VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Địa điểm thực hiện: phòng thí nghiệm công ty Tiên Phong Địa chỉ: lô
23 Đường Tân Tạo, Khu Công nghiệp Tân Tạo, quận Bình Tân TP.HCM
2.1.2 Nguồn mẫu bệnh và mẫu đối kháng dùng trong nghiên cứu
Mẫu bệnh cây và đất từ các khu vực trồng cây ăn quả (cam quýt) tại huyện Mỏ Cày Bắc, tỉnh Bến Tre đã được thu thập Mục tiêu là phân lập nấm Trichoderma sp và xác định chủng gây bệnh thối trên cây cam quýt đang nhiễm bệnh cũng như cây cam quýt khỏe mạnh.
Vi sinh vật gây bệnh Được phân lập từ mẫu rễ cây và đất ở khu vực cây bị bệnh ở các nhà vườn huyện Mỏ Cày Bắc tỉnh Bến Tre
Nấm đối kháng được phân lập từ các mẫu cây khỏe tại các nhà vườn cùng địa điểm với khu vực lấy mẫu nấm gây bệnh Các chủng nấm T01, T24 và T29 cũng được sử dụng để đánh giá khả năng của nấm phân lập từ vườn so với các chủng nấm có sẵn trong ngân hàng giống của công ty cổ phần công nghệ sinh học Tiên Phong.
2.1.3 Trang thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 2 1 Các dụng cụ sử dụng trong quá trình thực hiện đề tài
Stt Dụng cụ DVT Stt Dụng cụ DVT
1 Đĩa petri Cái 9 Ống nghiệm Cái
2 Cốc thủy tinh Cái 10 Chai thủy tinh Cái
3 Pippet 1,2,5,10 ml Cái 11 Micro pippet Cái
4 Que trang Cái 12 Que cấy mốc Cái
5 Que cấy vòng Cái 13 Quả bóp cao su Cái
6 Đèn cồn Cái 14 Panh kẹp Cái
7 Ống nhỏ giọt Cái 15 Lame+lamelle Hộp
8 Ống đong Cái 16 Phễu Cái
Bảng 2 2 Các thiết bị được sử dụng trong quá trình thực hiện đề tài
Stt Thiết bị Xuất xứ
5 Kính hiển vi Novex Holland Hà Lan
6 Cân phân tích hai số AI
7 Máy khuấy từ VELP Italia
9 Nồi hấp khử trùng Nga
10 Máy vortex KIA 2.1.3.3 Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong đề tài được thể hiện trực tiếp bên dưới các môi trường sử dụng
2.1.3.4 Các môi trường sử dụng trong đề tài nghiên cứu (Jeffers, 2006) a) Môi trường phân lập và giữ giống nấm Trichoderma sp là môi trường PDA (Potato Dextrose Agar)
Bảng 2 3 Thành phần môi trường PDA
Để pha môi trường nuôi cấy, bạn cần cân 400g khoai tây, gọt vỏ và cắt nhỏ, sau đó cho vào 500ml nước cất và đun sôi Sau khi nguội, lọc lấy nước và bỏ xác, tiếp theo cân 20g dextrose và 20g agar, cho vào dung dịch và dùng nước cất để định mức đủ 1 lít môi trường trước khi hấp Sau khi hấp, bổ sung môi trường với stock kháng sinh, kháng khuẩn (3P) nếu cần phân lập Phytophthora Môi trường phân lập Phytophthora sp có thể sử dụng nước quả V-8-agar (V8J), hoặc thay thế bằng nước sinh tố cà chua, cà rốt, hoặc cần tây lớn (Uchida, J.Y et al 1986).
