báo cáo bài tập thực hành

Ngoài ra Yersinia enterocolitia còn gây ra bệnh yersiniosis đường ruột ở người là một bệnh zoonotic được báo cáo phổ biến ở Liên minh Châu Âu EU, với khoảng 6.000 trường hợp được báo cáo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO BÀI TẬP THỰC HÀNH

SINH TIN HỌC

BÁO CÁO BÀI TẬP THỰC HÀNH

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu môn học 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Yersinia enterocolitica subsp enterocolitica 3

2.2 Bệnh do Yersinia enterocolitica 3

2.3 Chẩn đoán Yersinia enterocolitica 4

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP 6

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15

4.1 Kết quả 15

4.1.1 Kết quả trình tự primer thiết kế 15

4.1.2 Kiểm tra độ đặc hiệu 3 cặp primer trên In silico PCR Amplification 17

4.1.3 Kết quả BlAST trình tự 18

4.1.4 Trình tự FASTA 19

4.1.4.1 Trình tự FASTA cặp primer 1 19

4.1.4.2 Trình tự FASTA cặp primer 2 20

4.1.4.3 Trình tự FASTA cặp primer 3 20

4.2 Thảo luận 20

TÀI LIỆU THAM KHẢO 21

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1.1 Yersinia enterocolitica (nguồn: Internet) 3

Hình 4.1 Thiết kế primer bằng Primer3Plus (Cặp 1) 16

Hình 4.2 Thiết kế primer bằng Primer3Plus (Cặp 2) 16

Hình 4.3 Thiết kế primer bằng primer3plus (Cặp 3) 16

Hình 4.4 Kết quả kiểm tra primer bằng In silico PCR Amplification (Cặp 1) 17

Hình 4.5 Kết quả kiểm tra primer bằng In silico PCR Amplification (Cặp 2) 17

Hình 4.6 Kết quả kiểm tra primer bằng In silico PCR Amplification (Cặp 3) 18

Hình 4.7 Kết quả BLAST trình tự cặp 1 18

Hình 4.8 Kết quả BLAST trình tự cặp 2 19

Hình 4.9 Kết quả BLAST trình tự cặp 3 19

DANH SÁCH BẢNGBảng 4.1 Trình tự của 3 cặp primer đã thiết kế 15

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU1.1 Đặt vấn đề

Yersinia enterocolitica là một loại vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa quan trọng

có phân bố trên toàn thế giới Bệnh yersinia thường biểu hiện như viêm ruột, nhiễm trùng

đường ruột ở người và nhiễm không triệu chứng ở động vật Ngoài ra Yersinia enterocolitia còn gây ra bệnh yersiniosis đường ruột ở người là một bệnh zoonotic được

báo cáo phổ biến ở Liên minh Châu Âu (EU), với khoảng 6.000 trường hợp được báo cáovào năm 2014 (EFSA, 2015) Hầu hết các trường hợp ở người là phát tán và bùng phátkhông có nguồn gốc rõ ràng Trong vài thập kỷ qua, các đợt bùng phát nhỏ đã được ghinhận liên quan đến thịt lợn, salad và sữa Mặc dù một số nghiên cứu về vật chủ chứa

mầm bệnh và đường lây truyền của nhiễm Y enterocolitica đã được thực hiện nhưng vẫn

chưa rõ ràng Một lý do cho điều này là các phương pháp phân lập và xác định không

nhạy và không chính xác Yersinia enterocolitica là một nhóm vi khuẩn rất không đồng

nhất thuộc về sáu nhóm phân loài và kiểu sinh học riêng biệt, thay đổi từ các chủngkhông gây bệnh đến các chủng cực kỳ gây bệnh (Joutsen và Fredriksson-Ahomaa, 2016)

