Khóa luận tốt nghiệp Bảo vệ thực vật: Phân lập nấm Trichoderma spp. và khảo sát khả năng đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum và vi khuẩn Erwinia carotovora

Đánh giákhả năng phòng trừ của các dòng Trichoderma đối với vi khuan Ralstoniasolanacearum gây bệnh héo xanh trên cây cà chua trong phòng thí nghiệm theophương pháp của Silva và ctv 2003

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA NONG HOC

ek

KHOA LUAN TOT NGHIEP

PHAN LAP NAM Trichoderma spp VA KHAO SAT

KHA NANG DOI KHANG VOI VI KHUAN

Ralstonia solanacearum VA V1 KHUAN

PHAN LAP NAM Trichoderma spp VÀ KHAO SÁT

KHA NANG DOI KHANG VOI VI KHUAN

Ralstonia solanacearum VA VI KHUAN

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài tôi đã nhận được sự quan tâm, dạy bảo, giúp

đỡ của thầy cô, các anh chị và các bạn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến với:

Tôi xin kính trọng và tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với TS Võ Thị Ngọc Hà vàThS Phạm Kim Huyền là người đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện cho tôithực hiện khoá luận này cũng như chia sẻ kinh nghiệm quý báo giúp tôi thực hiệntốt khóa luận

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các quý Thầy Cô cùng Ban lãnh đạo của Khoa

Nông học trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện

cho tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài

Cảm ơn bạn Huỳnh Quốc Anh rất nhiều, bạn là người cộng sự, là người luônđồng hành và hỗ trợ tôi xuyên suốt trong thời gian thực hiện khóa luận này

Cảm ơn lớp DH19BV đã đồng hành cùng tôi trong những năm tháng học tập

và nghiên cứu tại trường Đại học Nông Lâm Thành phô Hồ Chí Minh

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đặc biệt nhất đến với gia đình Cảm ơn Ba

Me và các thành viên trong gia đình đã luôn bên cạnh giúp đỡ con, là chỗ dựa tinh

thần vững chắc, luôn ủng hộ và truyền động lực cho con bước đi trên con đường

mình đã chọn Con xin khắc ghi trong lòng

Xin chân thành cảm ơn!

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 02 năm 2024

Sinh viên

Đỗ Thị Kim Ngọc

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Phân lập nam Trichoderma spp và khảo sát khả năng

đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum và vi khuẩn Erwiniacarofovora ”, được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật — KhoaNông học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 05/2023đến tháng 02/2024 Mục tiêu nghiên cứu phân lập được nam Trichoderma spp vàkhảo sát khả năng đối kháng của Trichoderma spp với vi khuẩn Ralstoniasolanacearum va vi khuan Erwinia carotovora trong điêu kiện phòng thí nghiệm.

Phân lập nam Trichoderma spp theo phương pháp bay nam và định danhbằng phân loại dựa vào đặc điểm hình thái theo khóa phân loại của Soytong vàQuinio (1988) Các thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng được tiến hành theophương pháp cấy kép của Trần Thị Thu Hà và Phạm Thanh Hòa (2012) Đánh giákhả năng phòng trừ của các dòng Trichoderma đối với vi khuan Ralstoniasolanacearum gây bệnh héo xanh trên cây cà chua trong phòng thí nghiệm theophương pháp của Silva và ctv (2003) có cải tiến

Phân lập được 14 dong nam Trichoderma spp từ 40 mau đất thu tại Binh

Dương và Đồng Nai Hai dòng có khả năng đối kháng cao đối với vi khuẩn

Ralstonia solanacearum là dòng T-BD01 và T-BD04 có hiệu suất đối kháng lầnlượt là là 71,46% và 71,33% Có 4 dòng gồm T-BD02, T-BD04, T-PN12 và T-ĐNI4 có khả năng đối khang cao với vi khuân Erwinia carotovora với hiệu suấtđối kháng lần lượt là 71,08%, 72,90%, 72,09% và 71,89%.Trong điều kiện phòngthí nghiệm, hai dòng T-BD01 va T-BD04 đều thé hiện kha năng kiểm soát bệnh

héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra trên hạt cà chua Nghiệm

thức T-BDO1 - CXT2 cho tỉ lệ bệnh thấp nhất là 6,66% và hiệu lực phòng trừ caonhất là 93,33%,

MỤC LỤC

Trang

LOI CAM 09 iiaetna dices ceeds nenenicncndecnhedemeacnpivmenencel iiiMU: LUG sesscessesnssnessasssunsssramaanseannysaes mans sense varscesnaunmeuasmseaaeauseenneresmeneannrmaerecene 1VĐINH HH VI T TY ersenueesoesertsseborsd2gbontelÐkte/cbndig9gipssisigsgfre-Egilioglgsrsei vi

DANH SÁCH CAC HÌNH ” veces Viti

Đặt vẫn đề - S2 s11 1 2221121211121211112121212111111212111212111101011121211110101112121201 xe 10MUG TIỂU zs:cnngbo non tong L1 GL1S G3 EšSNHHEGLSRRIEEQHERGESNEIRESGEEIESSEISGSSGHHIENIGSRSBSULENSDLHESHGRGE1858E80801S88 11

1 11

Chương 'TƠNG QUAN TẤT LIỮU «eeeeeneeaaoeneoensnniuBiiiiiiiiigtihiiitgitiiAE058G006 0085 12

1.1 Tổng quan về bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum - 12

1.1.1 Sơ lược về vi khuân Ralstonia soÏafdC€đfFMIH 5-5-5252 S2+s+£+E+E££z£z+e+ez£zczcxz 12

1.1.2 Triệu chứng gây hại của vi khuẩn Ralstonia solanacearrum : -: 121.1.3 Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh 2 2 +S22E+E£2E2E£E££EzEz£2zEzZzz2zzzzz 13

1„1.4:Biện hấp: PHONG KEU «s-essaseeessesessbkssesnhdioiodiniiSRESulIrSEidBSGggdoisl3S0iB.480800I30i48 128030/2808 14

1.2 Tổng quan về vi khuẩn Erwinia €đf'OfOVOFA -:-2-52-52 522 2222S2+22+2+2+222+25se2 14

1.2.1 Sơ lượt về vi khuẩn Erwinia €afOfOVOY 5-2225 2sSESE+3EEEEEEEEEEEEEErrrrrrrrred 14

1.2.2 Triệu chứng gây hai của vi khuẩn Erwinia earOfOVOFđ : :-2-5z=2 14

1.2.3 Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh 2-2 25222 £2zS+E£EE2Ez£2zE2Ezzzzzzze 15

1.2 As Bist Pap PHOS EG scsssa sang Gá hĩa đa dưgdoegkấb suốt bins eemneiramsnakacisanasnaws sicewauiosia cane 16

1.3 Nam Trichoderma spp .s:s:sccscssssesvsvsseesesesesesessesesssesessesesessesestsseseseseeteseeees 17

1.3.1 Phân loại và phân bố nam Trichoderma spp Phân loại 2-5522 17

1.3.2 Cau tạo tế bảo của Trichoderma Spp -. . :-5:©5:52©525225222222222Ezzszzzccve2 18

1.3.3 Đặc điểm chung của 77icJođÌ@F11i4 5+52-52 5252222222222 222222E2E2zzzrxcre2 18

1.3.4 Cơ chế tác động của Trichoderma đôi với vi khuân hại - 5-55: 20

1.3.5 Yếu tố đinh dưỡng, sinh trưởng và phát triển của nắm 7ichodermma 21

1.3.6 Một số nghiên cứu ngoài nước về nắm 7”ichoderma -: - 252552: 221.3.7 Một số nghiên cứu trong nước về nam 7?ichoderina - 2 22252 5s+s25s 23Chương 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