Bảng 2 4 Thành phần môi trường V-8J-agar
Nước V8 (nước cà rốt) đã lọc 200ml
Nước cất Bổ sung cho đủ
1000ml c) Môi trường phân lập Phytophthora Cornmeal Agar (CMA) (McGinnis,
Bảng 2 5 Thành phần môi trường CMA
Để pha môi trường thu nhận bào tử của nấm Phytophthora sp, bạn cần cân 50g bột bắp thô (màu vàng) và hòa với 500ml nước cất, sau đó đun nhỏ lửa trong 30 phút Sau khi nguội, lọc lấy nước và bỏ xác bột bắp Tiếp theo, cân 15g agar và cho vào dung dịch, sau đó điều chỉnh với nước cất đủ 1 lít môi trường và đem hấp Trước khi đổ vào đĩa, bổ sung vào môi trường stock kháng sinh, kháng khuẩn (3P) Môi trường này được gọi là thạch nước cất agar WA theo nghiên cứu của Harris, J (1986).
Bảng 2 6 Thành phần môi trường Water agar (WA)
Nước cất 1000ml e) Môi trường phân lập nấm Phytophthora Carot Agar (CA)
Bảng 2 7 Thành phần môi trường CA
Để pha môi trường, bạn cần gọt vỏ 400g cà rốt đã cắt nhỏ và cho vào 500ml nước cất Đun nhỏ lửa trong 30 phút, sau đó để nguội và lọc lấy nước, bỏ xác Cuối cùng, cân 15g agar và cho vào dung dịch, dùng nước cất để định mức cho đủ.
Sau khi hấp 1 lít môi trường, trước khi đổ vào đĩa, cần phân lập Phytophthora sp và bổ sung vào môi trường stock kháng sinh, kháng khuẩn (3P) Hỗn hợp kháng sinh kháng khuẩn này sẽ được thêm vào môi trường phân lập Phytophthora sp để đảm bảo hiệu quả trong quá trình nuôi cấy.
Bảng 2 8 Thành phần hỗn hợp kháng sinh kháng khuẩn bổ sung vào môi trường phân lập Phytophthora sp
Thành phần Stock (mg/ml)
Lượng ml bổ sung vào môi trường
Nồng độ cuối cùng (μl/ml)
Polymixin B (kháng vi khuẩn G-) 50 1 20-50 g) Môi trường nhân giống nấm bệnh để ra vườn và chủng ngược trên mẫu cây con Môi trường hạt kê vỏ trấu
Để pha môi trường, ngâm hạt kê và vỏ trấu trong 24 giờ để ráo nước, sau đó trộn đều với tỷ lệ 1:1 Sử dụng phễu để cho hỗn hợp đã trộn vào chai nhỏ 250ml, sau đó đậy nắp bằng bông Tiến hành hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C với áp suất 1atm trong 15 phút Thành phần môi trường thạch CMC được sử dụng để định tính khả năng sinh enzyme cellulase.
Nước cất Thêm vào vừa đủ 1000ml
Để pha môi trường, cần cân chính xác 1% CMC và từ từ cho vào nước cất để tránh vón cục Tiếp theo, cho agar vào môi trường với hàm lượng 2% Sau đó, hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút ở áp suất 1 atm, rồi đổ hỗn hợp vào đĩa petri Lưu ý chọn các đĩa có kích thước đồng đều.
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1.1 Phân lập mẫu bệnh (Mohsin Tariqet al,2009)
Sau khi thu thập mẫu bệnh từ vườn cam, bao gồm mẫu rễ, lá và đất, chúng tôi tiến hành phân lập nấm bệnh Đất được xử lý sơ bộ trước khi phân lập, trong khi mẫu rễ được khử trùng và cấy trên môi trường PDA có bổ sung kháng khuẩn phù hợp Sau khi phân lập, các nấm bệnh được cấy chuyền trên môi trường WA để quan sát hình thái vi thể Cuối cùng, các chủng nấm bệnh được xác định và cấy ngược lên cây con để xác minh nguyên nhân gây bệnh vàng lá thối rễ trên cây có múi.
2.2.1.2 Phân lập nấm Trichoderma sp (Mohsin Tariqet al,2009)
Sau khi thu mẫu đất từ cây cam khỏe mạnh, tiến hành phân lập bằng phương pháp pha loãng và cấy mẫu trên môi trường PDA có bổ sung kháng sinh diệt vi khuẩn Sau 4 ngày ủ ở nhiệt độ 20-25°C, lựa chọn các chủng nấm thích hợp và cấy chuyền trên môi trường WA để quan sát hình thái và bào tử của nấm Cuối cùng, giữ giống nấm trên môi trường PDA để bảo tồn.
