Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Đánh giá khả năng đối kháng của sáu chủng vi khuẩn Pseudomonas spp. với nấm Fusarium solani gây bệnh héo vàng cây cà chua

Mục tiêucủa nghiên cứu này là đánh giá khả năng đối kháng của sáu chủng Pseudomonas chốnglại Fusarium solani, tác nhân gây bệnh chết cây con và thối rễ.. Đồng thời với điều kiện khí hậu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO _ ;TRUONG DAI HOC NONG LAM THANH PHO HO CHi MINH

KHOA KHOA HOC SINH HOC

——

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG DOI KHANG CUA SAU CHUNG

VI KHUAN Pseudomonas spp VOI NAM Fusarium solani

GAY BENH HEO VANG CAY CA CHUA

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : PHAN MINH ĐẠT

Mã số sinh viên : 19126022Niên khóa : 2019 — 2023

TP Thu Đức, 3/2024

; BỘ GIAODUCVADAOTAOTRUONG DAI HOC NONG LAM THANH PHO HO CHi MINH

KHOA KHOA HOC SINH HOC

ĐÁNH GIÁ KHẢ NANG DOI KHANG CUA SAU CHUNG

VI KHUAN Pseudomonas spp VOI NAM Fusarium solani

GAY BENH HEO VANG CAY CA CHUA

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

PGS.TS NGUYÊN VŨ PHONG PHAN MINH ĐẠT

ThS TRAN THỊ THANH HƯƠNG

TP Thủ Đức, 3/2024

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu, khoa Khoa học Sinh học,Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho em có cơ hội

được học tập tại đây.

Em xin cảm ơn khoa Khoa học Sinh học, Phòng Sinh học tích hợp thực vật đã tạo

điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất, trang thiết bị cho em trong suốt thời gian thực hiệnkhoá luận tốt nghiệp

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Vũ Phong đã định hướng,tận tình hướng dẫn kiến thức chuyên môn, tạo điều kiện giúp em hoàn thành khóa luậntốt nghiệp

Em xin cảm ơn chị Hà Thị Trúc Mai, chị Đặng Huỳnh Thúy Vy và chị Trần Thị

Thanh Hương, các ban và các em phòng Sinh học tích hợp thực vật luôn bên cạnh giúp

đỡ, động viên em trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

Con xin cảm gia đình luôn bên cạnh động viên, khuyến khích và tạo điều kiện tốtnhất dé con được học tập và rèn luyện

Em xin chân thành cảm ơn.

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Phan Minh Dat, MSSV: 19126056, Lớp: DH19SHB, sinh viên ngành Công

nghệ Sinh học, Khoa Khoa học Sinh học, Trường Dai học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh,xin cam đoan: Đây là khóa luận tốt nghiệp do bản thân tôi thực hiện, các số liệu và thông

tin trong nghiên cứu là hoan toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách

nhiệm trước hội đồng về những cam kết này

Tp Hồ Chí Minh, ngày 02 tháng 01 năm 2023

Người viét cam đoan

ii

TÓM TẮT

Trong lĩnh vực nông nghiệp, Pseudomonas spp đã được công nhận là tác nhân

kiểm soát sinh học nhờ khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh Mục tiêucủa nghiên cứu này là đánh giá khả năng đối kháng của sáu chủng Pseudomonas chốnglại Fusarium solani, tác nhân gây bệnh chết cây con và thối rễ Trong điều kiện phòngthí nghiệm, tác dụng ức chế của dich lọc nuôi cấy từ sáu chủng này đối với sự phát triển

va nảy mam của sợi nam F solani đã được đánh giá Kết quả cho thấy hai chủng PN02

và PN05 có tỷ lệ ức chế cao lần lượt là 60,29% và 58,82% Trong điều kiện nhà lưới,hai chủng này cho thấy hiệu quả phòng bệnh đáng kê lần lượt là 61,29% và 48,40% trêncây cà chua sau 28 ngày chủng Nghiên cứu đang được tiếp tục thực hiện tập trung vàoviệc nghiên cứu các đặc tính kháng sinh, các hợp chat dé bay hơi, các đặc tính gây kháng

stress và đánh giá mức độ an toàn sinh học của chúng.

Từ khóa: cà chua, đôi khang, Fusarium solani, thôi ré, Pseudomonas,

ili

In the field of agriculture, Pseudomonas spp have gained recognition as

exceptional biological control agents due to their ability to inhibit the growth of pathogenic microorganisms The objective of this study was to evaluate the antagonistic properties of six strains of Pseudomonas against Fusarium solani, a causative agent of seedling damping-off and root rot In laboratory conditions, the inhibitory effects of

culture filtrates from these six strains on the hyphal growth and germination of F! solani were assessed The results demonstrated that two strains, namely P2 and PS, exhibited

high inhibition rates of 60.29% and 58.82% respectively Under greenhouse conditions, these two strains showed significant preventive efficacy of 61.29% and 48.40% respectively, on tomato plants after 28 days of inoculation Ongoing research is currently

focused on studying their antibiotic properties, volatile compounds, stress

resistance-inducing properties, and evaluating their biosafety level.

