Khảo sát khả năng đối kháng sinh học của nấm trichoderma sp lên một số nấm gây bệnh vàng lá thối rễ trên cây có múi

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MƠI TRƯỜNG  Khóa luận tốt nghiệp KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC CỦA NẤM Trichoderma sp LÊN MỘT SỐ NẤM GÂY BỆNH VÀNG LÁ THỐI RỄ TRÊN CÂY CÓ MÚI Giáo viên hướng dẫn: TS Phạm Minh Tuấn Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Bích Tuyền MSSV: 2008110342 Lớp 02DHSH1 TP.HCM, ngày 29 tháng năm 2015 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: Phạm Minh Tuấn LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy Phạm Minh Tuấn Em cảm ơn Thầy thời gian vừa qua tận tâm hướng dẫn, trao đổi tạo điều kiện tốt cho em thực tập tốt nghiệp Cảm ơn Thầy truyền đạt cho em hiểu biết thêm kiến thức mà trước em cịn thiếu sót Cảm ơn Thầy tin tưởng em hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn quí Thầy, Cô Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cơng Nghiệp Thực Phẩm TP Hồ Chí Minh truyền đạt cho em kiến thức để chúng em có đủ kiến thức để thực đề tài thực tập tốt nghiệp Em xin cảm ơn đến anh, chị công tác Công ty Cổ phần Công nghệ Sinh học Tiên Phong tạo điều kiện tốt cho em hồn thành khóa luận tốt nghiệp, kĩ năng, thao tác thực hành cung kiến thức chuyên sâu trình thực để tài, thường xuyên đóng góp ý kiến hỗ trợ em thời gian thực đề tài Cuối chúng em xin cảm ơn gia đình bạn bè quan tâm, động viên, chia sẻ chúng em suốt thời gian thực đề tài Trong thời gian thực đề tài thực tập tốt nghiệp, có nhiều cố gắng, nhiên thời gian có hạn kiến thức, kinh nghiệm cịn nhiều hạn chế nên khơng thể tránh sai sót Rất mong quan tâm, thơng cảm góp ý Thầy, Cơ anh chị để đề tài hoàn thiện Chúng em xin chân thành cảm ơn! Sinh viên thực Nguyễn Thị Bích Tuyền ii SVTH: Nguyễn Thị Bích Tuyền KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: Phạm Minh Tuấn LỜI CAM ĐOAN  Em cam đoan báo cáo thực tập em thực Các số liệu thu thập kết phân tích báo cáo trung thực, không chép từ đề tài nghiên cứu khoa học Ngày … tháng … năm … Sinh viên thực (ký ghi họ tên) Nguyễn Thị Bích Tuyền iii SVTH: Nguyễn Thị Bích Tuyền KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: Phạm Minh Tuấn MỤC LỤC Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh vàng thối rễ có múi 1.1.1 Triệu chứng bệnh 1.1.2 Nguyên nhân gây bệnh 1.1.3 Điều kiện phát sinh phát triển bệnh 1.1.4 Biện pháp phòng trừ bệnh 1.2 Lịch sử nghiên cứu bệnh vàng thối rễ ngồi nước 1.2.1 Tình hình nghiên cứu nước 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nước 1.2.3 Biện pháp sinh học bảo vệ trồng 1.3 Các nấm gây bệnh vàng thối rễ có múi 1.3.1 Nấm Fusarium sp 1.3.2 Pythium sp Phythophthora sp 1.3.3 Tuyến trùng 13 1.4 Nấm đối kháng với chủng nấm gây bệnh có múi 15 1.4.1 Nấm Trichoderma sp 15 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu nghiên cứu 19 2.1.