báo cáo thực hành sinh tin

Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌCBÀI TẬP THỰC HÀNHSINH TIN HỌCTHIẾT KẾ CÁC CẶP PRIMER ĐẶC HIỆUCHO VI KHUẨN Yersinia pestis

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÀI TẬP THỰC HÀNH

SINH TIN HỌC

THIẾT KẾ CÁC CẶP PRIMER ĐẶC HIỆU

CHO VI KHUẨN Yersinia pestis

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÀI TẬP THỰC HÀNH

SINH TIN HỌC

THIẾT KẾ CÁC CẶP PRIMER ĐẶC HIỆU

CHO VI KHUẨN Yersinia pestis

Hướng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN BẢO QUỐC

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH SÁCH CÁC HÌNH iv

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Vi khuẩn Yersinia pestis 2

2.2 Trung tâm thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia – National Center for Biotechnology Informations (NCBI) 2

2.3 Primer3 3

2.4 In silico PCR amplification 3

2.5 Primer-BLAST 4

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 5

3.1 Vật liệu nghiên cứu 5

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 5

3.1.2 Công cụ nghiên cứu 5

3.2 Phương pháp nghiên cứu 5

3.2.1 Thu thập khuôn mẫu 5

3.2.3 Xét độ đặc hiệu của primer với In silico PCR amplification và Primer-BLAST

10

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 13

4.1 Kết quả 13

4.1.1 Cặp primer thứ nhất đặc hiệu cho Yersinia pestis 13

4.1.1.1 Thu thập khuôn mẫu 13

4.1.1.2 Thiết kế primer cho khuôn mẫu 13

4.1.1.3 Xét độ đặc hiệu của primer với In silico PCR amplification và Primer-BLAST 14

4.1.2 Cặp primer thứ hai đặc hiệu duy nhất cho Yersinia pestis 15

4.1.2.1 Thu thập khuôn mẫu 15

4.1.2.2 Thiết kế primer cho khuôn mẫu 15

4.1.2.3 Xét độ đặc hiệu của primer với In silico PCR amplification và Primer-BLAST 16

4.1.3 Cặp primer thứ ba đặc hiệu duy nhất cho Yersinia pestis 16

4.1.3.1 Thu thập khuôn mẫu 16

4.1.3.2 Thiết kế primer cho khuôn mẫu 17

4.1.3.3 Xét độ đặc hiệu của primer với In silico PCR amplification và Primer-BLAST 18

4.2 Thảo luận 18

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NCBI: National Center of Biotechnology Informatics

BLAST: Basic Local Alignment Search Tool

MEGA: Molecular Evolutionary Genetics Analysis

PCR: Polymerase Chain Reaction

NIH: National Institutes of Health

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Hình thái vi khuẩn Yersinia pestis 2