Ngăn chặn sự xâm nhập của Yersinia enterocolitica vào chuỗi thức ăn là một thách thức

rất lớn, đặc biệt là chuỗi thịt lợn Thực hiện vệ sinh tốt ở tất cả các giai đoạn sản xuất và

chế biến thực phẩm là cần thiết để giảm nhiễm Yersinia enterocolitica Chúng có thể dễ

dàng bị tiêu diệt bằng xử lý nhiệt nhưng làm lạnh không được coi là biện pháp kiểm soát

hiệu quả vì Yersinia có thể nhân lên ở nhiệt độ lạnh Ngoài ra, loài này phân bố trên toàn

thế giới, được tìm thấy trong các mẫu động vật, thực phẩm và môi trường Việc phân lập

và xác định các chủng Y enterocolitica gây bệnh rất khó khăn và tốn thời gian Động vật

sản xuất thực phẩm và động vật hoang dã là những ổ chứa quan trọng của loài này, và cómột số đường lây truyền tiềm ẩn để lây lan mầm bệnh này từ động vật sang người, vớithực phẩm bị nhiễm bẩn là một nguồn lây nhiễm quan trọng (Fredriksson-Ahomaa,

2015) Vì thế việc xác định loài và chẩn đoán chính xác bệnh do Yersinia enterocolitica

đóng vai trò rất quan trọng trong việc điều trị hiệu quả và ngăn ngừa lây lan Kỹ thuậtphản ứng chuỗi polymerase (PCR) được biết đến là phương pháp chẩn đoán hiện đại ,

mang lại nhiều ưu điểm so với các biện pháp truyền thống như nuôi cấy vi khuẩn Đặcbiệt, biện pháp này có khả năng phát hiện DNA vi khuẩn một cách nhanh chóng, nhạycảm và xác định được chủng loài cụ thể Việc tìm được đoạn mồi chuyên biệt của chủngloài là yếu tố thiết yếu để thực hiện phản ứng PCR

1.2 Mục tiêu môn học

Tìm được primer chuyên biệt của Yersinia enterocolitica subsp enterocolitica

1.3 Nội dung thực hiện

Tìm 3 cặp primer chuyên biệt để phát hiện Yersinia enterocolitica subsp enterocolitica

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Yersinia enterocolitica subsp enterocolitica

Yersinia enterocolitica thuộc giới Vi khuẩn, ngành Pseudomonadota, lớp Gammaproteobacteria, bộ Enterobacterales, họ Yersiniaceae, chi Yersinia, loài Y.

enteratioitica Yersinia enterocolitica có 2 phân loài là Yersinia enterocolitica subsp.

enterocolitic và Yersinia enterocolitica subsp palearctica Yersinia enterocolitica subsp enterocolitica là một loại vi khuẩn Gram âm, hình trực khuẩn

Hình 1.1 Yersinia enterocolitica (nguồn: Internet).

2.2 Bệnh do Yersinia enterocolitica

Y.enterocolitica gây ra các bệnh về đường ruột như viêm ruột, tiêu chảy viêm ở trẻ

sơ sinh và trẻ nhỏ, viêm hồi tràng giai đoạn cuối cấp tính ở người lớn Y.enterocolitica

là vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hoá phôt biến ở các nước phát triển, chỉ sau vi khuẩn

Salmonella spp và Campylobacter spp Vi khuẩn lây nhiễm vào vật chủ bằng cách bám

vào tế bào chủ bằng cách sử dụng chất kết dính tự động vận chuyển trimeric

Lợn được đánh giá là nguồn tàng trữ chính của các chủng Y.enterocolitica gây bệnh ở người, mặc dù lợn không có các dấu hiệu lâm sàng của bệnh Y.enterocolitica có

trong khoang miệng, trên lưỡi, hạch amidan, các hạch bạch huyết, trong ruột lợn và lợnthường xuyên bài tiết vi khuẩn này qua phân Quá trình di chuyển của vi khuẩn