Ð.1 'Thời gian về địa điểm nghiền BẾN‹aeesceeseseseeniiingndt60001656 012 Ó00000.164600014006196 25

2.2, Vat liệu V8.đỤñp CUATEDICH GỮU c0 1e s0 S65 60 ng n2 HD He 4 HH H2 me, 25

2.2.1 Dụng cụ bà thiết bị máy móc 2-2 ¿+2+S2S22E2ESE2E2E22E2E22225222212122223222, 25

2.2.2 Môi trường dùng trong nghién CỨU: 5 - 5< +22 *++2£*+£eeeeereeerererrrrree 25

2.2.3 Các vi khuẩn trong nghiên CUMU c.cccccccscssessessesssesesessecscseescoeseessetesesseseseens 25

53 Phirongiphiap nghi H:ỮU-ssxesissvissu2igzass6ii0080i680Đ1S8068358061883u63504353392G.ĐĐGRRRRIERIS.S0ĐA 26

2.3.1 Phân lập và định danh nam Trichoderma spp . -2-525252552522525522 26

2.3.2 Phương pháp đánh giá kha năng đối kháng nắm Trichoderma trong điều kiện

PORCHES CEASE ss ctrencrecne cnc ase se i eT TIM ETA 28

2.4 XU ly n4 ĂĂĂĂ 31

Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 5 <s7<©secs+secs+zezsersers 32

3.1 Phân lập nam Trichoderma spp và định danh bằng đặc diém hình thái 32

3.2 Khả năng đối kháng của các dòng Trichoderma spp đối với vi khuân Ralstoniasolanacearum trong điều kiện phòng thí nghiệm -2-©5255225222c22+2zvsssv2 36

3.3 Kha năng đối kháng của các dòng Trichoderma spp đối với vi khuan Erwiniacavotovora trong điều kiện phòng thí nghiệm 2- 2 222+22++2++2++z++z++s+2 38

solanacearum trên hạt cà chua trong điều kiện phòng thí nghiệm 40KET LUẬN VÀ DE NGHỊ 2- 255 5++s£E£veteeretrereererserserersersrrsree 44EEO 44)C TP HÌ sggg2051002)0WHENHGIERERHEGPSNERGENUENHHEEERERNGHSGINGIEIESINEGEIRNGEBISWGLGBĐĐNSSIIGESUEEGIBEUMREHIEEHUEER 44TÀI LIEU THAM KHẢO - 252552 +s+<££++e£+eEeeEeerersereererserxrrree 45

EEE ỒỐỎ 49

DANH SÁCH CHU VIET TAT

CMA Corn Meal Agar

ctv Cộng tác viên

DKKL Duong kinh khuan lac

HSDK Hiệu suất đối kháng

EEL Lan lặp lại

LB Luria Broth

NT Nghiệm thức

NSC Ngày sau cay

PDA Potato Dextrose Agar

DANH SÁCH CAC BANG

TrangBang 2.1 Thông tin địa điểm thu thập mẫu đất - 26Bang 3.1 Đường kính vi khuan Ralstonia solanacearum và hiệu suất đối kháng

của 14 dong Trichoderma spp đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum trong

điều kiện phòng thi nghi@n 0.0 cccccecccceceeeescseeesseeeeseseeeeesesessesesessseesueetseseteneeeeees 36Bang 3.2 Đường kính vi khuẩn Erwinia cavotovora và hiệu suất đôi kháng của 14dong Trichoderma spp đối với vi khuẩn Erwinia cavotovora trong điều kiện

BRöofig thi NghiEM: sessscssssscsizsxxses151555666101641033/3005916946915050016556893680.16661008830H830700GGH0338/4105030010/40/8GG05538 38Bảng 3.3 Hiệu qua phòng trừ bệnh của 2 dòng Trichoderma với vi khuan

Ralstonia solanacearum trên hạt trong phòng thi nghiệm - - - - - 41

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 3.1 Mẫu dat thu được và phân lập bằng phương pháp bẫy nam 32

Hình 3.2 Các mẫu thu Vinamit Organic farm thuộc Xã Phước Sang , Huyện Phú

Giáo, Tinh Bình Dương ở thời điểm 5NSC - 2522222222222 252222121221212212 25Hình 3.3 Các mẫu thu ở các hộ thuộc huyện Bắc Tân Uyên, tỉnh Bình Dương ở

Hình 3.4 Các mẫu thu ở các hộ thuộc Xuân Bắc, huyện Xuân Lộc , tinh Đồng Nai

trước đĩa nắm (A), mặt sau đĩa nam(B), cảnh bao tử (C), bao tử

(D) Hình 3.9 Kha năng đối kháng của các dong Trichoderma với vi khuẩn

Ralstonia solanacearum ở thời điềm 5 NSC 522222222222222252221222222e

Hình 3.10 Khả năng đối kháng của các dòng Trichoderma với vi khuẩnErwinia cavotovora ở thời điểm 5 NSC 2- 5-52 S22222221222212121221211212 xe

Hinh 3.11 Kha năng phòng trừ bệnh của 2 dòng Trichoderma với bệnh héo xanh

do Vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra trên hạt cà chua trong phòng thí

GIỚI THIỆU

Đặt vấn đề

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới nóng âm, mưa nhiều và có nên kinh tế cao về

cây trồng Do đó đã tạo điều kiện thuận lợi cho các vi sinh vật (VSV) xâm nhiễm,phát triển và gây hại trên cây trồng Trong đó, có Ralstonia solanacearum gây

bệnh héo xanh va Erwinia carotovora gây bệnh thối nhũn; đây là những bệnh phô

biến nhất làm chết và gây ton thất nghiệm trọng đến năng suất và chất lượng câytrồng, do đó gây thiệt hại nặng nề cho sản xuất nông nghiệp (Lê Lương Té và VũTriệu Mân, 1999).

Dé phòng trừ bệnh héo xanh và bệnh thối nhữn trên cây trồng, người nông

dân thường phòng trừ bệnh bằng các biện pháp hóa học tuy mang lại hiệu quả caonhưng việc này một mặt sẽ dẫn đến sự kháng thuốc của VSV gây bệnh, mặt kháclàm mat cân bằng sinh thái, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người và

dư lượng hóa chất trong nông sản cũng như gây ô nhiễm môi trường (Trần Văn

Hai, 2009).

Do sự an toàn của con người và môi trường nên sử dụng biện pháp phòngtrừ sinh học thay thế cho các biện pháp phòng trừ hóa học Biện pháp phòng trừsinh học trong sản xuất nông nghiệp nhằm định hướng phát triển nông nghiệp sạch,

an toàn và bền vững, nhiều chủng vi sinh vật hữu ích có khả năng đôi kháng với vi

nam gây bệnh đã được nghiên cứu và ứng dụng vào sản xuất nông nghiệp, dé bảo

vệ môi trường, làm tăng năng suất cây trồng và giá trị của nông sản Trong đó nắm

Trichoderma spp được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi nhờ vào khảnăng đối kháng, ức chế và tiêu diệt vi nam và vi khuan ký sinh gây bệnh với nhiều

cơ chế kiểm soát sinh học khác nhau (Burgess, 2009; Manjur va ctv, 2019)

Trước tình hình đó dé tài “Phân lập nam Trichoderma spp và khảo sát khảnăng đối kháng vi khuân Ralstonia solanacearum và vì khuân Erwiniacarotovora” được thực hiện.