Hình 2.2 Giao diện chính của NCBI 3

Hình 2.3 Giao diện chính Primer3 3

Hình 2.4 Giao diện chính In silico PCR amplification 4

Hình 2.5 Giao diện chính của Primer-BLAST 4

Hình 3.1 Thao tác tìm kiếm dữ liệu 5

Hình 3.2 Danh sách các chủng NCBI tìm được 5

Hình 3.3 Truy cập mã GenBank của đối tượng nghiên cứu 6

Hình 3.4 Chọn Protein trong mục Related Information 6

Hình 3.5 Thao tác giới hạn chiều dài chuỗi 7

Hình 3.6 Tìm hypothetical protein và chọn Identical Proteins 7

Hình 3.7 Các chủng, loài có thể tạo ra protein đã chọn 7

Hình 3.8 Kết quả sau khi chọn một chủng, loài bất kì ở trang trước 8

Hình 3.9 Chọn FASTA để lấy trình tự DNA 8

Hình 3.10 Trình tự DNA đã thu nhận 8

Hình 3.11 Dán trình tự vào Primer3 9

Hình 3.12 Giới hạn band của sản phẩm PCR 9

Hình 3.13 Cặp primer do Primer3 đề xuất cho trình tự đã chọn 10

Hình 3.14 Chọn Yersinia và bấm Next step 10

Hình 3.15 Thao tác thực hiện In silico PCR 11

Hình 3.16 Kết quả sau khi chạy In silico PCR amplification 11

Hình 3.17 Nhập trình tự primer vào Primer-BLAST 12

Hình 3.18 Thiết lập điều kiện chạy Primer-BLAST 12

Hình 3.19 Danh sách các loài bắt cặp với primer mà Primer-BLAST cho 12

Hình 4.1 Chọn hypothetical protein A1122_18785 [Yersinia pestis A1122] 13

Hình 4.2 Kết quả thử nghiệm trên In silico PCR amplification 14

Hình 4.3 Kết quả thử nghiệm trên Primer-BLAST 14

Hình 4.4 Chọn hypothetical protein A1122_03145 [Yersinia pestis A1122] 15

Hình 4.5 Kết quả thử nghiệm trên In silico PCR amplification 16

Hình 4.6 Kết quả thử nghiệm trên Primer-BLAST 16

Hình 4.7 Chọn hypothetical protein A1122_06085 [Yersinia pestis A1122] 17

Hình 4.8 Kết quả thử nghiệm trên In silico PCR amplification 18

Hình 4.9 Kết quả thử nghiệm trên Primer-BLAST 18

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong lĩnh vực Sinh học, khi các thông tin đầu tiên về cấu trúc, chức năng, trình

tự protein và DNA được khám phá, do các phân tử này được cấu thành từ số lượngđơn phân rất lớn, khối lượng thông tin lưu trữ và so sánh là cực lớn nên rất cần có sự

hỗ trợ của hệ thống máy tính, tin học Ngoài ra Tin học còn liên quan đến việc sử dụngInternet, một mạng máy tính toàn cầu để liên kết dữ liệu của nhiều nơi trên thế giới lạivới nhau Sự kết hợp Tin và Sinh học giúp việc quản lý tính toán và phân tích cácthông tin sinh học (gen, bộ gen, protein, tế bào, hệ sinh thái, thông tin y tế, robot, trítuệ nhân tạo,…)

1.2 Mục tiêu

Tìm hiểu, thuần thục khả năng thiết kế đoạn primer bằng công cụ sinh tin baogồm: phần mềm phân tích đa dạng di truyền MEGA, cách lấy đoạ primer từ trình tự có

sẵn bằng primer3, chạy thử sản phẩm PCR với in silico PCR amplification,…

1.3 Nội dung thực hiện

Thiết đoạn primer dành cho Yersinia pestis cần trải qua nhiều bước Bước đầu tiên

là sử dụng NCBI để thu thập dữ liệu, các trình tự DNA của vi khuẩn, sau đó sử dụng

primer3 để lấy các đoạn primer phù hợp và kiểm tra sản phẩm PCR với in silico PCR amplification Vì dữ liệu của in silico PCR amplification là dữ liệu cũ, nên cần thực

hiện thao tác primer BLAST thông qua Primer-BLAST để kiểm tra độ đặc hiệu củacác đoạn primer

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vi khuẩn Yersinia pestis

Yersinia pestis là vi khuẩn gram âm, không có tính di động, hình que thuộc họ

Enterobacteriaceae Nó là tác nhân gây bệnh của dịch hạch, căn bệnh đã gây nhiều trậndịch kinh hoàng với tỉ lệ tử vong rất cao trong lịch sử nhân loại như ở trận Đại dịchhạch và Cái chết đen

Để tìm hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh, cách xâm nhập, hạn chế sự lây lan của vikhuẩn, việc nghiên cứu rõ về bộ gene Để làm được điều này, việc thiết kế các đoạnprimer cho phản ứng PCR là không thể tránh khỏi

Hình 2.1 Hình thái vi khuẩn Yersinia pestis.

2.2 Trung tâm thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia – National Center for Biotechnology Informations (NCBI)

NCBI là một nhánh thuộc National Institute of Health (NIH), được thành lập từnăm 1988 NCBI quản lí các cơ sở dữ liệu liên quan đến công nghệ sinh học và y học,

và là một nguồn quan trọng đối với các dịch vụ và công cụ sinh tin học Các cơ sở sữliệu chính bao gồm Genbank, PubMed Nơi đây cũng là cơ sở dữ liệu về biểu hiện gen,protein, biến dị, phân tích nhiều đối tượng của sinh học

Địa chỉ web: https://www.ncbi.nlm.nih.gov

Trong bài báo cáo thực hành này, NCBI sẽ được dùng để lấy các trình tự của DNA

của Yersinia pestis thông qua các đoạn protein mà vi khuẩn này tạo ra

Hình 2.2 Giao diện chính của NCBI.

