TÓM TẮTĐề tài nghiên cứu “Định danh vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héoxanh trên cây họ cà bằng trình tự vùng gen egi, hrpB, mutS và đánh giá sự đa dang di truyền bằng chỉ thị p
Trang 1TRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH
KHOA NONG HOC
3 3k 2s 2k 3k 2k 2
KHOA LUAN TOT NGHIEP
DINH DANH VI KHUAN Ralstonia solanacearum GAY BENH HEO XANH TREN CAY HO CA BANG TRINH TU VUNG
GEN 16S-rDNA VA DANH GIA SỰ DA DẠNG DI
TRUYEN BANG CHI THI PHAN TU ISSR
SINH VIEN THUC HIEN: PHAM XUAN MAINGANH : BAO VE THUC VATKHOA : 2019 — 2023
Tp Hồ Chi Minh, thang 02/2024
Trang 2ĐỊNH DANH VI KHUAN Ralstonia solanacearum GAY BỆNH HÉO XANH TRÊN CÂY HỌ CÀ BẰNG TRÌNH TỰ VÙNG
GEN 16S-rDNA VÀ ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI
TRUYEN BANG CHI THI PHAN TU ISSR
Tac gia PHAM XUAN MAI
Khóa luận được dé trình dé đáp ứng yêu cầucấp bằng kỹ sư ngành Bảo vệ Thực vật
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Đề hoàn thành khóa luận này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
Ban Giám hiệu trường Dai học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh
Ban chủ nhiệm Khoa và tất ca quý thầy cô khoa Nông học đã tạo điều kiện thuận
lợi và truyền tải cho tôi những kiến thức hữu ích trong quá trình học tập tại trường
TS Lê Khắc Hoàng, ThS Nông Hồng Quân người đã tận tình hướng dẫn và sẵnsàng đưa ra những lời khuyên sâu sắc cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoànthiện đề tài tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thay rất nhiều!
TS Võ Thị Ngọc Hà, ThS Pham Kim Huyền, là người đã hỗ trợ cho tôi trong suốt
quá trình làm đề tài tại phòng thí nghiệm bệnh cây Bộ môn Bảo vệ Thực vât Em xin
chân thành cảm ơn cô rất nhiều!
Cảm ơn bạn các bạn, đặc biệt là Bùi Quang Bảo, Huỳnh Thường Vương, Bùi ThanhThủy, Đỗ Thị Kim Ngọc đã tận tình giúp đỡ, ủng hộ và quan tâm xuyên suốt thời gian
thực hiện khóa luận này.
Cảm ơn tập thể lớp DH19BV, các anh chị các bạn Lab 105 đã đồng hành với tôitrong 4 năm học tập và thực hiện đề tài tại trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ ChíMinh.
Và trên hết, con xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Ba Mẹ người đã có côngsinh thành, dưỡng dục, chăm lo, luôn động viên và tạo điều kiện tốt nhất dé con học tập
và trưởng thành như ngày hôm nay Mến thương gia đình rất nhiều!
Cuối lời, kính chúc tất cả mọi người nhiều sức khỏe, may mắn, hạnh phúc và gặpnhiều thành công
Xin chân thành cảm ơn!
Thanh phố Hồ Chi Minh, tháng 02 năm 2024
Sinh viên
Phạm Xuân Mai
Trang 4TÓM TẮT
Đề tài nghiên cứu “Định danh vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héoxanh trên cây họ cà bằng trình tự vùng gen egi, hrpB, mutS và đánh giá sự đa dang di
truyền bằng chỉ thị phân tử ISSR” đã được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo
vệ Thực vật — Khoa Nông hoc, Trường Đại học Nông Lâm Thành pho Hồ Chi Minh từ
thang 5/2023 dén thang 2/2023 Muc tiéu xac dinh duoc vi khuan Ralstonia
solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây họ cà bang kĩ thuật sinh học phân tử trình tựvùng gen 16S-rDNA, đánh giá sự đa dang di truyền của 32 dong vi khuẩn bằng chỉ thị
sinh học phân ISSR.
Các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum được định danh bằng trình tự vùnggen 16S-rDNA với cặp môi 27F-1492R, tiến hành thực hiện PCR ISSR với 8 primer
(AF80820, AF80821, AF80822, AF80825, UBC808, UBC810, UBC834 và UBC841).
Kết quả vùng gen 16S-rDNA của 10 dong vi khuan đc khuyéch dai thành côngvới mỗi 27F-1492R và giải trình tự, các trình tự thu được có độ tương đồng từ 94,56%
— 98,6% với các trình tự Ralstonia solanacearum có sẵn trên ngân hàng gen, cho thay
các vi khuẩn được nghiên cứu là vi khuân Ralstonia solanacearum
Đánh giá đa dang di truyền bằng kỹ thuật PCR — ISSR bằng 8 primer (AF80820,
AF80821, AF80822, AF80825, UBC808, UBC810, UBC834 và UBC841) cho sản phẩmkhuếch dai là 97 băng, trong đó có 90 băng đa hình chiếm ty lệ 92,97% va 7 băng đồnghình chiếm tỉ lệ 7,03% Sản phâm khuếch đại có kích thước từ 100 — 2500 bp Kết quả
của 8 chỉ thi ISSR sử dụng cho hệ số tương đồng di truyền trung bình là 0,63 và chia 32
dong vi khuẩn thành 6 nhóm chính Kết qua này chứng minh được các dòng vi khuẩn
Ralstonia solanacearum được khảo sat có sự đa dang cao vê mặt di truyện.
Trang 5MỤC LỤCI0 1
MUC ti6u 0.3 2
Yêu cÂU - 2-5222 21221221221221211221211211211211211111111211111111111111111211211121 1c re 2
CL | naayeurrdstrctrkrggtrosynotiicdsydagtixrgtoaosgiagrgissgkgxtsttdisgtigdgigarrigetirggegrl 2
Chương 1 TONG QUAN TÀI LIỆU 22222222222EE22EE22EE22EE22EE222E222E222E222x.zze 3
1.1 Giới thiệu tổng quan về cây họ cà -. 2-22 ©2222+222222EE22EE22EE22EE2EEEcEErrrrree 3
1;1,] (Cay Ca Chil! scccueserecnsussaneom maxes 0058E18333363EĐSSEENSESNSS.SSXSSSSS53S893500853g0533920154008838888 3 V1.2 (Cay KGET VAY vassssssesescacssnsenescosnsrssess seanecmmemen enna emma anne mE 3 I9) 4
1.2 Vi khuẩn Ralstonia solanacearuim 5-5 s+SSE+E+E+E£EEEEEE2E2EEEEEEEEEE2121EEEEEree 41.2.1 Sơ lược về vi khuẩn Ralstonia solanacearum 2- 5-52 S2c5Ss+E+£‡+Ez£zzzxccez 4
1.2.2 Đặc điêm câu tạo và điêu kiện phát triên của vi khuân Ralstonia solanacearum
sans inna ba abana Sin SS83h40158,SGSRS.SI-SSBSSDNSEES&SSSSã45838EELISEi4L3SE0E58À588S5AHB.S8GS5ASS34ESVESS3AERGAA45056385458036.38608/218 5 1.2.3 Hình thức xâm nhập vào cây ky chủ - ¿52+ 2212122122122 221112 1 re 5
LQA Bien pháp phòng tue esse vescess seessenvsepssnsesspinesensussessesusunisenesseensesusaancheusesaeaneneonsenuaees 5
1.3 Tinh hình nghiên cứu bệnh héo xanh ở Việt Nam va thế 00 9
1.3.1 Tình hình nghiên cứu bệnh ở Việt Nam - - +5 2-22 +++sEsrrerererrrrrrrx 9
1.3.2 Tình hình nghiên cứu bệnh ngoài nước - +52 +5 <+sc+sc+sczsrcee 101.3.2.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn hại cây trồng L_ ssgözztrggiEriSEEgiisid8zBxidivl 101.3.2.2 Những nghiên cứu về vi khuẩn gây bệnh héo xanh -5 5- 101.4 Phân tích đa dạng di truyền dựa vào chỉ thị sinh học phân tử lãi1.4.1 Khái niệm đa dang di truyên -2-©2222222222E22E222E2EEEEESEEEEEESExrrrrrrrrrer II
1.4.2 Chi thị sinh học phân tử - chỉ thị DNA -5- 22s Hit 12 1.4.3 Kỹ thuật ISSR (Inter — simple Sequence Repeats) - - 5: 14
Trang 61.4.4 Đánh giá da dạng di truyễn -2- 2-22222E22E22212212221221211221211211 221.22 cze 16
1.5 Một số nghiên cứu về đa dang di truyền vi khuẩn Ralstonia solanacearum ở ViệtNam và trên thế giới -2-©22©2222222E22E1222122121122122112212111211211211211211211 21121 xe iChương 2 VAT LIEU VA PHƯƠNG PHAP NGHIÊN CỨU . - 19
PA Thồi gĩan vã fet TR ass anessnssnnnasnsnnnnnnennnneannnindaoutshineentnnnnsinasannasantannnsicttannasnanananee 19
DD, 70ijÍ12381018n4ii15ì TT 19
2.2.1 Các dòng vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm: 2- 2© 2©22222z+2z+>+2 19
2.2.2 Dụng cụ, thiết bị máy móc -2- -2+222+2E22EE22EEE2EE227322712271227122212222 2e 21
2.2.3 Môi trường, hóa chất sử dụng - 2-22 ©22222+2222EE+EE22EE2EErEEEerxrrxrerrrrev 21
2.3 Phương thấp 1g his GỮU:issccxccosiseiinss222602-1011631001340188EL4 4004.1800: 48c281066E141S3.86L10g88 21
