Báo cáo thực hành sinh hóa học

Protein THÍ NGHIỆM 1: Định tính alpha amino acid b ng thu - ằ ốc thử Ninhydrin... Hiện tượng Ống 1 Xuất hiện màu xanh tím trong Ống 2 Xuất hiện màu xanh tím đục Giải thích Sự xuất hi

TRƯỜNG ĐẠ I HỌC CÔNG THƯƠNG TP H CHÍ MINH Ồ

KHOA SINH H C Ọ Z Z MÔI TRƯỜNG

- o0o

-BÁO CÁO THỰC HÀNH SINH HÓA HỌC

GV: Đào Thị Mỹ Linh

Nhóm 6 Lớ p 14DHSH03

1 Nguyễn Dương Phương Minh - 2008230104

2 Phan Thị Kiều Diễm - 2008230020

3 Nguyễn Hoàng Khang - 2008230077

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9, năm 2024

1 Nguyễn Dương Phương Minh – 2008230104 (viết báo cáo)

2 Phan Thị Kiều Diễm - 2008230020

3 Nguyễn Hoàng Khang - 2008230077

Bài 1 Protein

THÍ NGHIỆM 1: Định tính alpha amino acid b ng thu - ằ ốc thử Ninhydrin.

1 Nguyên tắc

Phả n ng ninhydrin đ ứ ặ c trưng cho các amino acid, v 𝛼- ới s tham gia c ự ủ a 2 nhóm

là 𝛼-carboxyle và amine 𝛼- Ở nhiệt độ cao, amino acid tác dụng với ninhydrin t o thành ạ carbonic CO2, ammonia NH , aldehyde (3 -CHO) tương ứng có mạ ch carbon ng ắn hơn amino acid một carbon và ph ản ng ninhydrin b ứ ị ử kh

B2: Thêm vào mỗ ống 5 gi dung d i ọt ịch thu c th ố ử Ninhydrin 0 1%

B3: Đun nóng c 2 ng nghi ả ố ệm trong ngọ ửa đèn cồ n l n ( ~ 30 giây )

4 Kết quả

Hiện tượng

Ống 1 Xuất hiện màu xanh tím trong

Ống 2 Xuất hiện màu xanh tím đục

Giải thích

Sự xuất hiện màu xanh tím là do ph n ng c ả ứ ủa Ninhydrin và acid amine Acid amin tác d ụng với Ninhydrin ở nhiệt độ cao s ẽ bị dezamin hóa, oxy hóa và decacboxy hóa t o thành CO ạ 2 , NH3 , aldehyde tương ứng (ng n đi 1 cacbon so v ắ ới acid amin gốc)

và ph n ng Ninhydrin b ả ứ ị khử Phân tử ninhydrin b ị khử tác dụ ng v ới NH3, tạ o thành phức hợp xanh tím phụ thuộc vào lượng NH3 tạo thành Đây là phản ng chung cho các ứ protein và acid amin t do Ph n ng này cho phép nh n d ng t ự ả ứ ậ ạ ất cả các acid amin có nhóm NH và COOH t do 2 ự

THÍ NGHIỆM 2: Định tính b ng ph n ng biuret ằ ả ứ

1 Nguyên tắc:

Phả n ng đ ứ ặ c trưng cho liên kết peptide (- CO NH ) trong phân tử protein Trong - môi trư ờng kiề m m ạnh, các liên k ết peptide phả ứ n ng v ới sulfate đồ ng (CuSO4) t o ạ thành phức chất màu Các hợp chất có 2 liên k t peptide tr ế ở lên đều cho ph n ả ứng biuret

-2 Hóa chất

- Dung dịch sodium hydroxide 10%

- Dung dịch copper sulfate 1%

3 Tiến hành

B1: Lấy 2 ng nghi ố ệm, đánh số 6.2.1 và 6.2.2 , cho vào:

- Ố ng 1: 0,1 gam tinh th urea ể

- Ố ng 2: 1 mL dung d ịch protein trứ ng .