Y.enterocolitica từ lợn sang người chủ yếu thông qua quá trình tiêu thụ thực phẩm, đặc

biệt là thực phẩm không được chế biến và bảo quản đảm bảo vệ sinh

Hầu hết các trường hợp bệnh yersiniosis được báo cáo từ Bắc Âu, đặc biệt là

Scandinavia, và từ Canada và Nhật Bản Tuy nhiên, bệnh Yersiniosis không phải là một

tình trạng phải báo cáo ở hầu hết các quốc gia (bao gồm cả Hoa Kỳ) và các ca nhiễmtrùng ở các quốc gia không có chương trình giám sát có thể được trình bày chưa đầy đủ

Tại Hoa Kỳ, Y enteratioitica gây ra ≈ 92% số ca nhiễm trùng có thông tin về loài đã biết,

gây ra khoảng 117.000 ca bệnh, 640 ca nhập viện và 35 ca tử vong mỗi năm

Ở vùng khí hậu ôn đới, nguy cơ nhiễm trùng tăng lên trong những tháng lạnh hơn.Trẻ em bị nhiễm bệnh thường xuyên hơn người lớn Những người mắc các bệnh gây ranồng độ sắt cao (ví dụ như bệnh hemochromatosis, thalassemia), bao gồm cả nhữngngười đang điều trị thải sắt, có nguy cơ nhiễm trùng và bệnh nặng cao hơn Tỷ lệ mắcbệnh ở những người du lịch đến các quốc gia có thu nhập thấp và trung bình nhìn chung

là thấp và hầu hết các trường hợp được cho là do lây truyền qua thực phẩm Một nghiên

cứu ở Hoa Kỳ cho thấy ≈ 6% số ca nhiễm Y enteratioitica có liên quan đến du lịch.

Thời gian ủ bệnh là 4–6 ngày (khoảng 1–14 ngày) và triệu chứng khởi phát có thểdiễn ra từ từ hơn so với các bệnh nhiễm trùng do mầm bệnh đường ruột khác gây ra.Viêm ruột là biểu hiện lâm sàng phổ biến nhất; các triệu chứng thường bao gồm đaubụng, tiêu chảy (có thể ra máu và kéo dài trong vài tuần) và sốt Đau họng cũng có thểxảy ra, đặc biệt ở trẻ em Viêm hạch mạc treo, biểu hiện đau giống viêm ruột thừa, đãđược mô tả rõ ràng Viêm ruột hoại tử đã được mô tả ở trẻ nhỏ Viêm khớp phản ứng ảnhhưởng đến cổ tay, đầu gối và mắt cá chân có thể xảy ra, thường là 1 tháng sau đợt tiêuchảy ban đầu, khỏi sau 1–6 tháng Ban đỏ nút, biểu hiện là các tổn thương đau đớn, nổilên màu đỏ hoặc tím dọc theo thân và chân, có thể xảy ra và thường tự khỏi trong vòng 1tháng

2.3 Chẩn đoán Yersinia enterocolitica

Chẩn đoán thường được thực hiện bằng cách phân lập sinh vật từ mật, máu, dịchnão tủy, hạch bạch huyết mạc treo, dịch màng bụng, phân, tăm bông họng hoặc vếtthương Nếu nghi ngờ bệnh yersiniosis, hãy thông báo cho phòng thí nghiệm lâm sàng vì

có thể sử dụng phương pháp làm giàu lạnh, xử lý kiềm hoặc cấy mẫu bệnh phẩm lâmsàng trên môi trường thạch CIN để tăng khả năng nuôi cấy dương tính Một số xétnghiệm chẩn đoán không phụ thuộc vào nuôi cấy (CIDT) hiện đã có sẵn và tăng hơn gấpđôi tỷ lệ phát hiện Yersinia spp ở Mỹ Các nhóm CIDT thường chỉ nhắm mục tiêu đến

Y enteratioitica và sự hiếm gặp của bệnh yersiniosis đã ngăn cản việc đánh giá chắc chắn

về tính đặc hiệu và độ nhạy của nền tảng CIDT thông qua các nghiên cứu tiền cứu Cầnphải nuôi cấy để xác định loài và kiểm tra độ nhạy cảm với kháng sinh