Mục tiêu

Phân lập được nam Trichoderma spp và khảo sát khả năng đối kháng với

vi khuân Ralstonia solanacearum và vi khuẩn Erwinia carotovora

Chương 1

TỎNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tống quan về bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum

1.1.1 Sơ lược về vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Vi khuẩn Ralstonia solanacearum là vi khuẩn hình que, hai đầu hơi tròn, cólông roi ở một đầu, kích thước tế bao 0,5 — 1,5 um, nhuộm gram âm có 1 — 3 lôngroi, hai đầu hoi tròn (Buddenhagen va ctv, 1964) Vi khuẩn thích hợp ở nhiệt độ 25

— 35°C, nhiệt độ tối đa là 41°C, nhiệt độ tối thấp 10°C, nhiệt độ gây chết là 55°C Vikhuân phát triển trên phạm vi rộng pH = 6,8 — 7,2 (Vũ Triệu Man, 2007)

Vi khuẩn t6n tại trong đất, nước, tàn dư thực vật, ký chủ phụ, hạt giống.Chúng xâm nhập vào cây qua vết thương hoặc qua lỗ thở tự nhiên, vết nứt đầu rễ

và đi chuyền vào trong bó mạch, sau đó phá bó mạch làm tắt nghẽn sự vận chuyển

nước và chất dinh dưỡng gây ra bệnh héo xanh trên các cây họ cà, mạnh nhất khi

cây đang trong giai đoạn phát triển

1.1.2 Triệu chứng gây hại của vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Một trong những bệnh nguy hiểm đối với nhiều loài cây trồng là bệnh héoxanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum, đặc biệt là những cây họ cà, họ bau bi,

họ đậu và nhiều loại cây trồng khác (Wicker va ctv, 2007) Bệnh phat sinh cả giai

đoạn cây con và trưởng thành Triệu chứng được biểu hiện ngay sau khi bệnh xâm

nhập vào cây Khi cây còn non toàn bộ lá héo rũ đột ngột và chết nhanh chóng Trêncây đã lớn thì héo đầu tiên ở các lá ngọn héo rũ có màu xanh tái, sau đó các lá phíadưới, các cảnh héo dần vào ban ngày và ban đêm có thé hồi phục, cây bị còi cọc,nhưng sau 2 - 5 ngày toàn cây héo hắn và chết (Agrios, 2005)

Cat ngang đoạn thân cây gân gôc ta thay bó mạch bị hóa nâu, cho vào côc nước, thây có giọt dịch khuân màu trăng sữa tiệt ra Trong điêu kiện âm độ cao

thân cây bị

bệnh dân dân thôi mêm, ân gân miệng vêt cắt có dịch nhờn vi khuân tiệt ra, màu trăng sữa Rê có màu nâu đen và thôi.

Vi khuẩn tôn tại trong đất, nước, tàn dư thực vật, ký chủ phụ, hạt giống

(đậu phộng) Chúng xâm nhập vào cây qua vết thương hoặc qua lỗ thở tự nhiên,

vết nứt đầu rễ và di chuyên vào trong bó mạch, sau đó phá bó mạch làm tắt nghẽn

sự vận chuyên nước va chất dinh dưỡng gây ra bệnh héo xanh trên các cây họ cà,mạnh nhất khi cây đang trong giai đoạn phát triển (Lê Tương Té và Vũ Triệu Man,1998).

1.1.3 Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh

Bệnh phát triển nhanh và mạnh trong điều kiện nhiệt độ cao, mưa gid, phôbiến trên đất cát pha, thịt nhẹ hoặc đất đã nhiễm vi khuân Bệnh xuất hiện rõ khinhiệt độ phải trên 20°C, nhiệt độ đất trên 14°C, 4m độ cao, tưới nhiều, tưới ngậprãnh là điều kiện tốt nhất cho bệnh xâm nhiễm, phát triển và lan truyền dé dang

(Vũ Triệu Mân, 2007).

Thời gian vi khuẩn tồn lưu trong đất phụ thuộc vào nhiều yếu tố như âm độ,nhiệt độ, hóa lý đất Vi khuan có thé tồn lưu trong dat từ 5 — 6 năm, trong cơ thê kýchủ thực vật hoặc trong hạt giống có thể sống tới 7 tháng, còn nếu bám dính trên

bề mặt hạt chỉ tồn tại 2 — 7 ngày (Vũ Triệu Man và Lê Lương Té, 1998)

Vi khuẩn lan truyền chủ yếu bằng nguồn nước, đất như bám dính vào giày

dép, dụng cụ canh tác Bệnh héo xanh vi khuẩn phát sinh phát triển phụ thuộc vào điều kiện đất đai như trên các chân đất cao bệnh thường nặng hơn các chân đất thấp,

đất được luân canh với lúa nước làm giảm tỉ lệ bệnh đáng ké (Đỗ Tan Dũng, 2001)

Thời vụ trồng cũng là yếu tô quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển bệnh,thời vụ trồng có mưa nhiều, âm độ cao làm gia tăng sự phát sinh phát triển bệnh.Phương pháp tưới cũng là điều kiện cần được quan tâm, do nước tưới là nguồn lâylan bệnh chủ yếu Khi đã xâm nhập vào cây, chúng sinh sản rất nhanh khi vào bêntrong làm bít các lỗ mạch, tiết ra độc tố làm các bó mạch hóa nâu, đen và gây ra

hiện tượng héo do cây bị thiếu nước Vi khuẩn có thé di chuyên ra bên ngoài môi

trường đất khi gặp điều kiện thuận lợi, đó cũng là sự tương tác giữa rễ và đất, rễ bị

nhiễm vi khuẩn từ đất và đất bị nhiễm khuẩn khi chúng từ trong cây ra môi trườngđất (Hồ Thanh Hoàng, 2005).

1.1.4 Biện pháp phòng trừ

Việc phòng trị bệnh héo xanh thường rất khó khăn do chúng có phạm vi ký

chủ rộng, có khả năng lưu tồn rất hữu hiệu trong dat (Đỗ Tan Dũng, 2001)

Luân canh cây trồng không phải ký chủ của vi khuẩn Ralstoniasolanacearum là một trong những giải pháp quan trọng giúp giảm mật độ vi khuẩntrong đất và hạn chế tối đa nguồn bệnh từ các tàn dư thực vật ở vụ trước Xử lý vàcải tạo đất bằng việc bón tăng cường phân chuồng, lưu huỳnh, canxi cũng đem lạinhững kết quả khác biệt nhau Sử dụng gốc ghép có thể cung cấp mức độ khángbệnh đáng ké trong khi rễ của cây kháng bệnh và cây man cảm đều bị bệnh xâmchiếm (Huynh Thị Tố Chi và ctv, 2018)

Gieo hạt giống khoẻ, sạch bệnh nên xử lý hạt trước khi gieo bởi chế phẩm

sinh học Phòng trừ sinh học bởi các chế phẩm sinh học, chất kích kháng, chếphẩm thảo mộc Cần áp dụng các biện pháp canh tác và bón phân hợp lý (Jones vàctv, 2005)

Biện pháp dùng thuốc bảo vệ thực vật được cho là ít có hiệu quả trong

phòng chống vi khuân Ralstonia solanacearum do vi khuan này có nguồn gốc từ đấtxâm nhiễm gây bệnh và sinh sản trong hệ thống mạch dẫn của cây

1.2 Tông quan ve vi khuan Erwinia carotovora

1.2.1 Sơ lượt về vi khuẩn Erwinia carotovora

Vi khuẩn phân lập lần đầu tiên trên cả rốt có dạng hình gậy, nhuộm Gram

âm, yếm khí Tuy nhiên, theo nhiều tác gia, Erwinia caratovora là vi khuan ki khítùy nghi nghĩa là chúng có thé sinh trưởng trong môi trường hiếm khi và yếm khí,

có kha năng di động dạng hình gây ngắn, hai đầu hơi tròn, cơ thé có 3 — 14 roidạng tiêm mao, thường tồn tại ở dạng đơn hoặc từng cặp, kích thước nhỏ, khoảng0,8 — 3,2 x 0,5 — 0,8 pm (Vũ Triệu Man, 2007).

