Khóa luận tốt nghiệp Bảo vệ thực vật: Phân lập và định danh nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên ớt tại tỉnh Tiền Giang

gây bệnh than thư trên ớttại tỉnh Tiền Giang” được thực hiện tại phòng Bệnh học Thực vật, Viện Nghiên cứuCông nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại hoc Nông Lâm thành phó Hồ Chí Minh.T

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HÒ CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

3K A 2K 26 2K 2K OK

KHOA LUAN TOT NGHIEP

PHAN LAP VA DINH DANH NAM Colletotrichum spp.

GAY BENH THAN THU TREN OT

TAI TINH TIEN GIANG

NGANH : BAO VE THUC VATNIEN KHOA : 2019 — 2023

SINH VIÊN THUC HIỆN : TRUONG CONG MINH

Tp Hồ Chí Minh, thang 02 năm 2024

PHAN LẬP VÀ ĐỊNH DANH NAM Colletotrichum spp.

GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN ỚT

TAI TINH TIEN GIANG

Tac gia

TRUONG CONG MINH

Khóa luận được đệ trình dé đáp ứng yêu cầucấp bằng kỹ sư ngành Bảo vệ Thực vật

HỘI DONG HƯỚNG DANPGS TS NGUYEN NGỌC BẢO CHA!

PGS TS NGUYEN BAO QUOC 7")

{ ee’

Tp Hồ Chi Minh, thang 02 năm 2024

LỜI CẢM ƠN

Con xin khắc ghi công ơn to lớn đã sinh thành, dưỡng dục của cha mẹ Cảm ơncha mẹ và những người thân trong gia đình đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con, lànguồn động lực dé cho con có thé vượt qua mọi khó khăn, vấp ngã và có được như ngày

hôm nay.

Tôi xin gửi những lời kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc nhất đến quý thầy côkhoa Nông học - Trường Dai học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh đã tận tình truyềnđạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu, luôn tạo điều kiện quan tâm, giúp đỡ vàrèn luyện trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong quá trình thực hiện khoáluận.

Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS TS Nguyễn Bảo Quốc vàPGS TS Nguyễn Ngọc Bảo Châu cùng với đó là KS Nguyễn Thị Phụng Kiều đã tậntình hướng dẫn, truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn và nhiều kinh nghiệmquý báu trong suốt quá trình thực hiện khoá luận

Bên cạnh đó tôi không quên gửi lời cảm ơn đến anh Nguyễn Mai Nghiệp, cácanh chị và các bạn tại phòng thí nghiệm Bệnh học và Chuan đoán thuộc bộ môn Côngnghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã luôn hỗ trợ vàgiúp đỡ tôi hoàn hoàn thành khoá luận.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thé lớp DH19BV đã cùng tôi đồng hành,gắn bó trong suốt 4 năm học tập và nghiên cứu ở trường Đại học Nông Lâm Thành phố

Hồ Chí Minh

Tran trọng cảm on !

Thanh phố Hồ Chi Minh, ngày 19 tháng 02 năm 2024

Sinh viên thực hiện

Trương Công Minh

TÓM TẮT

Đề tài “Phân lập và định danh nam Colletotrichum spp gây bệnh than thư trên ớttại tỉnh Tiền Giang” được thực hiện tại phòng Bệnh học Thực vật, Viện Nghiên cứuCông nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại hoc Nông Lâm thành phó Hồ Chí Minh.Thu thập và phân lập mẫu bệnh thán thư dựa vào triệu chứng gây hại trên quả của haigiống ớt chỉ thiên và ớt sừng vàng Châu Phi tại tỉnh Tiền Giang Các mẫu nấmColletotrichum được định danh cấp độ loài bằng hình thái học và kỹ thuật phân tử trên

ba vùng gen ITS, TUB2, Apmat Đánh giá khả năng gây bệnh của nam Colletotrichumspp đối với giống ớt chỉ thiên bằng cách lây nhiễm nhân tạo trong điều kiện phòng thínghiệm trên quả.

Thu thập được 30 mẫu bệnh thán thư trên cây Ot, mẫu phân lập được có đặc điểm

hình thái đặc trưng của chi Colletotrichum spp Các mẫu phân lập sau đó được phân ra

thành 4 nhóm với các đặc trưng khác nhau về đặc điểm hình thái tan nam

Kết quả định danh cấp độ loài bằng đặc diém hình thái học xác định 3 nhóm hìnhthái Qua định danh cấp độ loài bằng kỹ thuật phân tử xác định sản phẩm của phản ứngPCR của ba vùng gen ITS, Ø- tubulin và Apmat lần lượt có kích thước như sau: 590 bp,

550 bp và 910 bp Vùng gen ITS có kích thước 590 bp được giải trình tự gen được so

sánh với các mẫu trên ngân hàng gen Genbank đề định danh đến loài các mẫu bệnh xácđịnh 2 mẫu phân lập là loài Colletotrichum scovillei có độ tương đồng từ 98% với cácmẫu trên ngân hàng Genbank, có nguồn góc phân lập từ quả ớt và 2 mẫu nam còn lại làđều có độ tương đồng trình tự cao 95 % với các loài thuộc phức hợp loài Colletotrichum

gloeosporioides.

Đánh giá về đặc điểm hình thái chia thành 4 nhóm Kiểm tra khả năng gây bệnhcủa 4 nhóm nam Colletotrichum spp lên quả ớt chỉ thiên Hai mũi tên đỏ cho thay tất cảcác mau nam đều có khả năng gây bệnh, tuy nhiên có sự khác nhau về tỷ lệ bệnh va chỉ

số bệnh giữa các nghiệm thức Ty lệ bệnh dao động từ 31,493 — 77,24% và 19,923 —32,56% đối với chỉ số bệnh Điều này cho thấy, mặc dù cùng loài nhưng giữa các mẫu

nâm vân có sự khác biệt đáng kê.

MỤC LỤC

Wane TH can ng ngon gia Tu HH go nm masses mannan eames ene aA ORS i

CC Tao dkeniibbiisidrdtiinhiaigirniadtianiggigtnigtidadifgiadsGiSistodiGgdassgiind iii

MUC LUG wes seussnesscensnsneesnan sins nsenciseensnonecerese sea rasneseannueunanccansomsensrexenmencenmensneasisess iv

Pe aie ||| y1 viiiDANH SÁCH CÁC BANG ssvicscoseussussreunsarctane suamervaeareunneranernananuseerimanrrenenernuacmnreenree x

| Tag na gggauhgdatridtsogriSitordBidtgtfiingtfGiEiretdstutascidrgrnsgigioutdtrosrgiSvgdrdSe |Đặt vấn đề - + s1 2121121121111 211211112121111212211212111 2122112122111 re 1

IMG TOUS BET GỮ caeeenaenoessessisggeiEbEESESSRGGESSSGGSHGSSESSG09599998SE2NNĐ7S313.0.B-DUSG191-J008/.08120551000 0085 2

Ct ThusestsstsvienrtssntsntgginsBtiepioElsispiGiygizplisifsntoigttpgftorgrsifiptiiissrtetgiggdtsgglotstssrjositrsitiEib 2Giới hạn đề tài 5+ 222225 212121221211212112112121121121212112121211211121121012112101222 2e 2

CHUONG 91 3

hes a 3

RL | i 3M030 ašäằ5°<°31 3I0 840 4 3WaT Bei in mg Wane VỗÏlbeeeesoeednetenrinebecitttongs36i2499010400000564001080008/0)0060646101E.0 xi 4[1X EẾc tinh errr oreo 51.1.5 Gia tri dinh dưởng và công dụng CUA Ớt 5 Sư ng 5

1.2 Téng quan vé nam 22//272/7:7/77,.80 8 nPRMc 6

1.2.1 Phần loại khoa HQGiisceacteecsaiiecgib ii sicg ho pecs saw sensqinus cose ceimusameus tomas sy pavenste tverenis pamneran wavered 61.2.2 Phân bố ký CHU o cccccccscccsessessessessessessessecsessessessessessessessesseesessessessessessessessesseeseeeeess 6

155 ịk ck cau nh hhthHhHgHh hghogigH0NG108-G)ảgEdĐigiinEudboddEggiiochinmdidaoEmuổ 71:24 Dac tinh sink hoe-wal Stal Hi ssscsssssssenseseiotendsicudstitoynkidEsigil9NSEISBUGGHSSIGB/GU20E4Ei8ti38EngiG00000ni585 7 12.4.1 Dae tinhisinh HỢC sssesssacceceeencassaeensdeneexaastezeeuaseaeeaesinevaxseiaaeen as 34582385338 mada 4883535408558 Ỷ

1.2.4.2 Dae ttn SINH KHẢ ¡s68 axoxaexe gi ng ng gS68011616441361554843516493ã33843554882838358348XAS8858388435.4588 8

1.2.5 Nghiên cứu về các loài nam Colletotrichum spp gây bệnh than thu trên ot 91.2.5.1 Nghiên cứu về nam Colletotrichum gloeosporioides -2:©2+55z5sz5sz5s2 91.2.5.2 Nghiên cứu về nắm Colletotrichum đCHE@fMI -. ©2+©22©52552+2+2222s+>s25522 101.2.5.3 Nghiên cứu về nam Colletotrichum IFMWHCAfHH -. -55-©52©52255225s255225+z5+2 111.2.6 Dac dim gay Wai 0 iâ445 ẢẢẢẢ 12