2.3.1 Dinh danh vi khuan gây bệnh héo xanh bằng trình tự vùng gen 16S-rDNA 212.3.1.1 Phương pháp ly trích DNA - - 5 2.22222122222222 22122 HH re 21
231.2 Phan Vine PC Res cesaserseoansessevenuntenmasevanensuaeeenenewceunuteuatencmuaamnnnsawpaacaadlizaconimets 22
2.3.2 Đánh giá da dang di truyOn oo cccceccecccecessessessesssssetsesseeseeseesessessessessesseseesseees 242.3.2.1 Phương pháp ly trích DNA - 2 - 5 2-1 212212212 HH rớt 24
23.20 Phan ID POR cesses sem oenmranenmnarmrw enero wy reenter: 24
2.3.2.3 Điện di doc kết qua PCR trên gel agarose 1.5% scccceecssesssesstecsteseteseeeeneee 252.3.2.4 Đánh giá da dạng về đặc điểm di truyền 22 2¿222222E222E22E2zxzze 26
3.3 TÍE lý SỐ TIỆ nen HenganienningHingg0002109000230070890090050G0534000001300150051000000803000/03000602 0/10 a
Chương 3 KET QUA VA THẢO LUẬN -©225222222E22E22E22E22E22E22222222222e2 283.1 Dinh danh vi khuan gây bệnh héo xanh bằng sinh học phân tử 28
3.2 Đánh giá sự đa dạng về đặc điểm di truyền của các chủng vi khuan Ralstonia
solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây họ cà bang chi thị phân tử ISSR 303.2.1 Sản phẩm PCR với primer ISSR 2 2© 2 ©222E22E2E2E22E222222122222222222e2 313.2.2 Phân tích sự đa dạng di truyền của 32 chủng vi khuân Ralstonia solanacearum
gay bénh héo xanh trén cay ho Ca eee 39 LOMB OG ier ee ee en ee ee ee 55
Trang 7DANH SACH CHU VIET TAT
Asian Vegetable Research and Development Center
(Trung tâm Nghiên cứu va Phat triển Rau Chau A)base — pair
Cộng tác viên Deoxyribonucleic acid Deoxynucleotides triphosphate Inter - simple sequence repeats(Khuéch đại vùng giữa 2 đoạn có cùng kiểu lặp lại)Héo xanh vi khuẩn
Môi trường King’ B Agar National Center for Biotechnology Information
(Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia)
Numerical Taxanomy System personal computer Polymerase chain reaction
(Chuỗi phan ứng nhân ban DNA dựa trên các chu kỳ nhiệt)Random Amplified Polymorphic DNA
(DNA đa hình được khuếch dai ngẫu nhiên)Sequential Agglomerative Hierarchical Non — overlapping
Unweighted Pair — Group Method with Arithmetical Mean
(Phương pháp nhóm cặp không điều chỉnh các giá trị trung bình
số học)
Trang 8DANH SÁCH CAC BANGBảng 1.1 Các chỉ thị DNA thường được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền.
ss I gS ee 13
Bảng 1.2 Ưu điểm và nhược điểm của các chi thị phân tử -22-5z55255+2 15Bảng 1.3 Công thức tính các hệ số phân tích đa dang di truyền - 17Bảng 2.1 Danh sách các dòng vi khuân được sử dụng -22 222z52+225ze: 19
Bang 2.2 Danh sách thông tin các primer sử dụng trong phan ứng PCR 22 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với primer 27F và 1492R 23
Bảng 2.4 Thanh phan phản ứng PCR với primer 22 22 +2+22+2£+2E22E22E2222zz2ze2 24
Bảng 2.5 Danh sách các primer được sử dụng trong phan ứng ISSR 25
Bảng 3.1 Nhiệt độ bắt cặp của 8 primer ISSR được sử dụng - 31Bảng 3.2 Số băng khuếch đại của 8 primer ISSR - 0.ccccccccceccessseseeeetesseeseesseeeeeeeees 32Bang 3.3 Hệ số tương đồng di truyền của 32 mẫu vi khuẩn Ralstonia solanacearum 41
Trang 9DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 1.1 Kỹ thuật ISSR mỗi đơn (AG)8, non — anchored (a), 3’ — anchored (b) và ØHTCHGTE (Cee ee ee ee ee 14Hình 3.1 Kết quả điện di DNA của các mau vi khuan Ralstonia solanacearum bằng cặp0080085910103 29
5’-Hình 3.2 Cây phát sinh loài mồi 27F-1492R của các dòng vi khuan phân lập với một số
dòng ren ngan hans ĐH án g0 016B i054381280340L8181401439544384E143818ã035313138818884301336316 30Hình 3.3 Sản phẩm PCR được khuếch đại dựa vào kỹ thuật ISSR với primer AF80820
Trang 10GIỚI THIỆUĐặt vấn đề
Hiện nay, bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra là một trongnhững bệnh gây hại phố biến mang đến những tôn thất nghiêm trọng cho các vùng canh
tác nông nghiệp, đặc biệt là gây hại đến những cây trồng có ý nghĩa kinh tế như cà chua,
khoai tây, thuốc lá, ớt Vi khuân Ralstonia solanacearum là tác nhân gây bệnh héo xanh
và lây nhiễm trên 200 loài thực vật thuộc 50 họ (Caldwell và ctv, 2017), gây thiệt hại
khá nghiêm trọng đến năng suất, có khi lên đến 95% thậm chí là mat trắng Ở Việt Nam,bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra làm chết hàng loạt cà chuatrên đồng ruộng, nhất là vùng đồng bằng sông Hồng (Hồ Thanh Hoàng, 2005) Hiện
nay, nhiều tiến bộ kỹ thuật được áp dụng vào san xuất Tuy nhiên bệnh héo xanh vi
khuẩn vẫn luôn hiện diện, gây hại và là mối lo ngại đối với người sản xuất
Một trong những biện pháp có tính khả quan nhất là sử dụng giống kháng bệnh.Công tác chọn tao các giống kháng héo xanh vi khuẩn đã được thực hiện bởi AVRDC
và các nhóm nghiên cứu khác (Scott và ctv, 2005) Tuy nhiên, sự kháng bệnh của cácgiống không ổn định do sự đa dạng di truyền của vi khuẩn gây bệnh và các yếu tô môitrường như nhiệt độ cao (Jaunet và Wang, 1999) và các chủng đặc hiệu (Truong và ctv,
2008; Wang và ctv, 2013) Vì vậy, việc phòng trừ bệnh và chọn tạo giống kháng bệnh
gặp rất nhiều khó khăn Các nghiên cứu mới chi dừng lại ở mức độ đánh giá đa dạnghình thái vi khuẩn trên môi trường phân lập Hiện nay phương pháp sinh học phân tử
trong đánh giá đa dạng di truyền rất có giá trị ở hầu hết các loài sinh vật Mối liên hệgiữa đặc điểm hình thái và đặc điểm di truyền bằng chỉ thị sinh học phân tử ISSR trên
các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum vẫn chưa được có công bố nào được thựchiện ở Việt Nam Chỉ thị ISSR cho sản pham PCR ổn định do đoạn mỗi (primer) dai hơn
và tỷ lệ phần trăm băng đa hình cao hơn so với chỉ thị RAPD (Blair và ctv, 1999) Đểđánh giá sự đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên cây họ cà
và chính vì thực tiễn trên, dé tài “Định danh vi khuẩn Ralstonia solanacearum gâybệnh héo xanh trên cây họ cà bằng trình tự vùng gen 16S-rDNA và đánh giá sự đadạng di truyền bằng chỉ thi phan tử ISSR”, được thực hiện nhằm khảo sát sự đa dạng
Trang 11và mối quan hệ di truyền của những dòng vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên cây họ cà dé
từ đó tìm ra những biện pháp phù hợp để quản lý bệnh hiệu quả nhất
Mục tiêu
Định danh vi khuẩn héo xanh Ralstonia solanacearum bằng trình tự vùng gen
16S-rDNA và đánh giá sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử ISSR
Yêu cầu
Ly trích DNA và khuếch đại vùng gen với cặp mỗi 27F-1492R, kết quả được sosánh với cơ sở dữ liệu ở GenBank và vẽ cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA 11
Khuéch đại thành công DNA các mẫu vi khuẩn với các đoạn môi ISSR
Phân tích được kết quả kỹ thuật ISSR bằng phần mềm thống kê di truyền
Giới hạn đề tài
Chỉ nghiên cứu giới hạn 32 mẫu vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnhhéo xanh trên cây họ cà do phòng thí nghệm Bệnh cây, Bộ môn Bảo vệ Thực vậtkhoa Nông học cung cấp
Chi sử dung 8 primer ISSR để đánh giá đa dạng di truyền
Đề tài được thực hiện từ tháng 05-2023 đến tháng 02-2024
Trang 12Chương 1
TỎNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu tổng quan về cây họ cà
Cây ho ca có tên danh pháp khoa học là Solanaceae, là một loại thực vật có hoa.