B2: Đun nóng ống 1 trên ng n l ọ ừa, l úc đ u urea nóng ch y, sau đó b ầ ả ắ ầu c ng t đ ứ lại, được b iuret, đ nguội ể

B3: Thêm vào mỗ ống 1mL dung dịch NaOH 10% và 1 giọ i t dung d ịch CuSO41% Lắ c đ u ề

Chú ý: Không nên cho quá nhiều dung dị ch CuSO4 vì màu xanh c a dung d ủ ị ch Cu(OH)2 có thể lấn át màu c ủa phả ứ n ng biuret Ph n ng đư ả ứ ợc coi là dương tính khi

có màu tím rõ

4 Kết quả

- Ổng 1 : xuất hiệ n màu h ng nh ồ ạt

- Ống 2 : xuất hiệ n màu tím do protein c ủa trứ ng ph n ng v ả ứ ới Cu2+

Giải thích

Protein có trong trứng ph n ả ứng với sulfate đồng trong môi trư ng ki ờ ềm mạnh cho phức hợp màu tím đậm, cho thấy sự có mặt c ủa nhi ều liên k t peptide Đây là ph ế ản ứng dùng đ phát hi n và đ nh lư ng protein (phương pháp so màu) ể ệ ị ợ

THÍ NGHIỆM 3: Tìm điểm đằng đi n c a protein b ng phương pháp t o pH khác nhau ệ ủ ằ ạ

1 Nguyên tắc

Dựa trên tính lư ỡng tính củ a acid amine và protein, ph ụ thuộ c ch ủ yế u vào s ự có mặt của các nhóm carboxyle và amine t ự do Tùy theo đ pH khác nhau, mứ ộ c đ ộ phân

ly của carboxyle và amine tự do s khác nhau ẽ

- Trong môi trường trung tính, mức độ phần ly của nhóm carboxyle bằng với nhóm amine, amino acid và protein tồn tại chủ yếu ở dạng ion lư ng c ỡ ực (chỉ 1% ở dạng trung hòa) Ở dạ ng ion lư ng c ỡ ực, nhóm carboxyle bị phân ly, nhóm amine b proton hóa ị

- Trong môi trường acid (pH=1), mức độ phân ly của nhóm carboxyle giảm, nhóm carboxyle không ion hóa, nhóm amine ở dạng proton hóa, amino acid và protein bi u ể hiện tính base, t n t ồ ại dư i d ớ ạ ng m ột cation

- Trong môi trường ki ềm (pH=11), nhóm carboxyle có khả năng phân ly cho proton, nhóm amine không ion hóa, amino acid và protein bi u hi n tính acid, t n t ể ệ ồ ại dưới d ạng mộ t anion

Điể m đ ng đi n: pHi là m ẳ ệ ức pH mà tại đó các acid amine và protein có số điệ n tích dương bằ ng với số đi n tích âm, bi u hi n tính ch ệ ể ệ ất lưỡ ng tính.

B2: Lắc đ ều các ng nghi ố ệm để dung d ị ch đ ệm đ m b ả ảo đ pH tương ộ ứng

B3: Thêm vào mỗ ống nghi i ệm 1ml dung d ch protein tr ị ứ ng, l ắc nhẹ

B4: Thêm vào m i ỗ ống nghi ệm 1mL cồ n 96°, lắc đề u, đ ể yên

Protein là chất keo ưa nước do trên b ề mặ t phân t ử có các nhóm phân c c tích ự

đi ện, có kh năng h p th ả ấ ụ các phân t ử nư ớ c lư ng c ỡ ực tạ o thành màng nư ớc bao quanh phân tử protein (gọi là các lớp vỏ hydrate) Độ bền của dung d ch keo protein tùy thu c ị ộ vào nhi u y u t ề ế ố như: s ự tích điệ n c ủa phân tử protein, m ức độ hydrate hóa, nhi ệt độ, Khi thay đổi các y ế u t này, ch ố ẳ ng h n làm trung hòà đi n phân t protein, lo ạ ệ ử ạ ỏ lớp i b

vỏ hydrate, các phân t ử lớ n protein s ẽ kế ụ lạ t t i v i nhau t ớ ạo thành khố ớn, tách khói i l dung dịch, g ọ i là k t t ế ủ a protein Khi đó, tính chấ t hóa lý thay đ i, tính hòa tan gi ồ ả m,