2.2.1.3 Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma sp với nấm bệnh
Sau khi phân lập 3 chủng nấm bệnh và 2 chủng nấm Trichoderma sp., cùng với 3 chủng nấm từ bộ sưu tập giống của công ty Tiên Phong, chúng tôi tiến hành cấy đối kháng trên môi trường PDA với các đĩa có kích thước đồng nhất Các mẫu được ủ trong cùng điều kiện môi trường nuôi cấy và được đo lường hàng ngày trong 14 ngày Kết quả cho phép tính toán tỉ lệ ức chế (hay chỉ số đối kháng), tốc độ tăng trưởng của nấm trong giai đoạn đối kháng và thời gian đối kháng Các mẫu đối chứng bao gồm nấm bệnh và nấm Trichoderma sp được nuôi riêng rẽ trong cùng thời gian và điều kiện nuôi cấy.
2.2.1.4 Đánh giá hiệu quả đối kháng của Trichoderma sp đối với nấm gây
Tiến hành gieo cây con trước khi thí nghiệm Ta thực hiện bố trí các nghiệm như bảng 2.9
Bảng 2 9 Bảng bố trí thí nghiệm cấy đối kháng ra vườn
STT Nghiệm thức 0 ngày 7 ngày
Quan sát mức độ gây hại của nấm bệnh được thực hiện vào các thời điểm 2, 4 và 6 ngày sau khi cấy nguồn bệnh Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác của kết quả.
Chỉ tiêu theo dõi: ghi nhận tỉ lệ cây bệnh, tỉ lệ cây chết tình trạng bệnh của cây tại các thời điểm 2, 4, 6 ngày sau khi cấy nguồn bệnh
2.2.2.1 Phương pháp thu mẫu đất
Để phân lập nguồn bệnh từ đất của cây cam quýt bị bệnh, sử dụng ống nhựa có đường kính vừa đủ và cắt nhọn đầu để dễ dàng lấy mẫu đất ở độ sâu 15-30 cm, nơi vi sinh vật tập trung nhiều nhất Việc lấy mẫu cần thực hiện ở cả vùng cây bị nhiễm bệnh và cây khỏe mạnh, mỗi mẫu khoảng 100-200g đất được cho vào túi nhựa Sau đó, mẫu đất được phơi dưới ánh nắng mặt trời trước khi tiến hành pha loãng và phân lập trên môi trường chọn lọc.
2.2.2.2 Phương pháp thu nhận mẫu rễ bị nhiễm bệnh
Khi phát hiện cây có triệu chứng vàng lá và thối rễ, cần thu mẫu rễ cây bệnh ngay lập tức Mẫu rễ này nên được cho vào túi nhựa, ghi rõ ngày và địa điểm thu mẫu, sau đó tiến hành phân lập mẫu trong phòng thí nghiệm càng sớm càng tốt.
Trong quá trình phân lập mẫu từ rễ, cần chú ý không khử trùng lá quá mức, vì chất khử trùng có thể tiêu diệt cả nấm bệnh mà chúng ta đang muốn phân lập.
2.2.2.3 Phương pháp khử trùng mẫu
Sau khi phân lập mẫu bệnh trong phòng thí nghiệm, cần rửa sơ bộ bằng nước máy và cắt nhỏ các vết bệnh có kích thước khoảng 0,5 x 0,5 cm Tiếp theo, khử trùng mẫu bằng cồn 70 độ trong 1 phút để loại bỏ vi khuẩn, sau đó dùng bông thấm nước để làm khô cồn trên mẫu Mẫu cần được rửa lại bằng nước cất vô trùng từ 2 đến 3 lần để loại bỏ hoàn toàn cồn Cuối cùng, dùng bông thấm nước để làm khô nước còn sót lại và cấy mẫu trên môi trường PDA có bổ sung kháng khuẩn.