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 19 2.1.2 Nguồn mẫu bệnh mẫu đối kháng dùng nghiên cứu 19 2.1.3 Trang thiết bị hóa chất sử dụng nghiên cứu 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Bố trí thí nghiệm 23 2.2.2 Phương pháp phân tích 24 2.2.2.8 Phương pháp đánh giá tính đối kháng Trichoderma sp nấm bệnh môi trường PDA (André Drenth et al, 2004) 27 2.2.2.9 Phương pháp xác định vịng phân giải mơi trường chứa cellulose 29 2.2.3 Xử lí số liệu thống kê 30 Chương KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 31 3.1 Kết phân lập nấm bệnh, nấm Trichoderma vườn cam 31 3.1.1 Phân lập nấm bệnh từ mẫu bệnh thối rễ có múi 31 3.1.2 Chủng lại nấm bệnh phân lập vào 33 iv SVTH: Nguyễn Thị Bích Tuyền KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP 3.1.3 3.2 GVHD: Phạm Minh Tuấn Phân lập nấm Trichoderma từ có múi khỏe mạnh vườn 34 Kết cấy đối kháng 35 3.2.1 So sánh tốc độ phát triển nấm Trichoderma sp nấm Fusarium sp 42 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 4.1 Kết luận 44 4.2 Kiến nghị 44 Chương TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 5.1 Tài liệu tiếng việt 45 5.2 Tài tiệu tiếng anh 45 5.3 Tài liệu online 46 v SVTH: Nguyễn Thị Bích Tuyền KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: Phạm Minh Tuấn DANH MỤC HÌNH Hình 1 Biểu bệnh vàng thối rễ có múi Hình Triệu chứng bệnh vàng thối rễ xuất rễ Hình Hình thái bào tử nấm F oxysporum Error! Bookmark not defined Hình Fusarium solani, khuẩn lạc nấm môi trường PDA, 27℃, ngày Hình Đặc điểm hình thái Pythium senticosum 10 Hình Hình thái khuẩn lạc Phytophthora PDA (bên phải) and V8J (bên trái) 14 ngày 12 Hình Đặc điểm hình thái Phytophthora nicotianae 12 Hình Chu kỳ bệnh đơn giản hoá tác nhân gây bệnh thuộc lớp nấm trứng (Burgess et al, 2009) 13 Hình Hình dạng tuyến trùng gây hại có múi, Tylenchulus semipenetrans (Cobb, 1913), Error! Bookmark not defined Hình 10 Hình dạng tuyến trùng đực hại có múi, Tylenchulus semipenitrans (Cobb, 1913) Error! Bookmark not defined Hình 11 Hình thái bào tử chủng Trichoderma parareesei sp CBS 125925 sau ngày môi trường CMD (Sigma corn meal agar plus 10% dextrose) 25°C.2010, American Society for Microbiology.) 16 Hình 12 Hình thái khuẩn lạc Trichoderma harzianum mơi trường PDA 17 Hình Kiểm tra khả đối kháng nấm bệnh Trichoderma môi trường PDA 28 Hình 2 Hình ảnh thể vùng ức chế nấm Trichoderma sp lên nấm bệnh 29 Hình Hình thái đại thể vi thể nấm Fusarium phân lập từ vườn cam bị bệnh 33 Hình Kết phân lập trước kết chủng ngược nấm Fusarium sp lên 34 Hình 3 Hình thái đại thể vi thể chủng nấm Trichoderma sp phân lập từ mẫu đất cam khỏe mạnh 35 Hình Nấm Trichoderma sp đối kháng nấm Fusarium sp 37 Hình Hình thái khuẩn lạc đối kháng nấm Trichoderma sp với nấm Fusarium sp sau ngày cấy đối kháng 39 Hình Hình ảnh thể vịng phân giải chủng nấm Trichoderma môi trường CMC Error! Bookmark not defined vi SVTH: Nguyễn Thị Bích Tuyền KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: Phạm Minh Tuấn DANH MỤC BẢNG Bảng Các dụng cụ sử dụng trình thực đề