1.2.7 Quá.trình phat sinh bệnh 62262121622 S002 n0 d1, có A00 46.040140Hgcr 131.2.8 Giới thiệu về chỉ thi DNA và vùng gen ITS 2 2-cz2ccxcrxecrecrerree 151.2.8.1 Tổng quan về chỉ thị DNA 2-22 ©2222222E22E22EE22E22EE2232221273222222122222xe 15

1.2.8.2 Vùng trong được sao mã (Internal Transcribed đệm Spacer - [TS) 17 1.2.9 Các phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại - - - 18

MT TIEIT VÀ PHƯƠNG PAP INGEN (0 saisssnscaxsinsowsnncansasccunanaarensacasaansnice 202.1 Nội dung nghiên cứu đề tài ¿22-522 22222S22222EE22E222122122212212221221 21222 202.2 Thoi gian i0 0 -:+44 202.3 Đối tượng Va, Vat liệu HOMISH CU sassstisesisisssatiiSigttiglg19SSESSSSSGSAESGEEEISGSSESIHDEGSSHESSSIS08g8 202.3.1 Đối tượng nghiên COU cece cee ccseseeesecsecseessesessesesstsnesssessessessessessnsseseesseeseeees 2022,352, Vat LOU AEMICH CU secre scarsancnenyenes series semaine seasuunecsa anennemcarueenaresvonsemmensruaness 20 2.4 Phuong phap nghién 00000022 212.4.1 Phương Pháp thu thập mau bệnh than thư trên ớt 2- ¿22 225z+s+=+zs2 212.4.2 Phương pháp phân lập va làm thuần nam Colletotrichum spp từ mau bénh 222.4.2.1 Phương pháp chuẩn bị một số môi trường cho quá trình phân lập 222.4.2.2 Phương pháp phân lập và làm thuần nắm Colletotrichum Spp . - 222.4.3 Định danh hình thái các chủng nam Colletotrichum spp gây bệnh than thư trên ớt

DI RUN Luổ: TH | he ea 37Đối với cặp mồi -tubulin và ApMat 0.0cccccccccccccsccsessessecseesessessessessessessessesseeseeseeees 373.3 Đánh giá kha năng gây bệnh của nấm Colletotrichum Spp .-. -5 - 42KET LUẬN VÀ DE NGHỊ, -2- 222 +S2EE2E2EE2121121212112121211211111111 112111 xe 46

a 52

DANH SÁCH CHU VIET TAT

Cs : Cộng sự

Ctv :Cộng tác viên

DNA :Deoxyribonucleic acid

ITS ‘Internal Transcribed spacer

EL : Lan lặp lại

NCBI :National Center for Biotechnology Information

NSC : Ngày sau cay

PCI : Phenol Chloroform Isoamyl

PCR : Polymerase Chain Reaction

PDA : Potato Dextro Agar

rDNA : Ribosome deoxyribonucleic acid

WA :Water Agar

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 bản đồ phân bố của nắm colletotrichum spp.trên thới gới . - 6Hình 1.2 hình thái của các chủng nam colletotrichum khi được cây trên dia petri quanBẵI tưới eth Te VŨ nguuagggtgt nghgiog cet te es mre 7Hình 1.3 Triệu chứng đặc trưng của bệnh than thư gây hai ớt cây trên đồng rudng 14Hình 1.4 Vòng đời của Colletotrichum SpỤ - -5-55-552<S2<S2<S+<ssccseeseeeersrree 15Hình 2.1 Phân cấp chỉ số bệnh thán thư trên ớt (Theo QCVN 01-160:2014/BNNPTNT)

ee 28

Hình 3.1 Triệu chứng bệnh than thư trên Ot - 5 ++++2*£++eE++eeezeeezeeeses 29

Hình 3.2 Phân lập Sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA -2- 32Hình 3.3 Đặc điểm hình thái của các mẫu nắm nhóm I -+-+5 33Hình 3.4 Đặc điểm hình thái của các mẫu nắm nhóm ÏI - 2 2 s+=z£szszzzzsz2 34Hình 3.5 Đặc điểm hình thái của các mẫu nắm nhóm III - 35Hình 3.6 Đặc điểm hình thái của các mẫu nắm nhóm I'V -2- 2 s+s+=zszzxzz+ 36

Hình 3.7: (A) Kết qua điện di tong số, (B) Kết quả điện di DNA bằng cặp mỗi ITSđối với bon mẫu nam Colletotrichum spp ( M: Ladder 1 Kb, (-): Đối chứng ,1: TH3.1,

we Se eee NIP TT re 37Hình 3.8: (A) Kết quả điện di DNA bang cặp mồi B-tubulin, (B) Kết qua điện diDNA bằng cặp moi ApMat đối với các mẫu nắm Colletotrichum spp ( M: Ladder 1

Kb, (-): Đối chứng ,1: TH3.1, 2: TTB2.1, 3: TT3.3, 4: MPT2.2) -+- 37Hình 3.10 Cây phat sinh loài dựa trên môi ITS của bốn mẫu nắm TH3.1,TTB2.1,TT3.3

và MPT2.2 phân lập với một số mẫu trên ngân hang Gen Các giá tri bootstrap sau 1000lần lặp lại là thé hiện dưới dạng phan trăm 2-2 22222222E++2E2Ezz2xzzzzzzxzex 39Hình 3.11 Kết quả giải trình tự gene mẫu TH3.1 được so sánh với các chủng trên cơ sở

dữ Genbank bằng công cụ Blast -2 22222 222222E22212221222122212211223122322222 222 ee 39

Hình 3.12 Kết quả giải trình tự gene mẫu TTB2.1 được so sánh với các chủng trên cơ

sở dit Genbank bằng công cu Blast - 2-2252 22222222122E222122322212212211221 2122 40Hình 3.13 Kết quả giải trình tự gene mẫu TT3.3 được so sánh với các chủng trên cơ sở

at Genbarilt bằng cũng cụ HE se coseesoeksiesdobitiGu200GllnyEHGA00384660060000450053/40010/03g0/08 006 40Hình 3.14 Kết quả giải trình tự gene mẫu MPT2.2 được so sánh với các chủng trên cơ

sở dit Genbank bằng công cụ Blast -2+5252 S22 S222E2E 22x 2E2Errrkerrerrrreg 403.3 Đánh giá khả năng gây bệnh của nắm Colletotrichum Spp - 42Hình 3.13 Triệu chứng bệnh do nam Colletotrichum spp sau 6 ngày trên quả ớt chỉ

thiểm ELA TO TÊH/HÔoesrceoasnotetiitiatottS3guiBUGGESAGEGIENHGBUGEESGRDGSESSGTONHGHGEVGSIGDEGNURDRiGidSgSaaRtosogeoidi 44

DANH SÁCH CÁC BANG

Bảng 2.1 Kí hiệu vườn, mẫu và vị trí thu thập mẫu bệnh thán thư trên ớt ở tỉnh Tiền

HT Di c0 166 10E))E2SPSCEEEUCBCEEEIDIEEEEGSSEBIEEIESHO-BSESSG/PHEEHGCESDSESESERPGGG-G/210IEGGI2IEEGi22/720E30003123000 10C 22Bang 2.2 Thanh phần phản ứng PCR với priimer 2-2: 22552 2s+2E+2S22E£2E2E2z22522 24Bảng 2.3 Danh sách các đoạn primer va trình tự 5555552 +5<£+s£+sczsceseeeces 25 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với primer ITS1/ ITS4, Bt2a/Bt2b 25 Bang 2.5 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với primer AM-EF/AM-R 25Bang 3.1 Loài Colletotrichum spp phan lập từ ớt (Capsicum spp.) ở tinh Tiền Giang

GIỚI THIỆU

Đặt vần đề

Cây ớt (Capsicum spp.) thuộc chi Capsicum, họ cà (Solanaceae) là một trong

những cây gia vị có giá trị dinh dưỡng cao chứa nhiều vitamin, capsaicin được sửdụng phổ biến Bệnh than thư do nam Colletotrichum spp gây ra là một trong nhữngbệnh gây hại nặng nhất trong giai đoạn trước và sau thu hoạch ở những vùng trồng ớttrên toàn thế giới (Isaac, 1992)

Năng suất ớt có thé làm giảm đến 50 - 80% khi ớt nhiễm bệnh than thu(Poonpolgul et al, 2007) Ngoài ra bệnh còn làm giảm chất lượng ớt, giảm trọng lượngkhô, hàm lượng capsaicin và oleoresin trong quả ớt (Mistry et al, 2010).