Keywords: antagonistic, root rot, Fusarium solani, Pseudomonas, tomato.

iv

1-5 NIho: Hiểm HIỂH-CTbsszsssses6ii86-g5002863608636iai000/802608640g4830g33suit2g:liquEt4E/53G0đGG4ã0268 6030:8040 2

1.3 Nội dung thực D160) sss ccssessessrsecessesversaseeseaxsusavecexseesseneeeeyeovesesseacecwreseeseeseereveeenesven ss 2CHUGNG 2 TONG QUANW TÃI LIB U sccssicucenssarsieestorrancstavicsavawnurnsmnnsavservsseontusnneiy 32.1 Tổng quan về nắm FUsarii cccccccccecsesscessesseessesseessecsessiessessesssesseseseesessssieseeeeses 32.1.1 Giới thiệu về nm #/SđÏHIH - 5-5-5252 25SE+ESEEEEEEEE2EEE12121112111112111 11111 te 3S171 RE ưới Tri a ee 3

3.1:3: Tác hai của Fusarium Wen PAU MAU na nntndeiitessetagLG11393 12583384 0px8355xãg3se23saystsei 4

2.1.4 Các biện pháp phòng trừ nam Fusarium gây hại trên cây trồng - 52.2 Đặc điểm của vi khuẩn Pseudomonas o cccsscssssesveseseessseessesessesesesesvesesesessesseeeeeeees 62.2.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa -2 2- 22522 2S22E£2E+2E+ZE+£E+zzzzzzzzzze2 62.2.2 Khả năng kiểm soát sinh học - 2-2-2252 5SSS22E22E£EE2EEEEEEEEZEEEerErrxrrrrrei 72.2.3 Sự cảm ứng dé kháng hệ thống (ISR) 2- 22 ©22222222222222E22+22xczxrsrvee 72.2.4 Cơ chế đối kháng của vi khuẩn con St crceHesrrrkkrrrrrkrrrrerrke 82.3 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoai NưỚC - ces ceeeeeeeeeeeeeeeeees 9 2.3.1 Những nghiên cứu trong ƯỚC - + +22 + E2 E*xEEEsvv rnnnrngưrrg 9 23.2: Những nghiên cỨu nude 20a ssisccszssseesssgi5954051560045053365336535455gnE438S5105145556030148 556 10CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22 2+22+S£2E£E2E2E2£E2EZEzzxczd 113.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu +- 2+ 2+22++2++EzEvtrxrrrrrrrrrrrrrrrrres 123.2 Vật liệu nghiên cứu và thiết bị - 2-522222222E22E1223222122322212212211221212222e 12

3.2.1; Vat iG ME NICI: CU sceessavssnsussesuxssennsresssassus acm t50ES808958S508193E4033858G10093638.000313635i2M55.808380068 123.2.2 Dung cu va thiết Di occ ec eeccccceececcecesceeescescecseceecseseceevevsecsecsesevseceeseeeeverseveecseseveeees 123.2.3 Môi trường sử dụng nghiên CỨU - - 2+ +2 + £+EEeErererrrrrrrrrrrrrrrrre 12

3,3: Nội dung NOHIGH GỮU s:ccsxseseiisoeiaiesiisiaag145561151555151355813531455935ãE35EESSSESSBE3554ESEE1901E 13

3.3.1 Nội dung 1: Đánh giá khả năng đối kháng với nam Fusarium solani của các dong

vi khuân Pseudomonas spp trong điều kiện phòng thí nghiệm - 133.3.2 Nội dung 2: Đánh giá kha năng phòng trừ bệnh do nam Fusarium solani củaPseudomonas spp trên cây cà chuatrong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới 153.3.3 Phương pháp xử lý số liệu -2 -2¿©22¿222+22++22E22EE222E222E22212211222E222.crrree 17CHUGNG 4, KẾT QUÁ XÃ THẢO LUẬN s.ccees-easiesiexieseartreiainaokedriisrsae 184.1 Khả năng đối kháng với nam Fusarium solani của các đòng vi khuẩn Pseudomonasspp trong điều kiện phòng thí nghiệm 2 2 22222+EE+2E£2EE+EE22EE2EE22E222E22222xee 184.1.1 Phương pháp đồng nuôi cấy 2-22 222222EE£EE2EE22E2E22212212221 222.22 czev 184.2 Khả nang phòng trừ bệnh với nam Fusarium solani của các dòng vi khuan đã chọnlọc trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới + 22 222222z2z£+2z2zzzzz2222 224.2.1 Trong điều kiện i70 wifrO -2-©2¿©22222222222E222222122112212212112112211221 22122 xe 224.2.2 Trong điều kiện nhà lưới - 2-22 ©5222+22E+2EE£EE2EE2EEEEE2EEEEEzEErrxrrrrcrer 24

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

CFU: Colonies forming units

Ctv: Cong tac vién

DC: Đối chứng

HSDK: Hiệu suất đối kháng

KB: King B

NSC: Ngày sau cấy

NSN: Ngày sau nhiễm

NT: Nghiệm thức

PDA: Potato Dextrose Agar

PGPB: Plant growth promoting bacteria — vi khuan kích thích tăng trưởng thực vat

VSV: Vi sinh vat

vii

DANH SÁCH CÁC BANG

TrangBảng 4.1 Khả năng đối kháng nam F solani của 6 dòng vi khuẩn theo phương pháp

ae 19Bang 4.2 Kha năng đối khang nam #Ƒ solani của 6 dòng vi khuẩn theo phương phápkhuếch tán giếng thạch 2: 2¿22222E22E12EE221122122112112711211221211211211211 21121 xe 21Bảng 4.3 Ti lệ bệnh héo vàng trên cây cà chua sau khi xử lý nam và vi khuẩn 24Bảng 4.4 Chỉ số bệnh (%) của cây cà chua và hiệu lực phòng trừ của vi khuẩn sau khi

TW Tý ni gã kh ee 25

Vili

DANH SÁCH CÁC HÌNH

TrangHình 3.1 Bồ trí vi khuân đối kháng với nam Fusarium solani trên đĩa petri 13Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng của các dịng vi khuẩnđối với nắm Fusarium sỌ4ữi -5 5-5252 +22SEE22E2EEEE3232212112122121121112112111211212 xe 15Hình 4.1 Kha năng đối kháng nắm Fusarium solani của 6 dong vi khuẩn theo phươngpháp đồng nuơi cấy ở các thời điểm theo dõi -2-©22©2222cSccrxrrecrxerkee 20Hình 4.2 Khả năng đối kháng nam Fusarium solani của 6 dong vi khuẩn theo phươngpháp khuếch tán giếng thạch ở các thời điểm theo dõi 2- 22 5252225522 22Hình 4.3 Cây cà chua con được xử lý với vi khuân Pseudomonas spp và nam F