tài 19 Bảng 2 Các thiết bị sử dụng trình thực đề tài 20 Bảng Thành phần môi trường PDA 20 Bảng Thành phần môi trường V-8J-agar 21 Bảng Thành phần môi trường CMA 21 Bảng Thành phần môi trường Water agar (WA) 21 Bảng Thành phần môi trường CA 21 Bảng Thành phần hỗn hợp kháng sinh kháng khuẩn bổ sung vào môi trường phân lập Phytophthora sp 22 Bảng Các chủng nấm phân lập từ cam bị bệnh 31 Bảng Kết hình thái nấm Fusarium sp phân lập 32 Bảng 3 Kết mô tả đặc điểm đại thể vi thể nấm Trichoderma asperellum phân lập từ đất cam khỏe mạnh Error! Bookmark not defined Bảng Kết đối kháng nấm Trichoderma sp với nấm Fusarium sp 37 Bảng Vòng phân giải cellulose chủng Trichoderma sp Error! Bookmark not defined Bảng So sánh tốc độ phát triển nấm Trichoderma (T01, MCB1) nấm Fusarium (Fus1) sau ngày cấy 42 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biều đồ Biểu đồ thể mối quan hệ vùng ức chế tỉ lệ ức chế nấm Trichoderma sp nấm Fusarium sp Error! Bookmark not defined Biều đồ Tốc độ phát triển nấm Trichoderma sp nấm Fusarium sp Error! Bookmark not defined vii SVTH: Nguyễn Thị Bích Tuyền KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: Phạm Minh Tuấn LỜI MỞ ĐẦU Hiện Đồng Sơng Cửu Long hình thành số vùng chun canh có múi với diện tích lớn chủ yếu cam sành bưởi Ở vùng xuất loại bệnh gây thiệt hại nặng nề cho nhiều vườn cam, chí hàng loạt vườn cam giai đoạn cho trái phải đốn bỏ khơng cịn khả phát triển, với việc mở rơng diện tích vườn có múi bị đối tượng dịch hại cơng gây hại ngày nhiều Trong nguy nhiểm bệnh vàng thối rễ, bệnh làm cho nhiều vườn cam bưởi bị chết hàng loạt phải đốn bỏ gây tổn thất lớn cho nhà vườn Bệnh vàng thối rễ xuất cách lâu nhiên bệnh phát triển rộng rãi hơn, mạnh Bệnh phát triển tùy theo vùng, có vùng với điều kiện ngập nước nhiều nên tình trạng gây bệnh nặng Theo nhà chun mơn có nhiều tác nhân gây bệnh vàng thối rễ có múi như: đất đai bị thối hóa màu mỡ kĩ thuật canh tác công thêm công gây bệnh nấm: Fusarium solani, Phythium, Phytophthora tuyến trùng,… nấm Fusarium solani quan trọng nhất, chúng kết hợp với tuyến trùng gây thiệt hại nặng cho có múi Các nấm gây thiệt hại không nhỏ nông dân trồng ăn khơng có Đồng sơng Cửu Long mà cịn khu vực khác Viêt Nam số nước Đông Nam Á như: Indonesia, Malaysia, Philippines, Thailand,…( André Drenth et al, 2004) Việc sử dụng nơng dược để phịng trị bệnh dường tốn kém, gây ô nhiễm môi trường dễ hình thành chủng có khả kháng thuốc (Ahmed et al., 1999) Trong số nghiên cứu cho thấy khả nấm Trichoderma việc phòng trị nấm bệnh Phytophthora (Harman & Kubicek, 1998; Hoitink & Boehm, 1999) nấm Fusarium (Patel, 2011), chủng Trichoderma nội địa đồng sông Cửu Long (ĐBSCL) nghiên cứu tiềm phòng trị bệnh nấm gây hại ăn (Nguyễn Văn Tứ, 2005; Dương Minh et al., 2005) Ngồi ra, bón phân hữu có bổ sung nấm Trichoderma vào đất vườn giúp tăng số trái suất ăn trái so với bón phân vơ (Võ Thị Gương et al., 2006) Khả đối kháng giúp Trichoderma khống chế hiệu với nấm gây bệnh