2.2.2.4 Phương pháp phân lập nấm bệnh từ mẫu rễ cây và mẫu lá bị bệnh (Mohsin Tariq et al, 2009)
- Rửa sạch cát bụi dính trên mẫu lá và rễ cây bệnh
- Ngâm mẫu rễ bệnh ngập trong cồn 70% khoảng 1 phút để loại bỏ các vi khuẩn bám trên rễ
- Rửa mẫu bằng nước cất vô trùng (thực hiện 2-3 lần)
- Thấm khô nước bằng bông thấm, cắt mẫu rễ, lá thành từng đoạn nhỏ dài khoảng 0.5 cm
- Đặt các đoạn rễ, lá vừa cắt vào môi trường phân lập (PDA/CMA)
- Đem ủ môi trường nuôi cấy ở nhiệt độ 28 0 C trong 2-4 ngày
- Quan sát kết quả hình thái khuẩn lạc trên đĩa môi trường
- Quan sát vi thể nấm trên kính hiển vi
Chủng ngược mẫu nấm bệnh được phân lập trên cây con khỏe mạnh để quan sát triệu chứng bệnh Phương pháp lây bệnh nhân tạo đã được thực hiện theo mục 2.2.1.3.
- Cấy chuyền giữ giống cho các thí nghiệm tiếp theo
2.2.2.5 Phương pháp pha loãng mẫu
Phương pháp này dùng cho các mẫu đất:
Các mẫu đất cần được xử lý trước bằng cách phơi khô dưới ánh nắng mặt trời trong 2-3 ngày Sau đó, sử dụng rây để loại bỏ các hạt cát và sạn có kích thước lớn hơn 2-3 mm.
Cân 1g đất đã xử lý và cho vào 9 ml nước cất vô trùng Sử dụng máy vortex để hòa tan hoàn toàn đất trong nước Để hỗn hợp yên khoảng 30 phút nhằm kích hoạt các thành phần.
Pha loãng mẫu với các nồng độ pha loãng khác nhau khoảng 10 -4 , 10 -5 là hai nồng độ thích hợp để phân lập mẫu trong đất ở Việt Nam
Hút 0.1 ml dịch pha loãng ở hai nồng độ trên cấy trang trên đĩa petri chứa môi trường PDA có bổ sung chất kháng khuẩn Đem ủ đĩa petri ở nhiệt độ phòng Phân lập các nấm sợi từ những khuẩn lạc riêng lẻ trên đĩa thạch sau 4-10 ngày
2.2.2.6 Phương pháp lây bệnh nhân tạo
Nhân gống cây con trước 1 tháng với số lượng vừa đủ thí nghiệm
Nhân các giống nấm bệnh Fusarium sp trên môi trường hạt kê vỏ trấu để giữ được hoạt tính gây bệnh của nấm bệnh
Cấy mẫu nấm bệnh lên cây con bằng phương pháp lây bệnh hỗn hợp (Phan Thu Hiền, 2009)
Quan sát các triệu chứng trên cây con bị nhiễm bệnh là rất quan trọng, vì các triệu chứng này cần phải tương đồng với hình thái ban đầu của cây trồng bị bệnh.
Phân lập lại tác nhân gây bệnh từ các bộ phận cây mới bị bệnh, mẫu cấy phải giống như mẫu cấy được làm thuần ban đầu
Khi lựa chọn cây khỏe mạnh để thực hiện lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch, cần chú ý sử dụng cùng một giống với cây bị bệnh mà từ đó tác nhân gây bệnh được phân lập Điều này giúp các triệu chứng xuất hiện trong quá trình lây bệnh nhân tạo gần gũi với triệu chứng bệnh tự nhiên ban đầu Ngoài ra, các giống cây trồng có thể có độ mẫn cảm khác nhau đáng kể đối với một tác nhân gây bệnh.
Kết quả phân lập Fusarium sp được đánh giá dựa trên các tiêu chí như hình thái khuẩn lạc trên môi trường PDA, kích thước và số vách ngăn của tế bào, cũng như màu sắc của các dạng bào tử bao gồm macroconidia, microconidia và clamydospore.