Tên khoa học của họ này có nguồn gốc từ tiếng Latinh Solanum, nghĩa là “cây cà được”
Ở Việt Nam, họ cà gồm các cây thân thảo hoặc cây nhỏ, phân bố rộng khắp cả nước.Một số loài được trồng dùng làm thực phẩm (cà tím, cà pháo, cà chua, khoai tây), gia vi
(ớt), cây công nghiệp (thuốc lá) hoặc cây dược liệu
1.1.1 Cây cà chua
Cây cà chua có tên khoa học là Solanum lycopersicum L., thuộc họ ca (Solanaceae)
là một loại rau ăn quả có nguồn gốc từ Nam Mỹ Theo Somraj và ctv (2017) cùng với
Nalla va ctv (2016) thì cà chua là một loại cây rau quan trọng, phố biến và được trồng
rộng rãi khắp nơi trên thế giới, đặc biệt là ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới
Theo tô chức nông lương thé giới (FAO, 2022), diện tích trồng cà chua trên thế giới vào
khoảng 4.917.735 ha với sản lượng 186.107.972 tan Là cây rau có giá tri, có sản lượng
chiếm 1/6 tong sản lượng rau hang năm trên thế giới và luôn đứng ở vị trí số 1 về sảnlượng Cà chua có tầm quan trọng chỉ sau khoai tây ở nhiều quốc gia và đứng thứ nhất
về rau được bảo quản, chế bién và cả mục dich sử dụng tươi
1.1.2 Cây khoai tây
Khoai tây có tên khoa học là Solanum tuberosum L., thuộc ho cà (Solanacea) có
nguồn gốc xuất xứ ở day Andes Khoai tây được trồng lâu đời ở Nam Mỹ và được đưa
vào châu Âu từ thé ki 16 Sau đó, khoai tây được trồng ở nhiều nơi và dan trở thành câylương thực chủ đạo Ở nước ta, khoai tây được du nhập vào từ người Pháp từ dau thé ki
19 Theo tổ chức nông lương thế giới (FAO, 2022), diện tích trồng khoai tây trên thế
giới vào khoảng 17.788.408 ha với sản lượng 374.777.763 tấn
Trang 131.1.3 Cây ớt
Cây ớt (Capsicum annuum L.) có nguồn gốc nhiệt đới và cận nhiệt đới Châu Mỹ
Cây ớt có mặt ở nước ta được du nhập từ Trung Quốc, An Độ Diện tích phân bố khárộng rãi, tập trung ở miền Bắc và miền Trung, ở miền Nam diện tích trồng ớt còn phântán Theo tô chức nông lương thế giới (FAO, 2022) cây ớt được xem là một trong nhữngcây trồng quan trọng của vùng nhiệt đới Diện tích trồng ớt thế giới vào khoảng
2.020.816 ha cho mục đích lấy quả tươi với sản lượng 36.972.494 tấn
1.2 Vi khuẩn Ralstonia solanacearum
1.2.1 Sơ lược về vi khuẩn Ralstonia solanacearum
Vi khuẩn Ralstonia solanacearum gay hai hon 200 loai thuc vat Day 1a loai vikhuẩn gây bệnh mach dan được nghiên cứu bởi Halted vào năm 1892 Đến năm 1896,tiếp tục được Erwin Frink Smith nghiên cứu, mô ta và định tên Ralstonia solanacearum.Thời gian sau đó, nhiều nhà khoa học trên thế giới đi sâu vào nghiên cứu bệnh do vikhuẩn Ralstonia solanacearum gây ra một cách toàn diện hon, phải kế đến như làKelman (1954), Hayward (1964), Yabuuchi (1992) (Vũ Triệu Man và Lê Lương Té,
1998).
Theo Caldwell và ctv (2017), Ralstonia solanacearum là tác nhân gây bệnh héo
xanh đo vi khuẩn và lây nhiễm trên 200 loài thực vật thuộc 50 họ Vi khuẩn trong đất
có thê gây chêt đôi với nhiêu loài sông đơn độc, bao gôm cả ca chua.
Bệnh phát sinh từ cây non đến khi thu hoạch Triệu chứng thường biểu hiện ngaysau khi vi khuân xâm nhập vào cây Ở cây bị bệnh, ban ngày lá mat màu nhẫn bóng, táixanh, héo cụp xuống Ở giai đoạn cây con thường biểu hiện trên toàn cây, còn ở giaiđoạn trưởng thành triệu chứng thường biểu hiện ở lá ngọn trước Ở 1 - 2 ngày đầu cây
có thể phục hồi lại được vào lúc trời mát hoặc về đêm, nhưng sau 2 - 3 ngày lá héo
không thể hồi phục lại được nữa và toàn cây bị héo rũ rồi chết Vỏ thân gần gốc của cây
bị bệnh san sùi, khi cắt ngang thấy bó mạch bị hóa nâu Trong điều kiện 4m độ cao, thân
cây bị bệnh dan dần thối mềm, ấn mạnh gần miệng cắt có thé thay dịch nhay vi khuẩn
tiết ra màu trắng sữa Rễ có màu nâu đen và thối (Kucharek, 1998)
Trang 141.2.2 Đặc diém cau tạo và điêu kiện phát triên của vi khuân Ralstonia solanacearum
Vi khuẩn Ralstonia solanacearum là vi khuẩn hình que, hai đầu hơi tròn, có lôngroi ở một đầu, kích thước tế bào 0,5 - 1,5 um, nhuộm gram âm Vi khuẩn tồn tại trong
đất, nước, tàn dư thực vật, ký chủ phụ, hạt giống (đậu phộng) Vi khuẩn thích hợp ở
nhiệt độ 25 — 35°C, nhiệt độ tôi đa là 41°C, nhiệt độ tối thấp 10°C, nhiệt độ gây chết là55°C Vi khuẩn phát triển trên phạm vi rộng pH = 6,8 - 7,2
Thời gian vi khuẩn tồn lưu trong đất phụ thuộc vào nhiều yếu tố như âm độ, nhiệt
độ, hóa lý dat Vi khuẩn có thé tồn lưu trong đất từ 5 - 6 năm, trong cơ thé ký chủ thựcvật hoặc trong hạt giống có thê song toi 7 thang, con nếu bám dính trên bề mặt hat chitồn tại 2 - 7 ngày (Vũ Triệu Man và Lê Lương Té, 1998)
Vi khuẩn lan truyền chủ yếu bằng nguồn nước, đất như bám dính vào giày dép,dụng cụ canh tác (Martin và French, 1985) Bệnh héo xanh vi khuân phát sinh phát triển
phụ thuộc vào điều kiện đất đai như trên các chân đất cao bệnh thường nặng hơn các
chân đất thấp, dat được luân canh với lúa nước làm giảm tỷ lệ bệnh đáng ké (Đỗ Tan
Dũng, 2001).
Thời vụ trồng cũng là yếu tô quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển bệnh, thời vụtrồng có mưa nhiều, âm độ cao làm gia tăng sự phát sinh phát triển bệnh Mật độ trồngcao tỷ lệ bệnh thường cao do chúng tạo một vùng khí hậu thuận lợi cho sự phát sinh pháttriển bệnh
1.2.3 Hình thức xâm nhập vào cây ký chủ
Vi khuẩn R solanacearum lan truyền theo nước tưới, xâm nhập vào cây qua vếtthương hoặc qua lỗ thở tự nhiên, vết nứt đầu rễ và di chuyên vào trong bó mạch, sau đó
phá bó mạch làm tắc nghẽn sự vận chuyền nước và chất dinh dưỡng gây ra bệnh héo
xanh trên các cây họ cà, mạnh nhất khi cây đang trong giai đoạn phát triển
1.2.4 Biện pháp phòng trừ
Đây là loại bệnh rất khó phòng trị, sử dụng thuốc hoá học không có hiệu quả cao,
do vậy áp dụng các biện pháp phòng tri tong hợp có hiệu qua cao hơn
Trang 15Biện pháp canh tác: Luân canh cây trông; đây là biện pháp có hiệu quả cao, có thê
luân canh với cây khác họ cà hoặc luân canh với lúa nước Không nên trông cà chua 2
vụ liên tiếp trên một chân đất
Xử lý hạt giống trong nước nóng 50°C trong 25 phút
Sử dụng cây giống ở vườn ươm không bị bệnh
Vệ sinh đồng ruộng dọn sạch cỏ dai
Sử dụng phân hữu cơ hoai mục dé bón
Sử dụng biện pháp ghép dé tăng tính chống chịu cũng là một trong những biệnpháp hiệu quả.