độ nhớt tăng, ho t tính quang h ạ ọc, kích thư c phân t ớ ử thay đ i Tùy thu ổ ộc vào bản chất của các y ếu t ố tác độ ng, th ời gian, điề u ki n ph n ng (đ ệ ả ứ ặ c bi ệt là nhi t đ ệ ộ), có thể tạo nên tr ng thái k ạ ế t tủa thu ậ n ngh ịch và k ết tủ a không thu ậ n ngh ịch protein

- Kết t ủa thu ận nghị ch : protein tr ở về trạng thái ban đ u sau khi lo ầ ạ ỏ các nhân i b

tố gây kết tủa.

B2: Sau đó thêm vào:

- Ống 1: 1mL dung d ịch (NH4)2SO4bão hòa, l ắ c nhẹ, xu t hi ấ ệ n các th ể vẩ n tr ng ắ globuline

- Ống 2: thêm t ừ từ tỉ nh th ể (NH4)2SO4, lắ c cho đ ế n khi dung d ịch trở thành bão hòa (NH4)2SO4.

B3: Quan sát, so sánh khối lư ợng kế ủ t t a trong 2 ng nghiệm ố

B4: Sau đó thêm nước cất vào từng ng nghi ố ệ m, khu ấ y nh ẹ từ từ cho đ ến khi tủ a tan hoàn toàn, tạo thành dung dịch protein trong suốt

4 Kết quả

- Ống 1 xu ất hiệ n k ế t tủa tr ắ ng do các h ạt k t t ế ủa protein Khi thêm (NH₄)₂SO₄ bão hòa vào lòng tr ng tr ng (protein globulin), protein s ắ ứ ẽ bị kết t ủ a Lý do là do mu ố i amoni sulfate làm giảm độ tan c ủa protein trong nư c, d ớ ẫ n đ n hi n tư ng "k ế ệ ợ ế t t ủa muối".

- Ố ng 2:

+ Ban đầu, dung d ịch có màu trong ho c hơi đ c Khi thêm d ặ ụ ầ n (NH₄)₂SO₄, xu ất hiệ n kết tủa từ từ, các hạ ế t k t tủa trắng d n tích t ầ ụ trong ống nghiệm Sau khi thêm nước, kết tủa có th ể tan l i, và dung d ạ ị ch tr ở nên trong suốt tr ở lạ i -> Kế ủ t t a thu ận nghị ch: khi thêm mu i (NH₄)₂SO₄, protein k t t ố ế ủa, nhưng khi thêm nư c vào, k ớ ế ủa có thể t t tan tr ở lại

THÍ NGHIỆM 4b: K ết tủ a protein b ng mu ằ ố i trung tính (NH4)2SO4 và b ằ ng cách đun sôi trong các môi trư ng khác nhau (K ờ ết tủ a không thu n ngh ậ ịch)

1 Nguyên tắc

Protein là chất keo ưa nước do trên b ề mặ t phân t ử có các nhóm phân c c tích ự

đi ện, có kh năng h p th ả ấ ụ các phân t ử nư ớ c lư ng c ỡ ực tạ o thành màng nư ớc bao quanh phân tử protein (gọi là các lớp vỏ hydrate) Đ ộ bề n c ủa dung d ch keo protein tùy thu c ị ộ

vào nhi u y u t ề ế ố như: s ự tích điệ n c ủa phân tử protein, m ức độ hydrate hóa, nhi ệt độ, Khi thay đổi các y ế u t này, ch ố ẳ ng h n làm trung hòà đi n phân t protein, lo ạ ệ ử ạ ỏ lớp i b

vỏ hydrate, các phân t ử lớ n protein s ẽ kế ụ lạ t t i v i nhau t ớ ạo thành khố ớn, tách khói i l dung dịch, g ọ i là k t t ế ủ a protein Khi đó, tính ch ấ t hóa lý thay đ i, tính hòa tan gi ồ ả m,