2.2.2.7 Phân lập các chủng nấm Trichoderma spp
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Kết quả phân lập nấm bệnh, nấm Trichoderma trên vườn cam
3.1.1 Phân lập nấm bệnh từ mẫu cây bệnh thối rễ trên cây có múi
Sau 2 tuần phân lập mẫu nấm bệnh, chúng tôi đã thu được 7 khuẩn lạc khác nhau từ môi trường PDA có bổ sung chất kháng khuẩn Qua quan sát hình thái đại thể và vi thể, chúng tôi đã chọn được 5 mẫu nấm bệnh, bao gồm 3 chủng Fusarium solani và 2 chủng nghi ngờ là nấm Phytophthora sp.
Bảng 3 1 Các chủng nấm được phân lập từ cây cam bị bệnh
Kí hiệu chủng Nấm Fusarium Nấm trứng
Khuẩn lạc nấm phân lập có đặc điểm hình thái tương đồng, với màu trắng đục và sợi nấm nhỏ Một số loài như MCB5, MCB7 và MCB8 tiết ra màu vàng khác nhau, từ vàng xanh đậm đến vàng tươi Đặc biệt, khuẩn lạc nghi ngờ là nấm Trứng Phytophthora có màu trắng sữa, sợi nấm mỏng, mọc thưa thớt, với bề mặt như hạt cát mịn và không làm đổi màu môi trường.
Hình thái vi thể của các chủng nấm MCB5, MCB7, MCB8 thuộc giống Fusarium sp có dạng hình sợi với kích thước khoảng 10-15 µm, có vách ngăn Các cuống bào tử chứa macroconidia và microconidia tạo thành hình cụm tròn Macroconidia lớn có hình sợi dài, một số cong hình liềm với 2-5 vách ngăn, trong khi microconidia nhỏ có dạng oval với đầu tròn và 0-2 vách ngăn Hình thái này tương tự như nấm Fusarium solani được miêu tả trong báo cáo của M Ravi Chandran, 2012.
Các chủng nấm MCB9 và MCB10 được nghi ngờ là nấm Trứng Phytophthora do hình thái khó phân biệt với nấm Pythium Để xác định chính xác, mẫu nấm đã được đưa đi định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 28S rRNA, và kết quả cho thấy đây không phải là loài Phytophthora.
Bảng 3 2.Bảng thểhình thái đại thể và vi thể của nấm bệnh phân lập
Hình thái khuẩn lạc trêm môi trường PDA
Sợi nấm màu trắng kem, tơi xốp, sợi rất mỏng, có 2 viền vòng
Mặt dưới có màu vàng nâu
Sợi nấm màu trắng đục, tơi xốp, sợi mỏng, thưa thớt, có 1 viền vòng
Mặt dưới có màu vàng nâu đậm
Sợi nấm màu trắng đục, tơi xốp, sợi mỏng, thưa thớt có 2 viền vòng
Mặt dưới có màu vàng nhạt
Hình sợi dài hơi cong hình liềm và dạng sợi thẳng , đầu tròn
Có dạng sợi dài hơi cong hình liềm và dạng thẳng, đầu tròn Không màu
Có dạng sợi dài thẳng hoặc hơi cong hình liềm, đầu tròn
2-3 Hình cầu Không màu nấm trứng Phytophthora mà là chủng nấm Byssochlamys nivea nên loại bỏ hai chủng nấm này
Chỉ phân lập được 3 chủng nấm Fusarium sp và không phân lập được các nấm khác như Pythium, Phytophthora hay Tuyến trùng
Hình thái đại thể và vi thể của nấm Fusarium được phân lập từ vườn cam bị bệnh bao gồm các đặc điểm sau: hình thái khuẩn lạc của nấm Fusarium sp (hình a-c), hình thái cuốn bào tử (hình d-f), và các dạng bào tử như macroconidia, microconidia và clamydospores (hình g-i).