Theo French va ctv (2018), tác nhân gây bệnh trong dat Ralstonia solanacearum
là tac nhân gây bệnh héo xanh vi khuẩn va gây mat mùa đáng kể trong ho Solanaceae
Đầu tiên mầm bệnh lây nhiễm vào rễ, đây là nguồn kháng bệnh quan trọng ở cachua 6 (Solanum lycopersicum L.) Rễ của cả cây kháng bệnh và cây man cảm đều bị
mam bệnh xâm chiếm, tuy nhiên gốc ghép có thé cung cấp mức độ kháng bệnh đáng kẻ
Hiện tại, các cơ chế của “sự đề kháng qua trung gian gốc rễ” này phần lớn vẫnchưa được biết Đề xác định cơ sở phân tử của tính kháng này, đã tiến hành phân tích
phản ứng phiên mã trên toàn bộ bộ gen của rễ cây cà chua “Hawaii 7996” và cà chua
“West Virginia 700” (WV) nhạy cảm ở nhiều thời điểm sau khi được cấy vi khuẩn R.solanacearum Nhận thay rằng các con đường phòng thủ trong rễ của Hawaii 7996
kháng thuốc được kích hoạt sớm hơn và mạnh hơn so với rễ của WV nhạy cảm Hơn
nữa, các con đường truyền tín hiệu và vận chuyên auxin bị ngăn chặn trong rễ của giống
kháng Phân tích chức năng của một đột biến vận chuyên auxin trong cà chua cho thấyvai trò của con đường auxin trong bệnh héo ở vi khuẩn Kết quả của nghiên cứu chothấy rằng rễ làm trung gian đề kháng với R solanacearum thông qua các thay đôi phiên
mã trên toàn bộ bộ gen dẫn đến kích hoạt mạnh các gen bảo vệ và thay đổi con đường
Trang 16thu được về gốc ghép, ở Tân Hòa, cây ớt ghép trên gốc TN557 có tỉ lệ bệnh (18,8%)thấp hơn đối chứng không ghép (36,3%) ở giai đoạn kết thúc thu hoạch, năng suất trái
10,3 tan/ha, cao hơn 25,0% so với đối chứng không ghép và 32,1% so với đối chứng
ghép lên chính nó Ở Tân Hué, gốc TN557 cũng có tỉ lệ bệnh héo xanh (20,0%) thấphơn đối chứng không ghép (38,8%) ở giai đoạn kết thúc thu hoạch, năng suất trái 5,44
tan/ha, cao hơn 18,0% so với đối chứng không ghép và 23,4% so với đối chứng ghép
lên chính nó Vật liệu phủ liếp không ảnh hưởng đến bệnh héo xanh vi khuẩn, năng suất
ớt trồng có sử dụng màng phủ là 9,63 tắn/ha, tương đương 33,0% cao hơn phủ rơm ở xã
Tân Hòa và 5,17 tan/ha, tương đương 30,5% cao hơn phủ rơm ở xã Tân Hué
Võ Thị Bích Thủy và ctv (2016), đã thực hiện nghiên cứu “Đánh giá khả năng gâybệnh của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum và bước đầu khảo sát ảnh hưởng
của các gốc ghép ớt đến khả năng chống chịu bệnh héo vi khuẩn trên ớt sừng 7 trongđiều kiện nhà lưới” Kết quả phân lập được 6 chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum
phân bố tại các tỉnh An Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp và Kiên Giang
So sánh kha năng gây hại của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trongđiều kiện nhà lưới bằng phương pháp tưới huyền phù vi khuẩn (4x10!° CFU/mL) vàođất giai đoạn cây có 4 - 5 lá thật (22 ngày sau khi gieo), 5 mL/cây Kết quả cho thấy, 6chủng vi khuẩn được sử dụng đều có khả năng gây bệnh héo xanh do vi khuẩn bat đầu
từ 12 ngày sau khi lây bệnh nhân tạo Thời điểm 32 ngày sau khi lây bệnh, 6 chủng vikhuân đều gây hại trên giống ớt sừng vàng Châu Phi, trong đó 2 chủng vi khuân phânlập ở Thanh Bình - Đồng Tháp gồm Rs1 (Tân Binh) và Rs2 (Tan Quới) có tỉ lệ bệnh(93,79% và 95,78%) và cấp bệnh (2,32 - 2,50) cao hơn so với các chủng còn lại, trongkhi đó đối chứng - không chủng bệnh hoàn toàn không có bệnh, vì vậy 2 chủng vi khuẩn
này được sử dụng để tiếp tục nghiên cứu đánh giá khả năng kháng bệnh héo xanh vi
khuẩn trên cây ớt sừng ghép gốc Thời điểm 40 ngày sau khi lây bệnh, các gốc ớt ghép
TN592, TN557 và hiểm 27 (2,50%) cho kết quả kháng bệnh tốt hơn với tỉ lệ bệnh trong
khoảng 0,00 - 7,15% và cấp bệnh dao động từ 0,00 - 0,83, thấp hơn có khác biệt so vớiđối chứng - không ghép (ti lệ bệnh 54,18% và cấp bệnh 1,77)
Bên cạnh đó, việc sử dụng giống kháng cũng đã có những hiệu quả nhất định Theo
Caldwell và ctv (2017), bệnh được kiểm soát tốt nhất bằng cách sử dụng các giống cây
Trang 17trồng kháng bệnh, đặc biệt là các gốc ghép kháng bệnh mặc dù cây kháng bệnh có thémang mam bệnh cao (từ 10° đến 108 CFU/g trọng lượng tươi) Làm thé nào những câynày bị nhiễm khuẩn tiềm ân nhưng duy tri sức đề kháng vẫn chưa được rõ ràng R.solanacearum đầu tiên lây nhiễm vào cây thông qua hệ thống rễ và do đó, việc xâmnhiễm rễ sớm có thé là chìa khóa dé hiểu tính kháng Có giả thuyết rang sự phân bố vàthời gian xâm nhập của vi khuân khác nhau ở rễ của các giống cà chua kháng và mẫncảm Sử dụng kết hợp giữa kính hiển vi điện tử quét và kính hiển vi ánh sáng dé khảosát R solanacearum xâm nhập vào rễ của các giống cà chua kháng và man cam với đất
trồng ở nhiều thời điểm sau khi cấy Kết quả của nghiên cứu cho thấy rằng sự xâm nhập
của trụ mạch rễ bị trì hoãn trong khả năng kháng “Hawaii 7996” và một khi vi khuẩnxâm nhập vào các mô mạch gốc, sự xâm 8 nhập cua khuẩn lạc trong hệ mạch bị hạn chế
về mặt không gian Dữ liệu cho thấy tính kháng một phần là do khả năng của giống cây
trồng kháng bệnh trong việc hạn chế sự xâm chiếm của rễ vi khuẩn trong không gian vàthời gian.
Theo Kim và ctv (2016), bệnh héo rũ vi khuẩn trên cà chua do vi khuẩn Ralstoniasolanacearum gây ra là một loại bệnh làm hạn chế việc canh tác cà chua tại Hàn Quốc
Cách tốt nhất dé kiểm soát bệnh này là sử dụng những giống cà chua có tính kháng Mức
độ kháng đối với R solanacearum đã được đánh giá đối với 285 cây cà chua được bảo
tồn tại Trung tâm Đa dạng sinh học Quốc gia của Cục Quản lý Phát triển Nông thôn.Những giống cà chua này có nguồn gốc từ 23 quốc gia Mức độ nghiêm trọng của bệnh
đối với cà chua xâm nhập được khảo sát từ 7 ngày đến 14 ngày trong khoảng thời gian
7 ngày sau khi cay R solanacearum trong điều kiện nhà kính Tông số 279 sự xâm nhậpcủa mầm cà chua nhạy cảm với R solanacearum, dẫn đến héo và chết ở 70 đến 90% sốcây này Hai giống cà chua có khả năng kháng R solanacearum ở mức độ trung bình.Chỉ có bốn lần gia nhập đã cho thay khả năng chống lại R solanacearum cao Không cótriệu chứng khác biệt của bệnh xuất hiện trên các mầm cà chua kháng thuốc trong tối đa
14 ngày sau khi chủng R solanacearum Soi kính hiển vi những thân cà chua kháng
bệnh bị nhiễm R solanacearum cho thấy sự lây lan của vi khuẩn hạn chế với sự dày lên
của mang hồ và tạo mủ Do đó, bốn mầm cà chua kháng bệnh này có thể được sử dụngtrong chương trình nhân giống cà chua chống lại bệnh héo xanh do vi khuẩn
Trang 18Biện pháp cơ giới vật lý: Nhồ bỏ cây bị bệnh gom lại dem đi đốt Tránh việc tiếpxúc giữa cây bệnh và cây khỏe, lưu ý khi tưới nước, tỉa cành, thu hái trái.
Biện pháp sinh học: Có thể sử dụng chế phẩm sinh học đối kháng như
Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis.