7/7180 22Hình 4.4 Cây cà chua con được xử lý với vi khuân Pseudomonas spp và nam F

ŠOlGTii sau! T THBẦN seseeseseinssisicESDkiEEESLEELSEEEEEESEEESSS351LEE2E2S115E0S8S1SS0S11S02EG11141323010116011.8 23

Hình 4.5 Cây cà chua sau khi xử lý nam và vi khuan ở giai đoạn 28 ngày 25

ix

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa có khí hậu nóng am quanh nam néntạo điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển các loại cây rau, nhất là các loạirau ăn quả và ăn lá Đồng thời với điều kiện khí hậu như vậy cũng là sự thuận lợi cho

sự sinh trưởng và phát triển cho nhiều loại vi sinh vật trong đó có các loại vi sinh vatgây bệnh hại cho cây trồng

Trong các loại rau màu ở nước ta, cà chua được xem là loại cây trồng có giá trị dinhdưỡng cao, cung cấp nhiều hợp chất quan trọng, đặc biệt là một số chất chống oxy hóanhư lycopene (Elbadrawy và Sello, 2016) Việc canh tác cây cà chua gặp nhiều khó khănđòi hỏi nhiều khâu chăm sóc, kinh nghiệm canh tác, phòng trừ dịch hại, đặc biệt là cácbệnh do vi nắm gây ra làm giảm năng suất thu hoạch từ 30-70% trên rau màu Fusarium

là một trong những tác nhân gây bệnh phô biến trên cây cà chua, làm lá biến vàng héokhô dan, cây sinh trưởng yêu và cuối cùng toàn cây bị héo chết Hơn thế nữa, các bệnh

do Fusarium gây ra có thể lan rộng nhanh chóng thành dịch lớn trên đồng ruộng nhờgió, mưa và các hoạt động của côn trùng (Đường Hồng Dật, 1969; Vũ Triệu Mẫn và LêLương Té, 1998)

Dé phòng trừ nam gây bệnh người nông dân thường sử dung nhiều loại thuốc hóahọc, đây là một biện pháp có hiệu quả cao, diệt trừ dịch hại nhanh chóng, triệt để Tuynhiên việc sử dụng thuốc hóa học liên tục để phòng bệnh sẽ làm mầm bệnh dễ hìnhthành tính kháng, dễ phát sinh loài mới và gây ô nhiễm môi trường do dư lượng thuốchóa học còn tồn dư lại trong quá trình sử dụng Vì vậy để khắc phục những hạn chế này,

xu hướng hiện nay là sử dụng các tác nhân sinh học hay những sản pham trao đối chấtcủa các tác nhân này đề phòng trừ bệnh hại cây trồng Nhiều nhóm vi sinh vật có đặctính đối kháng với tác nhân gây bệnh đã được sử dụng như nam đối khang Trichoderma

viride, Bacillus subtilis và Streptomyces Trong đó Pseudomonas spp là nhóm vi

khuẩn hiện diện nhiều ở vùng rễ cây trồng có khả năng tiết ra nhiều loại kháng sinh ứcchê nhiêu loại nam gây bệnh có nguôn gôc trong dat.

Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Đánh giá khả năng đối kháng của sáu chủng vikhuẩn Pseudomonas spp đối với nam Fusarium solani gây bệnh héo vàng cây cachua” đã được thực hiện.

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài này được thực hiện nhằm chọn lọc dòng vi khuân Pseudomonas spp có khảnăng đối kháng cao với nam Fusarium solani gây bệnh héo vàng cây cà chua

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Đánh giá khả năng đối kháng với nam Fusarium solani của sau chủngPseudomonas spp trong điều kiện phòng thí nghiệm

Nội dung 2: Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh do nam Fusarium solani của 6chủng vi khuan Pseudomonas spp trên cây cà chua trong điều kiện phòng thí nghiệm

và nhà lưới.

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tong quan vé nam Fusarium

2.1.1 Giới thiệu về nam Fusarium

Nam Fusarium thuộc ngành Ascomycota, lớp Sordariormycetes, bộ Hypocreales,

họ Nectriaceae Soi nắm của Fusarium không có sắc tố, nên người ta có thé phân loạichúng trong số hyalohyphomycetes Có ít nhất 70 loài Fusarium spp đã được xác định

và mô tả, nhưng có thể có nhiều loài hơn nữa vẫn chưa được xác định Fusarium sốnghoại sinh hoặc ký sinh trên nhiều loại cây trồng, cây ăn trái và rau Hệ sợi nam phânnhánh, có vách ngăn, sợi nam thường không màu và chuyển mau nâu khi già Hệ sợinam sản sinh độc tố tiết vào hệ mạch gây héo cây chủ Cơ thé dinh dưỡng dang sợi dabào, phân nhánh phức tạp, vách ngăn có lỗ thủng đơn giản ở giữa, trong tế bào có mộtnhân hoặc nhiều nhân Vách tế bào được cấu tạo từ chitin, glucan Sắc tố khuẩn lạc thayđổi từ nhạt, hong, đỏ tia đến tím xanh tùy thuộc vào loài và điều kiện sinh trưởng

Ở giai đoạn hữu tinh, nam F solani hầu như không gây bệnh cho cây dù từ giaiđoạn nuôi cấy, còn ở giai đoạn vô tinh thì F solani thường sẽ gây hại cho cây Giai đoạn

vô tinh của F solani bao gồm cả dạng giao phối đồng loại (homothallism) và giao phôikhác loại (heterothallic).

Fusarium sinh sản vô tính trung bình giữa 3 kiểu bao tử vô tinh là bào tử đính lớn(Macroconidia), bao tử đính nhỏ (Microconidia) và bào tử vách dày (hậu bào tử -chlamydospores) (Nguyễn Văn Bá, 2005) Bào tử đính lớn của F solani có hình trụ hoặchình liềm, thường có 3-5 vách ngăn (Barreto và ctv, 2005) Bào tử đính nhỏ có hình trụhoặc hình nêm, có thể có một vách ngăn Còn bào tử hậu của nắm F solani hình thành

ở nhiệt độ 30°C (Li va ctv, 1998) và được kích thích hình thành bởi các chiết xuất từ củhành tây ở nhiệt độ 35°C và pH từ 6 — 7 (Sood, 1996).