1.2.2 Triệu chứng gây hại của vi khuan Erwinia carotovora

Theo Lê Lương Té và Vũ Triệu Man (1999), hiện tượng thối hỏng là hậu

quả của quá trình phá vỡ cấu trúc mô tế bào của cây do tác động chủ yếu của các

enzyme phân giải của vi khuẩn Toàn bộ thịt củ, quả bị thối biến thành một khốinhão, có mùi.

Vết bệnh đầu tiên thường xuất hiện ở các cuống lá già phía dưới gần mặtđất, tạo thành những đốm mọng nước, sau đó thối và nhũn Vết bệnh theo cuống

lá phát triển lên phía trên làm cho cả lá bị vàng và thối nhũn Các lá phía trên cũng

có thé bị bệnh và cả cây bị thối Khi cây bị bệnh, các tế bào trở nên mềm, có nước

và nhớt, có mùi lưu huỳnh.

Giới hạn giữa vùng mô bệnh và mô khoẻ phân biệt rõ ràng Lá ngoài cùngcủa cây bị héo rũ vào ban ngày đến ban đêm có thé phục hồi Nếu bệnh tiếp tụcphát triển thì lá không thé phuc hồi được, héo rũ cụp xuống Nếu nhiệt độ và 4m

độ cao thì toàn bộ lá trên cây bị thối nhữn mau nâu Trong mô bệnh ở lá cũng như

ở thân cây chứa đầy chất dính màu vàng xám, đó là dịch vi khuẩn gây bệnh Bộphận mô cứng, dày như rễ và thân già hoá gỗ cũng có thé bị bệnh phá hại, vết bệnhmàu nâu đen giới hạn trong phạm vi hẹp, không lan rộng và không thối nhữn điểnhình.

1.2.3 Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh

Erwinia cavotovora là là dạng vi khuẩn gây bệnh cơ hội có phổ ký chủ rấtrộng và khả năng lây nhiễm rất mạnh khi ở môi trường cận nhiệt đới và ôn đới

Khả năng Erwinia spp phá hủy thành tế bào thực vật, làm vết bệnh lanrộng, mêm và phân rã là do tác động của các enzyme ngoại bào.

Vi khuân xâm nhập vào cây thông qua con đường tự nhiên như khí không(stomata) và lỗ vỏ, thân, rễ (lenticles) hoặc thông qua vết thương gây ra bởi côn

trùng, động vat ăn cỏ (herbivorus), g1ó (Montesano, 2002).

Chúng thường tổn tại trong hạt giống, nguyên liệu nông sản bị nhiễm bệnh,

trong quá trình canh tác, lưu trữ bảo quản và trong đất nông nghiệp tự nhiên Vi

khuẩn này cũng được tìm thấy trong rễ của một số loại cỏ đại, cây trồng và nướctưới Côn trùng và gió đã tham gia vào sự lây lan của Erwinia spp., nông sản khi bịcôn trùng tấn công hoặc bị ton thuong do tac nhan co hoc sé tao điều kiện tốt cho

vi khuẩn này xâm nhập gây bệnh, từ đó chúng sẽ lây nhiễm khắp nơi do đó côn

trùng cũng là nguyên nhân trong việc gây ra các tác nhân gây bệnh thối nhữn

Quá trình lây nhiễm và phát triển của vi khuân gây thối nhiin được xác định

bởi ba yếu tố: số lượng nguyên liệu, mật độ vi khuẩn gây bệnh và điều kiện môi

trường Nhiệt độ và độ âm là yếu tố quan trọng trong phát triển bệnh và làm ảnhhưởng đến khả năng gây bệnh của vi khuẩn, trong đó độ âm được coi là yếu tốquyết định quan trọng nhất cho sự tăng trưởng và phát triển của vi khuẩn Schober

và Zadoks (1999) cho thấy nhiệt độ và nguồn nước trong quá trình sản xuất củ,quả sau thu hoạch và bảo quản là những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự

tồn tại, phát triển và nhiễm trùng bởi vi khuẩn gây thối nhũn, nhiệt độ thích hop

cho Erwinia spp từ 20 — 38°C

1.2.4 Biện pháp phòng trừ

Dé hạn chế tác hại của bệnh cần áp dụng triệt để các biện pháp phòng trừtong hợp, trong đó việc phòng bệnh là chủ yếu (Lê Lương Té và Vũ Triệu Mẫn,1998) theo đó:

Trong giai đoạn vườn ươm: Cần gieo hạt đúng thời vụ, đất thoát nước tốt,bỏn chủ yếu là phân chuồng phân oai mục Bón vôi khử trùng đất với lượng 40 —

50 kg/sao.

Trong giai đoạn trồng ngoải ruộng san xuất chọn cây khỏe, không bị nhiễmbệnh, trồng đúng mật độ, khoảng cách, đúng tuổi cây Bên cạnh đó, bón phân déphòng trừ bệnh là yếu tố quyết định trong phòng trừ bệnh này Vì vậy bón phânhợp lý, bón theo phương châm nặng đầu nhẹ cuối, bón lót tất cả phân chuông, lân,kali, ure Kip thời phát hiện, xử lý, nhé bỏ cây bệnh dé tránh lây lan Trong quatrình chăm sóc, tránh tạo vết thương cho cây

Trong trường hợp cần thiết có thể sử dụng biện pháp hóa học thuốc trừ bệnh

gốc đồng được sử dụng dé phòng trừ vi khuẩn gây bệnh này khi cây vừa xuất hiện

triệu chứng.

dựa trên cấu trúc phân tử đã được áp dụng (Hồ Đình Hải, 2013) Các loài

Trichoderma thường được biết đến là một loại nam sống trong đất, xuất hiện ởnhiều nơi và nhiều loại đất khác nhau Trong tự nhiên, Trichoderma thường đượctìm thấy trong các vật liệu hữu cơ và vô cơ Chúng nồi tiếng với sự tàn phá với các

loại nam được trồng thương mại nhưng cũng ky sinh ở các loại nam khác trong

rừng và môi trường tự nhiên khác.

Chi nam Trichoderma lần đầu tiên được công bố là một trong những chinam mốc cốt lõi bởi nhà vi sinh vật học người Hà Lan Cristiaan Hendrik Persoon

cách đây hơn 200 năm Trong các chi nam mốc cốt lõi này còn bao gồm:Aspergillus, Cladosporium, Fusarium và Penicillium Chúng có mặt ở hầu hết moinơi và được biết đến với chức năng sinh hóa và hoạt động sống sinh học ảnhhưởng cả mặt tôt và xâu đên con người.

Trong suốt 2 thé ky cho đến năm 2013 đã có trên 150 loài namTrichoderma spp được mô ta Trichoderma được phan chia thành 5 nhóm phụ: Pachybasium, Trichoderma, Saturnisporum, Longibrachiatum, Hypocreanum v6i

một sô loài khác.

Nguôn gôc

Ching năm Trichoderma được phát hiện dau tiên bởi Persoon vào năm

1994, vào thời điểm đầu tiên này ông đã mô tả được 3 loài:

Trichoderma caesium Pers (1794)

Trichoderma nigrescens Pers (1794)

Trichoderma viride var Viride Pers.(1794)

Trong suốt 2 thé kỹ tiếp theo đến năm 1999 các nhà khoa học trên thé giới

đã phát hiện thêm khoảng 90 loài.