2.3 Primer3

Để thu nhận các đoạn primer dễ dàng, bài báo cáo này sử dụng Primer3 để lấy cáccặp primer phù hợp với trình tự lấy được từ NCBI

Địa chỉ web: https://primer3.ut.ee

Hình 2.3 Giao diện chính Primer3.

2.4 In silico PCR amplification

In silico PCR amplification là trình duyệt mô phỏng lại phản ứng PCR với các

trình tự DNA, đoạn primer cho trước Kết quả của công cụ này không đúng hoàn toàn,

do dữ liệu của web này đã cũ Công cụ Primer-BLAST được đề xuất để kiểm tra lại kếtquả

Địa chỉ web: http://insilico.ehu.es/PCR/

Hình 2.4 Giao diện chính In silico PCR amplification

2.5 Primer-BLAST

Primer-BLAST là công cụ để kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp primer, thuộc mộtnhánh của NCBI Primer-BLAST hoạt độ khi có các đoạn primer

Địa chỉ web: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

Hình 2.5 Giao diện chính của Primer-BLAST.

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Thu thập khuôn mẫu

Bước 1: Truy cập NCBI qua đường dẫn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov, bấm vào thanh

tìm kiếm, chuyển chế độ lọc về Genome và tìm từ khoá “Yersinia pestis”

Hình 3.1 Thao tác tìm kiếm dữ liệu.

Bước 2: Màn hình hiển thị các chủng Yersinia pestis khác nhau, trong bài cáo này sẽ chọn chủng Yersinia pestis A1122 để thực hành, bấm vào mã số assembly của chủng

này

Hình 3.2 Danh sách các chủng NCBI tìm được.

Bước 3: Sau khi truy cập vào thông tin của chủng Yersinia pestis A1122, tiến hành kéo

xuống dưới đến mục Chromosome, bấm mã CP002956.1

Hình 3.3 Truy cập mã GenBank của đối tượng nghiên cứu.

Bước 4: Để dễ dàng thực hiện, trong trang mới, ở mục Related information, chọnProtein, sau đó giới hạn độ dài của chuỗi protein thành 80-200 để thu hẹp phạm vinghiên cứu và tránh sự trùng lặp khi tìm kiếm dữ liệu Sau khi giới hạn độ dài chuỗipolypeptide, chọn Apply để xuất hiện kết quả cần tìm kiếm

Hình 3.4 Chọn Protein trong mục Related Information.

Hình 3.5 Thao tác giới hạn chiều dài chuỗi.

Bước 5: Tìm kiếm các mục có “hypothetical protein” để phân tích, khi tìm thấy các kếtquả này, chọn Identical Proteins Sau đó, NCBI sẽ hiển thị các chủng, loài có khả năngtạo ra loại protein vừa chọn

Hình 3.6 Tìm hypothetical protein và chọn Identical Proteins.

Hình 3.7 Các chủng, loài có thể tạo ra protein đã chọn.

Bước 6: Chọn một trong các chủng, loài trong kết quả này, sau đó bấm FASTA để lấy trình tự DNA của loài đã chọn mã hoá cho protein

Hình 3.8 Kết quả sau khi chọn một chủng, loài bất kì ở trang trước.

Hình 3.9 Chọn FASTA để lấy trình tự DNA.

3.2.2 Thiết kế primer cho khuôn mẫu

Bước 1: Truy cập Primer3 qua đường dẫn: https://primer3.ut.ee Sao chép đoạn trình tự

đã thu thập và dán vào Primer3 Sau đó, kéo xuống mục General Primer PickingConditions, Product Size, chỉnh về 150-250 để giới hạn Primer3 tạo các đoạn primercho sản phẩm PCR có band từ 150-250

Hình 3.11 Dán trình tự vào Primer3.