nhờ tiết enzym như: protease, cellulose, β-glucanase (Harman & Kubicek, 1998; Cruz & Llobell, 1999) để phân hủy vách tế bào nấm noãn nấm thực, gồm β-1,3-glucan cellulose (Inglis & Kawechuck, 2002), ngồi enzyme phân hủy thành tế bào nấm bệnh nấm Trichoderma cịn có khả sản sinh acid hữu như: harzianic acid, viii SVTH: Nguyễn Thị Bích Tuyền KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: Phạm Minh Tuấn alamethicins, tricholin, peptaibols, 6-penthyl-alpha-pyrone, massoilactone, viridin, gliovirin, glisoprenins, heptelidic acid loại khác (Vey et al., 2001) Trên sở này, đề tài “Khảo sát khả đối kháng sinh học nấm Trichoderma sp lên số nấm gây bệnh vàng thối rễ có múi” thực nhằm phân lập, chọn lọc, khảo sát chủng nấm Trichoderma sp có khả đối kháng hiệu nấm gây bệnh thối rễ có múi tỉnh Đồng Sơng Cửu Long Kết nghiên cứu góp phần vào sở khoa học ứng dụng biện pháp sinh học quản lý dịch bệnh tổng hợp (IPM- Integrated Pest Management) theo hướng bền vững cho vườn ăn trái khu vực Bệnh hại rễ có múi, vấn đề xuất gần đây, việc hiểu biết tác nhân gây hại, tương tác tác nhân, v.v hạn chế Việc hiểu chế này giúp cho việc quản lý bệnh hữu hiệu hơn, sản xuất bền vững Trong xu hướng việc ứng dụng đối kháng sinh học biện pháp sử dụng giống kháng, kết hợp với vi sinh vật có ích đất giúp việc quản lý bệnh lâu dài, triệt để bền vững a Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát khả đối kháng nấm Trichoderma sp với nấm gây bệnh thối rễ cam quýt phân lập tử mẫu bệnh thu thập tỉnh Bến Tre b Nội dung nghiên cứu Phân lập chủng nấm cam quýt bị bệnh nấm Trichoderma sp mẫu đất thu thập số vườn cam quýt tỉnh Bến Tre Khảo sát tính đối kháng nấm Trichoderma sp nấm gây bệnh thối rễ cam quýt môi trường PDA Khảo sát hiệu đối kháng Trichoderma sp môi trường đất quy mô nhà lưới ix SVTH: Nguyễn Thị Bích Tuyền KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: Phạm Minh Tuấn Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh vàng thối rễ có múi Bệnh vàng thối rễ phát lần giới tử năm 1834, sau lan truyền phát Bồ Đào Nha, Địa Trung Hải, Châu Mỹ, Châu Á Bệnh gây hại nghiêm trọng vườn ghép lớn vường sản xuất Cây bị bệnh chậm lớn tàn lụi dần, suất giảm sút, vàng úa, rụng chết Bệnh xảy quanh năm lẻ tẻ, không đáng kể Bệnh thường bắt đầu phát triển thành dịch vào đầu mùa nắng, khoảng tháng 11 12 dương lịch năm Cây chết hàng loạt vào tháng đến tháng dương lịch tiếp tục kéo dài mùa mưa năm sau Với vườn lên liếp trồng có múi, bắt đầu chết bệnh thối rễ từ năm thứ năm năm thứ bảy trở sau, tùy cách canh tác vườn 1.1.1 Triệu chứng bệnh Trên lá, thân cây: Khi bệnh xuất hiện, bình thường có xuất gân màu trắng, phiến màu vàng cam dễ rụng vàng vài nhánh hay tồn cây, già rụng trước sau đến non, hoa trái phát triển dễ rụng Khi bị bệnh nặng nhìn vào cành thấy trơ trọi, có khơng có khả phát triển, thời kì cho trái đạt suất thấp trái thường khơng có giá trị thương phẩm Hình 1 Biểu bệnh vàng thối rễ có múi SVTH: Nguyễn Thị Bích Tuyền