3.1.2 Chủng lại nấm bệnh phân lập được vào cây con
Sau 10 ngày chủng ngược nấm gây bệnh phân lập được lên cây con Cây con có biểu hiện héo rũ làm chết cây con (Hình 3.2d)
Chúng tôi đã tiến hành phân lập nấm từ mẫu cây con bị bệnh và thu được nấm có hình thái tương tự với chủng nấm bệnh ban đầu (hình 3.2 b, c, e, f) Kết luận cho thấy nấm này là một trong những nguyên nhân gây bệnh thối rễ trên cây có múi.
Kết quả phân lập và chủng ngược nấm Fusarium sp lên cây con cho thấy sự khác biệt rõ rệt Hình a, d minh họa cây con trước và sau khi bị chủng ngược nấm bệnh Hình b, c cung cấp hình ảnh đại thể và vi thể của nấm Fusarium được phân lập từ cây cam trong vườn Cuối cùng, hình e, f thể hiện hình thái đại thể và vi thể của nấm Fusarium sau khi được chủng ngược vào cây con.
3.1.3 Phân lập nấm Trichoderma từ cây có múi khỏe mạnh trong vườn
Nấm Trichoderma phát triển nhanh chóng với sợi nấm màu trắng, sau 2 ngày hình thành bào tử màu xanh đen Sau khoảng 7 ngày nuôi cấy, nấm tạo ra các đường tròn đồng tâm Hình thái vi thể của nấm cho thấy có vách ngăn và cuống sinh bào tử phân nhánh hình nón hoặc kim tự tháp Thể bình được quan sát tại đỉnh cuống sinh bào tử, với các bào tử đính tạo ra ở đầu mút của thể bình.
Hình 3 3 Hình thái đại thể và vi thể của các chủng nấm Trichoderma sp phân lập từ mẫu đất của cây cam khỏe mạnh
Sau khi tiến hành quan sát tổng thể và vi thể, tôi đã thực hiện việc định danh nấm để xác định xem có phải là nấm Trichoderma hay không Bằng phương pháp giải trình tự gen 28S rRNA, kết quả cho thấy mẫu nấm đúng là Trichoderma, cụ thể là Trichoderma asperellum.
Kết quả cấy đối kháng
Chủng phân lập Tiêu chuẩn
Chúng tôi đã thực hiện cấy đối kháng với 5 chủng Trichoderma sp và 3 chủng nấm Fusarium sp gây bệnh thối rễ trên cây có múi, và kết quả thu được từ quá trình cấy đối kháng cho thấy sự tương tác đáng chú ý giữa các chủng nấm này.
Hầu hết các chủng Trichoderma sp đều thể hiện khả năng đối kháng cao, nhưng mức độ này thay đổi tùy thuộc vào từng loại nấm Trichoderma sp Cụ thể, khả năng chống lại nấm Fusarium sp của chúng cũng khác nhau.
Các chủng nấm phân lập từ ngoài vườn cho thấy khả năng đối kháng mạnh mẽ, có khả năng ức chế sự phát triển của nấm bệnh Chúng bao phủ lên khuẩn lạc của nấm bệnh, giúp làm giảm dần sự sinh trưởng của nấm bệnh sau 8 ngày cấy.
Các chủng nấm do phòng thí nghiệm công nghệ sinh học Tiên Phong cung cấp có khả năng đối kháng mạnh mẽ, ức chế nhanh sự phát triển của nấm bệnh trong giai đoạn đầu Tuy nhiên, chúng không làm giảm đường kính của nấm bệnh, và khuẩn lạc nấm vẫn giữ nguyên diện tích ban đầu, không gây tàn lụi như hai chủng nấm được phân lập từ vườn cây có múi.
Hình thái khuẩn lạc trên môi trường PDA
Khuẩn lạc phát triển mạnh mẽ với hệ sợi dày đặc Trong hai ngày đầu, sợi nấm có màu trắng, sau đó chuyển sang màu xanh đen, tạo thành các vòng tròn đồng tâm.
Khuẩn lạc nấm có hệ sợi phát triển mạnh mẽ và dày đặc, với màu trắng trong 2 ngày đầu, sau đó chuyển sang màu xanh đen Sự phát triển này tạo thành các vòng tròn đồng tâm và bào tử đính (conidium) cũng được hình thành trong quá trình này.