Từ năm 2000 trở lại đây đã phát hiện thêm khoảng 50 loài mới Cho đếnhiện nay (2013) đã có trên 150 loài nam Trichoderma được mô tả

1.3.2 Cấu tạo tế bào của Trichoderma spp

Thành phan cấu tạo chủ yếu của Trichoderma spp là chitin và chitosan

(chitin bị deacetyl hóa) Chitin có công thức hóa học (CsH3NOs)n trong đó Cchiếm 47,29%, H chiếm 6,45%, N chiếm 6,89%, O chiếm 39,37% và các thànhphan khác gồm B - glucan, a — glucan, mannoprotein (Siu-Wai Chiu và DavidMoore, 2001), chất mau, lipid (8 — 33%) (Lâm Thanh Hiền, 1999) Màng tế bàodày khoảng 7 um thành phan chủ yếu là lipid (40%) và protein (38%) Nhân phânhỏa, thường hình tròn, đôi khi kéo dài, đường kính khoảng 2 — 3 um Ty thé hình

elip, luôn di động dé tham gia vào quá trình hô hap của tế bào (Lâm Thanh Hiền,

1999).

1.3.3 Dac điểm chung của Trichoderma

Nam Trichoderma spp hiện diện gần như trong tat cả các loại đất và trongmột số môi trường sống khác Đây là những loài nam đất phô biến trên khắp thégiới Chúng là loại nắm được nuôi cấy thông dụng nhất Chung nam Trichoderma

thuộc nhóm nắm nảo toàn (Deuteromycetes hay Fungi Imperfecti), có khuẩn lạc

màu lục (khi tăng trưởng dưới nắng mặt trời)

Đặc điểm hình thái

Theo Kurma và ctv (2012), sợi nắm của Trichoderma không màu, có tốc độphát triển rất nhanh, trên môi trường PDA ban đầu có màu trắng, khi sinh bào từthì chuyên sang xanh đậm, xanh vàng hoặc lục trắng ở một số loài còn có khả năngtiết ra một số chất làm thạch của mỗi trường PDA hóa vàng

Tan nam Trichoderma có màu trong suốt trên môi trường CMD Trên môitrường PDA tản nắm có màu trắng, đôi khi có màu vàng nhạt và có mùi thạch dừa

đặc trưng, ban đầu sợi nắm có mau trắng, khi sinh bào tử chuyền sang xanh đậm,

xanh vàng hoặc lục trăng Ở một số loài còn có khả năng tiết ra một số chất làmthạch của môi trường PDA hóa vàng.

Cuống bao từ của một số loài là một nhóm sợi nắm bện vào nhau Một số

loài khác có cuống bao tử mọc lên từ những cụm hay những nốt san doc theo sợi

nam hoặc ở khu vực tỏa ra của tan nam (7: koningii), có kích thước từ I - 7 um, cóhình đệm rất rắn chắc hoặc dạng như bông không rắn chắc, những nốt san dạng

này được tach dé dàng khỏi bề mặt thạch agar và chúng hoạt động như chéi mam

Bao tử định của Trichoderma là một khỗi tròn mọc lên ở đầu cuối của cuống

sinh bào tử phân nhiều nhánh, mang các bảo tử trần bên trong không có vách ngăn,không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ nhờ chất nhay Đặc điểm nổi bật củanam Trichoderma là dang hinh tring min, mau xanh luc dinh trén cac soi nam,thường xuất hiện dạng khô nhưng ở một số loài có thé được nằm trong giọt chatlỏng màu xanh lá cây hoặc màu vàng (Samuels, 2005; Chaverii, 2003).Chủ yếuhình cầu, hình elip hoặc hình oval với tỉ lệ dai : rộng từ 1 — 1.1m hay hình chữ

nhật với tỉ lệ dài : rộng là hơn 1.4um, đa số các bào tử tron láng, kích thước không

quá 5um.

Môi trường sống và đặc điểm sinh học

Khuan lạc của nam Trichoderma có màu trong suốt trên môi trường thạch

đường bột ngô (CMD) Ở môi trường thạch đường khoai tây (PDA), khuẩn lạc có

màu trăng, đôi khi có màu vàng nhạt và có mùi thạch dừa đặc trưng.

Nam Trichoderma hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh 6 vùng rễ

của cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ, phát triển nhanh ở 25 —

30°C, có một số ít loài Trichoderma tăng trưởng được ở 45°C Sợi nắmTrichoderma phân nhánh mạnh, thường được hình thành ở dang gần như vòng trònđồng tâm ở phần trục chính gần cực Các nhánh sợi nam thường mọc tạo gốc VỚItrục chính khoảng 90 độ ngọn sợi nam thường có dang như ngọn cây thông hay

kim tự tháp (Samuels, 2005; Chaverii,2003).

1.3.4 Cơ chế tác động của Trichoderma đối với vi khuẩn hại

Trichoderma sở hữu nhiều cơ chế khác nhau trong phòng trừ và tiêu diệt

nam bệnh như: hiện tượng kí sinh, sự sản sinh kháng sinh, sự tiết những enzymephá huỷ thành tế bào, khả năng cạnh tranh mạnh chất dinh dưỡng và không gian

sông Nam Trichoderma spp thuộc nhóm nam hoại sinh sống cộng sinh và có khả

năng thúc đây sự phát triển của cây trồng và ngăn ngừa các VSV khác (Chen,2016; Gupta, 2014), thông qua cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống (Singh

et al, 2014), hạn chế sự phát triển của vi khuẩn Ralstonia solanacearum va vìkhuân Erwinia carotovora.

Quá trình đối kháng của nam Trichoderma spp đối với vi khuẩn gây bệnhchủ yếu bằng cơ chế cạnh tranh dinh dương và môi không gian sống Cơ chế cạnhtranh dinh dưỡng và không gian sống được coi là cơ chế có ý nghĩa hết sức quantrong vì sự thiếu dinh dưỡng là nguyên nhân gây chết phổ biến đối với vi sinh vật

Cơ chế này cũng được ứng dụng nhiều và hiệu quả trong kiểm soát sinh học điềukhiển các bệnh do vi khuẩn Nắm Trichoderma có thé biéu hiện tính đối khángthông qua việc cạnh tranh với nấm bệnh về dinh dưỡng, nơi cu trú NamTrichoderma thường định cư trước so với các vi sinh vật Do đó, chúng chiếm các

chỗ định cư cũng như dinh dưỡng của vi sinh vật

Trichoderma có thé cạnh tranh nguồn cacbon, nito và yếu tô tăng trưởngkhác với các vi sinh vật gây bệnh bằng cách chiếm các mô ở hoa và tiêu diệt các tác

nhân gây bệnh tại những vùng bị nhiễm (Gullino, 1992) Trichoderma có thé hòa

tan tốt các chất dinh dưỡng vô cơ trong môi trường rễ cây như: đồng, photpho, sắt,mangan, kẽm và natri giúp cho cây hấp thu tốt các nguồn dinh dưỡng này Ngoài

ra, Trichoderma còn có khả năng làm giảm mức oxy hóa của các kim loại dé tăng

độ hòa tan của những kim loại này, và cũng có thê sản xuât ra các thê mang sắt(siderophores) để vận chuyên các nguyên tổ vi lượng như sắt.

