x 100
Trong đó: A là số cây bị bệnh nhiễm lở cổ rễ B là Tổng số cây điều tra
Hiệu lực phòng trừ(%) = [(D — C)/D] x 100
Trong đó: D là số cây nhiễm bệnh ở nghiệm thức đối chứng C là số cây nhiễm bệnh ở nghiệm thức thí nghiệm
Chỉ số thối rễ = [(1 x Ci+2 x Ca+ 3x Cạ+ 4x C¿)/(ẹx4)] x 100
Trong đó:
N: là tổng số cây theo dõi
Ci: Số cây bị bệnh ở cấp 1 với 1 — 10% diện tích rễ (cổ rễ) bị bệnh Co: Số cây bị bệnh ở cấp 2 với 11 — 25% diện tích rễ (cổ rễ) bị bệnh C3: Số cây bị bệnh ở cấp 3 với 26 — 50% diện tích rễ (cô rễ) bị bệnh C4: Số cây bị bệnh ở cấp 4 với 51 — 100% biến màu rễ (cây héo)
+ Chiều cao cây: Do từ mặt đất đến đỉnh ngọn cao nhất ở thời điểm 18 NSCB + Chiều dai rễ: Do từ gốc của cây đến đỉnh của rễ thời điểm 18 NSCB
2.5 Xử lý số liệu
Các số liệu thu thập được tính toán bằng phần mềm Microsoft Excel 2010.
Phân tích ANOVA và trắc nghiệm phân hạng bằng phần mềm SAS 9.1
27
Chương 3