Theo “Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn (Ralstonia solanacearum Smith) hai
cây khoai tây vùng Hà Nội - phụ cận và biện pháp phòng trừ” của Nguyễn Tất Thang
và ctv (2011), đã cho thây rằng các dòng vi khuân gây bệnh héo xanh phân lập trên cácgiống khoai tây khác nhau ở các vùng khác nhau đều có khả năng gây hại trên các giốngkhoai tây; sử dụng chế phẩm vi sinh vật đối khang Bacillus subtilis kết hợp với thuốchóa học dé phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn hại khoai tây Chế phẩm dùng xử lý đấttrước khi trồng có tác dụng hạn chế khả năng xâm nhiễm, phát sinh phát triển của bệnh
héo xanh vi khuẩn hại khoai tây Các loại thuốc hóa học và kháng sinh có khả năng ức
chế sự phát sinh gây hại của bệnh Trong đó, thuốc Lobo 8WP có hiệu lực phòng trừbệnh héo xanh vi khuẩn hại khoai tây cao nhất sau 28 ngày đạt 78,8% - 80,2% Tiếp đến
phòng chống vi khuẩn R solanacearum do vi khuan này có nguồn gốc từ đất xâm nhiễm
gây bệnh và sinh sản trong hệ thống mạch dẫn của cây (Caldwell và ctv, 2017)
1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh héo xanh ở Việt Nam và thế giới
1.3.1 Tình hình nghiên cứu bệnh ở Việt Nam
Ở trong nước các công trình tập trung nghiên cứu về tính phô biến, mức độ tác
hại, phạm vi kí chủ, triệu chứng bệnh, đặc tính sinh học và quy luật phát sinh phát triểncủa bệnh và một số hướng phòng trừ của một số tác giả Đặng Thái Thuận (1968), ĐoànThị Thanh va ctv (1995), Lê Lương Té (1997), Đỗ Tân Dũng (2001,2004)
Trang 19Theo Lê Lương Té (1997) bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc thường phát sinh ở cảhai thời vụ trồng là lạc vụ xuân và lạc thu
Nguyễn Xuân Hồng và ctv (1993) cho biết: Bệnh hại nghiêm trọng ở một số vùng
trọng điểm ở tỉnh Nghệ An và Thanh Hóa với tỷ lệ bệnh giao động từ 15 - 35% và ởvùng trồng lạc của tỉnh Long An và Tây Ninh là 20 - 30%
1.3.2 Tình hình nghiên cứu bệnh ngoài nước
1.3.2.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn hại cây trồng
Vi khuẩn được Smith n ghién cứu và đặt tên là Pseudomonas solanacearum từ nam
1896 Năm 1996 tác giả Yabuuchi đã nghiên cứu, đề nghị chuyên vi khuân gây bệnhHXVK thành tên mới Ralstonia solanacearum Smith Bệnh HXVK là loại bệnh quan
trọng và điển hình nhất ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và những vùng có khí hậu ôn đớitrên thế giới (Hayward, 1994) Bệnh gây nên những thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế,làm giảm năng suất trên nhiều cây trồng từ 15 - 95%, thậm chí là 100% trên cây cà chua
(AVRDC report, 2000) đến 70% trên cây khoai tây (Sinha, 1986)
1.3.2.2 Những nghiên cứu về vi khuẩn gây bệnh héo xanh
Bệnh HXVK do vi khuan R solanacearum có hình gậy ngắn, tròn ở hai đầu gậy
ra Kích thước khoảng 1,0 - 1,5 x 0,5 - 0,6 um Khuan lạc có bề mặt trơn, nhẫn, ít khi
gồ ghé, hơi chảy hoặc không chảy, có thé có màu trắng, trắng đục hoặc phot hồng trênmôi trường TZCA (Mehan va ctv, 1994).
Vi khuan gây bệnh HXVK là ky sinh đa thực, gây hai trên cà chua, lac, thuốc lá
và nhiều cây trồng, cây rừng và cả cỏ đại Vi khuẩn có thé tồn tại lâu trong đất, trongtàn dư cây bệnh và trên cỏ dại (Persley, 1986)
Dựa vào khả năng sử dụng, oxy hóa 3 loại rượu là mannitol, sorbitol, dulcitol và
3 loại đường là lactoza, maltoza, cellobioza (Hayward 1964; He va ctv, 1983) đã nghiên
cứu và phan loại vi khuẩn đến biovar (thử sinh học) Theo các tác giả, loài R
solanacearum có 5 biovar gây bệnh HXVK bao gồm:
- Biovar 1: không có oxy hóa cacbon hydrat
- Biovar 2: oxy hóa đường nhưng không oxy hóa rượu
Trang 20- Biovar 3: oxy hóa tất cả các cacbon hydrat
- Biovar 4: chỉ oxy hóa rượu
- Biovar 5: oxy hóa lactose, maltose, cellobiose và manitol nhưng không oxy hóa sorbitol, dulcitol.
Đã phát hiện va công bố 5 race khác nhau trên cơ sở phân biệt về phạm vi ký chủ,
phân bố địa lý và khả năng tồn tai ở những môi trường khác nhau (He va ctv, 1983)
Nòi 1 (race 1): Có phạm vi ký chủ rộng, lây nhiễm các cây họ cà và một cây họ
đậu Phân bố chủ yếu ở vùng đất thấp của vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Nòi 1 gồm
biovar 1, biovar 3 và biovar 4.
Noi 2 (race 2): Gây bệnh trên chuối (Heliconia spp.) ở miền Trung và Nam Mỹgồm biovar 2 và biovar 3
Nòi 3 (race 3): Phạm vi ký chủ hẹp gây bệnh chủ yếu cho khoai tây, cà chua và
được tìm thấy ở vùng ôn đới vĩ độ cao và ở những vùng nhiệt đới cao Nòi 3 chỉ có
1.4 Phân tích đa dang di truyền dựa vào chỉ thị sinh học phân tir
1.4.1 Khái niệm đa dạng di truyền
Da dạng di truyén là sự khác biệt về đặc điểm di truyền của các cá thể trong cùng
một loài hay các quần thể trong loài cũng như giữa các cá thê trong một quần thẻ
Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự đoạn gen khác nhau Trong cùngmột giống, các cá thể cũng có thể mang những trình tự gen khác nhau, do sự xuất hiệncủa một loại đột biến nào đó Đôi khi sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt di truyền, cóthé quy định thành một tinh trạng khác với những cá thé cùng giống
Trang 21Sự khác biệt di truyền được ghi nhận thông qua sự khác biệt trong trình tự DNA,trong đặc tính sinh học (cấu trúc protein, đặc trưng của enzyme), đặc điểm sinh lý (khánglại các yếu tố bất lợi môi trường hay mức độ sinh trưởng) và đặc điểm hình thái (màuhoa, dạng cây) giữa các cá thể (Nguyễn Đức Thành, 2015).
1.4.2 Chỉ thị sinh học phân tử - chỉ thị DNA
Chỉ thị sinh học phân tử DNA được tạo ra nhờ những kỹ thuật sinh học phân tử.
Chỉ thị DNA là những thay đôi trong phân tử DNA, nằm gần hay liên kết với gen vàkhông có hoặc ít ảnh hưởng tới kiểu hình Chỉ thị DNA là một đoạn DNA được sử dụng
dé đánh dấu hay truy theo một vị tri (locus) trên nhiễm sắc thé Những chi thi DNA
mang day đủ các đặc tinh của một chỉ thi di truyền điền hình Khác với chi thị hình thai
và chỉ thị sinh hoá, chỉ thi DNA không giới hạn về so lượng, không ảnh hưởng bởi cácyếu tố môi trường Chỉ thị DNA được chia thành nhiều loại dựa trên sự khác nhau vềphương pháp và kỹ thuật xác định sự đa hình (Bảng 1.1) (Nguyễn Đức Thành, 2015).Các chỉ thị phân tử ngày nay càng phát triển và được ứng dụng rộng rãi trong phân tích
đa dạng di truyền
Trang 22Bảng 1.1 Các chỉ thị DNA thường được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền
(Nguyễn Đức Thành, 2015).