Hiện nay, người ta thường dùng biện pháp PCR và realtime PCR để nâng cao tínhchính xác của kết quả chẩn đoán PCR ( Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật nhằmkhuếch đại một đoạn DNA đặc hiệu nhờ 1 cặp mồi Mồi sử dụng trong PCR thường là một cặpoligonucleotide, dài khoảng 15-30 nucleotide Thành phần của PCR là: đoạn DNA đích, các mồi

có trình tự bổ sung với DNA đích, hỗn hợp của 4 loại base và một DNA-polymerase phù hợp.Quá trình khuếch đại là một sự lặp lại các chu kỳ của tăng và giảm nhiệt độ Mỗi chu kỳ gồm 3bước: dãn xoắn sợi DNA kép, các mồi bắt cặp với từng sợi DNA đơn, tổng hợp sợi DNA mớinhờ DNA-polymerase Theo đó, số lượng DNA tạo ra tăng lên 2n với n là số chu kỳ (Saiki và cs,1987) Một trong những ứng dụng của PCR là xác định chính xác vi khuẩn Đây là phương phápnhanh, đặc hiệu, nhạy và tự động trong việc xác định các mầm bệnh là vi sinh vật

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP

Bước 1 Vào NCBI điền Hypothetical protein + Yersinia enterocolitica subsp

enterocolitica (tên của vi khuẩn cần tìm) vào thanh tìm kiếm và bấm search

Sau đó chọn protein

Bước 2 Lựa chọn các item có aa protein nằm trong khoảng 80 - 200 aa.

Chọn Run BLAST

Kết quả hiển thị sau khi nhấn Run BLAST, tiếp đến chọn BLAST

Bước 3 Chọn vào loài xuất hiện đầu tiên.

Chọn vào Identical Protein.

Bước 4 Chọn CDS Region Nucleotide để lấy trình tự và ưu tiên chọn chiều âm.

Chọn vào FASTA để lấy trình tự.

Bước 5 Copy trình tự vừa lấy được vào Primer 3 Plus sau đó chọn Pick Primers để thiết

kế primer

Sau khi hiển thị kết quả như hình sau, chọn cặp primer có tỉ lệ GC < 60%, hạn chế cóhairpin secondary structure và self any secondary structure band mục tiêu hạn chế dưới

200 bp

Bước 6 Kiểm tra với In silico PCR amplification

Chọn chi Yersinia (chi cần kiểm tra) Nhấn Next step

Nhập trình tự primer đã chọn tương ứng vào ô, tại ô Migroorganism chọn APPLY TO

ALL Yersinia Nhấn Amplify

Kết quả hiển thị, nếu xuất hiện duy nhất 1 band cho loài cần tìm thì tiếp tục kiểm tra với Primer BLAST Nếu xuất hiện band khác thì chọn cặp primer khác.

Bước 7 Kiểm tra Primer – BLAST

Tại Database chọn nr, tại Organism để trống Sau đó chọn vào Get Primers

Màn hình hiển thị là kết quả cần tìm

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN4.1 Kết quả

4.1.1 Kết quả trình tự primer thiết kế

Bảng 4.1 Trình tự của 3 cặp primer đã thiết kế

Prime

Nhiệt độ nóng chảy ( o C)

%GC

Kích thước band mục tiêu (bp)

R: TCCTGATCTATGCTGCCTTCC

59.159.3

38.552.4 308

R: GTCTAAAGTTGCGCCTGCTT

57.359.1

50.050.0 159

G: GATTAGTCTCCCGCCAGATG

58.857.5

55.055.0 152

Kết quả kiểm tra In silico PCR Amplification.

Hình 4.1 Thiết kế primer bằng Primer3Plus (Cặp 1)

Hình 4.2 Thiết kế primer bằng Primer3Plus (Cặp 2) Hình 4.3 Thiết kế primer bằng primer3plus (Cặp 3).