Nên xác định thành phần cũng như định danh đến loài của nam Colletotrichumspp có vai trò quan trọng không những về mặt khoa học mà còn là yếu tố quan trọng dékiểm soát mầm bệnh hiệu quả vì quan hệ giữa nam với cây ký chủ cũng như tính mancảm với thuốc hóa học khác nhau theo loài (Mongkolporn et al, 2010)

Tùy nhiên, việc xác định định danh nam Colletotrichum hại ớt ở trên (cũng nhưcác loài Colletotrichum khác) chủ yếu dựa vào nguồn gốc ký chủ và các đặc điểm hìnhthái bao gồm màu sắc, tốc độ phát triển và cấu trúc tản nấm; hình dang và kích thước

bào tử phân sinh; hình dang và kích thước đĩa ap, có hay không có lông gai của đĩa cành;

hình thành hay không hình thành hạch nam; hình thành hay không hình thành giai đoạnsinh sản hữu tinh Do các đặc điểm hình thái không đủ dé phân loại tới mức loài nên đã

có quá nhiều nhằm lẫn trong phân loại nam Colletotrichum (Hyde et al., 2009)

Do đó, việc định danh chính xác cấp độ loài bằng kỹ thuật phân tử đối với các

giống ớt hiện nay là cần thiết Chính vì vậy đề tài “Phân lập và định danh nắmColletotrichum spp gây bệnh than thư trên ót tại tỉnh Tiền Giang” được

thực hiện.

Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập định danh và tuyên chọn được giống nam Colletotrichum spp gây bệnhthan thư trên ớt Nhằm mục đích phát hiện những dòng nam Colletotrichum spp gâybệnh thán thư trên ở các vùng dịch bệnh ở các huyện trong tỉnh Tiền Giang

Yêu cầu

Thu thập và phân lập nắm Colletotrichum spp gây bệnh than thư trên ớt

Định danh hình thái các chủng nam Colletotrichum spp gây bệnh than thư trên

ớt đã thu thập được.

Định danh bằng kỹ thuật phân tử trên trình tự 3 vùng gen: ITS, TUB2, và ApMat

từ các chủng nam Colletotrichum spp gây bệnh than thư trên ớt đã thu thập được

Đánh giá khả năng gây bệnh của nắm Colletotrichum spp.d6i với giỗng ớt chỉthién(Capsicum frutescens) trong điều kiện phòng thí nghiệm

Giới hạn đề tài

Đề tài đã được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 8 năm 2023 đến tháng

2 năm 2024, các thí nghiệm được tiến hành tai phòng thí nghiệm RIBE 302 — 304 (Bệnhhọc và Chân đoán) thuộc Bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Nông Lâm TP

CHUONG 1

TONG QUAN TAI LIEU

1.1 Tổng quan về cây ót

1.1.1INguồn gốc

Từ châu Mỹ, đầu tiên, cây ớt đã được Christopher Columbus du nhập vào châu

Âu sau khi ông khám phá ra châu Mỹ vào thế kỷ 15 Diego Alvarez Chanca, một được

sĩ trong chuyến đi thứ hai của Columbus đến West Indies năm 1493, đã mang những hạt

ớt đầu tiên về Tây Ban Nha và đã lần đầu viết về các tác dụng dược lý của chúng vàonăm 1494 Từ Mexico, Tây Ban Nha các thương lái đã nhanh chóng chuyền ớt qua Ấn

Độ, Philippines và sau đó là Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản với sự trợ giúp của cácthủy thủ châu Âu Gia vị mới này đã nhanh chóng được sử dụng trong chế biến thức ăncủa các quốc gia này Do giao thương phát triển, cây ớt đã dần phân bố khắp thé giới,chủ yếu nhờ các nhà buôn và thủy thủ người Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha Khả năngphân bồ rộng của cây ớt một phần cũng nhờ khả năng thích ứng khí hậu khá tốt của loàinày.

1.1.2 Phân loại khoa học

Giới (Kingdom): Plantae;

Nganh (Phylum): Spermatophyta;

Phan nganh (Subphylum): Angiospermae;

Lớp (Class): Dicotyledonae;

Bộ (Oder): Solanales;

Ho (Family): Solanaceae

Chi (Genus): Capcicum L.

Loài (Species): Có khoảng 269 loài

1.1.3 Đặc điểm học thực vật

Rễ: Cây ớt có cả 2 loại rễ cọc và rễ chùm, ở giai đoạn đầu cây phát triển rễ cọc,sau đó nhiều rễ phụ phát triển mạnh tạo thành hệ thống rễ chùm, phát triển ăn sâu vàphân nhánh mạnh về bốn phía, nhưng chủ yếu tập trung ở tang đất mặt 0 - 30cm Phân

bổ theo chiều ngang với đường kính 50 — 70cm Rễ ớt có khả năng chịu hạn nhưngkhông chịu được ngập ung Khi tưới nước day đủ, bộ rễ ăn nông phân bố rộng và ngượclại khi gặp hạn, rễ ăn sâu và phân bó hẹp

Thân: thuộc loại thân gỗ, thân tròn, đễ gãy và một số giống còn non thân có lôngmỏng Khi thân già, phần sát mặt đất có vỏ xù xì, hóa ban Thân chính cây ớt dài hayngắn phụ thuộc vào giống, đọc theo chiều dài thân có 4 — 5 cạnh Thân có lông hoặckhông lông, cây cao 35 — 65 cm, có giống cao 125 — 135 cm, các nhánh mọc ra từ thânchính phát triển mạnh nhánh cấp 1, 2, 3 Khi cây già thì khó phân biệt thân chính và các

nhánh câp Trên thân các cành phát triên mạnh và mọc đôi xứng hoặc so le tùy giông.

Lá: ớt có nhiều dạng lá khác nhau nhưng có hai dạng chủ yếu: đạng elip (bầu dục),dạng lưỡi mác Phiến lá nhẫn không có răng cưa, đầu lá nhọn, gân lá dày nỗi rõ, phân bố

so le Cuéng lá mập, khỏe, dài, chiều dài cuống thường chiếm 1/3 so với tổng chiều dai lá

(2,5 — 5 cm) tùy giống Lá ớt thường có màu xanh đậm, xanh nhạt, xanh vàng và màu tím.Một số giống trên mặt lá non còn phủ lông tơ Diện tích, hình dạng, màu sắc lá phụ thuộcvào giống và điều kiện trồng trọt Lá ớt nhiều hay ít có ảnh hưởng sản lượng quả sau này

Lá ít không những ảnh hưởng đến quá trình quang hợp của cây mà còn làm cho ớt ít quả

vì ở môi nách lá nơi phân cành là vị trí ra hoa, ra quả.

Hoa: Ớt là cây hàng năm (cây một năm), hoa lưỡng tính (tự thụ phan), moc donhoặc thành chùm 2 — 3 hoa Hoa nhỏ, dài, hoa mau xanh có hình chén, lá đài nhỏ, hep vanhọn Tràng hoa có 6 - 7 cánh mảu trắng hoặc tím Số nhị đực bằng số cánh hoa và mọcquanh nhụy cái Phan trong cánh hoa có tiết mật Hoa ớt có thé tự thụ phan hay thụ phanchéo do côn trùng, thy phan chéo có ý nghĩa lớn ở ớt cay, tỷ lệ thụ phan chéo từ 10 — 40%tùy giống, do đó cần chú ý trong việc để giống và giữ giống thuần

Quả và hạt: Quả ớt thuộc loại quả mọng, nhiều nước, có 2 — 3 6 cách nhau bởi váchngăn dọc theo trục quả (lõi quả) Cấu tạo quả chia làm 3 phần (từ ngoài vào trong): thịtquả, xơ thịt và vỏ quả Hạt ớt nằm tập trung xung quanh lõi của quả Phần lớn chất cay

được tập trung phần giữa đến cuống quả Quả ớt chín có màu đỏ, vàng hoặc tím đen Ớt

có nhiều hình dang to hoặc nhỏ, đài hoặc nhọn cuối qua (chìa vôi), quả dai cong ở cuốiquả (sừng trâu) phụ thuộc vào đặc tính của giống và kỹ thuật canh tác Hạt ớt nhẫn, đẹp,

có màu vàng trừ hạt của loài Capsicum pubescens có màu đen Một gram hạt ớt cay cókhoảng 220 hạt, ớt ngọt có khoảng 160 hạt Sức nảy mầm của hạt giống khá cao nếu bảoquản tốt có thé giữ được 2 — 3 năm (Mai Thi Phương Anh, 1999)

1.1.4 Đặc điểm sinh thái

Nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng đến sinh trưởng, số hoa, tỷ lệ đậu trái Nhiệt độban đêm thấp khoảng 8 - 15°C thường làm giảm tỷ lệ đậu trái và sinh trái không hạt,nhiệt độ ban đêm thích hợp nhất là 20°C Ot cay thích nhiệt độ cao hon dao động 20 -

độ quá cao rễ sinh trưởng kém, cây còi cọc (Mai Thị Phương Anh, 1999)

1.1.5 Giá trị dinh dưởng và công dụng của ớt

Thanh phan hóa học quan trọng nhất trong quả ớt là chất cay capsaicin được dùnglàm gia vị và làm thuốc Ngoài ra ớt còn là cây trồng rất giàu vitamin A, vitamin C,khoáng chất cũng như folate, một trong những vitamin B (Kantar và ctv, 2016) Trênthế giới, ớt được tiêu thụ dạng tươi, khô hay bột Capsaicin là một loại alcaloid là hoạtchất gây đó, nóng, chế thuốc trừ sâu Nhiều nhà vườn đã đầu tư sản xuất, mang lại hiệu

quả kinh tế cao Hương vị của ớt đã được sử dụng trong rất nhiều sản phẩm cả trongthực phẩm cũng như công nghiệp thực phẩm Chat rutin có trong ớt được dùng rộng rãitrong dược phẩm Ngày nay, ớt với nhiều chủng loại, đa dạng về hình dáng, màu sắc bắt

mắt còn được trông làm cây cảnh cũng như chê thuôc trừ sâu.