2.1.2 Cơ chế lây nhiễm

Nam Fusarium solani tan công và xâm nhiễm vào cây trồng khi rễ và thân cây bịton thương, các mô bị suy yếu F solani là tác nhân gây ra các bệnh nghiêm trọng nhưthối rễ, thối thân, thối cũ, trên nhiều loại cây trồng khác nhau như toi, cam, quýt,khoai tây, cà chua

Tuyến trùng là nhân tố giúp nam F solani xâm nhập vào cây một cach dé dàng Khituyến trùng ký sinh vào rễ chúng sẽ tạo vết thương và từ đó nắm # solani tan công vàochóp rễ của cây trồng và làm thối rễ Do đó, những vườn cây có mật độ tuyến trùng càngcao thi khả năng cây trồng mắc bệnh do nam F solani gây ra càng nghiêm trọng Khicây trồng bị ngập úng, rễ cây phải hô hấp trong điều kiện hiếu khí, thường sản sinh ranhiều polyphenol, chất này làm cho các tế bào của rễ non bị chết đi Những nơi có tếbào rễ bị chết sẽ là nơi xâm nhập của #2 solani, sau đó sẽ lan dần vào các mạch xylem.Sau khi phát triển trong mạch xylem sẽ lan lên hệ thống mạch dẫn trong thân, gây tắcmạch xylem làm giảm lượng nước di chuyên trên cây, khiến cho cây bị héo rồi chết Quátrình này gây phản ứng của cây, tạo ra các hợp chất phenol và tạo ra thé san có màu nâu(Nene, 1991) Bên cạnh đó đất thiếu chất dinh dưỡng nên chua hơn cũng tạo điều kiệnthuận lợi cho nam # solani phát triển mạnh hơn.

Nam Fusarium solani có khả năng tồn tại lâu trong đất Hầu hết đất canh tác đều

có chứa khoảng 104 — 10° bào tử /g đất (Cook và Baker, 1989) Bên cạnh đó khả nănghình thành bào tử hậu cũng là một nguyên nhân giúp cho các chủng nam này có thé tồntại lâu dai trong đất Nam F solani gây hại ở giai đoạn khi cây con có 1 lá thật, cây con

bị nhiễm bệnh sẽ bị ức chế sinh trưởng, chóp rễ bị hóa nâu dẫn đến bị thối, khô (Kokalis

và ctv, 1997).

2.1.3 Tác hai của Fusarium trên rau màu

Fusarium là loại nam phân bố rộng ở nhiều vùng trên thé giới, có khả năng gâybệnh trên nhiều loại cây trồng Fusarium đã gây thiệt hại rất lớn đến nền nông nghiệp ởViệt Nam cũng như là trên toàn thé giới Hang năm, tại Pakistan Fusarium đã gây bệnhtrên cây đậu xanh làm giảm năng suất 10-50% (Khan và ctv, 2002) Theo Sở Nôngnghiệp và phát triển nông thôn năm 2003, tại Brazil năng suất cây cà chua cũng giảm45-80% do nam Fusarium Fusarium gây nhiều bệnh khác nhau trên cây trồng như héo

do tắc bó mạch, thối rễ, thân, củ

Vi dụ loài #2 decemcellulare thường hiện diện ở vùng nhiệt đới va á nhiệt đới Chúng được phân lập từ những cây bị bệnh loét, khô cành Từ các cây ca cao bị bướu ở Nam Mỹ.

Loài F moniliforme thường xuất hiện ở vùng khí hậu ấm Chúng thường được phânlập từ những cây có triệu chứng bệnh thối thân, thối bắp, thối rễ cây Sorghum, thối ngọn

ở cây mía, gây hư hỏng hạt lúa Loài này có khả năng nhiễm vào hạt giống của một vài

cây kí chủ như ngô, lúa Chúng có khả năng tạo ra độc tố moniliformin (Vesonder và

Hesseltine, 1981).

Loài F solani là loài có khả năng sống trong đất, phân bồ trên phạm vi toàn thégiới, xuất hiện ở các vùng mưa nhiều va đất thoát nước kém Là loài phổ biến nhất ở cácvùng nhiệt đới va á nhiệt đới Chúng gây thối rễ, cô rễ của nhiều loại cây trồng như đậu,

cà chua Gây thối củ, gây bệnh loét, chết khô của nhiều loại cây trồng (Nelson, 1981).Loài F oxysporum phố biến trong đất canh tác ở vùng ôn đới và nhiệt đới Loài nàygồm nhiều dòng khác nhau và gây bệnh nghiêm trọng: gây héo mạch dẫn (VanderMolen,1987), gây thối rạp cây con, gây thối rễ và cô rễ (Jarvis và Shoemmaker, 1978) Loàinày có hơn 100 dòng khác nhau và bệnh héo là một van đề quan trọng

Loài F semitectum rat phô biển trong đất nông nghiệp, ở các vùng nhiệtđới và ôn đới Chúng được phân lập từ các bộ phận dưới đất thân, rễ, cũ và các

và Lê Lương Té, 1998; Phạm Thị Lich, 2013)

2.1.4 Các biện pháp phòng trừ nam Fusarium gây hại trên cây trồng

Phòng bệnh và trừ bệnh là hai mặt không thể tách rời nhau trong việc bảo vệ câytrồng và nông sản nhằm đảm bảo hiệu quả kinh tế cao Các biện pháp phòng trừ bệnhhại trên cây trồng có thé chia thành các nhóm sau đây dựa trên nguyên lý tác động và

phương pháp sử dụng các biện pháp đó:

2.1.4.1 Biện pháp sử dụng giống chống bệnh và giống sạch bệnh

Tuyển chọn các giống một loại bệnh hoặc một nhóm bệnh có tác dụng làm giảmton thất và chi phí cho các biện pháp phòng trừ khác, là một biện pháp có hiệu quả kinh

tế cao Mặt khác, sử dụng giống không mang bệnh dé gieo trồng có tác dụng phòng trừbệnh trên quy mô đồng ruộng rất lớn Do đó đây là biện pháp đem lại hiệu quả và đảmbảo được chất lượng và năng suất cây trồng cao (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2008)

2.1.4.2 Biện pháp canh tác:

Làm đất: cày bừa vùi mầm bệnh xuống sâu dưới đất làm cho mầm bệnh còn trongđất bị chết hoặc khó khăn trong hoạt động gây hại cho cây Cày ải và phơi đất.