Hình gần cầu đến hình trứng
Hình gần cầu đến hình trứng
(2.5-3) x (1.5-2) Xanh nhạt Thể bình (phialide)
Mọc đối xứng thành cặp, mọc hơi xiên góc khoảng 60-80 0
Mọc đối xứng từng cặp và gần như vuông góc với sợi chính
Bào tử hậu (clamydospore) Không quan sát được Không quan sát được
Bảng 3 3 Kết quả mô tả đặc điểm đại thể và vi thể của nấm Trichoderma asperellum phân lập từ đất của cây cam khỏe mạnh
Khi quan sát dưới kính hiển vi, hình thái sợi nấm Trichoderma sp thể hiện sự quấn quanh sợi nấm Fusarium sp., cho thấy sự tương tác giữa hai loại nấm này.
Vách tế bào của nấm Fusarium sp mờ đi (Hình 3.4) điều này có thể là do Trichoderma sp tiết enzyme phân giải vách tế bào của nấm Fusarium sp
Kết quả định tính khả năng sinh enzyme cellulase trên 5 chủng Trichoderma sp điều cho kết quả dương tính
Bảng 3 4 Kết quả đối kháng của nấm Trichoderma sp với nấm Fusarium sp
STT Kí hiệu Vùng ức chế, Z (cm)
Tỉ lệ ức chế của nấm Trichoderma lên nấm Fusarium (%)
Hình 3 4 Nấm Trichoderma sp đối kháng nấm Fusarium sp
Nấm Trichoderma sp Nấm Fusarium sp
STT Chủng Kích thước (bán kính, cm)
STT Chủng Kích thước (bán kính, cm)
1 T01 Mọc lên trên thành petri
2 T24 Mọc lên trên thành petri
3 T29 Mọc lên trên thành petri
4 MCB1 Mọc lên trên thành petri
5 MCB2 Mọc lên trên thành petri
Hình 3 5 Hình thái các khuẩn lạc đối kháng của nấm Trichoderma sp với nấm Fusarium sp sau 9 ngày cấy đối kháng
Biều đồ 3 1[U2] Biểu đồ thể hiện tỉ lệc ức chế của nấm Trichoderma sp với nấm
Phân tích kết quả cấy đối kháng ta có:
Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế của các chủng nấm Trichoderm sp với nấm Fusarium sp.
Tất cả các chủng nấm Trichoderma sp đều thể hiện khả năng đối kháng mạnh mẽ đối với nấm Fusarium, với mức độ kháng từ 73% đến gần như hoàn toàn 97.3%.
Từ bảng số liệu và biểu đồ vùng ức chế của các nấm ta rút ra được các khả năng sau:
Trên biểu đồ 3.2, các chủng MCB cho thấy vùng ức chế lớn hơn so với các chủng Trichoderma sp trong môi trường phòng thí nghiệm Vùng ức chế được xác định là khu vực mà nấm Trichoderma sp bao phủ lên nấm bệnh trong đĩa cấy đối kháng Mặc dù tốc độ phát triển của các chủng MCB chậm hơn, nhưng chúng có khả năng bao phủ tốt hơn so với các chủng Trichoderma sp Tuy nhiên, khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng MCB lại thấp, dẫn đến tỉ lệ ức chế chung không vượt trội hơn so với các chủng nấm Trichoderma trong phòng thí nghiệm, theo các số liệu thống kê (xem Bảng 3.4, Biểu đồ 3.1).
Hình 3 6 Vòng phân giải cellulose của các chủng Trichoderma sp
STT Chủng Vòng phân giải (mm)
Biểu đồ thể hiện vùng ức chế của các chủng nấm Trichoderm sp với nấm Fusarium sp. vùngức chế (cm)
Biều đồ 3 2 Biểu đồ thể hiện vùng ức chế cảu các nghiệm thức cấy đối kháng của nấm Trichoderm sp với nấm Fusarium sp
5 MCB2 5.667 ± 0.333 a Kiểm tra khả năng sinh enzyme cellulase cho thấy rằng hầu hết các chủng có khả năng sinh enzyme
Khả năng sinh enzyme của nấm Trichoderma giúp phân huỷ vách tế bào của nấm bệnh, từ đó hạn chế sự phát triển của chúng khi nấm Trichoderma tiếp xúc và bao phủ nấm bệnh.