Hình 3.12 Giới hạn band của sản phẩm PCR.

Bước 2: Chọn Pick primer để bắt đầu lấy các đoạn primer phù hợp, trước khi tiến hànhbước tiếp theo, cần quan sát các điều kiện của cặp primer: nhiệt độ bắt cặp của 2 đoạn không được chênh lệch quá cao, tỉ lệ G/C không được vướt quá 50%, tỉ lệ tự bắt cặp và

tỉ lệ hình thành cấu trúc kẹp tóc phải thấp Nếu đầy đủ điều kiện thì tiếp tục bước tiếp theo

Hình 3.13 Cặp primer do Primer3 đề xuất cho trình tự đã chọn.

3.2.3 Xét độ đặc hiệu của primer với In silico PCR amplification và BLAST

Primer-Bước 1: Truy cập In silico PCR amplification qua đường dẫn:

http://insilico.ehu.es/PCR Ở mục các chi được công cụ hỗ trợ, chọn Yersinia và bấmNext step

Hình 3.14 Chọn Yersinia và bấm Next step.

Bước 2: Dán cặp primer đã thu được từ Primer3 Ở mục Microorganism, chọn APPLY

TO ALL Yersinia để mô phỏng quá trình thực hiện PCR trên toàn bộ loài của chiYersinia Sau đó chọn Amplify

Hình 3.15 Thao tác thực hiện In silico PCR.

Bước 3: Đọc kết quả, nếu tất cả các chủng thuộc Yersinia pestis đều có band xấp xỉ 200bp và các loài khác của Yersinia (Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia

enterocolitica,…) đều không có band thì tiếp tục kiểm tra độ đặc hiệu của Primer bằng

Primer-BLAST Bước kiểm tra lại này cần thiết vì dữ liệu từ In silico PCR

amplification đã cũ, các kết quả của trang có thể không đúng với dữ liệu hiện nay

Hình 3.16 Kết quả sau khi chạy In silico PCR amplification.

Bước 4: Truy cập Primer-BLAST qua đường dẫn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/

primer-blast Dán cặp primer cho kết quả đặc hiệu duy nhất cho Yersinia pestis ở In

silico PCR amplification

Hình 3.17 Nhập trình tự primer vào Primer-BLAST.

Bước 5: Trước khi kiểm tra độ đặc hiệu, cần chỉnh một số thông tin ở phần Primer PairSpecificity Checking Parameters Ở mục Database chọn nr Mục Organism xoá toàn

bộ để Primer-BLAST chạy trên toàn bộ loài mà primer có thể chạy Sau đó chọn Getprimer

Hình 3.18 Thiết lập điều kiện chạy Primer-BLAST.

Bước 6: Đọc kết quả, nếu Primer-BLAST trả kết quả tất cả các loài là Yersinia pestis

thì cặp primer đó đạt yêu cầu Nếu có xuất hiện loài khác thì phải lặp lại các bước đầu tiên đến khi tìm ra 3 cặp primer thoả yêu cầu

Hình 3.19 Danh sách các loài bắt cặp với primer mà Primer-BLAST cho

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả

4.1.1 Cặp primer thứ nhất đặc hiệu cho Yersinia pestis

4.1.1.1 Thu thập khuôn mẫu

Protein thứ nhất được chọn cho kết quả có thể tạo primer đặc hiệu: hypotheticalprotein A1122_18785 [Yersinia pestis A1122]

Hình 4.1 Chọn hypothetical protein A1122_18785 [Yersinia pestis A1122]

Chọn loài: Yersinia pestis Antiqua, complete genome GenBank: CP000308.1

Trình tự fasta của protein tương ứng từ Yersinia pestis Antiqua như sau:

ATGAGTACACGCCATGTAGTAATTACAGGTATGGGTGTCGTTTCCCCATTAGGCTGCGGTATCGAAACGGTCTGGCAACGGCTCTTGGCAGGGCAATCAGGCATCCGTGTTCTATCGGATGAAATTGTCGGTGACTTGCCCGCTAAAATTGGTGGGCAAGTGCCTACGTTAGCAGAAGACGCTAAAGCTGGTTTCGATCCAGATAAAGCGGTTACCCCAAAAGATCAAAAGAAAATGGATCGCTTTATTGAGTTTGCGATGGCGGCGGCCGATGAGGCAATTAGCCAGGCAGGCTGGCATGCTGTAACGAACGGTGCAATAGTGATCCACACCCAACGCCTGAAATCAGATCCAGGGGGTAATCTGCTCTCCTGA