Luân canh: luân canh giúp cắt đứt nguồn dinh dưỡng của một số ký chủ chuyêntính, nhờ đó làm giảm bớt mam bệnh

Xen canh: làm giảm bớt sự tiếp xúc của rễ cây này với cây khác trên đơn vị diệntích đất Giảm bớt sự lây lan của mam bệnh ở rễ

2.1.4.3 Biện pháp hóa học:

Biện pháp hóa học phòng trừ bệnh cây là việc dùng các thuốc hóa học có tác dụngtrực tiếp tiêu diệt hoặc ức chế VSV gây bệnh, chống lại sự phá hại của bệnh, bảo vệ cây

trồng Biện pháp này có tác dụng ngăn chặn, dập tắt mầm bệnh nhanh chóng, hiệu quả

rõ rệt nên được nông dân ưa chuộng và thường xuyên sử dụng trên thực tế

Các loại thuốc hóa học hay được sử dụng như: Copper B, Kitanzin 50 ND,Validacin, Tuy nhiên biện pháp này có thé ảnh hưởng bat lợi đến sự cân bang sinhthái, ô nhiễm môi trường, và ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của con người

2.1.4.4 Biện pháp sinh học:

Biện pháp sinh học trong phòng trừ bệnh hại cây trồng rất đa dạng và dựa trênnguyên tắc chung là sử dụng vi sinh vật có ích dé hạn chế vi sinh vật có hại (NguyễnLân Dũng và ctv, 2008) Hiện nay trong tự nhiên tồn tại nhiều vi sinh vật có khả năngđối kháng nắm bệnh như: Trichoderma, Glicocladium sp., Penicillium sp., Pseudomonas

arguginosa,

2.2 Đặc điểm của vi khuẩn Pseudomonas

2.2.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa

Vi khuẩn Pseudomonas thuộc họ Pseudomonadaceae, bộ Eubateriales, gram âm,hình que, lông roi thường ở một đầu, kích thước 0,5 — 0,8 um x 1,5 — 3,0 pm Nhiệt độtối ưu cho sự tăng trưởng của Pseudomonas là từ 25 — 30°C và chúng có thé phát triển

ở pH từ 4 — 10 Một đặc tính phô biến của Pseudomonas là chúng có khả năng phát sángdưới điều kiện tia UV Ngoài ra, Pseudomonas aeruginosa có khả năng lên men arginine

và lên men pyruvate giúp kéo dài thời gian sống sót trong điều kiện thiếu khí (Glasser

và ctv, 2014).

Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonasputida đều thuộc chi vi khuẩn Pseudomonas phat huỳnh quang (fluorescent

Pseudomonas) và là nhóm vi khuân đối kháng với các mầm bệnh quan trọng trong đất(Pallerom, 1984).

Pseudomonas aeruginosa có khả năng tiết ra nhiều sắc tố, siderophores, các chất

dễ bay hơi như hydrocyanic acid, các chất kháng sinh và các enzyme phân giải (Gupta

và ctv, 2005).

2.2.2 Kha năng kiểm soát sinh học

Nhiều nghiên cứu trước đây đã chỉ ra PGPB có khả năng kiểm soát bệnh hại thực

vật do tuyến trùng, vi khuẩn, nấm gây ra Dịch lọc nuôi cấy in vitro của chủngPseudomonas sp có thê làm giảm đáng kế mật độ tuyến trùng trong đất, đồng thời tăngcường sự phát triển và năng suất của cây trồng (Ali và ctv, 2002) Một số nghiên cứu đãbáo cáo P fluorescens và Bacillus spp thúc đây sức đề kháng toàn thân của cây trồngchống lại tuyến trùng do sự gia tăng của các enzyme liên quan đến phòng vệ đề sản xuấtcác hợp chất đối kháng như phenylalanine ammoniac - lyase, polyphenol oxidase vàperoxidase và thay đôi các chất tiết ra khỏi rễ như acid amin và polysaccharid (Abbasi

và ctv, 2014) Pseudomonas aeruginosa có thé kiêm soát bệnh than thư ở ớt chống lạimam bệnh Colletotrichum capsici P aeruginosa cũng có thê tao ra sức đề kháng hệthống của ớt đối với bệnh than thư (Jisha và ctv, 2018) Các mầm bệnh gây u sưng rễ vàthôi rễ thường bị ức chế khi sử dụng Pseudomonas spp làm tác nhân kiêm soát sinh học,ngoài ra Pseudomonas spp còn được sử dụng dé phòng trừ các bệnh sau thu hoạch(Habiba và ctv, 2016) So với thuốc hoá học, việc sử dụng chất đối kháng từ vi sinh vậthoặc sử dụng vi sinh vật kiếm soát bệnh thực vật đã trở thành một chủ đề đáng đượcquan tâm do có nhiều ưu điểm như không độc hại, xanh, tiết kiệm va kha thi để kiểmsoát mầm bệnh (Bonaterra và ctv, 2012)