1.2 Tổng quan về nam colletotrichum spp.

1.2.1 Phân loại khoa học

Hình 1.1 bản đồ phân bố của nắm colletotrichum spp.trên thới gới :

(Nguồn: CABI,2021)

Nam Colletotrichum spp tập trung chủ yếu tại Nam A đặc biệt là Trung Quốc,

Án Độ, vùng bờ biển Tây của Nam Mỹ, một số quốc gia Tây Phi đặc biệt là Ghana

1.2.3 Đặc điểm hình thái

Collletotrichum øcutotum sensu lato

Hình 1.2 hình thái của các chủng nam colletotrichum khi được cay trên dia petri quan

lớp ngoài cùng.

Nam Colletotrichum spp sinh sản vô tinh bằng bào tử, bào tử đính phát triển trêncuống bào tử dang quả thé là cụm cuống bào tử Cụm cuống bào tử có dạng đĩa phẳng,

mỗi cụm cuống bao tử gồm lớp chất nền, bề mặt sản sinh cuống bao tử trong suốt Cuốngbao tử không có vách ngăn kéo dài đơn bao, dạng liềm, cong, bào tử trong suốt Cùngvới bào tử và cuống bào tử là các lông cứng trên mỗi cụm cuống bào tử Lông cứng dài,thuôn nhọn, không phân nhánh và đa bao, cấu trúc như tơ cứng Một vài loại nam củaColletotrichum spp có hoặc không có lông cứng có thể được kiểm soát bởi sự thay đổicủa độ âm Khi gặp điều kiện thuận lợi, mỗi bào tử nảy mam từ một đến nhiều ống mầm

dé hình thành sợi nam, gây ton thương trên bề mặt vật chủ Soi nam già đôi khi hìnhthành vách dày, màu nâu sậm, hình cầu gọi là hậu bào tử (Chlamydospores), có thể tậncùng hoặc chen giữa sợi nam dé tồn tại trong thời gian dai và khi tách chúng ra cũng

nảy mam dé hình thành sợi nam mới.

Cũng như những loại nam gây bệnh thực vật khác, Colletotrichum spp tồn tạichủ yếu giai đoạn vô tính, còn giai đoạn hữu tinh chủ yếu tồn tại trên mô đã chết (Sutton,1995), chi Glomerella được xem như là giai đoạn hữu tính của Colletotrichum Co chếtái tiếp hợp và sinh sản hữu tinh của Colletotrichum vẫn chưa được mô tả chỉ tiết, theoWheeler (1952) thì chỉ Glomerella tồn tại cả hai dang trong hệ sợi là tồn tại đồng tan và

dị tan.Bao tử phân sinh của nam Colletotrichum spp nảy mầm trong nước sau 4 giờ,nhiệt độ thích hợp cho nắm gây bệnh là 25 — 29°C Bệnh than thư phát triển mạnh trongđiều kiện âm độ gần 100% (Hà Viết Cường, 2008) Bào tử phân sinh có sức sống cao,trong điều kiện khô mặc du tàn dư bị vùi trong đất vẫn có thé nảy mầm vào vụ sau Bào

tử phát tán nhờ gió và nhờ côn trùng.

1.2.4.2 Đặc tính sinh thái

Theo Pring và ctv (1995) cho rang nam Colletotrichum spp có thé sống sót qua

đông trên các cây ký chủ khác nhau như cây họ cà hoặc cây họ đậu, tàn dư thực vật và

các quả bị bỏ lại trên đồng ruộng Ở Phần Lan, C aucutatum có thé sông sót qua mùa

đông trong tàn dư dâu tây và tàn dư co dại (Parikka và ctv, 2006) Các loài

Colletotrichum spp sản sinh ra các hạch nắm nhỏ dé tồn tại ở trạng thái ngủ nghĩ trongđất giữa mùa đông hoặc khi gặp điều kiện stress và những hạch nhỏ có thé lưu tồn nhiềunăm Nam Colletotrichum spp được tìm thay sông nội sinh trên mô thực vật (Damm vàctv, 2009) Bào tử của nắm từ các mô trên quả bị bệnh hoặc từ các bộ phận khác hay tàn

dư cây bệnh phát tán đến toàn cây, toàn ruộng do nước mưa, nước tưới Các bào tử mới

nảy mầm và sinh sản trong mô bệnh sau đó phát tán sang quả khác Nông dân cũng cóthể mang vào qua các thiết bị hay dụng cụ nông nghiệp trong quá trình chăm sóc câytrồng Trong điều kiện nóng âm thông qua mưa và tưới tiêu bào tử đính từ trong các đĩacành và các hạch nắm nhỏ bị bắn tung tóe từ các quả bệnh tới quả khỏe và lá cây Quảbệnh như một nguồn lây nhiễm cho phép bệnh phát tán từ cây này sang cây khác trênđồng ruộng (Roberts, 2001) Các yếu tố môi trường đóng vai trò quan trọng trong pháttriển bệnh than thư Bệnh than thư ớt phát triển thuận lợi ở điều kiện nhiệt độ ~ 27°C và

độ âm cao (trung bình 80%) (Than và ctv, 2008)

1.2.5 Nghiên cứu về các loài nam Colletotrichum spp gây bệnh than thư trên ớt

Bệnh than thư, bắt nguồn từ một tiếng Hy Lạp có nghĩa là “coal”, là tên gọi chungcủa các bệnh thực vật được đặc trưng bởi các ton thương màu tối, trũng, chứa các bảo

tử (Issac, 1992) Bệnh than thư do loài Colletotrichum gây ra thuộc giới Nắm, ngành

Ascomycota, lớp Deuteromycetes, bộ Melanconiales, họ Melanconiaceae Bệnh thán

thư trên ớ đã được chứng minh là do nhiều hơn một loài Colletotrichum bao gồm C.acutatum, C capsici, C gloeosporiodes và C coccodes (Than va ctv, 2008) Theo Kim

va ctv (1989) xác định các loài gây bệnh than thu trên ớt ở Han Quốc là C.gloeosporioide, C acutatum, C coccodes, C dematium Tại Việt Nam đã có ít nhất 7

loài là C acutatum, C capsici, C gloeosporioides, C nigrum, C fructicola, C.siamense, C aeschnomenes được ghi nhận gây bệnh than thư ở các vùng trồng ớt trêntoàn quốc (Nguyễn Duy Hung, 2017) Bệnh than thư gây ra bởi một số loài namColletotrichum spp dẫn đến mat năng suất nghiêm trọng và ảnh hưởng đến chất lượngcây trồng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Thiệt hại do nắm này gây ra là rất nghiêmtrọng ở nhiều nước ở Châu Á, bao gồm Hàn Quốc, Thái Lan và Đài Loan, trong đó C.acutatum và C gloeosporioides là gây hại nghiêm trọng nhất và phân bồ rộng rãi nhấtcủa mầm bệnh thán thư Năng suất ớt giảm 50 — 80% khi ớt bị nhiễm bệnh thán thư(Poonpolgul và ctv, 2007) Bệnh thán thư gây hại chủ yếu trên quả ớt chín, gây thiệt hạinghiêm trọng cho quả ớt cả trước và sau thu hoạch.

1.2.5.1 Nghiên cứu về nam Colletotrichum gloeosporioides

Nam Colletotrichum gloeosporioides có mặt ở hau hết các nước trên thé giới,đặcbiệt phổ biến ở vùng nhiệt đới và vùng cận nhiệt đới Tên Colletotrichum

gloeosporioides được đề xuất dựa trên tên loài nam Vermicularia gloeosporioides đượcphân lập trên cây họ cam quýt ở Y (Weir va ctv, 2012) Đề xác định được sự phân bó

của loài nầm này chỉ có thê dựa vào cây ký chủ của chúng.

Nam Colletotrichum gloeosporioides có bào tử đơn bào trong suốt, một đầutrònmột đầu nhọn hoặc hai đầu tròn, 9 - 24 x 3 - 4,5 um Ngoài ra, trên môi trường PDA nhântạo, kích thước và hình dang của bào tử có thé thay đồi so với trên cây ký chủ Khối bào

tử màu hồng nhạt được hình thành trên cành bào tử phân sinh đơn độc sinh ra từ sợi nắmtrong đĩa cành nhan hoặc không dễ nhìn thấy lông gai Giác bám mau nâu, hình chùyđến dang không đều, không có hình dang xác định, kích thước 6 - 20 x 4 - 12 um TheoSutton (1995) việc tồn tại nhiều hình dạng và kích thước của giác bám và bào tử trênnhiều loại cây ký chủ khác nhau cho thay tồn tại nhiều loài khác nhau trong phức hợp loài

Colletotrichum gloeosporioides.