Tên viết tắt Tên tiếng anh Tên tiếng việt
Các chỉ thị dựa vào phương pháp lai DNARFLP Restriction Fragment Length Da hình độ dài đoạn cắt hạn
Polymorphism chếREF Restrition Endonuclease Lay dau cat han ché
Fingering
Cac chi thị dựa trên phản ứng PCR
AFLP Amplified Fragment Length Da dạng độ dai khếch đại
Polymorphism chọn lọc
RAPD Randomly Amplified DNA da hình được khuếch
Polymorphism DNA đại ngẫu nhiên AP-PCR Arbitrarily primed PCR PCR với primer ngẫu nhiên
Các chỉ thị dựa trên các tiểu vệ tỉnhISSR Inter — Simple Sequence Repeats Chuỗi lặp lại đơn giản giữa
ISTR Inverse Sequence Tagged Chuỗi lặp lại ngược được
Repeats đánh dau
Các chỉ thị PCR các chuỗi đặc trưng
STS Sequence — Tagged — Site Vị trí chuỗi đánh dau
SCAR Sequence Characterised Vung nhân ban các trình tự
Anplfication Regions được mô tả
SSR Simple Sequence Repeats Cac chuỗi lặp lại đơn giản
Các chỉ thị gen nhảyREMAP Retrotrasposon — Microsatellite Da hinh tiéu vé tinh gen
Amplified Polymorphism nhảy được khuếch đại
IRAP Inter — Retrotrasposon Amplified Da hình gen nhảy giữa được
Polymorphism khuêch đại
Các chỉ thị nhần khác ITS Interal Transcribed Spacer Vung sao mã giữa
SNP Single Nucleotide Polymorphism Đa hình nucleotide đơn
DarT Diversity array Technology Céng nghé sap xép da dang
Chi thi DNA có hiệu quả cao hon so với các chi thị sinh hoá truyền thống do nghiêncứu trực tiếp vật liệu di truyền và có thể tìm ra mối quan hệ giữa các loài (William và
ctv, 1990) Việc sử dụng các chi thị sinh hoá có nhiều hạn chế vì phải sử dụng số lượngmau lớn (Babik và Rafinski, 2000) So với chi thị hình thái, chỉ thi DNA tiết kiệm hơn
về thời gian và công sức (Cooke, 1984)
Trang 231.4.3 Kỹ thuật ISSR (Inter — simple Sequence Repeats)
Nghiên cứu đầu tiên về kỹ thuật chi thi phân tử ISSR được xuất ban năm 1994.ISSR là một trong các loại chỉ thị microsatellite sử dụng nguyên tắc cơ bản của RAPDvới mồi hình thành từ phần của chuỗi microsatellite và phần base ngẫu nhiên có độ dàikhoảng 16 — 25 bp (Reddy va ctv, 2002) Các mỗi sử dụng có thé là non — anchored haycòn gọi là MP — PCR (microsatellite primed PCR) (Meyer và ctv, 1993; Gupta và ctv, 1994), hoặc là anchored ở vi tri 5’ hoặc 3’ với 1 - 4 base (Zietkiewicz va ctv, 1994).
Trinh tự primer được sử dung trong phản ứng PCR — ISSR được thiết kế dựa trên những
đoạn trình tự nucleotide lặp lại đơn giản gồm 2 nucleotide như (CA), (AT)n, (AG)n haynhững trình tự gồm 3 nucleotide được lặp lại nhiều lần như (AGC)n, (TAT)n
[—CTCTGTCTCTCTCTCTCTCTCT ==) + §
—— SS F._———
Về nguyên tắc, PCR sẽ khuếch đại những đoạn sườn (nằm kế cận) các motif
microsatellite Trong những điều kiện khuếch đại phù hợp, kỹ thuật ISSR cho phép sản
Trang 24sinh vài chục sản phâm có chiều dài trong khoảng 200 — 2000 bp, do đó chúng có théđược điện di trên gel agarose hay gel acrylamide (Reddy và ctv, 2002) Sự đa dạng đượcphát hiện chủ yếu thuộc dạng xuất hiện hoặc không xuất hiện như đối với RAPD nhưng
đôi khi tương ứng với sự khác nhau trong độ dài câc đoạn như đôi với microsatellite Các bước thực hiện kỹ thuật ISSR:
- Tach DNA hệ gen.
- Chay PCR với DNA hệ gen với mồi đơn là các microsatellite
- Phân tách các đoạn DNA được khuếch đại trên gel agarose
- Nhuộm gel và chụp ảnh.
- Phân tích số lượng
- Đánh giá đa dang di truyền
So với các chỉ thị khác, chỉ thị ISSR có các ưu điểm và nhược điểm xét về mức độ
đa hình, chi phí thực hiện và bản chất của các chỉ thị (Bang 1.2)
Bang 1.2 Ưu điểm và nhược điểm của các chi thi phan tử (Vijayen, 2005)
Chi phí Chi phí Tên chỉ Sử dụng Mức độ đa Bản chất ]
thị PCR hình dau tư thực hiện
RFLP Không Trungbình Đồng trội Cao Cao
RAPD Có Cao Trội Thấp Thấp
SSR Có Cao Đồng trội Cao Trung bìnhISSR Có Cao Trội Thấp Thấp
AFLP Có Cao Trội Trung bình Trung bình
Isozyme Không Thấp Đồng trội Cao Trung bình
STS Có Cao Trội Cao Trung bình
Những chỉ thị ISSR được phát hiện rất đa hình ISSR có ưu điểm hơn RADP do sửdụng môi có kích thước dài hơn nên các điều kiện trong giai đoạn bắt cặp của các moi
có sự nghiêm ngặt cao, han chế được hiện tượng nhằm lẫn bắt cap giữa các primer dẫnđến khả năng lặp lại (reproductible) cao hon RAPD (Zietkiewicz va ctv, 1994; Bornet
và Branch, 2001; Reddy và ctv, 2002) Nghiên cứu khả năng lặp lại của ISSR cho thấy
92 — 95 % các băng DNA được khuếch đại từ cùng mẫu DNA của cùng một giống
Những băng mờ nhạt, không rõ mới không có khả năng lặp lại Hơn nữa, kỹ thuật này
Trang 25thực hiện đơn giản, it tốn thời gian và chi phí không cao so với các chỉ thị phân tử khác
(Reddy và ctv, 2002).
Trong hầu hết trường hợp, ISSR là chỉ thị mang tính trội (dominant) (Tsumura vàctv, 1996) Tuy nhiên, trong một số trường hop, nó là chỉ thị đồng trội (co — dominant)
có thê phân biệt được cá thê đồng hợp tử và dị hợp tử (Sankar và Moore, 2000) Các tác
giả Bornet và Branch (2001) khi nghiên cứu sử dụng ISSR trên bông cải và cây dâu tâyđều cho biết chỉ thị ISSR có khả năng lặp lại cao và đáng tin cậy Hiện nay, kỹ thuậtISSR và các kỹ thuật có nguyên tắc hoạt động tương tự được sử dụng rộng rãi trên nhiều
loại cây trồng trong nghiên cứu nhận diện di truyền, đa dạng di truyền, lập bản đồgenome, xác định gen trong chọn giống cây trồng và nghiên cứu hoá sinh học (Reddy
và ctv, 2002).
1.4.4 Đánh giá đa dạng di truyền
Da dang di truyền giữa các cá thé trong một quan thé được đánh giá dựa vào mức
độ đa dạng gen Đa dạng gen là sé bang đa hình hoặc ty lệ bang đa hình được thực hiện
bằng việc khuếch đại các trình tự DNA với các primer hoặc các cặp primer bằng các kỹ
thuật chỉ thị DNA tương ứng Số băng DNA đa hình hoặc tỷ lệ băng đa hình có thé daođộng từ 0 — 100% và giá trị càng lớn thì mức độ đa dạng càng cao Ty lệ băng đa hìnhđược tính bằng tổng số băng đa hình trong quan thê nghiên cứu chia cho tổng số các
băng ghi được (Nguyễn Đức Thành, 2015)
Phân tích sự đa dạng di truyền dựa vào các chỉ thị phân tử DNA bao gồm phântích mối quan hệ di truyền giữa các mẫu thu thập và các chỉ số đa dạng di truyền ở mức
độ cá thé hay quan thé Quan hệ di truyền giữa các cá thé trong quan thể được đánh giá
dựa vào hệ số tương đồng di truyền (genetic similarity cofficient) hoặc hệ số khôngtương đồng di truyền (genetic dissimilarity cofficient) Các hệ số thường dùng là hệ sốDice (còn gọi là hệ số Nei và Li); hệ số Jaccard; hệ số phù hợp đơn giản (SM) (Kosman
và Leonnard, 2005).
Trang 26Bảng 1.3 Công thức tính các hệ số phân tích đa dạng di truyền (Kosman và Leonnard,
2005)
Tên hệ số Công thức Giải thích
Hệ số Dice Dị = 2ai/(2ai + bị + cj) a là số băng chung của 2
Mối quan hệ di truyền được thé hiện bằng việc phân nhóm dựa trên các thuộctính hay mối quan hệ chung của cá thể thông qua việc sử dụng các hệ số tương đồng Hệ
sỐ tương đồng được tính toán dựa vào các số liệu về chỉ thị DNA đề phân nhóm theo
biéu đồ hình cây hoặc biểu đồ kiểu hình Các phương pháp phô biến dé xây dựng biểu
đồ hình cây cho ma trận khoảng cách là phương pháp nhóm cặp không điều chỉnh sử
dụng các giá trị trung bình số học (UPGMA) (Sneath và Sokal, 1973); phương pháp lân
cận (NJ) (Saitou và Nei, 1987) Phan mềm NTSYSpc (Rohlf, 2000) được sử dung thôngdụng nhất trong phân tích phân nhóm dựa trên số liệu chỉ thị phân tử DNA (Nguyễn Đức
Thành, 2015).