2.2.3 Sự cảm ứng đề kháng hệ thống (ISR)

ISR (Induction of Systemic Resistance) được định nghĩa là một trạng thái sinh lý

mà khả năng phòng vệ được tăng cường do sự đáp ứng với các kích thích nhất định củamôi trường và kết quả là sự phòng vệ bẩm sinh của thực vật có thê chống tại những tácđộng tiếp theo của các tác nhân gây bệnh (Pliego và ctv, 2008)

Theo Fatima và ctv (2017), kiểm soát sinh học các bệnh thực vật thông qua việctạo ra sức đề kháng toàn thân là một giải pháp thay thế thân thiện với môi trường đốitrong các biện pháp bảo vệ cây trồng Các tác nhân kích thích sinh học và phi sinh họckhác nhau có thê kích thích cây trồng kháng thuốc Sức đề kháng toàn thân được tạo ra

7

có liên quan đến việc tong hop mức độ tăng cường của các chất chuyên hóa thứ cấp khácnhau tham gia vào các cơ chế bảo vệ thực vật Chúng bao gồm phytoalexin làm tăng sức

đề kháng của thực vật thông qua hoạt động chống lại mầm bệnh Chúng ức chế sự nảymầm của bao tử nam và làm chậm sự phát triển của nấm (Fatima và ctv, 2017).Pseudomonas aeruginosa PM12 (phân lập từ rễ trồng cà chua khỏe mạnh) tạo ra tínhkháng toàn thân ở cà chua trong chống lại bệnh héo do nam Fusarium oxysporum(Fatima và ctv, 2017) Hơn nữa, việc sử dụng các tác nhân kiểm soát sinh học làm kẻthù tự nhiên của mầm bệnh trong đất bên cạnh việc nâng cao tiềm năng sản xuất câytrồng có thể cung cấp một chiến thuật bổ sung dé quan lý dịch hại tổng hợp bền vững.2.2.4 Cơ chế đối kháng của vi khuẩn

Các loại vi sinh vật đối kháng tiêu điệt hoặc ức chế các hoạt động của vi sinh vậtgây bệnh chủ yếu bằng các chất kháng sinh, là những sản phẩm trao đôi chất trong quátrình sống của chúng (Vũ Triệu Man và Lê Lương Té, 1988), tiết ra các enzyme nhưchitinase, 1,3 - glucanase, protease phân hủy thành phan vách tế bào nam và vi khuẩngây bệnh (Gupta và ctv, 2005).

2.2.4.1 Cơ chế tiết kháng sinh

Một vài loài nhóm Pseudomonas tạo 2,4 diacetylphloroglucinol (2,4 DAPG),hydrogen cyanide và pyoluteorin (PLT), phenazine, pyocyanin ức chế sự phát triểnnam gây bệnh của Pseudomonas acid và Azomycin ức chế vi khuẩn gây bệnh(Fernandez, 2005) Vi khuẩn va một nhóm không tạo ra PLT nhưng sinh ra hai chất trên;Pseudomonas fluorescens 94/96 tao ra visosinamid có khả năng kiểm soát Pythiumultimum (Phạm Mỹ Liên, 2004).

Một số loài Pseudomonas spp (bao gồm P chlororaphis, P fluorescens và Paeruginosa) có khả năng sản xuất kháng sinh dị vòng phenazine (Juhas và ctv, 2005;Mavrodi và ctv, 2006) có hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn và nắm thực vật.Các vi sinh vật thuộc chi Pseudomonas tạo ra nhiều loại kháng sinh dị vòng, bao gồmcác dẫn xuất phenazine, quinoline và pyrrole, quinone dị vòng, (Smirnov và ctv,1990) Trong một số báo cáo, pyocianin (thuộc nhóm phenazine) sắc tố màu xanh lam

có hoạt tính oxi hóa khử cũng có hiệu lực khang lại các loài Fusarium khác nhau (Anjaiah và ctv, 2003; Houshaymi và ctv 2019).

2.2.4.2 Tiết ra các enzyme phân hủy vách tế bào

Vách tế bào nắm gồm nhiều thành phần như glucan, chitin, protein (Phạm VănKim, 1999) Vi khuẩn đối kháng có khả năng tiết ra các enzyme phân hủy thành phầnglucan hay chitin hoặc thành phan protein của vách tế bào nắm gây bệnh, vi khuẩn tiết

ra enzyme phân hủy chitin được tim thay ở một số chi vi khuẩn như: Micrococcus,Bacillus, Streptomyces, Serratia, Acromonas, Bacillus cereus NCTU2 (Kuo, 2006),glucanase cũng được tiết ra từ chi Bacillus (Chen, 2003) Ngoài co chế đối kháng bangcach sinh tông hợp kháng sinh, Pseudomonas spp còn tiết ra các enzyme như chitinase,1,3 glucanase, protease phân hủy thành phần vách tế bao nam và vi khuân gây bệnh(Gupta và ctv, 2005) Đặc biệt là các nghiên cứu về khả năng sinh enzyme chitinase củaPseudomonas fluorescens có khả năng phân giải chitin dé phá hủy thành tế bao nam, tảo

và tuyến trùng (Nielsen và ctv, 1999)

2.2.4.3 Cơ chế do siderophore

Sắt là hợp chất quan trọng cho sự chuyên hóa thực vật Nó được tìm thấy trong cácprotein như là nitrogenase, ferredoxins, cytochromes và leghemoglobin Vi sinh vật đốikháng có khả năng cạnh tranh trực tiếp với nguồn bệnh về dinh dưỡng, oxy, không giansông, sinh kháng sinh, tạo siderophores đề sinh trưởng Trong đó, siderophore là một loạiprotein sinh ra trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật, nó có khả năng hap thụ cácion Fe+3 trong môi trường với ái lực cao nhằm phục vụ trực tiếp cho sự sinh trưởng và

hô hấp của vi sinh vật, làm cho môi trường xung quanh nghèo sắt, dẫn đến các loại visinh vật khác không có đủ ion Fe+3 cho quá trình sinh trưởng của mình, do đó chúng sẽ không sinh trưởng được.