Bên cạnh đó, Trichoderma cũng tác động trực tiếp lên vùng rễ như loại bỏmầm bệnh, làm tăng sự sinh trưởng và phát triển của rễ hoặc từ những điểm màTrichoderma tác động đến sẽ kích thích cây trồng tăng sản xuất các enzym bảo vệ

và các hợp chất kháng sinh nhờ đó giúp cây đề kháng tốt với mầm bệnh (Trần Thị

Thanh Thuần, 2009)

1.3.5 Yếu tố dinh dưỡng, sinh trưởng và phát triển của nắm Trichoderma

Theo Dhingra va Sinclair (1985), tất cả các loài vi sinh vat trong đất có yêucầu về các điều kiện môi trường (độ thông thoáng, ánh sáng, độ âm, nhiệt độ) màtrong khoảng điều kiện đó chúng phát triển và sinh bảo tử tốt nhất

Ánh sáng

Ánh sáng ảnh hưởng khả năng kích thích sự sản sinh bào tử vô tính và hữutính đối với rất các loài thuộc ngành nam mốc Nó có quan hệ mật thiết đến dinhdưỡng và nhiệt độ Ảnh hưởng của ánh sáng đến môi trường nuôi cay đã được thảoluận bởi Leach Marsh và cty cũng đã có các nghiên cứu về ánh sáng ảnh hưởng

đến khả năng sinh bào tử của nam UV hoặc gần với ánh sáng UV có bước sóng

nhỏ hơn 340 nm thường làm tăng khả năng sinh bào tử, nhưng nếu vượt quá bướcsóng 340 nm thì khả năng sinh bào tử bị hạn chế Ánh sáng đỏ rất khó kích thích

sản sinh bao tử Đèn UV hoặc gần với bước sóng của UV được áp dụng dé kích

thích sự sản sinh bào tử Nhiều loài nắm nhạy cảm với ánh sáng đòi hỏi sự chiếusáng liên tục để có thể sản sinh bào tử, nhưng cũng có những loài yêu cầu mộtkhoảng thời gian sáng tối xen kẽ

Nhiệt độ

Nhiệt độ tối hảo cho sự phát triển sinh dưỡng khác với sinh sản và khoảngnhiệt độ tối hảo cho sinh sản bào tử thường hẹp hơn sinh dưỡng Có những loài nắmphát triển và sản sinh bào tử ở một mức nhiệt độ có định, nhưng cũng có nhữngloài nam ưa thích sự thay đổi nhiệt độ ngày đêm Mặc dù nhiệt độ tối hảo của cácloài nắm thường có trong các bài học và nghiên cứu nhưng khi phân lập được mộtloài nào đó cần kiểm tra khoảng nhiệt độ của chúng ở mức chênh lệch từ 4 — 5°C

Không khí

Dư thừa CO› hoặc NH: có thé làm hạn chế khả năng sinh bào tử của các visinh vật Các yêu tố khác cũng ảnh hưởng đến khả năng phát triển va sinh bao tửcủa vi sinh vật trong đất đặc biệt là tỷ lệ C/N, pH môi trường nuôi cấy, nồng độ Oz

CO, trong không khí và loại môi trường sử dụng.

1.3.6 Một số nghiên cứu ngoài nước về nam Trichoderma

Theo Kubicek va Harman (1998), từ đầu thế ky XIX thì giống Trichoderma

đã được biết đến và có sự liên quan với dạng teleomorphs Fr, nhưng sự phân loại

loài sinh học này là cực kì khó đối với giống này về mặt hình thái

Cuối thế kỷ XX, các đữ liệu phân tử và kết quả phân tích DNA được sửdụng nhiều trong những nghiên cứu về định danh và phân lập Một số kết qua là 7:

viride, T atroviride, T koningii có quan hệ rat gần với T.harzianum, nhưng điểm

khác là loài này phát triển ở 35°C sản xuất ra mùi dừa có hoạt lực cao (chất khangsinh — pyrone) và loài này Trichoderma không thé có khả năng thích nghỉ với điềukiện 4m độ thấp, biên độ nhiệt độ lớn và trên nhiều cơ chất khác nhau Tuy nhiên

chưa có tài liệu nào chứng minh có thé phân lập được Trichoderma trong các lớp

mô thực vật năm sâu dưới lớp vỏ cây.

Nam Trichoderma không những tiêu diệt được nhiều loài nam gây hại câytrồng mà còn có tác dụng cải thiện cau trúc và thành phần hóa học của dat, daymạnh sự phát triển của vi khuân nốt san cố định đạm trong đất và kích thích sựphát triển của cây trồng, ức chế các vi sinh vật gây bệnh (Emxep, 1989)

Nam đối kháng là những thành viên phổ biến của hệ vi sinh vật dat, chúng

thường tiết các men gây độc cho nam gây bệnh hoặc nam đối kháng cạnh tranh

gây độc cho nam gây bệnh Nam đối kháng có thé kiềm hãm sự sinh trưởng vàphát triển của nam gây bệnh, giúp cây phục hồi nhanh, điều này đã được nhiều nhà

khoa học nghiên cứu và khẳng định Khi nghiên cứu về vi sinh vật đất nhận thấy

loại nam Trichoderma spp là một trong những loài nam đối kháng cao và được

nghiên cứu ở rộng rãi ở nhiêu nước (Jonnie, 2000).

Năm 2003, Chaverri và ctv đã chứng minh rằng Tharzianum là một loài phức

tạp, trong giới hạn của những phổ hệ phát sinh loài và hình thái học của loài này

tồn tại, có nhiều sự khác nhau về gen và hình thái trong những loài này

Tharzianum đã được nhận diện như là nguyên nhân gây bệnh mốc xanh trên nhữngnam đại được phát triển thương mại ở Châu Âu và Bắc Mỹ Việc phân tích chuỗiDNA và quan sát một cách can thận về hình thái đã cho thấy rằng loại nắm gây ramốc xanh trên nam lớn là một loài mới và có quan hệ với 7 harianum Loài mớinày là T.aggressivum, phát triển kém ở 35°C, trong khi 7: harzianum phát triển vàhình thành bào tử rất tốt

Nghiên cứu nam Trichoderma spp và sản xuất chế phẩm sinh học dé hạnchế gây bệnh như: Rhizoctonia, Sclerotium, Fusarium, Pythium, việc sử dụng các

chế pham sinh hoc hay lợi dụng vi sinh vat đối kháng trong đất dé tiêu diệt nambệnh đã được ứng dụng trong sản xuất đậu phụng ở nhiều nước trên thế giới Một

số loại nam đối kháng có hiệu quả cao trong ức chế, cạnh tranh, tiêu diệt nam gâythối trang hại đậu phụng như: Trichoderma viride, Trichoderma harziamum Đã cónhiều nghiên cứu thé hiện được khả năng ức chế kiêm soát được nhiều vi sinh vậtgây bệnh như: Sclerotium rolfsit, Phytothora, Fusarium pythium, Rhizoctonia gaybénh trén nhiéu loai cay trong: cây ho đậu, cây ăn trái, ho hòa thảo, cây côngnghiệp và cây hoa kiểng (Hajieghrari, 2010)

1.3.7 Một số nghiên cứu trong nước về nam Trichoderma

Các kết quả nghiên cứu của Đại học Cần thơ, Viện Lúa Đồng Bằng Sông

Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho thấy

hiệu quả rất rõ ràng của nam Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng bằng sôngCửu Long và Đông Nam Bộ Các nghiên cứu cho thấy nam Trichoderma có khả

năng tiêu diệt nấm Furasium solani (gây bệnh thối rễ trên cam quýt, bệnh vàng lá

chết chậm trên tiêu) hay một số loại nấm gây bệnh khác như Sclerotium

rolfsii, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani.