1.5 Một số nghiên cứu về đa dang di truyền vi khuẩn Ralstonia solanacearum ở ViệtNam và trên thế giới
Trong nghiên cứu đánh giá da dang di truyền của các chủng vi khuẩn Ralstonia
solanacearum Smith ở một số tỉnh miền Nam bằng chỉ thị RAPD, Trương Thị Hồng Hải
(2015) đã sử dụng 24 chỉ thị RADP dé nghiên cứu đa dang di truyền của 19 chủng vikhuẩn đã thu được tổng số 923 băng AND Dựa vào nức đọ tương đồng về hệ số di
Trang 27truyền, 19 chủng vi khuân chia thành 5 nhóm chính Hệ số tương đồng di truyền giaođộng 0,61 - 0,81.
Trong nghiên cứu đặc điểm của Ralstonia solanacearum gây héo vi khuẩn ở ớt
chuông tai bang Pernambuco, Brazil (Garcia va ctv, 2013) đã phân tích 77 chủng vi
khuẩn thu thập được bang phương pháp ISSR với 3 mỗi được sử dung là 820, GTG5 vàGACA, có độ tương tự cao và không có khả năng phân tách các chủng bằng biovar,biotype, phylotype hoặc khu vực lay mẫu Môi 820 cho thay sự tương đồng lớn hơn giữacác chủng Phân tích cụm được tạo bằng dữ liệu từ đoạn mỗi này cho thấy sự ton tại của
ba nhóm khác nhau ở mức độ tương đồng là 75%
Trang 28Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Thời gian và địa điểm
Đề tài được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 5 năm 2023 đến tháng 2 năm
2024, tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Bảo vệ Thực vật khoa Nông học, Trường Đạihọc Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh
2.2 Vật liệu thí nghiệm
2.2.1 Các dòng vi khuẩn sử dung trong thí nghiệm:
Cac dòng vi khuan tai phòng thí nghiệm Bộ môn Bao vệ Thực vat
Bảng 2.1 Danh sách các dòng vi khuẩn được sử dụng
STT Kí hiệu Định danh sinh hóa
1 CHAI Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
2 CHA2 Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
3 CHA3 Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
4 CHA4 Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
5 CHAS Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
6 CHA6 Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
7 KKADI Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
8 KKAD2 Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
9 KKAD3 Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
10 KKAD4 Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
Trang 29STT Kí hiệu Định danh sinh hóa
11 KKAD5 Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
12 KKAD6 Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
13 KKDI Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
14 KKD2 Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
lộ KKD3 Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
16 KKD4 Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
17 KKD5 Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
18 KKD6 Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
19 KKD7 Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
20 KQLI Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
21 KQL2 Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
22 KQL3 Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
23 KQL4 Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
24 KQLS Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
25 CXTI Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
26 CXT2 Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3 2/ CXT3 Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
28 CXT4 Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
29 CXT5 Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
30 CXT6 Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
31 CXT7 Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
32 CXT8 Ralstonia solanacearum thuộc biovar 3
Trang 30Tất cả 32 mẫu vi khuẩn trên được phân lập từ cà chua và khoai tây có triệu chứng bệnhhéo xanh tại tỉnh Lâm Đồng (HA - Hiệp An, KAD - Ka Don, KD - Ka Đô, XT - Xuân
Thọ)
2.2.2 Dụng cụ, thiết bị máy móc
Các trang thiết bị gồm: cân điện tử (PX OHAUS), bếp điện Sunhouse, đĩa petri, tủcay vi sinh, máy hấp khử trùng (MC40L, ALP, Japan), lò vi sóng, Máy lac Vortex ZX3Velp, máy ly tâm HERMLE Z287A, máy PCR (TurboCycler), hệ thống chụp gel UV,
tủ âm -20°C, máy điện di.
2.2.3 Môi trường, hóa chất sử dụng
Hóa chất sử dụng:
Hóa chất: My Taq Polymerase (Bioline — Anh), cồn 96, cồn 70, Primer ISSR,Agarose (Bioline), TAE Ly trich DNA: Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol (25:24:1), lysis buffer (Tris - HCL 50 mM, NaCl 300 mM, EDTA 25 mM, SDS 0,5%,
pH = 8), TE 1X (Tris -HCL 10 mM, EDTA 1 mM, pH =8), isopropanol, nước cất 2 lần
vô trùng, ethanol 70%.
Ky thuat dién di: Agarose 1,5%, TAE 1X, 6XGelred DNA Loading buffer tricolor,
Ladder Ikb.
Môi trường sử dung:
Môi trường KBA: peptone 20 g, glycerol 10 g, KaHPOa khan 1,5 g, MgSOa.7H2O
1,5 g, Agar 1 g, nước cất 1000 mL Tron chung tat ca các thành phần ngoại trừ MgSOa
Điều chỉnh pH đến 7,2 Từ từ thêm MgSOs và khuấy đều Hap khử trùng ở 121°C trong
25 phút
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Định danh vi khuẩn gây bệnh héo xanh bằng trình tự vùng gen 16S-rDNA2.3.1.1 Phương pháp ly trích DNA
DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp CTAB (Doyle J.J., 1991) cải tiến như
sau:
Trang 31Bước 1: Sử dụng cồn 70% lau don sạch chỗ ly trích Cho 400 pL TE (1M Tris HCl +0.5M EDTA) vào eppendoft 1,5 mL Lay vi khuẩn đã ủ sau 24 — 48h cho vào eppendoft
=> Vortex từ 3 - 5 phút.
Bước 2: Thêm 30 uL SDS 10% => Đảo nhẹ Sau đó thêm 100 wl NaCl 5M => Đảo nhẹ.
Bước 3: Cho 80 u_ CTAB 10% => Đảo nhẹ U 15 phút trong 65°C (5 phut/dao)
Bước 4: Thêm 300 uL Chlorophorm => Đảo nhẹ Sau đó ly tâm 15 phút / 14.000 vòng.Bước 5: Hút 300 — 500 pL dịch nổi cho vào ống eppendoft 1,5 mL mới Thêm 750 pLC2H5OH 96% => Đảo nhẹ.
+ Có thé ủ ngăn đá 10 — 15 phút dé có ADN Nếu ly tâm lạnh thì bỏ qua bước này =>Tiến hành ly tâm lạnh 15 phút / 14.000 vòng
Bước 6: Đồ bỏ phần chất lỏng phía trên và giữ lại phần cặn dưới đáy Lấy cặn rữa với
1000 pL C2H5OH 70% => Đảo nhẹ.
Bước 7: Ly tâm lạnh 15 phút / 14.000 vòng Sau đó sấy khô ở nhiệt độ phòng trong 30
phút.
Bước 8: Thêm 50 uL TE Sau đó trữ mẫu trong tủ lạnh — 20°C
* Kiểm tra độ tinh sạch DNA
Sau khi ly trích, DNA được kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch (A260/280) bangmáy Nano-Drop (ND2000 Spectrophotometer, Thermo Scientific, U.S.A), nhằm đảmbảo chất lượng DNA và điều chỉnh cho phù hợp với từng phản ứng PCR DNA này được
sử dụng làm nguồn chung cho các phản ứng PCR trong quá trình nghiên cứu
2.3.1.2 Phản ứng PCR
Bảng 2.2 Danh sách thông tin các primer sử dụng trong phan ứng PCR (Lane,1991)
Mỗi (Primer) Trình tự môi
27F 5”- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’
1492R 5’- ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’
Trang 32Bảng 2.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với primer 27F và 1492R
Chu kỳ Giai đoạn Nhiệt độCC) Thời gian
1 Tién bién tinh 96 4 phút
(10 uM) (Apical Scientific, Malaysia).
* Dién di kiém tra san pham PCR: Cac san pham PCR được nhuộm với 6X Gelred
DNA Loading trên gel điện di agarose 1,5% trong dung dịch đệm TAE 1X (40 mM Tris;
20 nM acid acetic; 1 mM EDTA; pH 8,0) ở 90 V trong 35 phút ở nhiệt độ phòng và hiển
thị dưới tia UV Kích thước của các vùng DNA khuếch đại được ước tinh bang cách so
sánh với thang HyperLadderTM 1kb (Bioline, Meridian).
* Giải trình tự: Sản phẩm PCR được khuếch đại, sau đó được gửi đi tinh chế vàgiải trình tự tại Viện Công nghệ ADN và Phân tích di truyền (GENLAB), Hà Nội
* Vẽ cây phát sinh loài: Tất cả các trình tự được phân tích bằng phần mềm Bioedit,
và kiểm tra mức độ tương đồng của các dòng vi khuẩn này với các chủng đã được công
bố trên cơ sở dữ liệu GenBan bằng công cụ BLAST
(http://blast.stva.ncbI.nlm.nih.øov/Blast.cg1).