Chủng nấm T24 tạo ra vòng phân giải cellulose cao nhất, đến các chủng
Các chủng nấm T01 và T29 tạo ra vòng phân giải nhỏ hơn so với chủng T24, và không có sự khác biệt đáng kể về khả năng sinh enzyme giữa hai chủng T01 và T29 Trong khi đó, các nấm MCB có khả năng sinh enzyme thấp hơn so với các chủng T01, T24 và T29, và cũng không có sự khác biệt về khả năng sinh enzyme giữa hai chủng MCB trong thống kê học.
Hình 3 7 Hình ảnh thể hiện vòng phân giải của các chủng nấm Trichoderma trên môi trường CMC
Chủng Trichoderma T01 và T29 phát triển nhanh chóng, ức chế sự phát triển của nấm Fusarium sp ngay từ 2 ngày đầu, khiến nấm này chỉ có thể mọc với đường kính nhỏ (0.7-1.9 cm) so với các chủng MCB Tuy nhiên, nấm Fusarium sp không bị hoàn toàn lấn át và sau 9 ngày, chúng có thể phát triển thêm so với trạng thái ban đầu Hình 3.5 cho thấy các đĩa đối kháng được tô màu vàng, cho phép quan sát rõ hơn về sự tương tác giữa các chủng nấm.
Nấm T24 có khả năng vượt trội trong việc ức chế sự phát triển của nấm bệnh, với tốc độ phát triển nhanh chóng Sau 4 ngày, nấm T24 bắt đầu xâm nhập vào khuẩn lạc của nấm Fusarium sp., lấn át hiệu quả nấm bệnh Đến ngày thứ 11, nấm T24 đã ăn sâu vào hầu hết khuẩn lạc của nấm bệnh, dẫn đến sự tàn lụi của chúng sau 13 ngày Đĩa đối kháng được đánh dấu màu đỏ như thể hiện trong hình 3.5.
Chủng MCB1 và MCB2 phát triển chậm hơn, mất khoảng 4 ngày để nấm MCB mọc phủ hoàn toàn khuẩn lạc của nấm bệnh (0.7-2.5 cm) Tuy nhiên, nấm MCB cho thấy khả năng lấn át nấm bệnh rất hiệu quả; sau 9 ngày, nấm MCB có khả năng xâm nhập sâu vào khuẩn lạc của nấm Fusarium sp., từ đó ức chế sự phát triển của chúng.
42 của nấm Fusarium sp và tàn lụi sau 13 ngày Các đĩa đối kháng được đánh dấu màu xanh lá quan sát trên hình 3.5
Kết quả nghiên cứu cho thấy có hai cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma Thứ nhất, các chủng nấm Trichoderma sp cạnh tranh chất dinh dưỡng, ngăn cản sự phát triển của nấm bệnh, từ đó có thể ứng dụng trong việc bón cho cây để phòng trị bệnh hiệu quả Thứ hai, một số chủng nấm Trichoderma có khả năng sinh ra enzyme phân giải sợi nấm bệnh như cellulase, protease, β-glucanase và cạnh tranh dinh dưỡng với nấm bệnh, cho phép ứng dụng trong sản xuất chế phẩm xử lý khi bệnh mới phát sinh, đặc biệt khi mật độ nấm bệnh trong đất cao.
Bảng 3 5 So sánh tốc độ phát triển của nấm Trichoderma (T01, MCB1) và nấm Fusarium (Fus1) sau 5 ngày cấy
Nấm Fusarium (bán kính, cm)
96 Mọc hết đĩa Mọc hết đĩa 2,3
120 Mọc lan lên thành đĩa petri
Mọc lan lên thành đĩa petri 3,5