Công dụng thứ hai của nam Trichoderma là khả năng phân huỷ cellulose,

phân giải lân chậm tan Lợi dụng đặc tính nay người ta đã trộn Trichoderma vàoquá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh dé thúc day quá trình phân huỷ hữu cơ đượcnhanh chóng.

Năm 2006 — 2010, Lê Dinh Đôn và công ty đã nghiên cứu về tính đa dang

về loài của nam Trichoderma tại một số vùng sinh thái khác nhau ở phía nam ViệtNam Kết qua đã phân được 278 mẫu có nam Trichoderma, định danh được 14 loài

bằng hình thái tan nam, đánh giá 129 mẫu đối kháng với nắm bệnh, ghi nhận đượckết qua 20 mẫu kháng mạnh với 4 loại nắm bệnh phô biến: Rhizoctonia solani

Phytophthora capsici, Sclerotium rolfsii, Fusarium spp., 58 mẫu không đối kháng

với nam Fusarium, Sclerotium.

Năm 2017, Võ Thi Thu Oanh va ctv đã tiến hành đánh thí nghiệm đánh giákhả năng đối kháng của một số dòng nam Trichoderma đôi với Phytopythiumhelicodes trong điều kiện phòng thí nghiệm Kết quả cho thấy, các dong namTrichoderma sử dụng trong thí nghiệm đều cho hiệu quả đối kháng cao từ 59% —

69%.

Theo Đỗ Tan Dũng (2006), nam đối kháng Trichoderma có thé sử dụngtrong phòng trừ bệnh héo rũ gốc mốc trang (Sclerotium rolfsii) hại cây trồng can,hiệu quả phòng trừ cao đạt 86,5% (trên cây đậu phụng) và 94,4% (trên cây đậutương) trong điều kiện chậu cây Trichoderma có thé sử dụng dé phòng trừ bệnh lở

cô rễ (Rhizoctonia solani) hại cây trồng cạn, hiệu quả phòng trừ cao đạt 85,9% (trêncây cà chua) và 77,8% (trên cây dưa chuột) trong điều kiện chậu cây

Trichoderma là tác nhân kiểm soát sinh học đối với nhiều loại nam gây bệnhtrên cây trồng cũng như cây cao su như Phytophthora, Fusarium, Rhizoctonia,Colletotrichum, Corticium Từ kết quả nghiên cứu trong việc sản xuất bao tửtrên cơ chất bã mía của chủng Trichoderma harzianum NAD101 (chủng nam đượcphân lập tại Bình Dương và có khả năng đối kháng mạnh với nam Corticium

salmonicolor trong phòng thí nghiệm) Bào tử của chủng Trichoderma harzianumNAD101 đã được thử nghiệm khả năng phòng trị bệnh nấm hồng trên quy mô

vườn thực nghiệm (Nguyễn Anh Dũng và ctv, 2018)

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 05 năm 2023 đến tháng

02 năm 2024.

Các thí nghiệm được tiễn hành tại phòng thí nghiệm và nhà lưới bộ môn Bảo

vệ Thực vật khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

2.2 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu

2.2.1 Dụng cụ bà thiết bị máy móc

Dia petri (đường kính 90 mm), bình tam giác thủy tinh (250 ml), pipet, thước

đo, que cấy, đèn cồn, giấy lọc.

Tủ cấy khử trùng (IIA2 — 4E8, Esco, Singapore), nồi hấp khử trùng MC40L,

ALP, Japan), máy sấy khử trùng (N10, Memmert, German), cân điện tử (PX224,

Ohaus, Mỹ), bếp điện, lò vi sóng, máy lắc Vortex- ZX3 (Velp, Ý), máy NanoVueTMPlus (SCIE-PLAS LTD, Boichrom, Anh), kính hiển vi (CX23, Olympus, Japan)

2.2.2 Môi trường dùng trong nghiên cứu:

Môi trường WA (water agar): 20 g agar, 1000 mL nước cất

Môi trường PDA (Potato-Dextrose-Agar): 200 g khoai tây, 20 g Dextrose,

20 g agar, 1000 ml nước cất

Môi trường LB - Luria Broth: thành phan 1 lit peptone 10 g, cao nam men 5 g, NaCl

10 g, agar 20 g, nước 1000 mL Hap khử trùng ở 121°C trong 20 phút.

2.2.3 Cac vi khuẩn trong nghiên cứu

Vi khuẩn Ralstonia solanacearum chủng CXT2 gây bệnh héo xanh và

Bảo vệ Thực vật, khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phó

Hồ Chí Minh

Hình 2.1 Vi khuẩn Ralstonia solanacearum ching CXT2 (A) va Erwinia

carotovora chung HLDT2 (B).

2.3 Phuong pháp nghiên cứu

2.3.1 Phân lập và định danh nam Trichoderma spp

Phương pháp thu mẫu

Các mẫu đất được thu thập ở độ sâu tầng đất từ 15 — 20 em với lượng đất500g đất/mẫu được đựng trong hộp nhựa có nắp, dán nhãn ghi thông tin mẫu(Kumar va ctv 2012) Các mẫu đất được thu thập tại tinh Đồng Nai, Binh Dương

Quy ước đặt tên mẫu: T- nơi lay mẫu (Tinh), thứ tự phân lập được trong mẫu dat

Ví dụ: mẫu đất thu thập tại thứ 1 của tinh Bình Dương là T-BDO1

Bảng 2.1 Thông tin địa điểm thu thập mẫu đất

Bắc Tân Uyên, Bình Dương

Bắc Tân Uyên, Bình Dương

Bắc Tân Uyên, Bình Dương

11°21'51.2"N 106°46'17.6"E 11°21'51.2"N 106°46'17.6"E 11921'51.2"N 106°46'17.6"E 11°05’24.9°N 106°88748.7°E

11°05’24.9"N 106°88748.7°E 11°21°79.2”N 106° §8°50.5”E

T-BD07 Bắc Tân Uyên, Bình Dương 11°21°79.2”N 106° 88°50.5”ET-DNO8 Xuân Bắc, Xuân Lộc, Đồng Nai 11°01?56.37”N 107°29°39.7”ET-ĐN09 Xuân Bắc, Xuân Lộc, Đồng Nai 11°01°56.3”N 107°29°39.7”ET-ĐNI0 Xuân Bắc, Xuân Lộc, Đồng Nai 10°99°87.4”N 107°28°81.6”ET-ĐNII Xuân Bắc, Xuân Lộc, Đồng Nai 10°99°87.4”N 107°28°81.6”ET-ĐNI2 Xuân Bắc, Xuân Lộc, Đồng Nai 10°99°87.4”N 107°28°81.6”ET-DN13 Lang Minh, Xuân Lộc, ĐồngNai — 10°87?73.5”N 107°35°85.7”E

T-ĐNI14 Huyện Xuân Lộc, tinh ĐồngNai — 10°87'73.57N 107°35'85.7”E

Phương pháp phân lập

Nam được phân lập từ đất bằng kĩ thuật đặt bẫy dùng giấy lọc Các mẫu đất

được phơi khô và nghiền nhỏ, sau đó đất nghiền được cho vào đĩa petri đường

kính 8cm với lượng khoảng 2/3 đĩa Các mảnh giấy lọc vô trùng, kích thước 1x1

em được đặt trên bề mặt đất trong đĩa petri Cac đĩa đất được ủ trong tủ định ôn ởđiều kiện 28°C và hàng ngày kiểm tra sự hình thành quả thể trên bay giấy Khi quathé xuất hiện thì chuyển lên môi trường WA có bổ sung kháng sinh ampicillin(100 mg/l) và streptomycin (100 mg/l), sau đó, tiếp tục cấy truyền lên môi trườngPDA để làm thuần (Soytong và Quimino, 1989)