2.3 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước

2.3.1 Những nghiên cứu trong nước

Nguyễn Trung Thành (2004) đã thành công nghiên cứu chọn lọc và đánh giá chủng

vi khuẩn đối kháng phân lập từ đất dé khống chế nắm Rhizoctonia solani, Sclerotiumrolfsii, và vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh trên cây cà chua Trong điều kiệnphòng thí nghiệm và nhà lưới các chủng vi khuan đối kháng đã khống chế được bệnh

do nam Sclerotium rolfsii gây ra

Phạm Mỹ Liên (2004) đã nghiên cứu chọn lọc và đánh giá chủng vi khuẩnPseudomonas fluorescens đôi kháng với nam Sclerotium rolfsii gây bệnh trên cây càchua Nguyễn Trọng Thể (2004) thành công sử dụng chủng vi khuẩn P fluorescensPMT5I (phân lập trên rễ cây mông toi), PTL 135 (phân lập trên rễ thuốc lá) trong phòng

9

trừ bệnh do nắm Rhizoctonia solani và Sclerotium rolfsii gây bệnh trên cây bông vải và

cây cà chua.

Nguyễn Thy Đan Huyền (2017) đã nghiên cứu sử dụng màng bao sinh học từ dịchchiết vi khuẩn Pseudomonas putida 199B dé kháng nam Aspergillus flavus T1 gây bệnhtrên hạt ngô Nguyễn Hiền Trang (2017) thành công nghiên cứu điều kiện thu nhận dịchchiết vi khuan Pseudomonas putida khang nam mốc Aspergillus niger gây bệnh trên hạt

đậu xanh.

Trương Chí Hiền (2020) thành công nghiên cứu chọn lọc và đánh giá được khảnăng đối kháng với nam Fusarium solani và Colletotrichum gloeosporioides trong điềukiện in vitro Lê Vũ Khánh Trang và Lý Hải Triều (2020) đã thành công phân lập vàtuyển chọn vi khuẩn Pseudomonas sp có khả năng kháng vi khuẩn Ralstoniasolanacearum gây bệnh héo xanh ở cây cà chua tạo cơ sở dé đa dang hoá các chế phẩmsinh học, cải thiện các chế pham từ Pseudomonas sp trong việc phòng và chữa bệnhhéo xanh đo vi khuẩn

Nguyễn Thành Hiếu và ctv (2022) đã nghiên cứu chọn lọc và xác định chủng vikhuẩn Pseudomonas sp PS5 và Pseudomonas sp PS2 có hiệu quả cao trong ức chế sinhtrưởng của nắm N dimidiatum ở điều kiện in vitro

2.3.2 Những nghiên cứu nước ngoài

Theo Agrios (1997), Pseudomonas fluorescens làm giảm sự lây nhiễm Drechsleradactyloides trên cây Ryegrass Sivamani va ctv (1987) cho rang vi khuẩn Pseudomonasfluorescens có thé ding như biện pháp sinh học, là tác nhân chống lai Pseudomonassolanserum gây bệnh héo moko cây chuối và vi khuẩn Xanthomonas campestris pv.oryzae gây bệnh cháy lá lúa Lambert và ctv (1987) đã phân lập Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas cepacia, Serratia liquefacien va Bacillus sp có hoạt tínhchống nam phổ rộng từ bap, lúa mach, xà lách xoong

Abdelzaher và Elnaghy (1998) cho biết bệnh thối rễ cây bông vai do Pseudomonascarolinianum ở Ai Cập được kiêm soát bởi vi khuân đối kháng P fluorescens Vi khuânAbdelzaher đôi kháng cao với nắm trong thí nghiệm trên đĩa petri và hạn chế được bệnhkhi áp dụng trong đất Hiệu quả kiểm soát cao khi trộn vi khuẩn vào đất hơn là chủng vikhuẩn vào vùng rễ trước khi trồng Tác động đối kháng do sự cạnh tranh về dinh dưỡng,siderophores, những chat có đặc tính kháng khuẩn — HCN

10

Gnanamanickam và ctv (1992) cho biết những nhóm vi khuẩn đối kháng pháthuỳnh quang và không phát huỳnh quang được quan sát trong ống nghiệm có khả năngkìm hãm nam Rhizoctonia solani vì chúng mang gen chitinase làm chitin hóa vách tếbào sợi nắm Nhiều chủng vi khuẩn có hiệu quả kìm hãm sự phát triển của khuẩn ty, làmảnh hưởng đến sự sống sót của hạch nam và bảo vệ cây lúa tránh được sự xâm nhiễmcủa nắm bệnh.

Trivedi và ctv (2008) cho biết vi khuân Pseudomonas corrugata có khả năng đốikháng với các loại nam gây bệnh Alternaria alternata va Fusarium oxysporum đượcphân lập từ các mẫu đất thu thập trong các khu rừng ôn đới của Uttaranchal Himalaya.Các loại nam thử nghiệm được biết là gây bệnh (Alternaria alternata — đôm lá, cháy lá

và thối nhữn, Fusarium oxysporum — héo và rũ do nam F usarium) 0 nhiều loài thực vat

khác nhau.

Islam và ctv (2018) cho biết bệnh héo rũ trên cây dưa leo do nam Fusariumoxysporum Ÿ sp cucumerinum được kiểm soát bởi vi khuẩn đối kháng Pseudomonasaeruginosa BAS BAS được phân lập là một vi khuân đối kháng nổi bật chống lại mambệnh và có thê tạo ra các hợp chất đối kháng khác nhau, bao gồm siderophores và cáchợp chất dé bay hơi, cũng như cho thấy tiềm năng thúc đây tăng trưởng cây trồng Cácphát hiện cho thấy rằng chủng phân lập được chọn có tiềm năng sử dụng như một tácnhân kiểm soát sinh học trong việc quản lý bệnh héo Fusarium trên dưa chuột

Lt

CHUONG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHAP

3.1 Thời gian va địa diém nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu từ 01/03/2023 đến 05/01/2024

Địa điểm: Phòng Sinh học và Tích hợp Thực vật, Khoa Khoa học Sinh học TrườngĐại học Nông Lâm TP.HCM.