Nam có thé tồn tại ở nhiệt độ 4°C nhưng nhiệt độ thích hợp nhất cho nam phattriển là từ 25 — 29°C và âm độ gần 100%, trong điều kiện này nam gây hại nghiêm trọngnhất Ảnh hưởng của các yêu tố môi trường (nhiệt độ và am độ), nồng độ chủng và mức

độ bệnh than thư do C gloeosporioides gây ra được quyết định bởi trái có vết bệnh vàtrái không có vết bệnh Theo Jeffries (1990) cho rằng bệnh vẫn có thé xuất hiện trongđiều kiện khô khi bào tử hoặc sợi nắm tiềm sinh xâm nhiễm vào mô bị tổn thương và

mô già, điều này cho thấy bệnh vẫn có thé gây thành dịch trên quả Sự nảy mam củanam C gloeosporioides liên quan chặt chẽ đến điều kiện môi trường Âm độ không khí

cao thuận lợi cho bao tử nảy mâm và xâm nhiễm vào ký chủ.

Một chủng C gloeosporioides gây triệu chứng loét điển hình chỉ có trên quả ớtxanh Khi quan sát dưới kính hiển vi tác giả cho thấy sự xâm nhiễm của nắm này vàotrong thành tế bào thông qua lớp biểu bì chỉ xảy ra trên quả ớt xanh mà không xảy ra

trên quả ớt chín (Oh và ctv, 1998).

1.2.5.2 Nghiên cứu về nam Colletotrichum acutatum

Colletotrichum acutatum được xác định bởi Simmonds (1965) Đến nay, sỐ lượngnam Colletotrichum acutatum ngày càng tăng Điều này dựa trên việc xác định các loàimới hoặc dựa trên sự phân loại lại các loài khác, chủ yếu từ C gloeosporioides, cho thay

sự tương đồng về hình thái cao và phô của kí chủ Sự đa dang giữa các chủng C

acutatum đã được công nhận từ lâu (biến thiên lên tới 4% trong trình tự rDNA - ITS),nhưng so sánh với các phân loại lân cận rõ ràng cho thấy đây là một nhóm đơn loài(Damm và ctv, 2009).

Tại Mỹ, C acutatum được coi là loài Colletotrichum có sức tan phá mạnh nhất

vì nó ảnh hưởng đến quả chín và quả chưa chín, trong khi đó C gioeosporioides chỉ gâybệnh chủ yếu trên quả ớt chín (Harp và ctv, 2008) Theo Sutton (1995), phức hợp loàiColletotrichum acutatum có bào tử trong suốt, hai đầu nhọn, đơn bào, kích thước 8,5 —16,5 x 2,5 — 4 um Giác bám màu nâu, dạng hình trứng ngược đến hình chuỳ, thườngnhẫn ở cạnh và có kích thước 8,5 — 10 x 4,5 — 6 um Tan nam loài C acutatum có mau

da cam hoặc màu xám nâu va đặc trưng là bào tử hình thoi Hình dạng của giác bám cóthé phân biệt loài C acutatum (với giác bám ít phân thuỳ) với C gloeosporioides (vớigiác bám thuỳ nhiều hơn) Hình dạng và kích thước giác bám là đặc trưng để định các

loài Colletotrichum spp với nhau.

1.2.5.3 Nghiên cứu về nắm Colletotrichum truncatun

Nam Colletotrichum truncatum, trước kia được gọi là Colletotrichum capsici, làmột trong các loài Colletotrichum có ý nghĩa kinh tế với phô ký chủ và tính gây bệnhrat đa dạng (Ranathunge va ctv, 2012) Colletotrichum truncatum ban đầu được mô tả

là Vermicularia truncatum Sydow ở An Độ Colletotrichum truncatum có phạm vi ký

chu rộng (Mordue, 1971) Colletotrichum truncatum cũng là nguyên nhân gây ra bệnh

than thư trên cây tiêu (Than va ctv, 2008).Chủng nắm này cũng là loài phố biến trên ớttại An Độ (Sharma va Shenoy, 2013), ở Thai Lan (Suwannarat và ctv, 2017), ở Uc (DaSilva va ctv, 2017) và là loài phé biến nhất trên ớt tại Trung Quốc (Diao va ctv, 2017)

Theo Đoàn Thị Lan Anh và ctv (2019) bào tử phân sinh hình lưỡi liềm hai đầu

tù, đơn bào, trong suốt Đĩa cành có lông gai đa bào màu rất đậm Bào tử không màu,hình lưỡi liềm, nảy mầm sau 12 giờ Kích thước trung bình 25,51 - 38,55 x 3,65 - 4,69

um Soi nam manh, mau trang lúc đầu mọc bung cao về sau sát mặt thạch Tản nắm màutrang, hơi xù, về sau chuyển sang màu vàng nâu Trên bề mặt tản nam xuất hiện nhiềubúi nam đen mọc thành những đường tròn đồng tâm, mép hoi gon sóng Trên bề mặt tannắm xuất hiện giọt dầu màu cam chứa 6 bao tử bên trong và có gai Mặt sau của tản nắm

có màu vàng nâu đến nâu Đường kính tan nam sau 6 ngày nuôi cấy là 90 mm Giác bám

có dạng hình trứng ngược, hình chùy, hơi tròn hay hình dạng không xác định, có phânthùy, lúc đầu không màu chuyền dan sang nâu đến đen; kích thước trung bình 9,34 —23,96 x 6,25 — 9,34 um.

1.2.6 Dac diém gay hai

Bệnh than thu có thé xảy ra trên lá, thân va ca quả trước và sau thu hoạch (Isaac,1992) Theo Vũ Triệu Mân (2007) bệnh có thể hại thân, lá, quả và hạt, nhưng hại chủyếu trên quả vào giai đoạn chín Vết bệnh ban đầu là một đốm nhỏ, hơi lõm, ướt trên bềmặt vỏ quả, sau 2 - 3 ngày kích thước vết bệnh có thé lên tới lem đường kính Vết bệnhthường có hình thoi, lõm, phân ranh giới giữa mô bệnh là một đường màu đen chạy dọctheo vét bệnh Trên bề mặt vết bệnh có những cham nhỏ là đĩa cành của nam gây bệnh.Các vết bệnh có thé liên kết với nhau làm quả bị thối, vỏ khô có màu trắng vàng ban.Nam có thé gây hại trên một số chéi non, gay hién tuong thối ngọn ớt Chồi bị hại cómàu nâu đen, bệnh có thể phát triển nặng làm cây bị chết dần hoặc cây bệnh có quả ởtừng phần nhưng quả ít, chất lượng kém

Theo Mai Thị Phương Anh (1999) vết bệnh thường có dạng tròn hay bầu dục,những cham nhỏ li ti màu vàng thường xếp thành những vòng tròn đồng tâm và khi vếtbệnh khô vỏ quả có hiện tượng lõm sâu và nhành những vùng nhăn gợn sóng Trongđiều kiện âm ướt thấy vết bệnh có màu hồng cam trên bề mặt vết bệnh, tâm vét bệnhmàu đen.

Than va ctv (2008) miêu tả triệu chứng điền hình trên quả là các tốn thương hìnhtròn, lõm, với vòng tròn đồng tâm trên bề mặt quả ướt và xuất hiện tản nắm hồng vớinhiều bào tử vô tính Dưới áp lực bệnh nặng, vết bệnh gây thối quả

Theo Fangling Liu (2016) triệu chứng bệnh trên quả được ghi nhận 3 loại điểnhình Loại 1: Các triệu chứng có màu sắc từ màu nâu sam đến đen, vết thương trũng cóvành hơi nhô lên và nhiều đốm màu đen trên bề mặt, thường tạo ra các khối bào tử trắngtrong điều kiện âm ướt, bào tử trong các triệu chứng này điển hình có hình lưỡi liềm.Loại 2: các triệu chứng gồm các mô hoại tử lõm xuống, có nhiều màu từ nâu sam đếnđen, với các vòng tròn đồng tâm có nhiều đĩa cành đen trên bề mặt, tạo ra các khối màuhồng, nhớt trong điều kiện âm ướt, bào tử hình trụ đến hình trụ dài Loại 3: gồm các mô

màu nâu nhạt đền nâu sâm, các khôi bào tử mau cam, bào tử có hình thoi.

1.2.7 Quá trình phát sinh bệnh

Colletotrichum sử dụng các cách khác nhau dé gây bệnh cho cây ký chủ Sự xâmnhiễm ban đầu bởi các nắm Colletotrichum có liên quan đến một loạt các quá trình baogồm sự tiếp xúc bào tử lên bề mặt cây trồng, sự nảy mầm của bào tử, sự hình thành giácbám, sự xâm nhập vào biểu bì của cây, sự phát triển, định vị vào mô cây, sự sản sinh ra

đĩa cành va bào tử phân sinh (Than và ctv, 2008).

Trên cây, nắm duy trì trạng thái tiềm sinh không gây bệnh cho tới khi các thayđổi sinh ly của mô (do ton thương, già hóa) xuất hiện Các thay đổi này kích thích nắmchuyên sang] trạng thái có tính độc cao và gây bệnh Trạng thái tiềm sinh của nắm cóthé diễn ra dưới 2 dang: nắm sống nội sinh trong mô nhưng không gây bệnh và trên bề

mặt cây, quả, đĩa cành của nắm có thê duy trì trạng thái ngủ nghĩ lâu dài (Hà Viết Cường,

c) Các triệu chứng loại I được đặc trưng bởi mau nâu sam đến đen, vết bệnh trũng vớivành hơi nhô lên và nhiều đốm đen trên bề mặt, tạo ra các khối bào tử màu trắng trongđiều kiện âm ướt (d — Ð Các triệu chứng loại II bao gồm màu nâu sam các vết bệnhchuyên sang màu đen, trũng với nhiều đốm màu đen trên bề mặt, tạo ra thịt bào tử cómàu hong, nhớt trong điều kiện ẩm ướt (g — i).