độ nhớt tăng, ho t tính quang h ạ ọc, kích thư c phân t ớ ử thay đ i Tùy thu ổ ộc vào bản chất của các y ếu t ố tác độ ng, th ời gian, điề u ki n ph n ng (đ ệ ả ứ ặ c bi ệt là nhi t đ ệ ộ), có thể tạo nên tr ng thái k ạ ế t tủa thu ậ n ngh ịch và k ết tủ a không thu ậ n ngh ịch protein

- Kết t ủa không thuận nghịch : sau khi lo i b ạ ỏ các nhân t gây kế ủa thì protein ố t t không tr ở về trạ ng thái ban đ ầu

- Ông 2: thêm 2 giọt CH3COOH 1%, đun nóng

- Ông 3: thêm 2 giọt CH3COOH 10%, đun nóng (có thể đế n sôi).

- Ống 4: thêm 2 giọt CH3COOH 10% và 2 giọt NaCl bão hòa, đun nóng

- Ông 5: thêm 1 giọt NaOH 10%, đun nóng (có thể đế n sôi).

(Ghi chú: nhiệt độ đun nóng kh ở oả ng 50 đ n 55°C) ế

Quan sát:

- Ống 1: Xu ất hiệ n k ết tủa trắng Do có sự tác dụng với nhi t đ ệ ộ, mạch protein bị giãn

nở, các liên k ết thứ cấ p b phá vỡ ừ đó protein vón cục không theo quy luật nào ị , t

tạo thành kết tủa

- Ống 2: Xu ất hiệ n k ết tủa trắ ng đ ục Khi cho acid acetic 1% sẽ tạ o môi trư ng acid ờ yếu Nhóm -COO- bị ứ c ch ế sự phân ly nên ti u phân t protein m ể ử ấ t đi ệ n tích, pH của môi trường g n đ ầ ạ t tr ạ ng thái đ ng đi ẳ ện

- Ống 3: Không xuất hiện kết tủa, do tính háo nước c a acid và môi trư ủ ờng acid m nh ạ

có nhiều ion H+ nên protein bị khử nước Các nhóm -COO- được trung hoà còn các nhóm NH3+ không được trung hoà Phân tử protein v n còn tích đi n dương Do đó ẫ ệ không t o k ạ ết tủa

- Ống 4: Xu ất hiệ n k ết tủa trắ ng đ ục Khi cho acid acetic 1% và NaCl bão hoà tác dụng s ẽ tạ o nên môi trư ng trung hoà v ờ ề điệ n, t đó t o k ừ ạ ết tủa

- Ống 5: Không xuất hi ệ n k ế t t ủa Do NaOH gây môi trường kiềm, nhóm NH3 được trung hoà Vì vậy khi đun sôi đi n t ệ ử âm c a ti ủ ể u phân t protein v n còn Protein ử ẫ tích điệ n âm không t o tủa ạ

Kết luận:

Phần l n protein b đông t khi đun trong môi trư ng trung tính hay acid y ớ ị ụ ờ ếu Trong môi trường ki ềm mạ nh hay acid m nh, protein còn tích đi n nên không t o t ạ ệ ạ ủa Protein dễ dàng t o t ạ ủa khi pH môi trườ ng đ ạ t đi m đ ể ẳ ng đi ện.

Ý nghĩa: Khảo sát s ự biế n tính protein b ởi nhi t và môi trư ệ ờ ng acid y u, ki ế ềm mạnh hoặc mu ố ủ i c a kim lo ại nặng

Phan Thị Kiều Diễ m ( Vi t báo cáo ) ế

Nguyễn Hoàng Khang

Nguyễn Dương Phương Minh

BÀI 2: PROTEIN (TIẾP THEO)

Thí nghiệm 1: Định lư ng protein b ng phương pháp MicroKjeldahl ợ ằ

Giai đoạn vô cơ hóa:

- Hút 15 mL H₂SO₄ thêm vào ống ( đư ợc th c hi ự ệ n trong t hút ) ủ

- Đặt ống phá vào máy phá mẫu:

- Cài đặt th i gian và nhi t đ ờ ệ ộ cho máy

- Thời gian ở 4 giai đo ạn lầ n lượ t là:

Nhiệt độ Thời gian Thời gian thực tế Hình ảnh minh họa

- Sau khi hết 60 phút của 415°C trên màn hình của máy xuấ t hi n hình tam ệ giác có d u ch ấ ấm thang bên trong báo hiệu đã xong và máy t ự độ ng nâng lên Dung dịch chuyển từ màu nâu s m chuy ẫ ể n d n sang màu nâu cánh gián, sau đó ầ sang màu vàng nh ạt và cu i cùng tr ố ở thành dung dị ch tr ắ ng trong, đánh d u k t ấ ế thúc giai đoạn vô cơ hóa

Thí nghiệm 2: Xác định hàm lư ng protein b ng phương pháp Lowry: ợ ằ

Sau khi đo quang phổ vẽ biểu đ biểu th ồ ị sự biến thiên n ng đ ồ ộ củ a 6 ống

Kết quả: 7 ng nghi ố ệm màu xanh đ m d ậ ầ n t ừ ố ng nghi ệ m s ố mẫu đ n ng ế ố

- Có sự hiện di n c ệ ủa protein: Khi trong các ố ng nghi ệm chứa protein, protein sẽ phản ứng với thuốc thử đồng và thuốc thử Folin, tạo ra màu xanh Mức đ ộ xanh đ m nh t phụ thuộ ậ ạ c vào n ồng độ protein

- Nồng độ protein tăng d n: N u các ng nghi ầ ế ố ệm chứa nồng đ protein khác ộ nhau, màu xanh s ẽ thay đ i tương ổ ứ ng, ng ch ố ứa nhiề u protein hơn s ẽ có màu xanh đ m hơn ậ

Tên thành viên:

Nguyễn Hoàng Khang

Phan Thị Kiều Diễm

Nguyễn Dương Phương Minh

BÀI 2: PROTEIN (TIẾP THEO)

Giai đoạ n c t đạm ấ

Tiế n hành trên bộ cất đ m MicroKjeldahl ạ

- Pha loãng dung dịch vô cơ hoá cho từ từ nước c ấ t vào m u đ nh m ẫ ị ứ c đ ến 50 ml

- Chuẩn b dung d ị ịch hứ ng NH3: Cho vào bình tam giác 10mL H2SO4 0,1N và 3 giọ t thu c th ố ử hỗn hợp, dung dị ch có màu tím đ ỏ

- Đặt bình hứng sao cho đ u mút c ầ ủ ố a ng sinh hàn ng p trong dung d ậ ịch H2SO40,1N của bình hứng

- Nếu dung d ịch chuyể n màu xanh, cho thêm H2SO4 0,1N vào ngay

- Cất đạm trong vòng 5 phút

- Đếm ngược còn 30 giây lấy bình h ng ra tráng đ u mút b ng nư ứ ầ ằ ớc cất, sau đó thử quỳ tím

Giai đoạ n chu n độ ẩ

- Lượng H2SO4 0,1N còn dư trong bình được chuẩ n đ ộ bằ ng NaOH 0,1N

- Chuẩn đ ộ đế n khi dung d ịch chuyể ừ n t màu tím sang màu xanh lá m ạ

- Lượng NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ tương đương v ới lượng H2SO4 0,1N còn

BÀI 3: ENZYME

Nguyên tắc

- Enzyme có tính đặc hiệu cao: mỗi enzyme có khả năng xúc t c qu á á trình chuy n ể

hó a m ột hoặ c m ột số chất nh t đ ấ ịnh theo mộ t ki ểu ph n ng nh ả ứ ấ ịnh Ng i ta dựa t đ ườ vào t nh đ í ặc hiệ u c ủa enzyme để phâ n lo ại chú ng

- Enzyme urease (có trong đậ u n nh) xúc t c cho ph n ng th y ph à á ả ứ ủ â n urea (CO(NH2)2) tạo th nh carbonic (COz) v à à ammonia (NH3) Ammonia đ c t ượ ạo th nh s à ẽ làm biến đ ổi mà u gi y qu ấ ỳ đỏ thà nh xanh