Trang 33Tiếp theo điều chỉnh thủ công sử dụng thông qua chương trình căn chỉnh ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) Phần mềm MEGA 11 (Kumar va ctv,
2016) được sử dung dé xây dựng cây phat sinh loài với hệ số bootstrap 1000 lần
2.3.2 Đánh giá đa dạng di truyền
Quy trình nhiệt của phản ứng PCR với primer ISSR:
Sau khi chuẩn bị xong hỗn hợp phản ứng PCR, tiến hành phản ứng với chu trìnhnhiệt như sau:
Giai đoạn 1 (giai đoạn tiền biến tính): khởi dau: 95°C trong 5 phút
Giai đoạn 2 (giai đoạn biến tinh) (denaturation): 95°C trong 30 giây
Trang 34Giai đoạn 3 (giai đoạn bắt cặp của các mồi) (annealing): 50°C — 57°C trong 1 phút(tuỳ thuộc vào mồi, bảng 2.5)
Giai đoạn 4 (giai đoạn kéo dài đoạn khuếch đại) (extension): 72°C trong vòng 45
giây Số lần lặp lại từ bước 2 đến bước 4 là 35 lần
Giai đoạn 5 (giai đoạn hậu kéo dai): 72°C trong 10 phút.
Sản phẩm PCR sau phản ứng được điện di trên gel agarose 1,5%, dung dịch đệmTAE 1X, hiệu điện thế 90V, cường độ dòng điện 400mA, trong 30 - 40 phút
Bảng 2.5 Danh sách các primer được sử dụng trong phản ứng ISSR
Primer (Môi) Trình tự (5° - 3’) = Tài liệu tham khảo Nhiệt độ
UBC841 (GA)sY Mahmodi va ctv (2014) 57,3°C
UBC810 (AG)sT Mahmodi va ctv (2014) 50°C
UBC808 (AG)sC Mahmodi va ctv (2014) 52,4°C
UBC834 (AG)sTT Mahmodi va ctv (2014) 51,6°C
*Y=C,T
2.3.2.3 Dién di doc két qua PCR trén gel agarose 1.5%
Phương pháp đồ gel agarose và điện di
Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1.5% (cho 1.5g agarose vào 100 ml dung dịch TAE
1X, đun sôi hỗn hợp trên khoảng 2 phút trong máy microwave)
Trang 35Bước 2: Dé nguội dung dịch agarose đã được nau chín đến khoảng 50-60°C, tiếnhành đồ dung dịch vào khuôn gel có gắn sẵn lược dé tạo giếng Đợi đến khi gel đông
hoàn toàn (hon 40 phút).
Bước 3: Lay lược ra, dat gel đã chuẩn bị vào bồn điện di, ngập trong dung dịchđệm TAE 0.5X khoảng 3-5 mm.
Bước 4: Nhuộm DNA bang GelRed (trộn đều 5 ul sản phẩm PCR với 1 pl GelRed).Bước 5: Bơm vào các giếng một cách cần thận toàn bộ hỗn hợp ở trên
Bước 6: Chạy điện di ở hiệu điện thế 90V trong 35 phút, cho đến khi thuốc nhuộmcach đầu tận cùng của gel là 1 cm
Bước 7: Đọc kết quả dưới tia UV
Bước 8: Chụp bản gel dé lưu lại kết qua
2.3.2.4 Đánh giá đa dạng về đặc điểm di truyền
Kích thước của các đoạn DNA khuếch đại được đo bằng cách sử dụng UVIDod(phiên bản 99.02) bằng cách so sánh với điểm đánh dấu 1 kb bậc thang DNA Các băng
DNA được ghi nhận dựa trên sự có mặt của chúng trên bảng điện di của các mẫu nghiên
cứu theo DNA thang chuẩn (DNA marker) Nếu một phân đoạn DNA xuất hiện ở mau inhưng không xuất hiện mẫu j hoặc đồng thời xuất hiện ở cả ¡ và j nhưng không xuất hiện
ở các mẫu khác thì phân đoạn DNA này gọi là phân đoạn đa hình Ngược lại, nếu phânđoạn DNA nào xuất hiện ở tất cả các mẫu nghiên cứu thì gọi là phân đoạn đơn hình(Phan Diễm Quỳnh va ctv, 2020) Các đoạn DNA được khuếch đại 6n định được chođiểm là 1 khi có mặt và 0 nếu không có dải DNA Điểm số được sử dụng để tạo ma trận
dữ liệu nhằm phân tích mối quan hệ di truyền Mối quan hệ di truyền được thể hiện bằngviệc phân nhóm dựa trên các thuộc tính hay mối quan hệ chung của cá thé thông qua
việc sử dụng hệ số tương đồng Hệ số tương đồng được tính toán dựa trên các số liệu về
chỉ thi DNA dé phân nhóm hay biểu đồ hình cây hoặc biéu đồ kiểu hình nếu hệ số tương
đồng được tinh toán dựa trên số liệu kiều hình Các phương pháp phô biến dé xây dựng
hình cây cho các ma trận khoảng cách là phương pháp nhóm đôi không điều chỉnh sửdụng các giá trị trung bình số học (UPGMA) hay còn gọi là phương pháp liên kết trung
bình (Sneath và Sokal,1973).
Trang 36Hệ số tương đồng di truyền và khoảng cách di truyền theo công thức hệ số SM(Bảng 1.3) Sơ đồ hình cây được thiết lập dựa trên phương pháp phân nhóm UPGMA
theo tương đồng di truyền, sử dụng chương trình phần mềm NTSYSpc 2.1
2.4 Xử lý số liệu
Các số liệu được tông hợp, tính toán bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2019
Hệ số tương đồng di truyền và khoảng cách di truyền theo công thức hệ số SM Sơ đồ
hình cây được thiết lập dựa trên phương pháp phân nhóm UPGMA sử dụng chương trìnhphần mềm NTSYSpc 2.1
Trang 37Chương 3
KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Định danh vi khuẩn gây bệnh héo xanh bằng sinh học phân tử
Từ kết quả phân lập và định danh bằng đặc điểm hình thái và sinh hóa trước đóghi nhận 32 dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum Sử dụng 10 dong vi khuẩn gồmCHAI, CHA3, CXT1, CXT6, KQL4, KQL5, KKAD2, KKAD3, KKD3, KKD5 để tiếnhành định danh bang kỹ thuật sinh học phân tử bang mồi của vùng gen 16S-rDNA va
vẽ cây phát sinh loài.
Các dong vi khuẩn đã được khuếch đại với cặp môi 27F và 1492R, sản phần PCR
có kích thước trong khoảng 1400 bp đến 1500 bp (Hình 3.1) So sánh trình tự của các
mẫu vi khuân đã được phân lập với trình tự có sẵn trên ngân hàng gen bằng công cụ
BLAST cho thấy 10 dong vi khuẩn có mức độ tương đồng từ 94,56 — 98,64% với vikhuẩn Ralstonia solanacearum chủng APK76 (MF973211.1) và chủng Rsll(HG425355.1) Trong đó chủng APK76 gây bệnh trên lạc ở An Độ (Umadevi va ctv,
2017) va chủng Rs11 gây bệnh trên khoai tây ở Ai Cập (El-Said và ctv, 2013) Trong đó
dòng vi khuan có mức độ tương đồng cao nhất 98,64% là CXT6 với chủng APK76(MF973211.1) và dòng vi khuẩn CXT1 có mức độ tương đồng thấp nhất 94,56% với
Trang 38Hình 3.1 Kết quả điện di DNA của các mẫu vi khuẩn Ralstonia solanacearum bằngcặp mồi 27F và 1492R (M: Ladder IKb; 0: Mẫu đối chứng: 1: CHA1; 2: CHA3; 3:
CXTI;4: CXTó; 5: KQL4; 6: KQLS; 7: KKAD2; 8: KKAD3; 9: KKD3; 10: KKDS)
Trang 39„6 z KKD3
9 KKAD2
KQLS
-—— Ralstoniasolanacearum strain SL2064 (CP022798.1) L——— Ralstoniasolanacearum strain CMR15 plasmid (FP885896.1) E——— Ralstonia solanacearum isolate Rs11 (HG425355.1)
— Ralstoniasolanacearum strain APK76 (MF973211.1) Bacillus thuringiensis strain neolonensis LBIT-107 (MN695920.1)
Hình 3.2 Cây phát sinh loài mỗi 27F-1492R của các dòng vi khuẩn phân lập với một
số dòng trên ngân hàng gen Các giá trị bootstrap sau 1000 lần lặp lại là thể hiện đưới
dạng phần trăm
3.2 Đánh giá sự đa dạng về đặc điểm di truyền của các chủng vi khuẩn Ralstonia
solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây họ cà bằng chỉ thị phân tử ISSR
Hiện nay, đã có rất nhiều nghiên cứu sử dụng các chỉ thị phân tử như SSR, ISSR,
RFLP, AFLP, RAPD, trong đánh giá mức độ di truyền trên nhiều đối tượng sinh vật ởnhiều phòng thí nghiệm trên thế giới và Việt Nam Các kết quả thu được rất có giá trị
trong chọn tạo giống cũng như công tác bảo tồn và tái tạo nguồn gen (Chung và ctv,2004; Vũ Thị Thu Hiền va ctv, 2009; Nguyễn Hoàng Nghia và ctv, 2010; Wu và ctv,2011; Dinh Thị Phong và ctv, 2014) Trong các loại chỉ thị thì chi thị ISSR (Inter
Sequence Simple Repeat) đang được ứng dụng rộng rãi va có hiệu quả trong việc đánh