(Nguồn: Liu và ctv, 2016)

Chống tần tụi ở dụng sợi nếm bay hạnh nấm Bệnh thần thư xuất hiện

trong xác thực vật và đất trên nhiều loại cây

Hình 1.4 Vòng đời của Colletotrichum spp.

(Nguôn: De,2017)Sau khi bào tử nắm tiếp xúc với vật chủ, chúng sẽ nảy nằm, hình thành đĩa bám

và bat đầu xâm nhiễm vao các tế bào của vật chủ, giai đoạn tiếp theo là hoại tử do các

tế bào vật chết đi vì mat chất dinh dưỡng Lúc này trên vật chủ như trái cây, thân hoặc

lá xuất hiện các vết bệnh, thối nhũn, màu den, hơi lõm và có thé có chất nhay Giai doan

tiếp theo là nam Colletotrichum spp sẽ hình thành các cành sinh bao tử va phat tán bào

tử, hoặc chúng sẽ tồn tại dưới dạng sợi nắm hay hạch nam trong dat, tan dư thực vat haycon goila giai doan tiềm ấn, bao tử hình thành và tồn tai trong các thể quả dạng chai,khi điều kiện thuận lợi chúng sẽ phát triển thành các túi bào tử và phát tán bào tử tiếp

tục vòng doi.

1.2.8 Giới thiệu về chỉ thi DNA và vùng gen ITS

1.2.8.1 Tống quan về chỉ thi DNA

Chỉ thị DNA sử dụng các đoạn trình tự gen hoặc DNA đặc hiệu là một công cụhữu ích để xác định, nhận dạng loài Số lượng nghiên cứu sử dụng mã vạch được sửdụng ngày càng nhiều Bằng cách kết hợp các thế mạnh của di truyền phân tử, công nghệgiải trình tự và tin sinh học, chỉ thị DNA cung cấp một phương tiện nhanh chóng vàchính xác để nhận biết các loài đã biết, mô tả và đặt tên trước đó và lấy thông tin về

chúng Cho đến ngày nay, công cụ này khám phá hàng ngàn loài động thực vật chưađược đặt tên, đặc biệt là trong quần xã sinh vật nhiệt đới Là một công cụ khám phá đa

dạng sinh học mang tính cách mạng (Rob De Salle và ctv, 2019) Chỉ thị DNA đã giúp

tìm kiếm các loài có tiềm năng mới đối với khoa học, phân tích dữ liệu di truyền củachúng, đặc biệt là với các loài có nguy cơ tuyệt chủng.

Dựa trên chỉ thị DNA, nhiều mã vạch DNA được phát triển Mã vạch DNA làcác trình tự đặc hiệu cho phép xác định một đơn vị phân loại nào đó như loài Đối vớinhững người sử dụng phân loại học ứng dụng, mã vạch DNA đóng vai trò là phương

tiện dé xác định các loài quy định, các loài xâm lấn và các loài có nguy cơ tuyệt chủng.Ngoài ra nó còn dé kiểm tra danh tinh và độ tinh khiết của các sản phẩm thực vật, nhưthuốc thảo dược thương mại và thực phẩm chức năng Mã vạch DNA hiện đang được

sử dụng dé giải quyết các van đề sinh thái, tiến hóa và bảo tồn Quá trình tạo và áp dung

mã vạch DNA thực vật cho mục đích nhận dang đòi hỏi hai bước cơ ban: 1) xây dựngthư viện mã vạch DNA của các loài đã biết và 2) khớp với chuỗi mã vạch DNA của mộtmẫu chưa biết so với thư viện mã vạch DNA Bước đầu tiên yêu cầu các nhà phân loạichọn một đến vai cá thé cho mỗi loài để làm mẫu tham chiếu trong thư viện mã vạchDNA Mô, tế bào có thé được thu trực tiếp từ các mẫu vật tươi hoặc các mẫu khô, không

bị nhiễm nam mốc Khi 7 thư viện mã vạch DNA hoàn tat, mẫu chưa biết sẽ được tachchiết DNA tong số và mã vạch DNA được tạo ra của mau vật sẽ được so sánh với mãvạch DNA đã biết bằng cách sử dụng một số loại thuật toán phù hợp

Chỉ thị DNA là công cụ hữu ích giúp phân loại các loài (W John Kress, 2017.

Đặng Ngọc Thanh và ctv, 2018) Đoạn gen được sử dụng có thể tìm thấy ở tất cả cácsinh vật (hoặc ít nhất là trong các thành viên của một nhóm loài), các trình tự nucleotide

sẽ giống nhau hoặc rất giống nhau ở các cá thể trong cùng một loài Vì vậy khu vực này

có thể được sử dụng cho nhận dạng các loài bằng cách so sánh trình tự của chỉ thị DNAtrong sinh vật thử nghiệm với trình tự tham khảo từ các cơ sở dữ liệu Các vùng genđược dùng làm chỉ thị DNA ở thực vật bao gồm các trình tự DNA trong lạp thể và DNAtrong nhân Hiện nay, các chỉ thị dựa trên trình tự DNA là một phương pháp xác địnhcác loài một cách hiệu quả Tuy nhiên, mỗi phương pháp phân loại đều có những mặthạn chế Chỉ thị DNA phân biệt các loài với nhau, nhưng không có đủ dit liệu dé mô ta

các loài mới nên có thé gây xáo trộn, làm thay đổi hệ thống phân loại truyền thống đã6n định với hệ thống danh pháp từ hang trăm năm nay (Đặng Ngọc Thanh, 2018).

1.2.8.2 Vùng trong được sao mã (Internal Transcribed đệm Spacer - ITS)

Vùng đệm trong được sao mã (Internal Transcribed Spacer - ITS) nằm giữa genRNA ribosome tiểu đơn vị nhỏ và gen RNA ribosome tiêu đơn vị lớn là một dấu hiệuphát sinh gen được sử dụng rộng rãi cho phân loại nhiều loài ITS ở thực vật nhân thựcchứa rRNA 5,8S được bảo tồn và các khu vực có thê biến đồi là ITS1 và ITS2 Các vùngnày có chiều đài có thé thay đổi và khuếch đại bằng cách sử dụng các đoạn môi bổ sungcho các vùng được bảo tồn của các gen sườn của chúng Có nghiên cứu trước đây đã chỉ

ra rằng việc loại bỏ các khu vực được bảo tồn dẫn đến phân loại chính xác hơn (Adam

R Rivers và ctv, 2018).

Các vùng tổ chức nhân (nucleolar organizing regions — NORs) nam trong nhiễmsac thé chứa các DNA ribosome (rDNA) là các phan của các đơn vị lặp lại được sắp xếptheo thứ tự nhất định với số lượng bản sao lên đến 30000 trong một tế bào, tổng độ dàivùng ITS đao động từ 600 — 700 bp (Nguyễn Đức Thành ,2014) Có một điểm lý thúcho vùng gen này là mức độ tiễn hóa của nó nhanh nên dễ dàng thay đổi về trình tự cũngnhư độ dài Bên cạnh đó, các vùng liền kề thì có trình tự rat bao thủ, thuận tiện cho việcthiết kế mỗi cho phản ứng PCR nhân dòng vùng gen ITS Ngoài ra, do đoạn trình tự genkhông dài, nên việc khuếch đại là không khó khăn Phân tích vùng gen ITS là một kỹthuật chỉ thị phân tử quan trọng cho nghiên cứu đa dạng di truyền giúp phân loại phân

tử các nhóm taxon có liên kết gần gũi (Gitte Petersen và ctv, 1996) Bởi vì ITS có tínhbảo thủ cao trong loài nhưng lại thay đổi ở các loài khác nhau (Thomas D Bruns, 1991)

Có nhiều nghiên cứu đã tiến hành phân tích riêng biệt từng vùng trình tự ITS1 và ITS2,song kết quả cho thay chưa đủ bằng chứng dé phân tích tiến hóa Do đó sự kết hợp ditliệu vùng ITS cho kết quả khả quan hơn Hầu hết các nghiên cứu được báo cáo, sự khácbiệt giữa các chuỗi ITS chủ yếu là do đột biến điểm Một tỷ lệ tương đối nhỏ của những

vị trí bị chèn (insert) hoặc xóa (indels) nucleotide trong các trình tự tương tự nhau dé

giữ lại tín hiệu đủ cho phân tích phát sinh gen (Bruce G Baldwin, 1995) Nghiên cứu đa

dạng di truyền sử dụng vùng gen ITS có thể được tiến hành bằng cách: Sử dụng nhữngcặp môi đặc hiệu dé khuếch đại số lượng ban sao vùng gen mong muốn; tiến hành giải

trình tự trực tiếp; xây dựng cây phát sinh phân loài sử dụng các trình tự nghiên cứu vàcác trình tự tham chiếu có sẵn trên Genbank.