Bằng phần mềm Primer3Plus đã thiết kế được 3 cặp primer cho vi khuẩn mục tiêu.

4.1.2 Kiểm tra độ đặc hiệu 3 cặp primer trên In silico PCR Amplification

Hình 4.4 Kết quả kiểm tra primer bằng In silico PCR Amplification (Cặp 1).

Hình 4.5 Kết quả kiểm tra primer bằng In silico PCR Amplification (Cặp 2).

Hình 4.6 Kết quả kiểm tra primer bằng In silico PCR Amplification (Cặp 3) 4.1.3 Kết quả BlAST trình tự

Hình 4.7 Kết quả BLAST trình tự cặp 1.

4.1.4.2 Trình tự FASTA cặp primer 2

>AM286415.1:c3771190-3770903 Yersinia enterocolitica subsp enterocolitica 8081complete genome

ATGAATCAGGAACAACAATTCTGGCAGTTAACGGCATCTGCACTGTTTAACAAACACTTCGGATTGACTCTGAACGATACCGATTTTTGTGAGGAAACCTGCGTAGTGGCGCTATACGAAACCGGCAAACGTCCGTTTGAGGCGATTAACGGTTTGGTGGATAAATACAACCTGGCTCGTTTGAATAACAATGCTTTTCAACCACGTTCA

CCTTACCTGAATGCAATCGATGAACTGATTGTCGTTCTTGAAGCAGGCGCAACTTTAGACATTATCCGTCAACCATAA11111111111111111111111111111111111111

4.1.4.3 Trình tự FASTA cặp primer 3

>AM286415.1:c3782068-3781715 Yersinia enterocolitica subsp enterocolitica 8081 complete genome

TTGCCAATAGAGTTATCTATACCGACGGCTCTTATCCCGTATCTGTCATATCCCCCGATATCCCGATTGTTTATCTTGATGCTCCAGACCGTGTGCAAAGGGGGAATCTTTGGTTCTTTGCCCACTAACCCCGTTCAGGCAGAAAAGCAGGTTCGTAAGCTTCTGGCGTCACCCACATTTAAATTACAGCAACAACAGTTAGCTGCGGCTTATCAGGGGATAATGAAAGCTTGGTCTTTGGGCTTGGAGAAATATCCGGCAGTGTATTCGATGACCAGTGGGTGGTGTACGGAACCACCGATATCGACGTGGCTA

4.2 Thảo luận

Sau khi tìm các cặp Primer phù hợp với các điều kiện đã cho trước đó Tiến hành kiểm tra

In silico kết quả hiển thị ta thấy được chỉ xuất hiện một band duy nhất ở loài cho thấy cặp primer mang tính chuyên biệt Sau đó phải tiến hành kiểm tra trên Primer-BlAST đã xuất hiện tên loài mong muốn trong quá trình kiểm tra chéo có xuất hiện một con thuộc

chi đó nhưng khác tên, trình tự của Yersinia enterocolitica strain 8081 Trong quá trình

tìm kiếm, thử với nhiều cặp primer với các mã protein khác nhau vẫn cho ra kết quả tương đồng

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT

1 Lưu Quỳnh Hương, Trần Thị Thu Hằng Lê Thị Hồng Nhung và Nguyễn Thị Thu

Hằng, (2020) Tỷ lệ lưu hành một số gen độc lực trên các chủng Yersina

enterocolitica phân lập từ lợn tại lò mổ ở Hà Nội Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú

y 27(6): 55-56

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG NƯỚC NGOÀI

1 Fredriksson-Ahomaa, M (2017). Yersinia enterocolitica Foodborne Diseases:

223–233

Guz-Regner, K., & Bugla-Płoskońska, G (2018) Identification of Yersinia

enterocolitica isolates from humans, pigs and wild boars by MALDI TOF

MS. BMC microbiology 18: 1-10.

TÀI LIỆU INTERNET