Đặc điểm hình thái của loài nắm Trichoderma spp

Nam được quan sát hình thái, màu sắc tan nắm, bào tử nắm, hình dạng cảnh

sinh bào tử, thể bình, cách mọc trên môi trường PDA Dưới kính hiển vi ở vật kính40X, quan sát các loại bào tử, thể bình, đo ngẫu nhiên bào tử và thể bình ở mỗi loạitheo kích thước chiều dài và chiều rộng Hình dạng cành sinh bào tử: cành sinh bào

tử của nam Trichoderma là một nhóm sợi nam bện vào nhau, cảnh sinh bào tửkhông màu, mọc lên từ những cụm dọc theo sợi nam Trên cành sinh bào tử cóđính các thể bình là những tế bao phình to có dạng bình thót cổ, mọc theo cụm

hoặc mọc riêng lẻ tùy loài, trên đầu thể bình có đính bào tử Hình dạng thé bình:

thé bình có thé mọc đơn lẻ hoặc mọc theo cụm từ 2 — 4 cái/cụm, trên các thé bình

có đính các bao tử Hình dạng, mau sắc bào tử: bào tử màu xanh, có nhiều hìnhdạng khác nhau, có khi hình tròn, hình cầu, hình trứng, hình elip, một sé

hình trứng (Kumar và ctv., 2012).

2.3.2 Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng nắm Trichoderma trong điều

kiện phòng thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng trên đĩa peptri

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố gồm 15nghiệm thức, tương ứng với 14 dòng Trichoderma phân lập được và 1 đối chứngvới 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 3 đĩa petri Nghiệm thức đối chứng là vikhuẩn Ralstonia solanacearum và vi khuẩn Erwinia carotovora được nuôi trong

dia petri chứa môi trường LB.

Các thí nghiệm đánh giá kha năng đối kháng được tiễn hành theo phươngpháp của Trần Thị Thu Hà và Phạm Thanh Hòa (2012)

Phương pháp thực hiện

Sử dụng môi trường PDA Trên cùng một dia petri 9cm tiến hành cấy cả nấmTrichoderma và vi khuẩn bệnh déi xứng trên cùng một đĩa môi trường Nghiệm thức

đối chứng chỉ cấy khuẩn bệnh (Trần Thị Thu Hà và Phạm Thanh Hoà, 2012) Vi khuẩn

bệnh cấy bang cách nhỏ 5 uL (nồng độ 10° CFU/mL) vào vị trí

VK TR VK

T

Đĩa đối chứng Đĩa thí nghiệmHình 2.2 Bồ Trí thí nghiệm đối kháng giữa Trichoderma với vi khuẩn gâybệnh trong điều kiện trong phòng thí nghiệm

Thí nghiệm tiến hành 3 NT:

NT 1: Nấm Trichoderma spp

NT 2: Nam Trichoderma spp và vi khuẩn gây bệnh

NT 3: Vi khuan gây bệnh.

Đo đường kính khuân lạc của vi khuẩn gây bệnh sau 5 ngày nuôi cấy dé

tính % hiệu quả ức chế và mức độ đối kháng

Công thức tính hiệu quả ức chế trong phòng thí nghiệm ký hiệu PIRG

PIRG (Percent Inhibition of Radical Growth)% = [(R1- R2)/R1] x 100.

Trong đó:

+ PIRG (%): Hiệu quả ức chế

+ R1(mm): là trung bình đường kính khuẩn lạc của vi khuẩn gây bệnh cay đối chứng + R2 (mm): là trung bình đường kính khuẩn lạc của vi khuẩn khi cấy với đối kháng

Đánh giá hiệu suất đối kháng: theo thang đánh giá của Soytong (1988)

HSĐK > 75%: có khả năng đối kháng rất cao

HSDK từ 61% đến 75%: có kha năng đối kháng cao

HSĐK từ 51% đến 60%: có khả năng đối kháng trung bình

HSĐK < 50%: có khả năng đối kháng thấp

Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng phòng trừ của nam Trichoderma

với vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên hạt cà chua trong phòng thí

nghiệm

Chuẩn bị: Hạt giống cà chua được rửa bằng cồn 70° trong 30 giây Ủ hạt

trên giấy thấm vô trùng âm đặt trong dia petri, giữ ở nhiệt độ phòng 27 - 30°C

Nguồn nam Trichoderma spp được nuôi trên môi trường PDA 5 ngày 10 mLnước cất vô trùng được cho vào từng đĩa petri, dùng lam kính sạch cạo nhẹ phầnsợi nắm, lọc qua vải lọc đã vô trùng, thu được huyền phù bào tử nam Mật số bào

tử nắm được đếm trên buồng dém bào tử và điều chỉnh đến mật số 10 bào tử/mLDịch vi khuẩn héo xanh: Nuôi vi khuân CXT2 trong môi trường LB lỏng, lắc

khuân trên máy lắc ở nhiệt độ phòng Sau 24 giờ, pha loãng trong nước cất vô trùng

dé đạt mật độ 10° CFU/ml

Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm đơn yéu tố được bố trí hoàn toàn ngẫu

nhiên, với 8 nghiệm thức trong đó có 2 nghiệm thức đối chứng, mỗi nghiệm thức

là 1 đĩa petri, mỗi đĩa 10 hat cà chua, 3 lần lặp lại

- NTI: xử lý nam Trichoderma |

Phương pháp thực hiện: Theo phương pháp Silva và ctv (2003), có cải tiến

Thí nghiệm phòng bệnh: Khi hạt nảy mầm khoảng 0,5 — 2 mm, ngâm hạt vao dịch

dich phù huyền bào tử 10° bào tử/mL Trichoderma spp đã chuẩn bị trong 30 phút Vớt hạt làm khô trên giấy thấm vô trùng, tiếp tục ngâm hạt vào vi khuẩn bệnh CXT2 trong 30 phút Vớt hạt làm khô

trên giấy thấm vô trùng, cấy vào dia petri chứa sẵn môi trường WA (10 hạt trên một dia petri), ding

giấy bạc bọc một nửa đĩa petri để ngăn ánh sáng chiếu vào rễ và đặt nghiêng một góc 60°, đặt ở nhiệt

độ phòng.

Thí nghiệm trừ bệnh: Khi hạt nảy mầm khoảng 0,5 — 2 mm, ngâm hạt vào dịch

vi khuan bệnh CXT2 đã chuẩn bị trong 30 phút Vớt hạt làm khô nhanh trên giấythâm vô trùng, tiếp tục ngâm hạt vào dịch dịch phù huyền bào tử 10° bào tử/mLTrichoderma spp trong 30 phút Vớt hạt làm khô nhanh trên giấy thấm vô trùng,cấy vào đĩa petri chứa sẵn môi trường WA (10 hạt trên một đĩa petri), dùng giấy

bạc bọc một nửa đĩa petri để ngăn ánh sáng chiếu vao rễ va đặt nghiêng một góc

60°, đặt ở nhiệt độ phòng.

Chỉ tiêu theo dõi: Ở thời điểm 7 ngày sau khi đặt hạt cà chua vào đĩa petri

Chiều dài thân (mm): đo từ gốc đến ngọn Chiều dài rễ (mm): đo từ gốc chođến đỉnh rễ dài nhất Khối lượng tươi (mg): cân khối lượng tất cả các cây trongđĩa Khối lượng khô (mg): cân khối lượng khô của cây sau khi sây ở 70°C đến khiđạt trọng lượng không đồi