Ứng dụng phân tích phân tử đầu tiên (Mills et al., 1992) đã xác định được các

khác biệt trong trình tự chuỗi ITS1 của 6 loài Colletotrichum, cũng như chứng tỏ có sự

đa hình ở vùng gen này của các mẫu C gloeosporioides phân lập từ các cây ký chủ khácnhau Số lượng các nghiên cứu phân loại nam Colletotrichum ứng dung phân tích phân

tử gia tăng nhanh chóng, tập trung vào các gen nền như gen mã hóa RNA ribosome(internal transcribed spacer (ITS)) (Crouch et al., 2009; Hsiang & Goodwin, 2001;

Johnston & Jones, 1997), gen mã hóa yếu tố xác định kiểu ghép cặp (mating-type

(MAT)) (Chen et al., 2002; Du et al., 2005).

Mặc dù ITS hiện được xem là gen “mã vạch” (barccode) trong phan loại phan tử

nam (Schoch et al., 2012) nhưng vùng gen này đã chứng tỏ chưa đủ dé phân loại tới mứcloài đối với một số nhóm nam Colletotrichum Chang hạn, tỷ lệ xác định sai các mẫunam nhóm Colletotrichum có bào tử dang lưỡi liềm dùng chuỗi ITS và tìm kiếm bằng

“Blast search” tai NCBI lên tới 86% (Crouch et al., 2009) Chính vì vậy, phân tích da

gen đã chứng tỏ ngay càng quan trong trong phân loại nam Colletotrichum Ngoài ITS,các trình tự thường được sử dung trong phân tích nay bao gồm glutamine synthetase

(GS), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), calmodulin (CAL), actin (ACT), chitin synthase (CHS-1), B- tubulin (TUB2), DNA lyase (APN2) vatrình tự bên trong nam giữa DNA lyase va gene Matl-2 (APMAT).( Nguyễn DuyHung va ctv 2017).

1.2.9 Cac phương pháp xây dung cây phat sinh chủng loại

Theo Darwin, tat cả các loài sinh vật đều tiến hóa từ một tô tiên chung Mối quan

hệ giữa các loài sinh vật được biéu diễn bởi một cây phân loài Dữ liệu đầu vào cây tiếnhóa hay cây phân loài có thé là một hay nhiều yêu tố chứa thông tin khác nhau liên quanđến chúng, như là thông tin về cau trúc hoặc là thông tin về hình dang bên ngoài (Lê SỹVinh, 2014) Về mặt nguyên tắc, các sinh vật có cấu trúc bên ngoài và hình dáng cànggiống nhau thì chúng càng có quan hệ gần gũi

Ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học, sinh học phân tử cũng nhưtin sinh hoc, chúng ta hoàn toàn có thé giải mã bat kỳ một hay nhiều đoạn gen nào chúng

ta mong muốn, thậm chí là toàn bộ hệ gen của sinh vật Đó là dữ liệu quan trọng và làbước tiến vượt bậc hữu ích cho ngành phân loại học Những gì chúng ta cần là nhữngđoạn DNA hay axit amin của mẫu nghiên cứu để so sánh giữa chúng với nhau và với đữliệu sẵn có Từ đó, chúng ta có cơ sở đề xây dựng cây phát sinh loài Đây là một công

cụ suy luận giúp các nhà phân loại học tái lập lại sự tiền hóa và phân loài trong tự nhiên

Một cây phân loài thường có cấu trúc nhị phân thể hiện mối quan hệ tiễn hóagiữa các loài sinh vật: (1) mỗi đỉnh (nút lá) của cây biéu hiện cho một loài sinh vật hiệntại; (2) mỗi nút bên trong biểu điễn cho một loài sinh vật tổ tiên; (3) mỗi cạnh của cây

sẽ nối hai nút của cây và biểu diễn mối quan hệ trực tiếp giữa hai loài sinh vật ở hai nútcủa cây; (4) độ dài của cạnh cho biết khoảng cách tiến hóa giữa chúng Có 2 dạng câythường gặp là cây không gốc (không có thông tin về các loài tô tiên, cạnh của cây khôngthể hiện mối quan hệ cha - con giữa các đỉnh của cây) và cây có gốc (các cạnh trên câythể hiện mối quan hệ cha con giữa các đỉnh của cây) (Lê Sỹ Vinh, 2014)

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu đề tài

Thu thập và phân lập nam Colletotrichum spp gây bệnh than thư trên ớt

Định danh hình thái các chủng nam Colletotrichum spp gây bệnh than thư trên

2.2 Thời gian địa điểm

Đề tài đã được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 8 năm 2023 đến tháng

2 năm 2024, các thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm RIBE 302 — 304 (Bệnhhọc và Chan đoán) và nha màng thuộc Bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại họcNông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

Mẫu bệnh được thu thập tại ba huyện Gò Công Đông, huyện Chợ Gạo và thị xã

Cai lậy tỉnh Tiền Giang

2.3 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu ớt có triệu chứng bệnh theo mô tả của Than và ctv năm 2008 được thu

thập tại các vùng trồng ớt thuộc ba huyện Gò Công Đông, Chợ Gạo và Tx Cai lậy trongtỉnh Tiền Giang Mau ớt có biểu hiện bệnh đã được lấy từ 4 vườn khác nhau

Hai giống ớt: ớt chỉ thiên (Capsicum frutescens), ớt sừng vàng Châu Phi(Capsicum annuum).

2.3.2 Vật liệu nghiên cứu

Môi trường nuôi cấy:WA, PDA

Hóa chất ly trích DNA: dung dịch đệm ly giải (Lysis buffer), PCI, Chloroform,Isopropanol, dung dịch đệm TE.

Hóa chất phản ứng PCR: mỗi (primer), MyTaq DNA polymerase, MyTaq buffer,H2O đã khử ion.

Dụng cụ thí nghiệm: kính hiển vi ban tự động, dia petri, pipet, đầu tip, que cấytam giác, dao mồ, cốc đong, bình tam giác, lam kính, lamen, ống fancol, ống nghiệm,giấy thấm, bông, kẹp gấp, túi nhựa thu mẫu, giấy, viết, chày nghiền mẫu ,nước cất, cồn,đèn côn, tủ cay cap 2, nồi hấp, tủ lạnh, eppendorf, máy PCR, máy cô quay, máy vortex,máy spin, máy ly tâm lạnh, máy điện di, bon điện di

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương Pháp thu thập mẫu bệnh thán thư trên ớt

Tiến hành thu mẫu trái trên ớt chỉ thiên, ớt sừng vàng có triệu chứng nhiễmbệnh than thu theo mô ta của Than va ctv (2008) được thu thập tại các vùng trồng ớtthuộc huyện Gò Công Đông, huyện Chợ Gạo và thị xã Cai lậy tỉnh Tiền Giang Tiếnhành chọn 4 vườn, thu mẫu theo 3 vị trí, mỗi vị trí thu 2 đến 3 trái ớt bệnh Mẫu trái

ớt bệnh được thu về sẽ được trữ lạnh ở 4°C và tiễn hành phân lập sau 1-2 ngày lấymâu.

Mẫu bệnh có triệu chứng điển hình do nắm Colletotrichum spp gây ra vết bệnhtrên quả là những đốm nhỏ, có các mô hoại tử lõm xuống, có nhiều màu từ nâu sam đến

đen với các vòng tròn đông tâm trên bê mặt.

Thông tin mẫu bệnh: thông tin mẫu bệnh được ghi dựa vào địa điêm lây mẫu,giống ớt, bộ phận bị bệnh (quả) và đánh thứ tự mẫu

Bảng 2.1 Kí hiệu vườn, mẫu và vị trí thu thập mẫu bệnh thán thư trên ớt ở tỉnh Tiền

Giang

Mã số Tọa độ/vị trí Mẫu/vườn | Giống ớt Kí hiệu

vườn

TT Xã Tân Thành 9 Chỉ thiên TT1.1—'TT3.3

TH Xã Tăng Hòa 9 Chỉ thiên THI.1 - TH3.3

TTB | Xã Tân Thuận Bình 9 Chithién | TTB1.1—TTB3.3 MPT | Xã Mỹ Phước Tây 9 Sừng vàng | MPT1.1 —MPT3.3

Chú thích tên nắm: TT 1.1 (TT: Tân Thành; 1.1: thứ tự lấy mau)

2.4.2 Phương pháp phân lập và làm thuần nắm Colletotrichum spp từ mẫu bệnh2.4.2.1 Phương pháp chuẩn bị một số môi trường cho quá trình phân lập

Môi trường WA (môi trường Water Agar): Dun sôi 500 ml nước cất, sau đó thêmvào 20 gam agar nấu cho đến khi tan hết agar và thêm nước cất vào cho đến khi dungdịch vừa đủ 1000 ml Hap khử trùng bằng nôi hap ở nhiệt độ 121°C, 1 atm trong 20 phútsau đó đồ ra đĩa petri (mỗi đĩa 15 ml dung dịch)

Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar):Rửa sạch 200 g khoai tây (không got

vỏ) Cắt khoai tây thành từng miếng nhỏ và luột trong khoảng 1 giờ, sau đó lọc khoaitây và nước luộc bằng rây (hoặc vải màn) rồi vức bỏ phần bả đi Có thể dùng máy xaysinh tổ để xay nát hỗn hợp Hòa tan 20 g đường dextrose (glucose) và 20 g Agar vào

1000 ml nước máy với nước lọc khoai tây Hap khử trùng 6 121°C trong 20 phút

2.4.2.2 Phương pháp phân lập và làm thuần nam Colletotrichum spp

Tác nhân gây bệnh thán thư được phân lập trực tiếp từ mẫu bệnh theo phương

pháp của Than và cộng sự (2008), Akhter và cộng sự (2009).