4.1.1.2 Thiết kế primer cho khuôn mẫu

Kết quả trình tự cặp primer từ khuôn mẫu được Primer3 trả về:

Forward primer: 5’-GGTGACTTGCCCGCTAAAAT-3’

Primer-Hình 4.2 Kết quả thử nghiệm trên In silico PCR amplification.

Hình 4.3 Kết quả thử nghiệm trên Primer-BLAST.

4.1.2 Cặp primer thứ hai đặc hiệu duy nhất cho Yersinia pestis

4.1.2.1 Thu thập khuôn mẫu

Protein thứ hai được chọn cho kết quả đặc duy nhất cho Yersinia pestis:hypothetical protein A1122_03145 [Yersinia pestis A1122]

Hình 4.4 Chọn hypothetical protein A1122_03145 [Yersinia pestis A1122].

Chọn chủng Yersinia pestis CO92 mã hoá cho protein trên và nhận trình tự FASTA như sau:

ATGTTAACTGAAGACACGGCAGAGGCCAAAGGCTGGCTGTCCAGCGGTCAGCTGCGGGAGGACGTCTTTACCCTGCTGCGTGTTTATCTGGGGTGTGATTACGATGCCAGCCTGACACTGACAATCCCGATGAATCTCGCACCGCTGCCACGTATGGGCGACCCCTTGCTGATGGCGGGGTATAACGTGATGCTGGGACTGCGTGAAGATAATCTGGATGAAAGGCCGGAGAAAGTGACGATGAAGTTGGGGCGGATTAGGGATAAGAGTAAACTTCAGAAGCACTAA

4.1.2.2 Thiết kế primer cho khuôn mẫu

Kết quả trình tự cặp primer từ khuôn mẫu được Primer3 trả về:

Forward primer: 5’- CTTTACCCTGCTGCGTGTTT -3’

3’ self complementarity: 0.00

4.1.2.3 Xét độ đặc hiệu của primer với In silico PCR amplification và BLAST

Primer-Hình 4.5 Kết quả thử nghiệm trên In silico PCR amplification.

Hình 4.6 Kết quả thử nghiệm trên Primer-BLAST.

4.1.3 Cặp primer thứ ba đặc hiệu duy nhất cho Yersinia pestis

4.1.3.1 Thu thập khuôn mẫu

Protein thứ ba được chọn cho kết quả đặc duy nhất cho Yersinia pestis:hypothetical protein A1122_06085 [Yersinia pestis A1122]

Hình 4.7 Chọn hypothetical protein A1122_06085 [Yersinia pestis A1122].

Chọn chủng Yersinia pestis Pestoides F mã hoá cho protein trên và nhận trình

tự FASTA như sau:

ATGGGTAAGCAAAACTTTTATTTTCTAGGCCAACTCATCGGTTGCCATTTTAATCAAGATTACGCCTATATAAATGATGGCGAAGATACTATTGAGGGGATTATCCAATTTTATAAGAAAACAGCAGATGAACAAACTTTGAGTGAGCTAAAAAAGAACTGTATGATTTTATTGAAATTTATTCTGACATTCTTGAGAAGGAATTTGAGGAAAGATACGGGTTTGATTTCTCTCCCGCATTATGGGAAACAGCCGCATATGATTTTCTCAAAACTATATTAA

4.1.3.2 Thiết kế primer cho khuôn mẫu

Kết quả trình tự cặp primer từ khuôn mẫu được Primer3 trả về:

Forward primer: 5’- TCTAGGCCAACTCATCGGTT -3’

Thông số của Forward primer:

4.1.3.3 Xét độ đặc hiệu của primer với In silico PCR amplification và BLAST

Primer-Hình 4.8 Kết quả thử nghiệm trên In silico PCR amplification.

Hình 4.9 Kết quả thử nghiệm trên Primer-BLAST.