3.2 Vật liệu nghiên cứu và thiết bị

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Nguồn nam Fusarium solani và sáu dong vi khuan Pseudomonas spp (P1, P2, P3,P4, P5, P6) được cung cấp từ phòng Phòng Sinh học và tích hợp thực vật, Khoa Khoahọc Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TPHCM.

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị

Dụng cụ: Đĩa petri, bình tam giác, ống nghiệm, pipette, nước cất khử trùng, côn,bọc, vải lọc, quặng đong, số ghi chép, máy chụp hình, bông gòn hút nước, thước đo, hộpnhựa, ống hút

Thiết bị: Kính hiển vi (AmScope), máy ly tâm (Hettich, Đức), máy lắc định ôn(MRC, Israel), máy vortex (Emclab, Đức) nôi hấp khử trùng (Sturdy, Đài Loan), tủ sấy(Binder, Đức), cân đếm điện tử (Đài Loan), tủ cây (Laminare, Pháp),

3.2.3 Môi trường sử dụng nghiên cứu

Môi trường nuôi cay nam Fusarium solani và thử nghiệm đôi kháng: PDA (PotatoDextrose Agar) khoai tây 200 g, D — glucose 20 g, agar 20 g, nước cất vừa đủ 1000 ml.Cách chế dịch khoai tây: Cân 200 gam khoai tây gọt vỏ đã được rửa sạch, đem tháinhỏ, thêm nước vào đun sôi, nhỏ lửa trong 30 phút, loc lay dịch trong Cho agar, glucosevào khuấy đều chiết ra các chai dem hấp khử trùng ở 121°C, | atm, 30 phút

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn va thử nghiệm: King B gồm peptone 20 g, glycerol

10 ml, KaHPO¿ 1,5 g, MgSO¿.7HaO 1,5 g, agar 20 g, nước cất đủ 1000 ml hấp khử trùng

ở 121°C, | atm, 30 phút.

L2

3.3 Nội dung nghiên cứu

3.3.1 Nội dung 1: Đánh giá kha năng đối kháng với nam Fusarium solani của cácdòng vi khuan Pseudomonas spp trong điều kiện phòng thí nghiệm

3.3.1.1 Đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn với nam Fusariumsolani theo phương pháp đồng nuôi cấy

Thí nghiệm được bố trí theo kiều hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố với mỗi dòng vikhuẩn là 1 nghiệm thức (NT) và 1 NT đối chứng (DC), mỗi NT gồm 4 dia petri Thinghiệm được thực hiện 2 lần

Nam Fusarium solani được nuôi cây trên môi trường PDA từ 5-7 ngày Vi khuẩnPseudomonas spp được nuôi trên môi trường King B trong 48 giờ sau khi nuôi cấy.Thí nghiệm được tiến hành theo Ferreira và ctv (1991), Huang và ctv (2014): sửdụng que cấy, vạch vi khuẩn thành 2 đường thang song song va cách vị trí đặt thạch nam

3 em vào dia petri có sẵn môi trường PDA Sau đó tiến hành cấy thạch nam (đường kính

5 mm) vào tâm dia petri U ở 28°C, ghi nhận kết quả sau 24 giờ

Nam Fusarium solani

Pseudomonas

Hình 3.1 Bồ tri vi khuân đối kháng với nam Fusarium solani trên dia petri

Nếu vi sinh vật có khả năng ức chế nắm bệnh sẽ thấy vùng xung quanh vi sinh vậtsợi nắm bệnh không sinh trưởng hoặc sinh trưởng yếu Còn nếu vi sinh vật không cókhả năng ức chế sự phát triển của nắm bệnh sẽ thấy nắm bệnh phát triển bình thường

Từ đó sơ bộ lựa chọn được chủng vi sinh vật có hoạt tính đối kháng nắm gây bệnh.Chỉ tiêu theo dõi: Do đường kính tản nắm ở các thời điểm 3, 4, 5, 6 ngày sau cay

và tính hiệu suất đối kháng theo Ferreira và ctv (1991)

AE (%) = ((C-T)/C)x100

Trong đó: AE (antagonistic efficacy): hiệu suất đối kháng

C: đường kính tản nắm ở nghiệm thức đối chứng (mm)T: đường kính tản nắm ở nghiệm thức có vi khuẩn đối kháng (mm)

13

Theo đánh giá của Soytong (1988) dựa vào hiệu suất đối kháng đánh giá khả năngđối kháng như sau:

Hiệu suất đối kháng >75%: có khả năng đối kháng rat cao

Hiệu suất đối kháng từ 61 — 75%: có khả năng đối kháng cao

Hiệu suất đối kháng từ 51 - 61%: có khả năng đối kháng trung bình

Hiệu suất đối kháng < 50%: có khả năng đối kháng thấp

3.3.1.2 Đánh giá kha năng đối kháng của các dòng vi khuẩn với nam Fusariumsolani theo phương pháp khuếch tán giếng thạch

Khả năng đối kháng của các dòng Pseudomonas đỗi với nam Fusarium solani đượckiểm tra theo phương pháp của Denis và Webster (1971) Cách thực hiện như sau: Chiađĩa môi trường PDA làm 4 phần bằng nhau, tiếp theo cấy thạch nắm gây bệnh (đườngkính 5 mm) vào giữa đĩa petri Sau đó tiễn hành đục 4 lỗ đối xứng nhau xung quanhthạch nắm cách thạch nắm 2 cm Cho 100 ul dịch lọc vi khuẩn vào 2 lỗ đối xứng nhau,

2 vị trí còn lại là vị trí chứa mẫu đối chứng được thực hiện tương tự với nước cất vôtrùng (Hình 3.2).

Hình 302 Sơ đồ bồ trí thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng của các dòng vi khuanđôi với nam Fusarium solani.

14