Mẫu trái ớt bị nhiễm bệnh được khử trùng bề mặt bằng cách dùng giấy mềm(giấy ăn) đã nhúng cồn étyl 70%, rửa lại trong nước vô trùng và dé khô trên giấy thâm

vô trùng Dùng dụng cụ đã khử trùng cắt những miếng cấy nhỏ (khoảng 2 x 2 mm) từ

phân ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh, sau đó chuyên mâu vào 10ml nước cât vô

trùng, tiễn hành pha loãng tới hạn và cấy trang lên môi trường PDA Đặt đĩa cấy ở nhiệt

độ khoảng 25°C Kiểm tra đĩa cấy hàng ngày, khi các tản nắm phát triển từ những mẫucấy, cấy truyền chúng sang môi trường dinh dưỡng như PDA

Phương pháp cấy đơn bào tử làm thuần mẫu nắm như sau

Khử trùng que cay Tạo dung dich bao tử bằng cách dùng que cay lấy một lượngnhỏ sợi nam trên mặt thạch có lẫn bào tử vào ống nghiệm chứa 10mL nước vô trùng.Lắc ống nghiệm dé phân tán các bào tử và kiểm tra mật độ bào tử bằng cách quan sátống nghiệm trước ánh sáng D6 dich bào tử vào một dia Petri có chứa một lớp mỏngmôi trường thạch nước cất Đồ dịch bào tử thừa từ đĩa Petri đi Một số bào tử sẽ nằm lạitrên mặt thạch Dé dựng dia Petri trong khoảng 18 giờ cho đến khi bào tử nảy mam.Kiểm tra dia Petri đưới kính lip soi nôi Dùng một que cấy đẹp cắt lấy ra một bào tử nảymam và chuyên sang một đĩa môi trường mới (Cai và ctv, 2009)

2.4.3 Định danh hình thái các chủng nắm Colletotrichum spp gây bệnh than thưtrên ớt

Phương pháp: cay một khoanh hệ sợi nam Colletotrichum (lay từ mép tản nam)đường kính 5 mm vào dia petri đã có môi trường PDA, đặt đĩa ở nhiệt độ 27 °C ủ tốitrong 7 ngày Quan sát những đặc điểm hình thái của nam Colletotrichum: Màu sắc khan

lạc, hình thái bào tử.

Đặc điểm của giác bám: Một mảnh môi trường PDA (1 cm?) được đặt vô đĩa petri

vô trùng Bao tử nam được cấy vào cạnh của miếng môi trường va một lamen vô trùng

đặt lên mảnh môi trường Dia được ủ 7 ngày ở 25 °C cho tới khi giác bám hình thành ở mặt dưới của lam (Cai va ctv, 2009) Ghi lại hình dạng và kích thước của giác bám Dựa

vào các đặc điềm trên phân loại và xác định các mẫu nắm thuộc giống Colletotrichum

spp theo khóa phân loại của Sutton (1995).

Mỗi nhóm hình thái chọn 1 đến 2 mẫu đặc trưng dé định danh phân tử

2.4.4 Định danh phân tử các chủng nắm Colletotrichum spp gây bệnh than thư trênớt

2.4.4.1 Phương pháp tách chiết DNA từ nam

Quy trình ly trích DNA được thực hiện theo các bước:

Bước 1: Cao lay sinh khối 0,1 — 0,5 g sol nam phat triển trên đĩa môi trường PDAcho vào eppendorf 1,5 ml.

Bước 2: Thêm 400 pl Lysis buffer, dùng chày vô trùng nghiền nhuyễn mau U ở65oC trong | giờ.

Bước 3: Thêm 300 pl dung dịch PCI Tron đều hỗn hợp trong ống, ly tâm 13000vòng trong 8 phút.

Bước 4: Hút 300 pl dịch nổi cho vào eppendorf 1,5 ml mới, thêm 100 ul

Chloroform Ly tâm 14000 vòng trong 5 phút.

Bước 5: Hút lấy 200 ul dịch nổi cho vào eppendorf 1,5 ml mới, thêm vào 100 plIsopropanol Ly tâm 14000 vòng trong 10 phút.

Bước 6: Loại bỏ dich nồi và thu kết tủa Cho 480 ml cồn 70° vào cặn kết tủa, đảotrộn, ly tâm 13000 vòng trong 10 phút (2 lần)

Bước 7: Loại bỏ dich nỗi, để khô tự nhiên

Bước 8: Thêm vào 50 pl TE buffer.

Bao quan mau ở -20°C

Sau khi ly trích, DNA được kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch dam bảo chất lượngDNA và điều chỉnh phù hợp cho phản ứng PCR Nguồn DNA này được sử dụng làmvật liệu chung cho phản ứng PCR trong quá trình nghiên cứu.

2.4.4.2 Phan ứng PCR với cặp mỗi ITS (ITS4, ITS5 ),TUB2 (Bt2a và Bt2b), ApMatBảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR với primer

Thành phần Nong độ đầu Nong độ cuối Thể tích (ul)

Tổng 25

Bảng 2.3 Danh sách các đoạn primer và trình tự

Gene Tên primer Trình tự primer Tài liệu tham khảo

rT ITS4 TCCTCCGCTTATT GATATGC White và ctv,

ITSS GGAAGTAAAA GTCGTAACAAGG 1990 p- Bt2a AACATGCGTGAGATTGTAAGT

Glass va ctv, 1995 tubulin Bt2b ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC

AM-F TCATTCTACGTATGTGCCCG

ApMat Silva va ctv, 2012

AM-R CCAGAAATACACCGAACTTGC

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt cua phan ứng PCR với primer ITS1/ ITS4, Bt2a/Bt2b

Chu ky Giai doan Nhiét d6 (°C) Thoi gian

1 Tién bién tinh 95 5 phút

ae Bién tinh 95 20 giây

Bat cap 56 20 giây Kéo đài 72 45 giây

1 Hau kéo dai 72 7 phut

Bang 2.5 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với primer AM-F/AM-R

Chu kỳ Giai đoạn Nhiệt độ (°C) Thời gian

1 Tién bién tinh 94 2 phút

sẽ Biến tính 94 30 giây

Bắt cặp 54 30 giây Kéo dài 72 1 phút

1 Hau kéo dai 72 5 phút

2.4.4.3 Quy trình điện di kiểm tra DNA tổng số của nắm

Chuan bị gel điện di 1%: cân 0,2 g agarose cho vào bình thủy tinh, thêm 20 mldung dịch TBE 0,5X, đun trong lò viba ở 350W trong khoảng 3 phút, lắc đều cho tan

hết hỗn hợp dung dịch Đề nguội 50 — 65°C, đồ gel vào khuôn và đặt lược tạo giếng.

Chờ gel nguội, rút lược ra khỏi gel, cho gel vào bồn điện di chứa dung dịch TBE 0,5X

Điện di và nhuộm gel: hỗn hợp điện di bao gồm 2 pl mẫu DNA, 0,5 pl loadingdye và 1 ul ethidium bromide Hút dung dich cho vào giếng trên gel Điện di 25 phút ởhiệu điện thé 100V

Đọc kết quả nhuộm gel: Vớt gel ra, rửa lại nhiều lần với nước và đọc kết quả dưới tia

UV DNA liên kết với ethidium bromide sẽ phát sáng dưới tia UV Kết quả được ghinhận và chụp lại bằng máy gel doc với phần mềm Quantity one

2.4.4.4 Phân tích phát sinh loài

Xây dựng cây phát sinh loài của nam dựa vào đoạn trình tự ITS1 — 5,8S — ITS2trong rDNA Chọn các trình tự của các chủng nam trong cùng một chi Colletotrichum

và một loài khác chi Colletotrichum trên NCBI Vẽ cây phat sinh loài từ trình tự cácchủng nam đã chọn với các chủng Colletotrichum spp đã phân lập bang phần mềmMEGA I1.

Sử dụng phần mềm MEGA 11 dé sắp xếp trình tự, vẽ cây phát sinh loài bang

phương pháp Maximum likelyhood, bootstrap 1000, theo mô hình Tamura-Nei cho trình

tự đoạn ITS.

2.4.5 Đánh giá khả năng lây bệnh của các dòng nam Colletotrichum spp

Chuẩn bị mẫu thí nghiệm

Quả ớt dé tiến hành thí nghiệm là ớt chỉ thiên Hai mũi tên đỏ không có triệuchứng bị bệnh, không bị côn trùng chích hút và vết thương cơ giới, đồng đều với nhau

về kích thước, hình dạng, màu sắc được xử lý bằng cồn 70 và rửa bằng nước sạch, đểkhô tự nhiên trước nhỏ dung dich bào tử nam

Tiến hành thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố với 5 nghiệmthức trong đó bao gồm 1 nghiệm thức đối chứng, 6 quả ớt/nghiệm thức, một nghiệmthức thực hiện 3 lần lặp lại Nuôi cay chủng nam Colletotrichum spp ở nhiệt độ phòng.Sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA, 10 mL nước cất thanh trùng được cho vào