- Thêm vào m ỗ ố i ng kho ng 1 ả gam bộ t đậu nành

- Đặt gi ấy quỳ tím vào thành miệng ng nghi ố ệ m và đ ậ y nút bông Lắc đều

Kết quả

- Ống số 1 màu quỳ đổi t ừ đỏ sang xanh

- Ống s 2 không đ ố ổi màu đỏ

Giải thích: Khi đậy bông và lắc lên ống 1 có khí ammonia (NH3) bay lên sẽ làm giấy quỳ đỏ sang xanh

Nguyên tắc

- Amylase là enzyme thuộc lo ại glucosidase, thuộ c nhóm enzyme th ủy phân (hydrolase)

- Enzyme amylase thủy phân tinh bột.

- α-amylase còn g ọi là dextrinogenamylase có trong nướ bọt, d c ịch tụy t ng, h ạ ạ t hòa thảo n y m ẩ ầm, trong n m m ấ ốc và vi khuẩn a-amylase xúc tác cho phản ứng th y phân ủ liên k t α ế -1,4 glucoside của tinh bộ t và m t s ộ ố polysaccharide khác S n ph ả ẩm thủ y phân là h n h p các dextrine, m ỗ ợ ột ít maltose và glucose Dưới tác dụng của a amylase - dung d ịch tinh bột nhanh chóng cho phả ứ n ng âm v ới dung dịch iode Do đó để xác định ho ạt độ - amylase người ta thườ α ng d ựa vào sự biế n đ ổ i màu c a h ủ ỗ n h p ph n ợ ả ứng v ới dung dịch iode α amylase không b - ề n trong môi trư ng acid, b n v ờ ề ới nhi t ệ Môi trường thể hiện hoạt tính cao nhất của a amylase malt đ - ạ i m ạ ch có pH=5 –6, nhiệt

nh ấ t c ủa ẞ- amylase malt đ ạ i m ạ ch có pH = 3,3 –4, nhiệt độ – 50 55°C.

- Glucoamylase có nhiều trong n ấm mốc, phân hủ y tinh b ột thành glucose.

- Trong thực tế, tinh bột chỉ bị thủy phân hoàn toàn khi có cả hai loại a-amylase và ẞ- amylase

- Enzyme amylase được dùng phổ biến trong công nghi p s n xu ệ ả ất m t tinh b t, rư ậ ộ ợu, bia, bánh mì, và s n ph ả ẩm thu được có độ tinh khi t, hi ế ệu suất thu h i, ch t lư ồ ấ ợng, cao hơn so với các phương pháp s ả n xu ấ t khác.

Tiến hành

- Lấ y 10 ng nghi ố ệm, đánh s ố từ 1 đ n 10, cho vào m ế ỗi ố ng 1 mL dung d ịch NaCl 0,9%

- Thêm vào ống s 1: 1mL d ố ịch chi ế t enzyme, l ắ c đ ề u, l y 1 mL chuy n sang ng s ấ ể ố ố

2, l ạ ắ i l c đ ề u và l y 1 mL t ấ ừ ố ng s 2 chuy n sang ng s ố ể ố ố 3; tiế ục làm như vậ p t y cho đến ống số 10, l y 1 mL t ấ ừ ố ng s 10 b ố ỏ đi

- Cho vào mỗ ố i ng 2 mL dung dịch tinh b ột 0,1% trong dung dị ch đ ệm pH = 5,8 Lắ c đều, gi ữ ở 37°C trong 30 phút (dùng t ủ ấm hoặc nồ i cách th ủ y có đi u nhi ề ệt) Sau đó lấy ra, làm l nh, cho vào m ạ ỗi ố ng 1 gi ọt dung dịch Iode 0,02N Ghi ố ng có đ pha ộ loãng lớn nh ất mà có khả năng phân gi ải hoàn toàn tinh b t ( ộ ố ng có màu vàng và ng ố tiế p sau nó v n còn màu đ nâu ho ẫ ỏ ặc tím)

Kết qu thí nghi ả ệm